本發(fā)明屬于藥物化學領域，具體涉及一類黃嘌呤衍生物及其制備方法，以及該類化合物作為二肽基肽酶IV(DPP-IV)抑制劑的用途。
背景技術：
：糖尿病是一種多病因的代謝疾病，其特點是慢性高血糖，伴隨因胰島素分泌及/或作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂。糖尿病也是一種非常古老的疾病，是由于人體內(nèi)胰島素相對或絕對缺乏而引起的血中葡萄糖濃度升高，導致糖大量從尿中排出，并伴隨多飲、多尿、多食、消瘦、頭暈、乏力等癥狀。在糖尿病治療中，運動療法和飲食療法是兩種必不可少的糖尿病治療方法。當這兩種療法不足以控制病情時，可以使用胰島素或者口服降糖藥。但由于這些降糖藥物存在很多副作用，開發(fā)出一種新型的、低副作用且能夠有效治療糖尿病的藥物尤為重要。二肽基肽酶IV(DPP-IV)是一種絲氨酸蛋白酶，它可以在次末端含有一個脯氨酸殘基的肽鏈里裂解N-末端二肽酶，盡管DPP-IV對哺乳動物的生理作用還沒有得到完全的證實，但其在神經(jīng)酶代謝，T-細胞激活，癌細胞轉(zhuǎn)移入內(nèi)皮以及HIV病毒進入淋巴樣細胞過程中都起到非常重要的作用(WO98/19998)。有研究表明DPP-IV可以阻止胰升糖素樣肽(GLP)-1的分泌，裂解(GLP)-1中N-末端的組-丙二肽酶，使其從活性形式的(GLP)-1降解(Endocrinology，1999，140：5356-5363)。在生理情況下，循環(huán)血中完整(GLP)-1的半衰期很短，而DPP-IV抑制劑能完全保護內(nèi)源性甚至外源性的(GLP)-1不被DPP-IV滅活，極大的提高(GLP)-1的生理活性(5-10倍)，由于(GLP)-1對胰腺胰島素的分泌是一個重要的刺激器并能直接影響葡萄糖的分配，因此DPP-IV抑制劑對非胰島素依賴型糖尿病例的治療起到很好的作用(US6110949)。目前已上市的DPP-IV抑制劑有西格列汀、維格列汀、沙格列汀、阿格列汀以及利格列汀等。其中，利格列汀在肝腎功能損害方面更小。利格列汀結(jié)構(gòu)式如下：據(jù)在利格列汀給FDA的報道中公開利格列汀在鼠以及人體內(nèi)的生物利用度不高(CD-1mouse，5mg/kg，F(xiàn)＝18.4％；man，5mg/subject，F(xiàn)＝30％)，因此，提供一種替代利格列汀的化合物是急需解決的問題。技術實現(xiàn)要素：為了解決上述問題，本發(fā)明是在利格列汀的基礎上，對其進行結(jié)構(gòu)改造，以期獲得安全、活性更高的、生物利用度更好的化合物。本發(fā)明提供了一類具有抑制DPP-IV活性并且可用于DPP-IV相關疾病的治療或緩解性藥物的化合物。利格列汀是已上市的DPP-IV抑制劑中活性最高、肝腎毒性最小的藥品，由本發(fā)明方法得到的化合物具有和利格列汀相近的活性，尤其是化合物I-3的活性比利格列汀更好，將來可以更好的治療DPP-IV相關的疾病(如糖尿病、高糖血癥、肥胖癥、或胰島素抵抗)。具體來說，本發(fā)明提供一種如式I所示的黃嘌呤衍生物及其溶劑合物，或它們藥學上可接受的鹽，其中，R選自：R1選自氰基或甲氧羰基；R2選自氫、鹵素原子，直鏈或支鏈的被1～5個鹵素原子取代或未被取代的C1-6烷基、直鏈或支鏈的被1～5個鹵素原子取代或未被取代的C1-6烷氧基；X、Y分別獨立的選自C或N；n為0、1、2、3或4。優(yōu)選的，R2選自氫、氟原子、氯原子、溴原子、甲基、乙基、異丙基、甲氧基、乙氧基、三氟甲基或三氟甲氧基；n為0、1或2。優(yōu)選的，R2選自氫、氯原子、氟原子、甲基或甲氧基。更優(yōu)選的，R2選自氫或氟原子最優(yōu)選的，所述黃嘌呤衍生物選自：其中，本發(fā)明所述的黃嘌呤衍生物及其溶劑合物，或它們藥學上可接受的鹽，其中所述藥學上可接受的鹽為黃嘌呤衍生物、或其溶劑合物與選自下列的酸形成的鹽：鹽酸、對甲苯磺酸、酒石酸、馬來酸、乳酸、甲磺酸、硫酸、磷酸、檸檬酸、乙酸或三氟乙酸。優(yōu)選的，所述的酸為對甲苯磺酸、鹽酸、酒石酸或三氟乙酸。本發(fā)明還提供一種含有所述黃嘌呤衍生物及其溶劑合物，或它們藥學上可接受的鹽的藥物組合物。本發(fā)明的黃嘌呤衍生物及其溶劑合物，或它們藥學上可接受的鹽，可以作為藥物組合物的主要活性成分，其重量占藥物組合物的0.1-99.9％。本發(fā)明的藥物組合物，優(yōu)選的是單位劑量的藥物制劑形式，在制成藥物制劑時可以制成任何可藥用的劑型，這些劑型選自：片劑、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、混懸劑、溶液劑、注射劑、栓劑、軟膏劑、硬膏劑、霜劑、噴霧劑、貼劑。優(yōu)選的是口服制劑形式，最佳優(yōu)選的是片劑，膠囊劑。進一步的，本發(fā)明所述藥物組合物還含有藥學上可接受的載體?？梢圆捎弥苿W常規(guī)技術制備該藥物制劑，如將本發(fā)明的黃嘌呤衍生物及其溶劑合物，或它們藥學上可接受的鹽，與藥學上可接受的載體混合。所述藥學上可接受的的載體包括但不限于：甘露醇、山梨醇、山梨酸或鉀鹽、焦亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、鹽酸半胱氨酸、巰基乙酸、蛋氨酸、維生素A、維生素C、維生素E、維生素D、氮酮、EDTA二鈉、EDTA鈣鈉，一價堿金屬的碳酸鹽、醋酸鹽、磷酸鹽或其水溶液、鹽酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化鈉、氯化鉀、乳酸鈉、木糖醇、麥芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纖維素及其衍生物、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、丙二醇、乙醇、土溫60-80、司班-80、蜂蠟、羊毛脂、液體石蠟、十六醇、沒食子酸酯類、瓊脂、三乙醇胺、堿性氨基酸、尿素、尿囊素、碳酸鈣、碳酸氫鈣、表面活性劑、聚乙二醇、環(huán)糊精、β－環(huán)糊精、磷脂類材料、高嶺土、滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂等。本發(fā)明的黃嘌呤衍生物及其溶劑合物，或它們藥學上可接受的鹽，作為藥物組合物的有效活性成分，在制成藥劑時，單位劑量的藥劑可含有本發(fā)明的藥物活性物質(zhì)0.1-1000mg，其余為藥學上可接受的載體。藥學上可接受的載體以重量計可以是制劑總重量的0.1-99.9％。本發(fā)明的藥物組合物在使用時根據(jù)病人的情況確定用法用量。本發(fā)明還包括所述黃嘌呤衍生物及其溶劑合物，或它們藥學上可接受的鹽在制備治療與二肽基肽酶IV相關的疾病的藥物中的用途。所述與二肽基肽酶IV相關的疾病包括但不限于II型糖尿病、葡萄糖耐量異常、高糖血癥、肥胖癥或胰島素抵抗等。附圖說明圖1正常鼠的糖耐量實驗結(jié)果圖2正常鼠的糖耐量實驗結(jié)果圖3肥胖鼠糖耐量實驗結(jié)果圖4肥胖鼠糖耐量實驗結(jié)果圖5糖尿病鼠糖耐量實驗結(jié)果圖6糖尿病鼠糖耐量實驗結(jié)果具體實施方式實施例11-[(6-氟-苯甲腈-2-基)甲基]-3-甲基-7-(2-丁炔-1-基)-8-[(R)-3-氨基-哌啶-1-基]-黃嘌呤的制備(1)3-甲基-7-(2-丁炔-1-基)-8-溴黃嘌呤的制備室溫條件下，將8-溴-3-甲基黃嘌呤(2.5g，10.2mmol)混懸于15mLN,N-二甲基甲酰胺(縮寫為：DMF)中，加入二異丙基乙胺(1.326g，10.2mmol)、1-溴-2-丁炔(1.357g，10.2mmol)，滴加完畢后，室溫攪拌12小時。反應完畢，將反應液倒入冰水中，攪拌析出固體，抽濾，真空干燥得淡黃色固體2.57g，產(chǎn)率85％。ES-API(m/z):[M+H]+297.0，299.0。(2)1-[(6-氟-苯甲腈-2-基)甲基]-3-甲基-7-(2-丁炔-1-基)-8-溴黃嘌呤的制備將3-甲基-7-(2-丁炔-1-基)-8-溴黃嘌呤(2.9g，9.8mmol)、碳酸鉀(2.2g，16mmol)和2-溴甲基-6-氟苯甲腈(2.3g，10.7mmol)加入至100mL的圓底燒瓶中，加入25mLN,N-二甲基甲酰胺，升溫至80℃攪拌5小時；反應完畢，將反應液倒入冰水中析出固體，抽濾，固體水洗，干燥得淺黃色固體3.5g，產(chǎn)率84％，ES-API(m/z):[M+H]+430.0。(3)1-[(6-氟-苯甲腈-2-基)甲基]-3-甲基-7-(2-丁炔-1-基)-8-[(R)-3-叔丁氧羰基氨基-哌啶-1-基]-黃嘌呤的制備將1-[(6-氟-苯甲腈-2-基)甲基]-3-甲基-7-(2-丁炔-1-基)-8-溴黃嘌呤(3.5g，7.4mmol)、碳酸鉀(1.9g，14mmol)和3-(R)-叔丁氧羰基-氨基哌啶(1.6g，8mmol)加入到50mL的圓底燒瓶中，加入25mLN,N-二甲基甲酰胺，升溫至80℃攪拌5小時；反應完畢，冷卻至室溫，將反應液倒入冰水中析出固體，抽濾、真空干燥，得淺黃色固體2.9g，產(chǎn)率72％。ES-API(m/z):[M+H]+550.3。(4)1-[(6-氟-苯甲腈-2-基)甲基]-3-甲基-7-(2-丁炔-1-基)-8-[(R)-3-氨基-哌啶-1-基]-黃嘌呤的制備將化合物1-[(6-氟-苯甲腈-2-基)甲基]-3-甲基-7-(2-丁炔-1-基)-8-[(R)-3-叔丁氧羰基氨基-哌啶-1-基]-黃嘌呤(0.4g，0.7mmol)溶于二氯甲烷(8ml)中，室溫下滴入三氟醋酸(2ml)，室溫反應1小時。加入二氯甲烷(10ml)將反應溶液稀釋后，用pH＝10的碳酸鉀水溶液洗滌，二氯甲烷萃取，有機相用無水硫酸鎂干燥，過濾，濃縮。殘留物用薄層色譜(二氯甲烷:甲醇＝20:1)分離純化，得到化合物1-[(6-氟-苯甲腈-2-基)甲基]-3-甲基-7-(2-丁炔-1-基)-8-[(R)-3-氨基-哌啶-1-基]-黃嘌呤(0.25g，淺黃色固體)，收率：77％。ES-API(m/z):[M+H]+450.2。1HNMR(400MHz,DMSO)δ7.68(m,1H),7.42(m,1H),7.13(m,1H),5.20(s,2H),4.90(s,2H),3.63(m,2H),3.38(s,3H),3.00(m,1H),2.90–2.71(m,2H),1.92–1.72(m,5H),1.62(m,1H),1.34-1.25(m,1H).實施例21-[(4,5-二氟-苯甲腈-2-基)甲基]-3-甲基-7-(2-丁炔-1-基)-8-[(R)-3-氨基-哌啶-1-基]-黃嘌呤的制備(1)1-[(4,5-二氟-苯甲腈-2-基)甲基]-3-甲基-7-(2-丁炔-1-基)-8-溴黃嘌呤的制備將3-甲基-7-(2-丁炔-1-基)-8-溴黃嘌呤(2.3g，7.9mmol)、碳酸鉀(1.7g，12.6mmol)和2-溴甲基-4,5-二氟苯甲腈(2.0g，8.7mmol)加入至100mL的圓底燒瓶中，加入25mLN,N-二甲基甲酰胺，升溫至80℃攪拌5小時；反應完畢，將反應液倒入冰水中析出固體，抽濾，固體水洗，干燥得淺黃色固體3.0g，產(chǎn)率86％，ES-API(m/z):[M+H]+448.0。(2)1-[(4,5-二氟-苯甲腈-2-基)甲基]-3-甲基-7-(2-丁炔-1-基)-8-[(R)-3-叔丁氧羰基氨基-哌啶-1-基]-黃嘌呤的制備將1-[(4,5-二氟-苯甲腈-2-基)甲基]-3-甲基-7-(2-丁炔-1-基)-8-溴黃嘌呤(2.3g，5.1mmol)、碳酸鉀(1.4g,10.4mmol)和3-(R)-叔丁氧羰基-氨基哌啶(1.1g,5.5mmol)加入到50mL的圓底燒瓶中，加入25mLN,N-二甲基甲酰胺，升溫至80℃攪拌5小時；反應完畢，冷卻至室溫，將反應液倒入冰水中析出固體，抽濾、真空干燥，得淺黃色固體2.2g，產(chǎn)率76％。ES-API(m/z):[M+H]+568.2。(3)1-[(4,5-二氟-苯甲腈-2-基)甲基]-3-甲基-7-(2-丁炔-1-基)-8-[(R)-3-氨基-哌啶-1-基]-黃嘌呤的制備將化合物1-[(4,5-二氟-苯甲腈-2-基)甲基]-3-甲基-7-(2-丁炔-1-基)-8-[(R)-3-叔丁氧羰基氨基-哌啶-1-基]-黃嘌呤(0.4g，0.7mmol)溶于二氯甲烷(8ml)中，室溫下滴入三氟醋酸(2ml)，室溫反應1小時。加入二氯甲烷(10ml)將反應溶液稀釋后，用pH＝10的碳酸鉀水溶液洗滌，二氯甲烷萃取，有機相用無水硫酸鎂干燥，過濾，濃縮。殘留物用薄層色譜(二氯甲烷:甲醇＝20:1)分離純化，得到化合物1-[(4,5-二氟-苯甲腈-2-基)甲基]-3-甲基-7-(2-丁炔-1-基)-8-[(R)-3-氨基-哌啶-1-基]-黃嘌呤(0.26g，黃色固體)，收率：79％。ES-API(m/z):[M+H]+468.2。1HNMR(400MHz,DMSO)δ8.18(m,1H),7.42(m,1H),5.16(s,2H),4.89(s,2H),3.62(m,2H),3.38(s,3H),2.99(m,1H),2.90–2.73(m,2H),1.93–1.71(m,5H),1.70–1.53(m,1H),1.35–1.24(m,1H).實施例31-[(3-氰基-吡嗪-2-基)甲基]-3-甲基-7-(2-丁炔-1-基)-8-[(R)-3-氨基-哌啶-1-基]-黃嘌呤(1)1-[(3-氰基-吡嗪-2-基)甲基]-3-甲基-7-(2-丁炔-1-基)-8-溴黃嘌呤的制備將3-甲基-7-(2-丁炔-1-基)-8-溴黃嘌呤(0.71g，2.4mmol)、碳酸鉀(0.53g，3.8mmol)和2-溴甲基-3-氰基-吡嗪(0.52g，2.6mmol)加入至50mL的圓底燒瓶中，加入5mLN,N-二甲基甲酰胺，升溫至80℃攪拌5小時；反應完畢，將反應液倒入冰水中析出固體，抽濾，固體水洗，干燥得淺黃色固體0.88g，產(chǎn)率89％，ES-API(m/z):[M+H]+414.0。(2)1-[(3-氰基-吡嗪-2-基)甲基]-3-甲基-7-(2-丁炔-1-基)-8-[(R)-3-叔丁氧羰基氨基-哌啶-1-基]-黃嘌呤的制備將1-[(3-氰基-吡嗪-2-基)甲基]-3-甲基-7-(2-丁炔-1-基)-8-溴黃嘌呤(0.23g，0.78mmol)、碳酸鉀(0.22g,1.6mmol)和3-(R)-叔丁氧羰基-氨基哌啶(0.17g,0.85mmol)加入到10mL的圓底燒瓶中，加入5mLN,N-二甲基甲酰胺，升溫至80℃攪拌5小時；反應完畢，冷卻至室溫，將反應液倒入冰水中析出固體，抽濾、真空干燥，得淺黃色固體0.35g，產(chǎn)率85％。ES-API(m/z):[M+H]+534.3。(3)1-[(3-氰基-吡嗪-2-基)甲基]-3-甲基-7-(2-丁炔-1-基)-8-[(R)-3-氨基-哌啶-1-基]-黃嘌呤的制備將化合物1-[(3-氰基-吡嗪-2-基)甲基]-3-甲基-7-(2-丁炔-1-基)-8-[(R)-3-叔丁氧羰基氨基-哌啶-1-基]-黃嘌呤(0.31g，0.6mmol)溶于二氯甲烷(8ml)中，室溫下滴入三氟醋酸(2ml)，室溫反應1小時。加入二氯甲烷(10ml)將反應溶液稀釋后，用pH＝10的碳酸鉀水溶液洗滌，二氯甲烷萃取，有機相用無水硫酸鎂干燥，過濾，濃縮。殘留物用薄層色譜(二氯甲烷:甲醇＝20:1)分離純化，得到化合物1-[(3-氰基-吡嗪-2-基)甲基]-3-甲基-7-(2-丁炔-1-基)-8-[(R)-3-氨基-哌啶-1-基]-黃嘌呤(0.19g，黃色固體)，收率：74％。ES-API(m/z):[M+H]+434.2。1HNMR(400MHz,DMSO)δ8.84(m,1H),8.75(m,1H),5.38(s,2H),4.89(s,2H),3.71–3.53(m,2H),3.37(s,3H),3.07–2.97(m,1H),2.90(m,1H),2.81(m,1H),1.93–1.73(m,5H),1.70–1.56(m,1H),1.32–1.22(m,1H).實施例41-[(3-甲酸甲酯-吡啶-2-基)甲基]-3-甲基-7-(2-丁炔-1-基)-8-[(R)-3-氨基-哌啶-1-基]-黃嘌呤(1)1-[(3-甲酸甲酯-吡啶-2-基)甲基]-3-甲基-7-(2-丁炔-1-基)-8-溴黃嘌呤的制備將3-甲基-7-(2-丁炔-1-基)-8-溴黃嘌呤(2.0g，6.7mmol)、碳酸鉀(1.5g，12.6mmol)和2-溴甲基-3-甲酸甲酯-吡啶(1.7g，7.4mmol)加入至100mL的圓底燒瓶中，加入20mLN,N-二甲基甲酰胺，升溫至80℃攪拌5小時；反應完畢，將反應液倒入冰水中析出固體，抽濾，固體水洗，干燥得淺黃色固體2.5g，產(chǎn)率83％，ES-API(m/z)：[M+H]+446.0。(2)1-[(3-甲酸甲酯-吡啶-2-基)甲基]-3-甲基-7-(2-丁炔-1-基)-8-[(R)-3-叔丁氧羰基氨基-哌啶-1-基]-黃嘌呤的制備將1-[(3-甲酸甲酯-吡啶-2-基)甲基]-3-甲基-7-(2-丁炔-1-基)-8-溴黃嘌呤(1.2g，2.7mmol)、碳酸鉀(0.74g,5.4mmol)和3-(R)-叔丁氧羰基-氨基哌啶(0.61g,3.1mmol)加入到50mL的圓底燒瓶中，加入10mLN,N-二甲基甲酰胺，升溫至80℃攪拌5小時；反應完畢，冷卻至室溫，將反應液倒入冰水中析出固體，抽濾、真空干燥，得淺黃色固體1.2g，產(chǎn)率80％。ES-API(m/z):[M+H]+566.3。(3)1-[(3-甲酸甲酯-吡啶-2-基)甲基]-3-甲基-7-(2-丁炔-1-基)-8-[(R)-3-氨基-哌啶-1-基]-黃嘌呤的制備將化合物1-[(3-甲酸甲酯-吡啶-2-基)甲基]-3-甲基-7-(2-丁炔-1-基)-8-[(R)-3-叔丁氧羰基氨基-哌啶-1-基]-黃嘌呤(0.4g，0.7mmol)溶于二氯甲烷(8ml)中，室溫下滴入三氟醋酸(2ml)，室溫反應1小時。加入二氯甲烷(10ml)將反應溶液稀釋后，用pH＝10的碳酸鉀水溶液洗滌，二氯甲烷萃取，有機相用無水硫酸鎂干燥，過濾，濃縮。殘留物用薄層色譜(二氯甲烷:甲醇＝20:1)分離純化，得到化合物1-[(3-甲酸甲酯-吡啶-2-基)甲基]-3-甲基-7-(2-丁炔-1-基)-8-[(R)-3-氨基-哌啶-1-基]-黃嘌呤(0.25g，淺黃色固體)，收率：77％。ES-API(m/z):[M+H]+466.2。1HNMR(400MHz,DMSO)δ8.59(m,1H),8.30(m,1H),7.44(m,1H),5.48(s,2H),4.89(s,2H),3.94(s,3H),3.61(m,2H),3.38(s,3H),3.00(m,2H),2.87–2.77(m,1H),1.94–1.72(m,5H),1.71–1.57(m,1H),1.36–1.25(m,1H).實施例5含有5mgTSL-0319化合物的包衣片劑1個片劑核芯含TSL-03195mg羥丙甲基纖維素15mg磷酸鈣90mg硬脂酸鎂1.5mg玉米淀粉35mg聚乙烯基吡咯烷酮10mg總量166.5mg制備：將TSL-0319化合物與磷酸鈣、玉米淀粉、聚乙烯基吡咯烷酮、羥丙甲基纖維素及指定量一半的硬脂酸鎂混合。在制片機中制造13毫米直徑的片，然后使用適當及其，使其摩擦經(jīng)過具有篩孔尺寸1.5毫米的篩網(wǎng)，并與其余硬脂酸鎂混合。于制片機中壓制此顆粒，以形成所要形狀的片劑。核芯重量：166.5mg沖頭：9毫米，凸型將如此制成的片劑核芯使用基本上由羥丙甲基纖維素構(gòu)成的薄膜包衣。將最后完成的薄膜包衣以蜂蠟拋光。包衣片劑的重量：175mg實施例6含有5mgTSL-0319化合物的膠囊化合物TSL-03195g淀粉400g微晶纖維素200g按常規(guī)方法，將所得的藥物組合物混合均勻后，裝入普通明膠膠囊，得到1000顆膠囊。按此類方法，得到含有5mg化合物TSL-0319的膠囊。試驗例一體外活性實驗(一)體外DPP-IV活性抑制試驗二肽基肽酶IV(DPP-IV)在室溫下可水解Gly-Pro-氨基熒光素(Gly-Pro-Aminoluciferin)，生成氨基熒光素(Aminoluciferin)，該物質(zhì)在DPPIV-Glo(TM)蛋白酶檢測試劑盒提供的熒光素酶反應系統(tǒng)中，可產(chǎn)生“輝光型”發(fā)光信號，該發(fā)光信號的強弱與DPP-IV酶的活力成正比。1、實驗目的：觀察本發(fā)明化合物I-1～I-4對二肽基肽酶IV(DPP-IV)酶的活性抑制，以評價其抑制效果。2、實驗材料：2.1人源重組二肽基肽酶IV(DPP-IV)：SIGMA產(chǎn)品，貨號D3446-10UG。2.2DPPIV-Glo(TM)蛋白酶檢測試劑盒：Promega產(chǎn)品，貨號G8351。2.3Trizmabase：Sigma產(chǎn)品，貨號T6066-1KG：配置成10mMTris-HCl，pH8.0。2.4384孔板(OptiPlate)：PerkinElmer產(chǎn)品，貨號6007299。2.5液體處理儀器：Bravo(Agilent公司)；Echo(Labcyte公司)2.6檢測儀器：Envision(PerkinElmer公司)3、實驗方法：3.1用Bravo將待測樣品用DMSO梯度稀釋10個濃度，然后用Echo轉(zhuǎn)移250nl樣品到384孔板中。3.2用10mMTris-HCl(pH8.0)將二肽基肽酶IV(Sigma)稀釋成0.2ng/ml溶液，加入待測樣品中，每孔25ul。同時設立空白對照(含底物，不含酶和樣品)和陽性對照(含底物，含酶，不含樣品)。3.3每孔加入25ul的DPPIV-GloTMReagent(按DPPIV-Glo(TM)蛋白酶檢測試劑盒說明書配置，含20uMDPP-IV底物Gly-Pro-氨基熒光素和熒光素酶反應體系)。3.4室溫反應60min，用Envision測定發(fā)光強度。3.5根據(jù)發(fā)光強度計算DPP-IV酶活力，酶活力＝(樣品發(fā)光強度值-空白對照發(fā)光強度值/(陽性對照發(fā)光強度值-空白對照發(fā)光強度值)X100。3.6根據(jù)酶活力，應用GraphPadPrism5.0軟件計算樣品的IC50。4、實驗結(jié)果表1本發(fā)明化合物I-1～I-4與利格列汀的IC50值由以上結(jié)果可知，本發(fā)明化合物I-3具有比利格列汀更好的活性，其他化合物I-1、I-2、I-4也具有與利格列汀相似的活性。(二)體外藥物選擇性實驗1、實驗目的：觀察本發(fā)明化合物I-3(以下簡稱TSL-0319)對二肽基肽酶酶的活性抑制作用，與已上市同類藥物的選擇性比較2、實驗材料：2.1人源重組二肽基肽酶IV(DPP-IV)、DPP8和DPP9酶，其它實驗材料與試驗例(一)相同。3、實驗方法：與試驗例(一)相同4、實驗結(jié)果表2本發(fā)明化合物I-3與已上市藥物的IC50值表由以上結(jié)果可知，本發(fā)明化合物TSL-0319只表現(xiàn)出對DPP4有抑制作用，對DPP8、DPP9無抑制作用，同時化合物TSL-0319的選擇性要明顯優(yōu)越于所有已上市同類藥物的選擇性。試驗例二體內(nèi)實驗1、實驗藥物：化合物I-3(簡稱TSL-0319)、利格列汀2、實驗方法：使用了正常鼠、肥胖鼠、糖尿病小鼠進行研究糖耐量實驗OGTT(口服糖耐量實驗)實驗過程：試驗開始前禁食6小時，給藥后60min灌胃給予葡萄糖(藥物濃度0.6mg/ml，給藥體積5ml/kg)(糖尿病鼠給糖2g/kg；肥胖鼠給糖2g/kg；正常鼠給糖5g/kg)，分別測定給予葡萄糖后0min、15min、30min、45min、60min、120min的血糖值。3、實驗結(jié)果：正常鼠的糖耐量實驗見表3，附圖1-2，本發(fā)明化合物I-3(簡稱TSL-0319)具有很好的降糖效果，尤其是降糖效果優(yōu)于利格列汀。肥胖鼠糖耐量實驗見表4，附圖3-4，本發(fā)明化合物I-3(簡稱TSL-0319)具有很好的降糖效果，尤其是降糖效果優(yōu)于利格列汀糖尿病鼠糖耐量實驗見表5，附圖5-6，本發(fā)明化合物I-3(簡稱TSL-0319)具有很好的降糖效果，尤其是降糖效果優(yōu)于利格列汀表3正常鼠口服糖耐量實驗(鼠種：C57BL/6J)(-60min給藥，0min給葡萄糖)：*：P<0.05vs空白組；**：P<0.01vs空白組；***：P<0.001vs空白組表4肥胖鼠糖耐量實驗(鼠種：B6.Cg-Lepob/JNju)(-60min給藥，0min給葡萄糖)：*：P<0.05vs模型組；**：P<0.01vs模型組表5糖尿病鼠糖耐量實驗(鼠種：B6.BKS(D)-Leprdb/JNju)(-60min給藥，0min給葡萄糖)：*：P<0.05vs模型組；**：P<0.01vs模型組；***：P<0.001vs模型組4、結(jié)論：在體內(nèi)糖代謝試驗中，使用了正常鼠、肥胖鼠、糖尿病小鼠進行研究，本發(fā)明化合物I-3(簡稱TSL-0319)對三種小鼠都具有降糖作用且降糖效果優(yōu)于利格列汀。試驗例三、hERG毒性研究1.測試方法：應用手動膜片鉗的方法在轉(zhuǎn)染hERG鈉通道的穩(wěn)定細胞株CHO上測試化合物對hERG鈉電流的作用，進而計算化合物對hERG的IC50值。膜片鉗技術(ConventionalPatch-Clamp)是已公開技術，是研究離子通道最重要的技術手段，被公認為是離子通道研究的“黃金標準”，是最精確的測量離子通道的實驗方法，適用于研究化合物與離子通道作用的作用機制，亦可用于新藥申報過程中候選藥物的毒性評價和先導化合物的結(jié)構(gòu)優(yōu)化。在心肌細胞中，humanEther-a-go-goRelatedGene(hERG)編碼的鉀通道介導一種延遲整流鉀電流(IKr)，IKr抑制是藥物導致QT間期延長最重要的機制。hERG因其特殊的分子結(jié)構(gòu)，使其可被結(jié)構(gòu)多樣化的化合物抑制。目前，檢測化合物對hERG鉀通道的作用已是臨床前評價化合物心臟安全性的關鍵步驟，也是FDA要求的新藥報批必備資料。使用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染hERG鉀通道的CHO細胞系，通過膜片鉗技術，可以測試化合物對hERG的影響并測定相應的IC50。2.實驗結(jié)果：進行的hERG實驗中，TSL-0319對hERG的IC50＝79.80μM。(利格列汀沒有報道對hERG的IC50，只提及：在1μM濃度下，對hERG的抑制率為3％；TSL-0319在1μM濃度下，對hERG的抑制率為0％。)按照大于Cmax20倍的要求計算，TSL-0319在5mg/kg劑量下，小鼠體內(nèi)Cmax為200-500nM，對hERG的IC50應大于20μM，因此TSL-0319在hERG毒性方面是安全的，要明顯優(yōu)于利格列汀。試驗例四、藥-藥相互作用研究(DDI)1、測試方法：使用人肝微粒體進行化合物對CYP酶的抑制活性測試。利用體外人肝微粒體孵育體系，通過cocktail探針藥物法(已公開技術)，同時測定人肝微粒體CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4底物非那西丁、雙氯芬酸、S-美芬妥英、美沙芬、咪達唑侖的含量變化，評價不同濃度下TSL-0319對人肝微粒體CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4亞型活性的影響并測定相應的IC50。實驗結(jié)果：表6TSL-0319不用濃度對CYP酶抑制率TSL-0319濃度μM00.050.150.51.551550對CYP1A2抑制率(％)0002.24.26.620.841.8對CYP2C9抑制率(％)0003.25.710.512.113.9對CYP2C19抑制率(％)003.38.2142.9對CYP2D6抑制率(％)000000314.6對CYP3A4抑制率(％)00044.48.717.944.62、結(jié)論：TSL-0319對CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4五種代謝酶的IC50都大于50μM，因此TSL-0319的使用不會影響其他藥物的代謝，可與其他藥物聯(lián)用。試驗例五、化合物TSL-0319小鼠藥代動力學實驗1、給藥方案：7-10周健康CD-1鼠6只，隨機分為兩組。分別靜脈注射以及灌胃給予2mg/kg、5mg/kg的TSL-0319(靜脈注射，2mg/ml，以DMSO/PEG400/H2O＝20/60/20的溶液制成透明溶液；灌胃，5mg/ml；以PEG400/Tween80/H20＝40/10/50的溶液制成透明溶液)；給藥前禁食12小時，自由飲水；于給藥前和給藥后按時間點在大隱靜脈或頜下靜脈取血(靜脈注射取血時間點：0h、0.0833h、0.250h、0.500h、1.00h、2.00h、4.00h、8.00h、12.00h、24.00h；灌胃取血時間點：0h、0.250h、0.500h、1.00h、2.00h、4.00h、8.00h、12.00h、24.00h)，最低定量濃度(lowerlimitofquantitation，LLOQ)設為3ng/ml。2、實驗結(jié)果：見表7表7TSL-0319藥代動力學實驗數(shù)據(jù)3、結(jié)論TSL-0319使用CD-1小鼠做藥代動力學實驗，由于取血點以及LLOQ的設定，其T1/2與linagliptin的公開數(shù)據(jù)相比有較大差別，但是60.5％的生物利用度遠高于同等條件下linagliptin的生物利用度(linagliptin使用CD-1小鼠做藥代動力學實驗，5mg/kg，口服，生物利用度為18.4％)。本發(fā)明化合物I-1～I-2、1-4結(jié)構(gòu)與I-3類似，因此化合物I-1～I-2、1-4都具有與化合物I-3相同的藥效作用。當前第1頁1 2 3