本發(fā)明涉及微生物應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體是一株假單胞菌及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

我國(guó)耕地面積約18.2 億畝，但其中低產(chǎn)田占我國(guó)耕地的41.6%，施用化學(xué)肥料是提高中低產(chǎn)田產(chǎn)量，保障我國(guó)糧食產(chǎn)量的最重要措施。目前我國(guó)每年化肥消費(fèi)量高達(dá)9000 萬(wàn)噸，但是依靠大量施用化學(xué)肥料也帶來(lái)了一系列問(wèn)題： 1) 我國(guó)化學(xué)肥料資源不足，嚴(yán)重依賴進(jìn)口，難以為繼；2) 化肥常年的過(guò)量使用，造成土壤有機(jī)質(zhì)減少、土壤板結(jié)和土壤微生物菌群多樣化及其功能降低，嚴(yán)重阻礙了我國(guó)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展；3) 導(dǎo)致嚴(yán)重的環(huán)境污染（如土壤酸化、地下水體污染），生態(tài)環(huán)境遭到破壞。

為了解決過(guò)量施用化肥造成的肥料利用率低、生態(tài)環(huán)境惡化等一系列問(wèn)題，迫切需要研制一種新型安全有效的肥料代替部分化肥。生物有機(jī)肥是以自然界中的有機(jī)物為基質(zhì)和載體，加入固氮菌、解磷菌、解鉀菌、抗病促生菌等功能性微生物，經(jīng)特殊工藝加工而成。該肥料綜合了有機(jī)肥和微生物肥料的優(yōu)勢(shì)，與化學(xué)肥料相比，具有增產(chǎn)效果好、綠色環(huán)保、功能多樣化、保水保肥、肥料利用率高等顯著特點(diǎn)。因此，合理開(kāi)發(fā)施用生物有機(jī)肥料不僅是獲得優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)作物和提高土壤肥力的重要措施之一，也是保護(hù)生態(tài)環(huán)境、促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的必然趨勢(shì)。

目前，植物促生菌株在生物有機(jī)肥的研發(fā)應(yīng)用方面存在如下幾個(gè)問(wèn)題：1) 促生功能單一，有的植物促生菌株只具備一種促生功能，不具有全面的植物促生特性；2) 目前用于研發(fā)生物有機(jī)肥的植物促生菌株種類較少，多為芽孢桿菌，不具有針對(duì)性；3) 菌株的活性不穩(wěn)定，與有機(jī)肥混合后發(fā)揮作用持續(xù)時(shí)間較短；4) 菌株的環(huán)境適應(yīng)性較弱，不同樣品、采樣地點(diǎn)分離篩選到的菌株不具有廣泛適用性。因此，單一功能的生物有機(jī)肥已不能滿足現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展的要求，而添加抗病、促生、提高肥料利用率等的功能性微生物已成為新型生物有機(jī)肥的發(fā)展趨勢(shì)。擁有多種促生功能且性能穩(wěn)定的植物促生菌在生物有機(jī)肥的研發(fā)應(yīng)用方面具有重要的研究意義和廣闊的市場(chǎng)前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種假單胞菌植物促生菌Pseudomonas sp. N21，該菌株具有生長(zhǎng)速度快、菌株活性強(qiáng)、促生功能全面，促生效果穩(wěn)定等特性。可廣泛用于生物有機(jī)肥的研發(fā)應(yīng)用等領(lǐng)域。

本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一株假單胞菌Pseudomonas sp. N21，于2016年4月7日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國(guó)武漢武漢大學(xué)，其保藏編號(hào)為CCTCC NO：M2016180。

所述假單胞菌是用胰蛋白胨大豆(TSA)培養(yǎng)基初篩后，再由植物促生指標(biāo)：產(chǎn)吲哚乙酸IAA、ACC脫氨酶、精氨酸脫羧酶、鐵載體及菌株動(dòng)態(tài)生成曲線復(fù)篩分離得到。

所述胰蛋白胨大豆(TSA)培養(yǎng)基的配方為：胰蛋白胨 1.2~1.5%，大豆蛋白胨0.5~0.8%，氯化鈉 0~0.5%，瓊脂粉 1.5~2.0%，蒸餾水 1L，pH 7.3±0.2。

本發(fā)明還提供了假單胞菌Pseudomonas sp. N21在解磷、解鉀中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了假單胞菌Pseudomonas sp. N21在制備促植物生長(zhǎng)制劑中的應(yīng)用。

所述制劑為微生物菌劑。

本發(fā)明還提供了一種用假單胞菌Pseudomonas sp. N21發(fā)酵制備而成的微生物菌劑。

本發(fā)明還提供了一種生物有機(jī)肥及其在促進(jìn)植物生長(zhǎng)中的應(yīng)用，該生物有機(jī)肥是將假單胞菌Pseudomonas sp. N21添加至以木薯酒糟厭氧污泥為原料的有機(jī)肥中研制而成。

本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明公開(kāi)的假單胞菌植物促生菌Pseudomonas sp. N21，能高產(chǎn)吲哚乙酸（濃度高達(dá)49.78mg/L）、AAC脫氨酶、精氨酸脫羧酶、鐵載體，促進(jìn)植物生長(zhǎng)、防治植物病害；該菌株具有生長(zhǎng)速度快、菌株活性強(qiáng)、促生功能全面，促生效果穩(wěn)定等特性；由于該菌株具有高效的植物促生效應(yīng)，研制的生物有機(jī)肥可極大地減少由化肥所造成的環(huán)境污染和對(duì)人類健康的威脅，不僅可以提高土壤肥力、肥料利用率、農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量，而且促進(jìn)了農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。因此，本發(fā)明的假單胞菌植物促生菌株及其研制的生物有機(jī)肥具有廣闊的應(yīng)用前景及市場(chǎng)潛力。

附圖說(shuō)明

圖1為假單胞菌Pseudomonas sp. N21動(dòng)態(tài)生長(zhǎng)曲線圖；

圖2為假單胞菌Pseudomonas sp. N21在TSA固體平板上的生長(zhǎng)形態(tài)；

圖3為假單胞菌Pseudomonas sp. N21的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)圖；

圖4為假單胞菌Pseudomonas sp. N21解磷效果圖；

圖5為假單胞菌Pseudomonas sp. N21解鉀效果圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施對(duì)本發(fā)明的植物促生菌及生物有機(jī)肥的研發(fā)應(yīng)用進(jìn)一步的作詳細(xì)說(shuō)明。

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)的方法，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容的基礎(chǔ)上可以選擇本領(lǐng)域其他常用的方法來(lái)代替說(shuō)明書(shū)具體實(shí)施例中采用的方法。

實(shí)施例1 、假單胞菌Pseudomonas sp. N21的分離和篩選

1.1、取樣

從海南粉蕉根際土壤中進(jìn)行篩選，其土壤為濱海沙壤土，將粉蕉根際土壤裝入事先準(zhǔn)備好的干凈且滅過(guò)菌的牛皮紙袋中，并帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2、菌株初篩、純化

稱取1g根際土壤樣品，置于裝有9ml無(wú)菌水的試管中，震蕩均勻制成土壤菌懸液，將稀釋度為10^-4、10^-5、10^-6的土壤懸液涂布在TSA固體培養(yǎng)基(胰蛋白胨 1.2~1.5%，大豆蛋白胨0.5~0.8%，氯化鈉 0~0.5%，瓊脂粉 1.5~2.0%，蒸餾水 1L， pH 7.3±0.2。)上，倒置于生化培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)3天。隨機(jī)挑取平板上的菌落，在TSA固體培養(yǎng)基上進(jìn)行重復(fù)劃線分離純化，直至得到單一菌落。

1.3、植物促生指標(biāo)復(fù)篩

1.3.1、產(chǎn)吲哚乙酸的定性和定量測(cè)定

定性測(cè)定：將分離純化后的細(xì)菌接種于含有L‐色氨酸（200mg/L）的TSA液體培養(yǎng)基中，30℃，180r·min^‐1搖床培養(yǎng)24h。取50μL菌懸液滴于白色陶瓷板上，同時(shí)加50μLSalkowski比色液（50mL 35%HClO₄+1mL 0.5MFeCl₃）。對(duì)照組為：在50μLSalkowski比色液中加入50μL50mg/L吲哚乙酸作為陽(yáng)性對(duì)照。白色陶瓷板于室溫避光放置30min后觀察，顏色變紅者表示能夠分泌吲哚乙酸。

定量測(cè)定：對(duì)初篩獲得的分泌吲哚乙酸（IAA）的細(xì)菌進(jìn)行定量測(cè)定，培養(yǎng)條件同上。首先用分光光度法測(cè)定菌懸液的OD₅₃₀值，然后將菌懸液以8000r·min^‐1離心15min，取上清液加入等體積Salkowski比色液，避光靜置30min，測(cè)定其OD₅₃₀值。計(jì)算菌懸液OD₅₃₀值為1時(shí)，單位體積發(fā)酵液中吲哚乙酸的含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制采用分析純的吲哚乙酸梯度稀釋制備。

1.3.2、產(chǎn)ACC脫氨酶的定性測(cè)定

將菌株接入SMN 培養(yǎng)基中，28℃ 搖床培養(yǎng) 18 h，離心收集菌體，將菌體用SM培養(yǎng)基洗 2 次后等量(100 μL) 的分別接入 SM 液體培養(yǎng)基、SMA 液體培養(yǎng)基、SMN液體培養(yǎng)基 (3 mL)。28℃ 振蕩培養(yǎng) 48 h，用分光光度計(jì)比色法測(cè)定不同處理菌懸液的OD₆₀₀ 值，并進(jìn)行比較。在 SM 培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)，在 SMA 和SMN培養(yǎng)基中可以良好生長(zhǎng)的菌株具有ACC 脫氨酶活性。

SM培養(yǎng)基的配制：葡萄糖1.0 ~1.2g，蔗糖1.0 ~1.2g，檸檬酸鈉1.0 ~1.2g，蘋果酸1.0~1.2 g，甘露醇1.0~1.2 g，醋酸鈉 1.0 ~1.2g，KH₂PO₄ 0.4~0.6 g，K₂HPO₄ 1.5~2.0 g， MgSO₄ 0.2~0.5 g，CaCl₂ 0.1 ~0.2g，CuSO₄ 1.5~2 mg，NiSO₄ 1.5 ~2mg，ZnSO₄ 4~5 mg，F(xiàn)eSO₄ 4~5 mg，MnSO₄ 4~5 mg，CoSO₄ 2~3 mg，Na₂MoO₄2~3 mg，H₃BO₃ 4~5 mg，生物素2（VB₆）8~10 mg，硫胺（VB₁）1.5~2 mg，氰鈷維生素（VB₁₂） 0.1~0.2 mg，泛酸（VB₅）4~5mg，葉酸1~2 mg，核黃素4~5 mg，煙酸4~5 mg，蒸餾水1000 mL，pH 6.4±0.2。 維生素過(guò)濾除菌后加入。

SMA培養(yǎng)基的配制：在無(wú)菌的SM培養(yǎng)基中加入過(guò)濾除菌的ACC，使終濃度為 3mM。

SMN培養(yǎng)基的配制：在SM培養(yǎng)基中加入 0.2% 的 (NH₄)₂SO₄。

1.3.3、產(chǎn)精氨酸脫羧酶的定性測(cè)定

培養(yǎng)基配方為：蔗糖10g，(NH4)₂SO₄ 1g，K₂HPO₄ 2g，MgSO₄ .7H₂O 0.5 g，NaCl 0.1 g，酵母膏 0.1 g，維生素B₆ ( 吡哆醛 ) 5 mg，酚紅0.02g，蒸餾水1000 mL，準(zhǔn)確調(diào)節(jié)pH 6.0。以上培養(yǎng)基分為2份，1份加入L-精氨酸鹽酸鹽，使終濃度為1%，另一份不加L-精氨酸鹽酸鹽作為空白對(duì)照，分別分裝試管中，121℃滅菌10 min。將供試菌株分別接種于上述兩種培養(yǎng)基中，30℃ 培養(yǎng)3-5d，若對(duì)照管不變色，而測(cè)試管變?yōu)樽霞t色則為陽(yáng)性，兩管都不變色 ( 黃色 ) 則為陰性，兩管都變紅色則為假陽(yáng)性，篩選陽(yáng)性菌株作為供試菌株。

1.3.4、產(chǎn)鐵載體的定性測(cè)定

測(cè)定鐵載體所用器皿均需用6N HCl浸泡，進(jìn)行脫鐵處理。將供試菌株接種于有氮液體培養(yǎng)基中，搖床 30 ℃ 150 rpm振蕩培養(yǎng)48 h。發(fā)酵液12000 rpm離心5 min，取上清液與等體積CAS檢測(cè)液充分混勻，顯色1 h后測(cè)定630 nm波長(zhǎng)處的吸光值 ( A ) ，以去離子水作對(duì)照調(diào)零。對(duì)照組：不含菌株的有氮液體培養(yǎng)基與等體積的CAS檢測(cè)液充分混勻，同法測(cè)定吸光值即為參比值 ( Ar ) 。

CAS檢測(cè)液的配制：取10 mmol L^-1十六烷基三甲基溴化銨（HDTMA）溶液6.0 mL加入100 mL容量瓶?jī)?nèi)并用雙蒸水適度稀釋。將1.5 mL 1 mmol·L^-1 FeCl₃溶液與7.5 mL 2 mmol·L^-1鉻天青（CAS）溶液混勻后，轉(zhuǎn)入至上述容量瓶中。稱取4.307 g無(wú)水雙二甲胺（anhydrous piperazine）溶解于約30 mL雙蒸水中，再小心加入6.25 mL 12 mol·L^-1 HCl，即得pH=pKa=5.6緩沖液。將此緩沖液轉(zhuǎn)入前述容量瓶中，并用雙蒸水定容至100 mL。

通過(guò)上面的生物學(xué)特性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法發(fā)現(xiàn)，假單胞菌菌株N21能產(chǎn)生吲哚乙酸(IAA)、ACC脫氨酶、精氨酸脫羧酶和鐵載體等多個(gè)植物促生指標(biāo)，且吲哚乙酸(IAA)含量高達(dá)49.78mg/L，具有全面促進(jìn)植物生長(zhǎng)的特性，測(cè)定結(jié)果如表一所示：

。

1.4菌株動(dòng)態(tài)生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

1.4.1、菌株的發(fā)酵培養(yǎng)

從保存的斜面上挑取菌落于2mL 液體試管中活化，待菌株生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期時(shí)，重新轉(zhuǎn)接至新的2mL 液體試管中，以備擴(kuò)大培養(yǎng)時(shí)用。

1.4.2、菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將上述培養(yǎng)基所得種子液，以2.5% 的接種量接種于裝有TSA液體的三角瓶中，置于30℃，180r/min 的恒溫培養(yǎng)基中振蕩培育48h。分別在0、4、8、12、18、20、22、24、28、32、36、40、44、48h用分光光度儀測(cè)定其吸光度(A)，并繪制成生長(zhǎng)曲線，如圖1所示。

通過(guò)菌株的48h動(dòng)態(tài)生長(zhǎng)曲線可知，菌株N21很快進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)、緩慢進(jìn)入衰亡期，因此具有生長(zhǎng)快、生物量大、活性穩(wěn)定、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，當(dāng)與有機(jī)肥混合后能發(fā)揮更長(zhǎng)、更好、更穩(wěn)的作用。

實(shí)施例2 、假單胞菌Pseudomonas sp. N21的鑒定

對(duì)上述初篩、純化后得到的純培養(yǎng)菌株進(jìn)行一系列生理生化鑒定，同時(shí)提取菌株的DNA、擴(kuò)增16S rDNA序列和測(cè)序。

假單胞菌Pseudomonas sp. N21主要生物學(xué)性狀如下：

（1）菌體形態(tài)特征：革蘭氏染色陰性，呈短桿狀，無(wú)芽孢。

（2）菌落形態(tài)特征：在TSA瓊脂培養(yǎng)基上，菌落為圓形、呈米白色、凸起，菌落表面濕潤(rùn)、光滑（如圖2所示）。

（3）生理生化特征：好氧，過(guò)氧化氫酶、氧化酶、硝酸鹽還原、明膠、精氨酸雙水解酶和吲哚反應(yīng)陽(yáng)性；檸檬酸鹽、脲酶、H₂S反應(yīng)陰性，能同化D-半乳糖，D-葡糖醛酸，D-巖藻糖，不能同化葡萄糖，甘露糖醇，蔗糖。

（4）分子生物學(xué)特征：利用通用引物27F和1492R對(duì)假單胞菌N21的16SrDNA進(jìn)行擴(kuò)增，并對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，在NCBI上比對(duì)測(cè)序結(jié)果，鑒定結(jié)果為N21屬于假單胞菌屬( Pseudomonas sp)，將其命名為Pseudomonas sp. N21，其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系樹(shù)圖（NJ法構(gòu)建）見(jiàn)圖3。

實(shí)施例3 、假單胞菌Pseudomonas sp. N21解磷、解鉀活性測(cè)定

3.1、溶磷能力測(cè)定

溶磷量：將Pseudomonas sp. N21在LB液體培養(yǎng)基中30℃，180rpm過(guò)夜培養(yǎng)，用LB培養(yǎng)基將菌濃度稀釋至1×10⁸個(gè)/ml，以10％接種量接入無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基中。以接入10％ LB培養(yǎng)基作為對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)三個(gè)重復(fù)，30℃，180rpm在搖床上培養(yǎng)3天后，將發(fā)酵液12000 rpm離心5min，取上清，在波長(zhǎng)700nm下，采用鉬銻抗比色法測(cè)定可溶性磷含量。

具體方法如下：取發(fā)酵上清液200 uL于比色管中，加入10mL蒸餾水，加兩滴2,4 ( 或2,6 ) 二硝基苯酚顯色液，用4mol L^-1 NaOH (約0.5mL )調(diào)至溶液剛出現(xiàn)黃色為止，再加1 mol L^-1 H₂SO₄ 調(diào)至無(wú)色。加 2.5 mL 鉬銻抗試劑，定容至25 mL，搖勻，反應(yīng)30 min 后測(cè)定700 nm 處吸光值。

稱取105℃烘干至恒重的KH₂PO₄ 0.2195 g 溶于400 mL水中，加5 mL濃硫酸，定容至1 L，得50 mg L^-1的磷儲(chǔ)液，用時(shí)稀釋至5 mg L^-1 。以0、1、2、3、4、5 mL 5 mg.L^-1 的磷標(biāo)準(zhǔn)溶液于比色管中，加蒸餾水少許，其他步驟同上。以標(biāo)準(zhǔn)液的吸光值計(jì)算發(fā)酵上清液中的磷濃度。

菌株Pseudomonas sp. N21在無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)液中的溶磷量為225.1mg/L，溶磷能力較強(qiáng)(如圖4所示)。說(shuō)明Pseudomonas sp. N21能夠通過(guò)分泌有機(jī)酸和磷酸酶等物質(zhì)將難溶性磷酸鹽轉(zhuǎn)化為植物可以直接利用有效磷，從而促進(jìn)植物生長(zhǎng)。

3.2、解鉀能力測(cè)定

在BHm培養(yǎng)基中，以黑云母為唯一鉀源，在150 ml錐形瓶中，加入BHm培養(yǎng)基30 ml和過(guò)100-300 目的黑云母礦粉0.15 g，按照 2% 的接種量接入菌懸液，另以不接菌為空白對(duì)照，每組試驗(yàn)均設(shè)3個(gè)平行樣品。以150 r·min^-1，28 °C的條件進(jìn)行溶解試驗(yàn)。溶解試驗(yàn)進(jìn)行7 d，將發(fā)酵液離心取2 ml上清液，加等量的10% 硝酸定容至4 ml，采用等離子發(fā)生耦合光譜 (ICP-OES) 測(cè)定發(fā)酵液中鉀離子的含量，換算成稀釋前的含量。

BHm培養(yǎng)基的配置: 蔗糖10.0 g，Na₂HP0₄ 1.5g，(NH4)₂S0₄ 0.5 g，MgS0₄ 0.05g，NaCl 0.1 g，酵母膏0.1g，去離子水1000 ml， pH 7.2。

測(cè)定結(jié)果如圖5所示，Pseudomonas sp. N21相比對(duì)照不接菌處理，發(fā)酵液中的鉀離子增加了1.5倍，說(shuō)明該菌株具有較強(qiáng)的解鉀能力，能將土壤中不溶性鉀轉(zhuǎn)化為有效鉀，從而有助于植物對(duì)土壤中鉀的吸收。

實(shí)施例4 、假單胞菌植物促生菌株N21在盆栽試驗(yàn)中的實(shí)驗(yàn)應(yīng)用

具體方法如下：選取南通市海門臨江鎮(zhèn)農(nóng)田表層土 (0-20 cm) 土壤作為供試土壤，土壤理化性質(zhì)：pH6.8；有機(jī)質(zhì)8.12；總氮142mg/kg；總磷107mg/kg；總鉀14.31g/kg；速效氮147mg/kg；有效磷16.5mg/kg；有效鉀376mg/kg。將供試土壤在陰涼避光處晾干，過(guò)1mm篩，且每盆栽添加無(wú)機(jī)肥N：0.1g/kg、P：0.2g/kg、K：0.2g/kg。

供試植株采用小白菜（四季小白菜）。小白菜種子用75% 的無(wú)水乙醇：30% H₂O₂ ( V：V=1：1) 表面消毒后，表面蓋一層白紗布進(jìn)行催芽。選取萌芽一致的種子種入盆缽中，其中每盆裝土2Kg, 每盆播入種子5粒，播種一周后間苗，每盆留苗3株。之后進(jìn)行接菌處理，每盆接入制備好的菌懸液50 mL，對(duì)照接入等量的去離子水，使菌體數(shù)量達(dá)到10^⁶~10^⁷ cfu/g soil，每個(gè)處理三個(gè)重復(fù)。

試驗(yàn)在平均溫度為20-30 ℃ 的溫室中進(jìn)行，并進(jìn)行統(tǒng)一管理(每48h澆水30ml)，培養(yǎng)20天。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，記錄如下數(shù)據(jù)：小白菜高度、小白菜鮮重、小白菜干重、小白菜可溶性多糖含量，其統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表二所示：

。

上表統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，菌株Pseudomonas sp. N21具有較好的植物促生效果。與對(duì)照相比，接菌處理后小白菜株高增加13.57％、鮮重增加50.44％，干重增加44.12％，小白菜可溶性糖含量增加41.95%。綜上所述，菌株Pseudomonas sp. N21處理的小白菜植株株高、鮮重、干重和可溶性糖含量均顯著高于對(duì)照，促進(jìn)了植物生長(zhǎng)，是促生效果較好的植物促生細(xì)菌。

實(shí)施例5、含有功能微生物假單胞菌Pseudomonas sp. N21的生物有機(jī)肥的制備工藝

具體方法如下：將高效植物促生菌Pseudomonas sp. N21作為二次固態(tài)發(fā)酵的出發(fā)菌株，接種于以木薯酒糟厭氧污泥為原料的有機(jī)肥中（相關(guān)專利見(jiàn)201410086926.7 有機(jī)肥的制備方法）。經(jīng)過(guò)堆肥過(guò)程與功能性植物促生菌株的耦合發(fā)酵，實(shí)現(xiàn)功能性生物有機(jī)肥的有效復(fù)配，待均勻混合后，在陰涼處晾干，袋裝，即為具有多種功效為一體的生物肥料。這不僅提高了廢棄物的資源化與增值化，生產(chǎn)的生物有機(jī)肥更是提高了土壤肥力、減少了環(huán)境污染、促進(jìn)了農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

研發(fā)的生物有機(jī)肥，其養(yǎng)分含量與理化性質(zhì)為：總氮(N)：2.73%、磷(P₂O₅)：3.47、鉀(K₂O)：2.34%、總養(yǎng)分：8.5%、有機(jī)質(zhì)：55%、pH：8.5、水分：23%；有效活菌數(shù)為：5×10^⁹ cfu/g。

實(shí)施例6、研發(fā)的生物有機(jī)肥在小白菜大田中的應(yīng)用

具體方法如下：于2015年6月16日播種，6月21日出苗 (出苗率90%) ，至7月24日收獲，在中國(guó)江蘇省海門市進(jìn)行了為期一個(gè)多月時(shí)間的生物有機(jī)肥應(yīng)用大田試驗(yàn)，采用隨機(jī)區(qū)組的方式，每個(gè)處理設(shè)有三個(gè)重復(fù)。共設(shè)有兩種不同的處理試驗(yàn)：對(duì)照組（常規(guī)施肥：不施有機(jī)肥，復(fù)合肥 1200 Kg/hm²) 和生物有機(jī)肥料處理組(生物有機(jī)肥：300~350 Kg/hm² ，復(fù)合肥 1200 Kg/hm² )。每個(gè)試驗(yàn)組的面積是30.60 m²，播種前分別用施用總施肥量的70% 作基肥，用供肥量的50% 分2次等量追肥，分別于6月23日、7月11日傍晚施肥。

每個(gè)試驗(yàn)組隨機(jī)選取5株測(cè)定平均產(chǎn)量；用2,6-二氯酚靛酚滴定法測(cè)定Vc 含量；用高錳酸鉀滴定法測(cè)定還原糖含量；用粗纖維測(cè)定儀測(cè)定粗纖維含量，測(cè)定葉位為第9葉。測(cè)定結(jié)果如下表三所示：

。

試驗(yàn)結(jié)果表明，添加含有高效植物促生菌Pseudomonas sp. N21的生物有機(jī)肥的處理組，其小白菜的產(chǎn)量顯著高于對(duì)照組，小白菜產(chǎn)量提高了29.13％，小白菜的維生素C的含量提高了47.94％(提高了品質(zhì))，小白菜的還原糖的含量增加了60.33%(提高了營(yíng)養(yǎng)價(jià)值)，粗纖維含量降低了22.55%（增加了口感)。大田試驗(yàn)結(jié)果表明菌株Pseudomonas sp. N21在生物有機(jī)肥的研制方面有著廣闊的應(yīng)用前景和經(jīng)濟(jì)效益。