本發(fā)明涉及有機(jī)污染物的處理技術(shù)領(lǐng)域，且特別涉及一種用于降解2，4，6-三氯苯酚的菌株及其篩選分離方法。

背景技術(shù)：

氯酚是用于非農(nóng)業(yè)殺蟲(chóng)用的氯代碳?xì)浠衔?、殺蟲(chóng)劑或抗微生物的一類(lèi)試劑，氯酚對(duì)人體產(chǎn)生毒害作用的濃度閾值為40ppm，對(duì)魚(yú)類(lèi)產(chǎn)生毒害作用的閾值僅為1ppm，因此，氯酚極易導(dǎo)致水體的污染，還被美國(guó)EPA列為優(yōu)先污染物以及中國(guó)關(guān)鍵污染物。

目前對(duì)氯酚類(lèi)物質(zhì)的處理方法主要有超濾法、化學(xué)沉淀法、生物法，其中超濾法和化學(xué)沉淀法存在能耗大、成本高、藥劑投加易造成二次污染的缺點(diǎn)，生物處理技術(shù)成為降解氯酚這種難降解有機(jī)物的較佳選擇，主要存在以下三種降解處理氯酚類(lèi)物質(zhì)的生物：

人們已經(jīng)利用生物反應(yīng)器馴化和培養(yǎng)出具有降解氯酚功能的厭氧污泥，但是該方法馴化周期較長(zhǎng)，而且得到的厭氧污泥并非純種氯酚降解菌，也沒(méi)有經(jīng)過(guò)初篩和復(fù)篩，純度較低，因此這種厭氧污泥對(duì)氯酚的降解處理效果不穩(wěn)定。

同時(shí)，國(guó)內(nèi)外關(guān)于氯酚生物降解的報(bào)道較多，分離得到多種具有氯酚降解效率的細(xì)菌，主要有假單胞菌(Psendomonas sp.)、芽孢桿菌(Bacillus sp)、脫鹵脫亞硫酸菌(Desulfitobacterium sp.)、貪銅菌(Cupriavidus sp.)、放線菌(Actinobacteria sp.)等微生物菌，尤其是假單胞菌降解氯酚類(lèi)有機(jī)物的研究報(bào)道較多。但這些微生物菌對(duì)氯酚的耐受濃度普遍較低，且大多需要在好氧條件下降解氯酚類(lèi)物質(zhì)，對(duì)苯酚的降解處理效果依然較差。

申請(qǐng)?zhí)枮?01410853541.9的中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利公開(kāi)了一種造紙廢水污灌葦田中典型細(xì)菌——紡錘形賴(lài)氨酸芽孢桿菌的篩選及其用途，該細(xì)菌能在污灌葦田造紙廢水中生存并有良好的需氧量CODcr和可吸收鹵化物(Absorbable Organic Halogen，AOX)的降解效率，可作為優(yōu)勢(shì)降解污灌葦田造紙廢水的兼性好氧耐堿細(xì)菌。該菌株經(jīng)生理生化特性及16SrDNA分析鑒定為L(zhǎng)ysinibacillus屬的菌株，命名為L(zhǎng)ysinibacillusWTXJ1-4；該菌已提交至中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏號(hào)為CGMCCNo.10053。

綜上所述，紡錘形賴(lài)氨酸芽孢桿菌在厭氧條件下通過(guò)還原脫氯降解氯酚類(lèi)有機(jī)物，降解效果好，但是目前關(guān)于該菌株的篩選方法篩選得到的紡錘形賴(lài)氨酸芽孢桿菌純度較低，產(chǎn)量也較低，無(wú)法滿(mǎn)足對(duì)氯酚類(lèi)物質(zhì)的大規(guī)模處理需求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種用于降解2，4，6-三氯苯酚的菌株的篩選分離方法，方法簡(jiǎn)單，得到的紡錘形賴(lài)氨酸芽孢桿菌的純度較高，產(chǎn)量也高。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種用于降解2，4，6-三氯苯酚的菌株及，此菌株可在厭氧條件下通過(guò)還原脫氯降解氯酚類(lèi)有機(jī)物，降解效果好。

本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題是采用以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

本發(fā)明提出一種用于降解2，4，6-三氯苯酚的菌株的篩選分離方法，其包括以下步驟：

馴化：采集用于處理造紙廢水的內(nèi)循環(huán)厭氧反應(yīng)器中的活性污泥，取相同體積的活性污泥和馴化培養(yǎng)基組成馴化體系，調(diào)節(jié)馴化體系的pH為7.0-7.2，將調(diào)節(jié)pH后的馴化體系在厭氧環(huán)境中，于30-40℃，在添加有2，4，6-三氯苯酚的固體培養(yǎng)基中進(jìn)行富集馴化，直至馴化后的固體培養(yǎng)基中2，4，6-三氯苯酚的濃度達(dá)到800mg/L以上，得到馴化污泥；

純化：將馴化污泥稀釋成不同濃度的多個(gè)稀釋液，將多個(gè)稀釋液分別接種于添加有8-12mg/L的2，4，6-三氯苯酚的固體篩選培養(yǎng)基中，分離得到多種對(duì)2，4，6-三氯酚具有降解能力的純化菌株；

篩選：將多種純化菌株分別接種于添加有90-110mg/L的2，4，6-三氯苯酚的降解培養(yǎng)基中，篩選得到對(duì)2，4，6-三氯苯酚的降解效率最高的純化菌株，即為用于降解2，4，6-三氯苯酚的菌株。

進(jìn)一步地，在本發(fā)明較佳實(shí)施例中，馴化培養(yǎng)基的組分包括：1.73g/L的K₂HPO₄，1.0g/L的NH₄Cl，0.1g/L的MgSO₄·7H₂O，0.02g/L的CaCl₂，0.04g/L的MnCl₂·4H₂O，0.05g/L的FeCl₃·6H₂O，5ml的微量元素溶液，余量為無(wú)菌蒸餾水，調(diào)節(jié)pH為7.0-7.2；固體篩選培養(yǎng)基是在馴化培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加有15-20g/L的瓊脂；降解培養(yǎng)基的組分與馴化培養(yǎng)基的組分相同。

進(jìn)一步地，在本發(fā)明較佳實(shí)施例中，實(shí)現(xiàn)厭氧環(huán)境的方法是：將調(diào)節(jié)pH后的馴化體系添加至馴化培養(yǎng)瓶中，向馴化培養(yǎng)瓶中充滿(mǎn)氮?dú)?，再用帶?dǎo)氣管的橡膠塞密封馴化培養(yǎng)瓶的瓶口，使導(dǎo)氣管位于瓶?jī)?nèi)的一端插入馴化體系內(nèi)，導(dǎo)氣管位于瓶外的一端插入氫氧化鈉溶液中進(jìn)行液封。

進(jìn)一步地，在本發(fā)明較佳實(shí)施例中，進(jìn)行富集馴化的方法是：

將馴化體系置于厭氧生化培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，將培養(yǎng)物按10％的接種量轉(zhuǎn)移至添加有50mg/L的2，4，6-三氯苯酚的固體培養(yǎng)基中，并放回厭氧生化培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，即為一個(gè)周期；

將繼續(xù)培養(yǎng)的培養(yǎng)物再連續(xù)培養(yǎng)多個(gè)周期，逐步增加對(duì)應(yīng)周期內(nèi)的固體培養(yǎng)基中2，4，6-三氯苯酚的濃度；

在上述培養(yǎng)過(guò)程中定時(shí)取樣，測(cè)定取得的樣品中2，4，6-三氯苯酚的濃度，直至樣品中2，4，6-三氯苯酚的濃度達(dá)到800mg/L以上，樣品對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)物為馴化污泥。

進(jìn)一步地，在本發(fā)明較佳實(shí)施例中，固體培養(yǎng)基的組分包括：5g/L的牛肉膏，10g/L的蛋白胨，5g/L的NaCl，20g/L的瓊脂，余量為水，調(diào)節(jié)pH為7.0，于121℃高壓濕熱滅菌20min。

進(jìn)一步地，在本發(fā)明較佳實(shí)施例中，純化的具體方法為：

將馴化污泥振蕩均勻，依次取1mL振蕩后的馴化污泥，按梯度稀釋成濃度為10^-5的稀釋液、濃度為10^-6的稀釋液、濃度為10^-7的稀釋液，分別取0.1mL濃度為10^-5的稀釋液、濃度為10^-6的稀釋液和濃度為10^-7的稀釋液，接種到載有固體篩選培養(yǎng)基的平板上，用涂布棒將稀釋液涂布均勻；

將平板置于厭氧生化培養(yǎng)箱中，于35℃下恒溫培養(yǎng)，待平板上長(zhǎng)出菌落后，挑選生長(zhǎng)良好的菌落，用平板劃線分離法在另一潔凈平板上接種劃線，將潔凈平板置于厭氧生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，即完成一次平板劃線分離；

重復(fù)進(jìn)行多次平板劃線分離，直到分離獲得多種具有2，4，6-三氯苯酚降解能力的培養(yǎng)菌株，將多種培養(yǎng)菌株放入-70℃的超低溫冰箱中保存。

進(jìn)一步地，在本發(fā)明較佳實(shí)施例中，篩選的具體方法為：分別將多種培養(yǎng)菌株配制成菌懸液，將菌懸液分別接種至降解培養(yǎng)基中，分別檢測(cè)接種后的降解培養(yǎng)基中2，4，6-三氯苯酚的濃度，對(duì)2，4，6-三氯苯酚的降解效率最高的培養(yǎng)菌株，即為用于降解2，4，6-三氯苯酚的菌株。

進(jìn)一步地，在本發(fā)明較佳實(shí)施例中，將菌懸液接種至降解培養(yǎng)液的方法為：分別吸取10mL的菌懸液添加有到190mL的添加有90-110mg/L的2，4，6-三氯苯酚的降解培養(yǎng)基中，于35℃恒溫培養(yǎng)5天。

進(jìn)一步地，在本發(fā)明較佳實(shí)施例中，菌懸液的配制方法為：從固體篩選培養(yǎng)基上挑取純化菌種接種到活化富集培養(yǎng)基里，于35℃下恒溫培養(yǎng)24h，將培養(yǎng)液離心10min，倒出離心后的上層液，收集其中的菌體，用無(wú)菌水反復(fù)洗滌3次后，用無(wú)菌水配制成菌懸液，其中，活化富集培養(yǎng)基的組分包括：5g/L的牛肉膏，10g/L的蛋白胨，5g/L的NaCl，余量為水，調(diào)節(jié)pH為7.0，于121℃高壓濕熱滅菌20min。

一種用于降解2，4，6-三氯苯酚的菌株，采用上述的篩選分離方法得到。

本發(fā)明實(shí)施例的用于降解2，4，6-三氯苯酚的菌株及其篩選分離方法的有益效果是：本方法是通過(guò)采集用于處理造紙廢水的內(nèi)循環(huán)厭氧反應(yīng)器中的活性污泥，在嚴(yán)格厭氧環(huán)境中進(jìn)行富集馴化，然后將馴化污泥按稀釋梯度分別接種于添加有8-12mg/L的2，4，6-三氯苯酚的固體篩選培養(yǎng)基中，分離得到多種對(duì)2，4，6-三氯酚具有降解能力的純化菌株；最后將多種所述純化菌株分別接種于添加有90-110mg/L的2，4，6-三氯苯酚的降解培養(yǎng)基中，篩選得到對(duì)2，4，6-三氯苯酚的降解效率最高的菌株。該方法簡(jiǎn)單，得到的紡錘形賴(lài)氨酸芽孢桿菌的純度較高，產(chǎn)量也高，此菌株可在厭氧條件下通過(guò)還原脫氯降解氯酚類(lèi)有機(jī)物，降解效果好。

附圖說(shuō)明

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，應(yīng)當(dāng)理解，以下附圖僅示出了本發(fā)明的某些實(shí)施例，因此不應(yīng)被看作是對(duì)范圍的限定，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他相關(guān)的附圖。

圖1為本發(fā)明實(shí)施例中不同濃度的菌種以及對(duì)2，4，6-三氯苯酚的降解率的線性關(guān)系圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例不同接種量的菌種以及對(duì)土壤中2，4，6-三氯苯酚的降解率的線性關(guān)系圖。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市售購(gòu)買(mǎi)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

下面對(duì)本發(fā)明實(shí)施例的用于降解2，4，6-三氯苯酚的菌株及其篩選分離方法進(jìn)行具體說(shuō)明。

本發(fā)明實(shí)施例提供一種用于降解2，4，6-三氯苯酚的菌株的篩選分離方法，其包括以下步驟：

S1馴化：采集用于處理造紙廢水的內(nèi)循環(huán)厭氧反應(yīng)器中的活性污泥，取相同體積的活性污泥和馴化培養(yǎng)基組成馴化體系，調(diào)節(jié)馴化體系的pH為7.0-7.2，將調(diào)節(jié)pH后的馴化體系在嚴(yán)格厭氧環(huán)境中，于30-40℃，在添加有2，4，6-三氯苯酚的固體培養(yǎng)基中進(jìn)行富集馴化，直至馴化后的固體培養(yǎng)基中2，4，6-三氯苯酚的濃度達(dá)到800mg/L以上，得到馴化污泥，富集是從大量母體物質(zhì)中搜集欲測(cè)定的痕量元素至一較小體積，從而提高其含量至測(cè)定下限以上的這一操作步驟。馴化是在細(xì)菌培養(yǎng)基中循序漸進(jìn)的加入靶向環(huán)境的材料或基質(zhì)，讓細(xì)菌逐漸適應(yīng)并依賴(lài)靶向環(huán)境的材料或基質(zhì)，從而達(dá)到改善或改變環(huán)境中的有效成分。

其中，馴化培養(yǎng)基的組分包括：1.73g/L的K₂HPO₄，1.0g/L的NH4Cl，0.1g/L的MgSO₄·7H₂O，0.02g/L的CaCl₂，0.04g/L的MnCl₂·4H₂O，0.05g/L的FeCl₃·6H₂O，5ml的微量元素溶液，余量為無(wú)菌蒸餾水，調(diào)節(jié)pH為7.0-7.2。

固體培養(yǎng)基的組分包括：5g/L的牛肉膏，10g/L的蛋白胨，5g/L的NaCl，20g/L的瓊脂，余量為水，調(diào)節(jié)pH為7.0，于121℃高壓濕熱滅菌20min。

上述步驟中，內(nèi)循環(huán)厭氧反應(yīng)器包括由下而上排布的混合區(qū)、第一厭氧區(qū)、第二厭氧區(qū)、沉淀區(qū)和氣液分離區(qū)，活性污泥取自于第一厭氧區(qū)。

實(shí)現(xiàn)嚴(yán)格厭氧環(huán)境的具體方法是：將調(diào)節(jié)pH后的馴化體系添加有至馴化培養(yǎng)瓶中，向馴化培養(yǎng)瓶中充滿(mǎn)氮?dú)猓儆脦?dǎo)氣管的橡膠塞密封馴化培養(yǎng)瓶的瓶口，使導(dǎo)氣管位于瓶?jī)?nèi)的一端插入馴化體系內(nèi)，導(dǎo)氣管位于瓶外的一端插入氫氧化鈉溶液中進(jìn)行液封。

上述步驟中進(jìn)行富集馴化的具體方法是：

將馴化體系置于厭氧生化培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，將培養(yǎng)物按10％的接種量轉(zhuǎn)移至添加有50mg/L的2，4，6-三氯苯酚的固體培養(yǎng)基中，并放回厭氧生化培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，上述過(guò)程為一個(gè)周期。

將繼續(xù)培養(yǎng)的培養(yǎng)物再連續(xù)培養(yǎng)多個(gè)周期，逐步增加對(duì)應(yīng)周期內(nèi)的固體培養(yǎng)基中2，4，6-三氯苯酚的濃度。

在上述培養(yǎng)過(guò)程中定時(shí)取樣，測(cè)定取得的樣品中2，4，6-三氯苯酚的濃度，直至樣品中2，4，6-三氯苯酚的濃度達(dá)到800mg/L以上，樣品對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)物為馴化污泥。

S2純化：將馴化污泥按稀釋梯度分別接種于添加有8-12mg/L的2，4，6-三氯苯酚的固體篩選培養(yǎng)基中，分離得到多種對(duì)2，4，6-三氯酚具有降解能力的純化菌株。其中，固體篩選培養(yǎng)基是在馴化培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加有15-20g/L的瓊脂，固體篩選培養(yǎng)基的組分包括：15-20g/L的瓊脂，1.73g/L的K₂HPO₄，1.0g/L的NH4Cl，0.1g/L的MgSO₄·7H₂O，0.02g/L的CaCl₂，0.04g/L的MnCl₂·4H₂O，0.05g/L的FeCl₃·6H₂O，5ml的微量元素溶液，余量為無(wú)菌蒸餾水，調(diào)節(jié)pH為7.0-7.2。

上述純化的具體方法為：

將馴化污泥振蕩均勻，依次取1mL振蕩后的馴化污泥，按梯度稀釋成濃度為10^-3的稀釋液、濃度為10^-4的稀釋液、濃度為10^-5的稀釋液、濃度為10^-6的稀釋液、濃度為10^-7的稀釋液，分別取0.1mL濃度為10^-5的稀釋液、濃度為10^-6的稀釋液和濃度為10^-7的稀釋液，接種到載有固體篩選培養(yǎng)基的平板上，用涂布棒將稀釋液涂布均勻。

將平板置于厭氧生化培養(yǎng)箱中，于35℃下恒溫培養(yǎng)，待平板上長(zhǎng)出菌落后，挑選生長(zhǎng)良好的菌落，用平板劃線分離法在另一潔凈平板上接種劃線，將潔凈平板置于厭氧生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，即完成一次平板劃線分離。

重復(fù)進(jìn)行多次平板劃線分離，直到分離獲得多種具有2，4，6-三氯苯酚降解能力的培養(yǎng)菌株，將多種培養(yǎng)菌株放入-70℃的超低溫冰箱中保存。

S3篩選：將多種純化菌株分別接種于添加有90-110mg/L的2，4，6-三氯苯酚的降解培養(yǎng)基中，篩選得到對(duì)2，4，6-三氯苯酚的降解效率最高的所述純化菌株，即為用于降解2，4，6-三氯苯酚的菌株。其中，降解培養(yǎng)基的組分與馴化培養(yǎng)基的組分相同。降解培養(yǎng)基的組分包括：1.73g/L的K₂HPO₄，1.0g/L的NH4Cl，0.1g/L的MgSO₄·7H₂O，0.02g/L的CaCl₂，0.04g/L的MnCl₂·4H₂O，0.05g/L的FeCl₃·6H₂O，5ml的微量元素溶液，余量為無(wú)菌蒸餾水，調(diào)節(jié)pH為7.0-7.2。

上述篩選的具體方法為：分別將多種培養(yǎng)菌株配制成菌懸液，將菌懸液分別接種至降解培養(yǎng)基中，分別用高效液相色譜檢測(cè)接種后的降解培養(yǎng)基中2，4，6-三氯苯酚的濃度，2，4，6-三氯苯酚的降解效率最高的降解培養(yǎng)基中的培養(yǎng)菌株即為用于降解2，4，6-三氯苯酚的菌株。

菌懸液的配制方法為：從固體篩選培養(yǎng)基上挑取純化菌種接種到活化富集培養(yǎng)基里，于35℃下恒溫培養(yǎng)24h，將培養(yǎng)液離心10min，倒出離心后的上層液，收集其中的菌體，用無(wú)菌水反復(fù)洗滌3次后，用無(wú)菌水配制成菌懸液，其中，活化富集培養(yǎng)基的組分包括：5g/L的牛肉膏，10g/L的蛋白胨，5g/L的NaCl，余量為水，調(diào)節(jié)pH為7.0，于121℃高壓濕熱滅菌20min。

將菌懸液接種至降解培養(yǎng)液的方法為：分別吸取10mL的菌懸液添加有到190mL的添加有90-110mg/L的2，4，6-三氯苯酚的降解培養(yǎng)基中，于35℃恒溫培養(yǎng)5天。

本發(fā)明實(shí)施例還提供一種用于降解2，4，6-三氯苯酚的菌株，采用上述的篩選分離方法得到。

以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的特征和性能作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

實(shí)施例1

采集某造紙廠用于處理造紙廢水的內(nèi)循環(huán)厭氧反應(yīng)器中的活性污泥，量取1L半流體狀的活性污泥加入至馴化培養(yǎng)瓶中，再加入1L馴化培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH至7.0，將調(diào)節(jié)pH后的馴化體系在嚴(yán)格厭氧環(huán)境中，于30℃下進(jìn)行富集馴化，直至馴化后的馴化體系中的2，4，6-三氯苯酚的濃度達(dá)到800mg/L，得到馴化污泥。

將馴化污泥按稀釋梯度分別接種于添加有8mg/L的2，4，6-三氯苯酚的固體篩選培養(yǎng)基中，分離得到3種對(duì)2，4，6-三氯酚具有降解能力的純化菌株：A1、A2、A3。

將純化菌株A1、A2、A3分別接種于添加有90mg/L的2，4，6-三氯苯酚的降解培養(yǎng)基中，經(jīng)檢測(cè)，純化菌株A1對(duì)2，4，6-三氯苯酚的降解效率最高，純化菌株A1即為用于降解2，4，6-三氯苯酚的菌株。

實(shí)施例2

采集某造紙廠用于處理造紙廢水的內(nèi)循環(huán)厭氧反應(yīng)器中的活性污泥，量取1L半流體狀的活性污泥加入至馴化培養(yǎng)瓶中，再加入1L馴化培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH至7.2，將調(diào)節(jié)pH后的馴化體系在嚴(yán)格厭氧環(huán)境中，于40℃下進(jìn)行富集馴化，直至馴化后的馴化體系中的2，4，6-三氯苯酚的濃度達(dá)到800mg/L，得到馴化污泥。

將馴化污泥按稀釋梯度分別接種于添加有12mg/L的2，4，6-三氯苯酚的固體篩選培養(yǎng)基中，分離得到5種對(duì)2，4，6-三氯酚具有降解能力的純化菌株：C1、C2、C3、C4、C5。

將純化菌株C1、C2、C3、C4、C5分別接種于添加有110mg/L的2，4，6-三氯苯酚的降解培養(yǎng)基中，經(jīng)檢測(cè)，純化菌株C2對(duì)2，4，6-三氯苯酚的降解效率最高，純化菌株C2即為用于降解2，4，6-三氯苯酚的菌株。

實(shí)施例3

采集某造紙廠廢水內(nèi)循環(huán)厭氧處理反應(yīng)器中活性污泥，量取1L半流體狀的活性污泥加入至馴化培養(yǎng)瓶中，再加入1L馴化培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH至7.0。向馴化培養(yǎng)瓶中充滿(mǎn)氮?dú)?，再用帶?dǎo)氣管的橡膠塞密封馴化培養(yǎng)瓶的瓶口，使導(dǎo)氣管位于瓶?jī)?nèi)的一端插入馴化體系內(nèi)，導(dǎo)氣管位于瓶外的一端插入氫氧化鈉溶液中進(jìn)行液封。將整套馴化裝置置于厭氧生化培養(yǎng)箱中于30-40℃下進(jìn)行培養(yǎng)。將培養(yǎng)物按10％的接種量轉(zhuǎn)移至添加有50mg/L的2，4，6-三氯苯酚的固體培養(yǎng)基中，并放回厭氧生化培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，按相同做法逐步增加固體培養(yǎng)基中2，4，6-三氯苯酚的濃度，連續(xù)培養(yǎng)幾個(gè)周期，馴化培養(yǎng)過(guò)程中，定時(shí)取樣測(cè)定馴化樣品中2，4，6-三氯苯酚的殘留濃度，直至2，4，6-三氯苯酚達(dá)到800mg/L，該樣品對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)物為馴化污泥。

將馴化污泥振蕩均勻，依次取1mL振蕩后的馴化污泥，按梯度稀釋成濃度為10^-3的稀釋液、濃度為10^-4的稀釋液、濃度為10^-5的稀釋液、濃度為10^-6的稀釋液、濃度為10^-7的稀釋液，分別取0.1mL濃度為10^-5的稀釋液、濃度為10^-6的稀釋液和濃度為10^-7的稀釋液，接種到載有固體篩選培養(yǎng)基的平板上，用涂布棒將稀釋液涂布均勻。將平板置于厭氧生化培養(yǎng)箱中，于35℃下恒溫培養(yǎng)，待平板上長(zhǎng)出菌落后，挑選生長(zhǎng)良好的菌落，用平板劃線分離法在另一潔凈平板上接種劃線，重復(fù)多次平板劃線分離，直到分離獲得4種純化菌株分別為B1、H1、DH-1和1-4，將這4種純化菌株放入-70℃的超低溫冰箱中。

從固體培養(yǎng)基上挑取純化菌種接種到活化富集培養(yǎng)基里，于35℃下恒溫培養(yǎng)24h，將培養(yǎng)液離心10min，倒出離心后的上層液，收集其中的菌體，用無(wú)菌水反復(fù)洗滌3次后，用無(wú)菌水配制成菌懸液，然后分別吸取10mL菌懸液加入到190mL添加有100mg/L的2，4，6-三氯苯酚的降解培養(yǎng)基中，于35℃恒溫培養(yǎng)5天，用高效液相色譜測(cè)定溶液中2，4，6-三氯苯酚的濃度，4種菌種對(duì)降解培養(yǎng)基中的2，4，6-三氯苯酚的降解率如表1所示，

由上表可以看出，純化菌株1-4對(duì)2，4，6-三氯苯酚接降解效率最高，因此，純化菌株1-4即為用于降解2，4，6-三氯苯酚的菌株。

以下對(duì)實(shí)施例2得到的用于降解2，4，6-三氯苯酚的菌株的生理特征進(jìn)行檢測(cè)。

1、形態(tài)特征

(1)菌落形態(tài)特征：白色，不透明，邊緣整齊，圓形，表面光滑且略隆起。

(2)菌體細(xì)胞形態(tài)特征：該菌為革蘭氏陽(yáng)性菌。

2、菌株的16S rRNA序列分析：

試驗(yàn)菌株16S rRNA的PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定：將提取的DNA作為擴(kuò)增模板。16SrRNA擴(kuò)增的PCR反應(yīng)所用的正向引物Pf：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向引物Pr：5′-GGTTACCTTGTTACGA CTT-3′，分別對(duì)應(yīng)于菌的16S rRNA基因的8-27和1492-1510堿基。

PCR反應(yīng)體系(50μL)為：模板2μL，dNTP(25mmol/L)5μL，引物(1mmol/L)各1μL，10×PCR緩沖液5μL，Mg2+(25mmol/L)4μL，Taq酶(5U/μL)0.4μL，超純水31.6μL。

PCR反應(yīng)條件：94℃，4min；94℃，1min；54℃，1min；72℃1.5min，循環(huán)30次；72℃延伸7min。16S rRNA擴(kuò)增和序列測(cè)定由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成，得到的測(cè)序結(jié)果已上傳至Genbank(登錄號(hào)為KP150574)。用Blast搜索程序從GeneBank中調(diào)出相似性較高的相關(guān)菌株的16S rRNA基因序列，用CLUSTAL1.8進(jìn)行多序列比對(duì)，根據(jù)Kimura 2-parameter模型估算系統(tǒng)進(jìn)化距離矩陣，用MEGA3.0軟件包采用鄰接法(Neighbor-Joining)進(jìn)行聚類(lèi)分析，最終確定該菌株(純化菌種1-4)為錘形賴(lài)氨酸芽孢桿菌Lysinibacillus fusiformis WTXJ1-4(CGMCC保藏號(hào)：No.10053)。

3、菌株對(duì)2，4，6-三氯苯酚的降解效果

配制一系列含不同濃度2，4，6-三氯苯酚的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH為7.0；取10mL配制好的菌懸液加入到190mL無(wú)機(jī)鹽中，其含2，4，6-三氯苯酚的濃度分別為50、100、200、400、600mg/L；然后將加有菌懸液的無(wú)機(jī)鹽在35℃，于厭氧條件下培養(yǎng)，定期取樣檢測(cè)，每個(gè)樣品設(shè)2個(gè)重復(fù)，并以不加菌種的無(wú)機(jī)鹽作空白對(duì)照，不同濃度的菌種對(duì)2，4，6-三氯苯酚的降解率的結(jié)果如圖1。

由圖1可知，2，4，6-三氯苯酚的初始濃度對(duì)菌株的降解性能有極大影響：2，4，6-三氯苯酚在50-600mg/L之間時(shí)，其降解率均不到60％，尤其在高濃度時(shí)，如600mg/L，2，4，6-三氯苯酚的降解率還不到5％。在2，4，6-三氯苯酚濃度為50mg/L，更有利于2，4，6-三氯苯酚的降解，降解率達(dá)到60％。

3、菌株對(duì)土壤中2，4，6-三氯苯酚的降解效果

稱(chēng)取一系列20g土壤于250mL錐形瓶中，加入0、2、4mL的1％(每100mL水含1g菌株)的菌懸液，瓶口用棉塞塞緊，于35℃恒溫箱中厭氧培養(yǎng)，土壤中2，4，6-三氯苯酚的污染濃度為50mg/kg，始終土壤的保持含水量為飽和含水量的60％，并每天加水維持恒重，在第0、5、10、20、30、40天取樣分析，不同接種量的菌種對(duì)土壤中2，4，6-三氯苯酚的降解率如圖2所示。

由圖2可知，加入4mL的菌懸液對(duì)土壤中2，4，6-三氯苯酚的降解率最大，可達(dá)到60％。

綜上所述，本發(fā)明實(shí)施例的用于降解2，4，6-三氯苯酚的菌株及其篩選分離方法，該方法簡(jiǎn)單，得到的紡錘形賴(lài)氨酸芽孢桿菌的純度較高，產(chǎn)量也高，此菌株可在厭氧條件下通過(guò)還原脫氯降解氯酚類(lèi)有機(jī)物，降解效果好。

以上所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。本發(fā)明的實(shí)施例的詳細(xì)描述并非旨在限制要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍，而是僅僅表示本發(fā)明的選定實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。