本發(fā)明屬于食品保鮮技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種生物保鮮菌及其在酸乳中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

隨著人們生活水平的提高，酸乳因其特有的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功能，越來(lái)越受到人們的喜歡。但酸乳保質(zhì)期相對(duì)較短，即便在冷藏條件下也不超過(guò)21天，這在一定程度上限制了酸乳市場(chǎng)的拓展空間。

霉菌是食品生產(chǎn)中常見(jiàn)的污染物，而酸奶因營(yíng)養(yǎng)豐富又極易受到污染，導(dǎo)致產(chǎn)品霉變、漲包、貨架期縮短等。高酸度、低溫度等不能完全抑制微生物的生長(zhǎng)，并且運(yùn)輸、銷售過(guò)程中冷鏈不能得到完全保證，導(dǎo)致酸乳的后酸化，使酸乳貨架期縮短，因此控制酸乳中真菌的污染是一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。

防腐劑根據(jù)其來(lái)源不同，可分為天然防腐劑和化學(xué)合成防腐劑兩大類。隨著社會(huì)生活水平的不斷提高和消費(fèi)者對(duì)健康的日益關(guān)注，人們對(duì)防腐劑之類的食品添加劑在安全性能上提出了更高的要求。長(zhǎng)期的研究表明，化學(xué)合成防腐劑存在致癌性、致畸性和易引起食物中毒等問(wèn)題；天然防腐劑不但對(duì)人體健康無(wú)害，而且還具有一定的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，所以越來(lái)越多的研究者開(kāi)始把目光投向天然防腐劑的開(kāi)發(fā)。

生物保鮮是指通過(guò)添加天然物質(zhì)、加入菌株本身或其抗菌產(chǎn)物來(lái)延長(zhǎng)食品的貨架期和保證食用安全性。乳酸菌是一類能在可利用的碳水化合物發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌。在食品工業(yè)上，乳酸菌被廣泛用作發(fā)酵劑來(lái)生產(chǎn)發(fā)酵食品，如酸奶、奶酪、香腸、魚(yú)、面包、啤酒、葡萄酒、酸菜、泡菜等。大多數(shù)乳酸菌通常被認(rèn)為是安全的，乳酸菌對(duì)食品的生物保鮮作用是由于菌株代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸、二氧化碳、乙醇、過(guò)氧氫、雙乙酰、細(xì)菌素和抗生素等。

乳酸菌作為生物保鮮菌，其不應(yīng)參與酸乳發(fā)酵過(guò)程，不影響發(fā)酵時(shí)間及乳酸菌數(shù)量，在保質(zhì)期內(nèi)能抑制霉菌的滋生。 然而大多數(shù)益生性乳酸菌都具有較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力，并代謝產(chǎn)生不同的風(fēng)味物質(zhì), 會(huì)使酸奶具有某些特殊的味道, 所以在應(yīng)用益生性乳酸菌生產(chǎn)酸奶制品時(shí)要注意其對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)的影響。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種生物保鮮菌，其有效成分為植物乳桿菌，商業(yè)編號(hào)為L(zhǎng)P45，保藏編號(hào)為YMC1005，該菌株的拉丁文名稱為：Lactobacillus plantarum，保藏單位為：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物菌種保藏中心，保藏地址為：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏日期為：2013年8月26日，保藏號(hào)為：CGMCC No.8072。本發(fā)明還提供一種具有食品防腐保鮮作用的生物保鮮菌的應(yīng)用，該生物保鮮菌以植物乳桿菌LP45 CGMCC No.8072為主要活性物質(zhì)；采用本發(fā)明生物保鮮菌后可抑制腐敗菌的滋生，延長(zhǎng)酸乳的貨架期，并保持原有的風(fēng)味和品質(zhì)。

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供植物乳桿菌Lactobacillus plantarum LP45 CGMCC No.8072菌株或植物乳桿菌Lactobacillus plantarum LP45 CGMCC No.8072菌劑在制備生物保鮮菌中的應(yīng)用；所述植物乳桿菌Lactobacillus plantarum LP45 CGMCC No.8072菌劑是將植物乳桿菌Lactobacillus plantarum LP45 CGMCC No.8072菌株擴(kuò)大培養(yǎng)后得到的。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供上述植物乳桿菌Lactobacillus plantarum LP45 CGMCC No.8072菌株或植物乳桿菌LP45 CGMCC No.8072菌劑在抑制霉菌生長(zhǎng)中的應(yīng)用；所述植物乳桿菌Lactobacillus plantarum LP45 CGMCC No.8072菌劑是將植物乳桿菌Lactobacillus plantarum LP45 CGMCC No.8072菌株擴(kuò)大培養(yǎng)后得到的。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種生物保鮮菌，其有效成分為權(quán)利要求1中所述的植物乳桿菌Lactobacillus plantarum LP45 CGMCC No.8072菌劑。

該生物保鮮菌中還可以包括本領(lǐng)域常用的輔料。

本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供上述生物保鮮菌在制備酸乳中的應(yīng)用。

作為優(yōu)選，在制備酸乳時(shí)，將發(fā)酵劑和上述生物保鮮菌同時(shí)加入進(jìn)行發(fā)酵。

作為優(yōu)選，所述生物保鮮菌按照10g/t的添加量添加。

發(fā)酵劑按照相應(yīng)的要求添加，例如發(fā)酵劑Yo-C655-F發(fā)酵一噸奶用量為30g，即按照30g/t的添加量添加。

本發(fā)明的生物保鮮菌以植物乳桿菌Lactobacillus plantarum LP45 CGMCC No.8072為主要活性物質(zhì)；采用本發(fā)明生物保鮮菌后可抑制腐敗菌的滋生，延長(zhǎng)酸乳的貨架期，并保持原有的風(fēng)味和品質(zhì)。

附圖說(shuō)明

附圖用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說(shuō)明書(shū)的一部分，與本發(fā)明的實(shí)施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。在附圖中：

圖1為酸奶產(chǎn)酸曲線；

圖2為本發(fā)明的生物保鮮菌的防霉加速實(shí)驗(yàn)結(jié)果；

圖3為本發(fā)明的生物保鮮菌在貨架期內(nèi)的抑菌試驗(yàn)結(jié)果；

圖4為酸乳發(fā)酵時(shí)加入本發(fā)明生物保鮮菌，得到的酸乳的口感及發(fā)酵風(fēng)味評(píng)價(jià)。

具體實(shí)施方式

以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為市售。

在本申請(qǐng)中，滴定酸度 (°T)的測(cè)定：參照GB 541334—2010食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)乳和乳制品酸度的測(cè)定方法。

pH值測(cè)定：采用精密 pH 計(jì)測(cè)量。

粘度測(cè)定：采用博樂(lè)菲旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)測(cè)量。

乳酸菌數(shù)測(cè)定：參考GB 4789.35-2010食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中的乳酸菌檢驗(yàn)方法。

霉菌從未滅菌鮮奶中分離得到，試驗(yàn)前取新鮮斜面培養(yǎng)物接種在YPD液體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)48小時(shí)。

酸奶平板的霉菌加速試驗(yàn)：事先準(zhǔn)備好滅菌的2. 5% 瓊脂溶液( 121 ℃ 15min) 和發(fā)酵好的酸乳( pH 4. 40) 1∶ 4 混合，在無(wú)菌環(huán)境下攪拌均勻，傾注平板，每個(gè)平板大約含有30 mL酸乳瓊脂，凝固后放入4 ℃冰箱中30 min，使凝固更加充分。用無(wú)菌棉簽挑取新鮮的黃綠青霉菌落( 葡萄糖-蛋白胨-酵母粉瓊脂上28 ℃培養(yǎng)3 ～ 4 d) ，制成含有霉菌孢子的菌懸液，利用血球計(jì)數(shù)板顯微鏡觀察霉菌孢子數(shù)，使每毫升菌懸液中含有5×10⁶CFU 孢子，即點(diǎn)殖接種的每6 μL 菌懸液中的孢子數(shù)大約為30 CFU。將制做好的含霉菌孢子的酸乳瓊脂平板放置于28℃恒溫箱，觀察7天的霉菌生長(zhǎng)情況。

霉菌抑制試驗(yàn)：取約1.5×10³cfu霉菌孢子于50g發(fā)酵乳，置于4℃恒溫存儲(chǔ)，觀察24天內(nèi)的霉菌的生長(zhǎng)情況。

霉菌檢驗(yàn)：參考GB/T 4789.15—2010，采用孟加拉紅培養(yǎng)基。

感官評(píng)定：請(qǐng)50名有食品品嘗經(jīng)驗(yàn)的人，分別從色澤、滋氣味、組織狀態(tài)3方面進(jìn)行評(píng)定。

實(shí)施例1 本發(fā)明的生物保鮮菌的獲得

本申請(qǐng)人在內(nèi)蒙古烏蘭察布市四子王旗烏蘭哈達(dá)蘇木站烏蘭哈達(dá)嘎查的傳統(tǒng)酸奶酪中采樣，分離篩選獲得植物乳桿菌LP45（YMC1005 或L45），具體分離鑒定步驟如下：

將內(nèi)蒙古四子王旗酸奶酪樣品溶解于滅菌生理鹽水試管中，充分震蕩混勻，混勻后使用接菌環(huán)蘸取混合液體并于MRS 平板上劃線培養(yǎng)（37℃，72h），分離菌株。用接菌環(huán)從第一代平板挑取單菌落，在新MRS 平板上劃線培養(yǎng)（37℃，72h），進(jìn)行純化。同樣方法再純化2 次，使最終平板上為同一形態(tài)菌落為止。挑取單菌落接菌于MRS 液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)18h，以備保藏和鑒定使用。

將液體培養(yǎng)基菌懸液收集至滅菌離心管中，清洗離心2 次，進(jìn)行基因組DNA 的提取，提取完畢后，利用通用引物27f：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1495r：5-'CTACGGCTACCTTGTTACGA-3' 進(jìn)行16S rDNA 的PCR 實(shí)驗(yàn)，完成PCR 后將最終PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果與Gene Bank 中相關(guān)序列進(jìn)行比較，比較結(jié)果顯示LP45（YMC1005 或L45）屬于植物乳桿菌。

將LP45（YMC1005 或L45）及ATCC14917( 植物乳桿菌) 菌株的純培養(yǎng)液進(jìn)行清洗離心，將獲得的菌體進(jìn)行基因組DNA 的提取，提取完畢后，利用隨機(jī)引物5'-GACGGATCAG-3'進(jìn)行RAPD 實(shí)驗(yàn)，將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并進(jìn)行凝膠成像，對(duì)比兩株植物乳桿菌的電泳條帶，結(jié)果顯示，植物乳桿菌LP45（YMC1005 或L45）與植物乳桿菌ATCC14917 屬于同一種屬的不同菌株，結(jié)果見(jiàn)附圖1。將植物乳桿菌LP45（YMC1005 或L45）于2013 年8 月26 日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物菌種保藏中心，保藏號(hào)為：CGMCC No.8072。

本發(fā)明的生物保鮮菌的主要活性成分為植物乳桿菌LP45 CGMCC No.8072菌劑，該菌劑是將上述的植物乳桿菌LP45 CGMCC No.8072菌株擴(kuò)大培養(yǎng)后得到的。本發(fā)明的生物保鮮菌中，每1g菌粉包含10¹²-10¹³單位活菌數(shù)。

本發(fā)明的植物乳桿菌LP45 CGMCC No.8072的擴(kuò)大培養(yǎng)方法可以參照現(xiàn)有技術(shù)中的植物乳桿菌的擴(kuò)大培養(yǎng)方法，任一方法均能很好的擴(kuò)大培養(yǎng)本發(fā)明的植物乳桿菌。

本發(fā)明的生物保鮮菌的使用方法依照現(xiàn)有的生物保鮮菌在酸乳中的使用方法即可，比如可以為：

按照94%鮮牛乳中加入6%白砂糖，充分溶解，也可按照全脂乳粉或脫脂乳粉8.8%、蔗糖6%，用軟化水調(diào)到100ml 配制復(fù)原乳。升溫至95℃，巴氏殺菌300s，然后降溫至42℃。接種發(fā)酵劑和本發(fā)明的生物保鮮菌，生物保鮮菌按照10g/t的添加量添加，發(fā)酵劑按照相應(yīng)的要求添加，例如發(fā)酵劑Yo-C655-F發(fā)酵一噸奶用量為30g，即按照30g/t的添加量添加，在42℃恒溫發(fā)酵。待發(fā)酵至pH=4.4±0.05時(shí)結(jié)束發(fā)酵，破乳，將發(fā)酵乳樣品迅速降溫至4℃-8℃，并在4℃-8℃下后熟12-24h，得到發(fā)酵乳。

實(shí)施例2 本發(fā)明的生物保鮮菌的性能試驗(yàn)

（1）發(fā)酵過(guò)程終止pH及產(chǎn)酸性能試驗(yàn)

將本發(fā)明的生物保鮮菌（主要活性成分為植物乳桿菌LP45 CGMCC No.8072菌劑）與發(fā)酵劑同時(shí)添加，對(duì)發(fā)酵過(guò)程無(wú)影響，終止pH及產(chǎn)酸曲線與只加發(fā)酵劑時(shí)一致。詳見(jiàn)表1和圖1。

表1 發(fā)酵終止時(shí)pH值

（2）抑菌實(shí)驗(yàn)

本發(fā)明的生物保鮮菌（主要活性成分為植物乳桿菌LP45 CGMCC No.8072菌劑），在霉菌的加速試驗(yàn)中，可以有效抑制霉菌的生長(zhǎng)。具體實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下：

從未滅菌鮮奶中分離得到霉菌，按照平板點(diǎn)接法點(diǎn)接30cfu霉菌孢子于平板，置于28℃下進(jìn)行霉菌加速試驗(yàn)，比較7天后的霉菌菌斑大小。防霉加速試驗(yàn)結(jié)果參見(jiàn)表2和圖2。

表2 本發(fā)明的生物保鮮菌的防霉加速試驗(yàn)

本發(fā)明的生物保鮮菌在貨架期內(nèi)的抑菌試驗(yàn)過(guò)程如下：

按照94%鮮牛乳中加入6%白砂糖，充分溶解，也可按照全脂乳粉或脫脂乳粉8.8%、蔗糖6%，用軟化水調(diào)到100ml 配制復(fù)原乳。升溫至95℃，巴氏殺菌300s，然后降溫至42℃。分四部分樣品接種：

1、只接種溫和菌作為發(fā)酵劑；

2、只接種快速菌作為發(fā)酵劑；

3、同時(shí)接種溫和菌及本發(fā)明的生物保鮮菌；

4、同時(shí)接種快速菌及本發(fā)明的生物保鮮菌；

待所有樣品均發(fā)酵至pH=4.4±0.05時(shí)結(jié)束發(fā)酵，破乳，將發(fā)酵乳樣品迅速降溫至4℃-8℃，并在4℃-8℃下后熟12-24h，得到發(fā)酵乳樣品。

取約1.5×10³cfu霉菌孢子于不同發(fā)酵乳中，置于4℃下進(jìn)行霉菌抑制試驗(yàn)，記錄24d 內(nèi)的霉菌的生長(zhǎng)情況。檢測(cè)不同樣品在4℃和25℃存儲(chǔ)21天內(nèi)的乳酸菌活菌數(shù)量。結(jié)果如表3和圖3所示。

表3 本發(fā)明的生物保鮮菌在貨架期內(nèi)的抑菌實(shí)驗(yàn)

（3）對(duì)酸乳活菌的影響

使用本發(fā)明的生物保鮮菌（主要活性成分為植物乳桿菌LP45 CGMCC No.8072菌劑），在貨架期內(nèi)對(duì)酸乳活菌數(shù)的影響，結(jié)果如表4所示。

表4 本發(fā)明的生物保鮮菌的活菌檢測(cè)結(jié)果（×10⁸cfu/g）

由表4可知，由于存儲(chǔ)的溫度條件不同，酸奶中的活菌數(shù)量也不一樣。在4℃存儲(chǔ)時(shí)，隨著存放時(shí)間延長(zhǎng)，空白樣及加入生物保鮮菌的處理樣中的活菌數(shù)量均略微衰減，但基本維持在4×10⁸以上。在25℃存儲(chǔ)時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，空白樣中的活菌數(shù)量明顯衰減，數(shù)量級(jí)從10⁸衰減到10⁶；而加入生物保鮮菌的處理樣僅略微衰減，基本維持在10⁸，沒(méi)有出現(xiàn)數(shù)量級(jí)的大幅度衰減。

（4）口感及發(fā)酵風(fēng)味等感官評(píng)價(jià)

與空白的酸奶樣品相比，加入本發(fā)明的生物保鮮菌進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵后當(dāng)天和存儲(chǔ)21天后對(duì)各項(xiàng)感官指標(biāo)進(jìn)行評(píng)定，結(jié)果：兩者在口感及發(fā)酵風(fēng)味等感官指標(biāo)上均無(wú)明顯差異。詳見(jiàn)圖4。

最后應(yīng)說(shuō)明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。