本發(fā)明涉及殼聚糖制備領(lǐng)域。更具體地，涉及一種聚-ε-賴氨酸改性的殼聚糖及其制備方法。

背景技術(shù)：

甲殼素是地球上儲(chǔ)量?jī)H次于纖維素的天然可再生資源，而由甲殼素脫乙酰后得到的殼聚糖是一種聚陽(yáng)離子堿性多糖，除了具有無(wú)毒、無(wú)免疫原性、良好的生物可降解性和生物相容性外，它還具有許多高分子材料所不具備的消炎作用以及促進(jìn)藥物對(duì)生物膜表面的滲透和吸收的作用，因此殼聚糖被應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化工及環(huán)保等行業(yè)。然而由于殼聚糖分子內(nèi)和分子間存在較強(qiáng)的氫鍵作用，使得殼聚糖難溶于水，極大地限制了在以上諸多領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。

殼聚糖分子上含有可反應(yīng)的羥基和氨基，可通過(guò)控制與羥基或氨基的反應(yīng)條件，進(jìn)行如?；?、羧基化、醚化、nh2烷基化、酯化、水解等反應(yīng)(j.adv.drug.deliv.rev.2001,50,591.)，引入其他基團(tuán)制成系列水溶性殼聚糖衍生物，從而改變其物理化學(xué)性能，賦予殼聚糖更多的特定功能，以適應(yīng)更多領(lǐng)域的需要，進(jìn)一步拓寬殼聚糖的適用范圍。

聚-ε-賴氨酸是賴氨酸殘基通過(guò)α-羧基和ε-氨基形成的酰胺鍵連接而成聚合物，在人體內(nèi)分解為賴氨酸，而賴氨酸是人體必需的8種氨基酸之一。聚-ε-賴氨酸溶于水，可生物降解，無(wú)毒，熱穩(wěn)定性好，可有效抑制多種革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌和真菌，并且對(duì)生物膜有良好的穿透力。但是聚-ε-賴氨酸極易與蛋白質(zhì)或者酸性多糖結(jié)合而喪失抗菌活性，同時(shí)，聚-ε-賴氨酸乳化性能差，進(jìn)而限制了其應(yīng)用。王瑩瑩等人采用干熱美拉德反應(yīng)制備了ε-聚賴氨酸-殼聚糖共價(jià)復(fù)合物，不同反應(yīng)程度生成的復(fù)合物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌呈現(xiàn)出不同的抑菌性(食品工業(yè)科技,2012,33(17):134-138.)。該方法反應(yīng)溫度高、耗時(shí)長(zhǎng)，制備過(guò)程需要大量緩沖鹽的水，同時(shí)，美拉德反應(yīng)制備的產(chǎn)物顏色發(fā)生褐變，影響產(chǎn)物的廣泛應(yīng)用。

如果能夠?qū)⒕?ε-賴氨酸接枝在殼聚糖分子鏈上，提高聚-ε-賴氨酸乳化性 能的同時(shí)，將會(huì)得到一種既易溶于水，又有一定廣譜抗菌性的高分子抗菌劑。

因此，需要提供一種既能提高殼聚糖抗菌功能又能提高殼聚糖生物安全性的殼聚糖衍生物及其制備方法

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題在于提供一種聚-ε-賴氨酸改性殼聚糖。

本發(fā)明要解決的第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題在于提供一種聚-ε-賴氨酸改性殼聚糖的制備方法。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：

一種聚-ε-賴氨酸改性殼聚糖，所述改性殼聚糖具有如式(ⅰ)的分子結(jié)構(gòu)：

其中，x、y、n和a為自然數(shù)，0＜x≤10⁷，0＜y≤10⁷，10²≤n≤10⁷，25≤a≤30。

所述聚-ε-賴氨酸改性殼聚糖，不但改善了殼聚糖的水溶性，而且在提高殼聚糖的抑菌抗菌性能，同時(shí)生物安全性沒(méi)有降低。另外，該聚-ε-賴氨酸改性殼聚糖作為生物可降解材料，抗菌效果好、毒性小、生物安全性高，是一種綠色產(chǎn)品。

一種聚-ε-賴氨酸改性殼聚糖的制備方法，包括如下步驟：

1)將殼聚糖溶解到ph4.5～5.0的mes緩沖溶液中，形成殼聚糖溶液；將聚-ε-賴氨酸、n-羥基琥珀酰亞胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽溶解于mes緩沖液中，獲得聚-ε-賴氨酸活化溶液；

2)將聚-ε-賴氨酸活化溶液加入殼聚糖溶液中，在0～35℃下反應(yīng)6～48小時(shí)；

3)向步驟2)的反應(yīng)液中加入鹽酸羥胺終止反應(yīng)；

4)過(guò)濾反應(yīng)液，然后用水透析，得到聚-ε-賴氨酸改性殼聚糖溶液；

5)干燥，即得到聚-ε-賴氨酸改性殼聚糖。

其中所述殼聚糖可選用分子量在1000～1,500,000g/mol之間的各種市售殼聚糖，優(yōu)選地，殼聚糖的分子量為10³～10⁷g/mol。在此分子量范圍可以保證殼聚糖的高分子屬性，分子量太大水溶性變差，抗菌性能也會(huì)下降。

所述殼聚糖為脫乙酰化的殼聚糖，脫乙?；潜ＷC殼聚糖分子上有足夠的氨基提供接枝位點(diǎn)。所述殼聚糖脫乙酰度為50～100％，優(yōu)選地，所述殼聚糖脫乙酰度為85％以上，更優(yōu)選地，采用脫乙酰度90％以上,分子量在2～20萬(wàn)g/mol之間的殼聚糖。

在一個(gè)實(shí)施方案中，在0～35℃條件下，將聚-ε-賴氨酸、n-羥基琥珀酰亞胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽溶解于2-(n-嗎啉代)乙烷磺酸(mes)緩沖液中，恒溫?cái)嚢杌罨?.5～3小時(shí)，獲得聚-ε-賴氨酸活化溶液。

所述mes緩沖液為2-(n-嗎啉)乙磺酸一水合物緩沖溶液，其濃度為常規(guī)使用濃度，優(yōu)選地，所述mes緩沖液的濃度為15～100mmol/l。

所述殼聚糖溶液中殼聚糖的質(zhì)量體積百分比為0.1％～20％。殼聚糖在這個(gè)濃度范圍能夠使得接枝反應(yīng)的更順利進(jìn)行，濃度太大則會(huì)因溶液粘度過(guò)大無(wú)法進(jìn)行反應(yīng)。

所述殼聚糖與聚-ε-賴氨酸的摩爾比為1～50∶1。

所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc·hcl)與聚-ε-賴氨酸的摩爾比為0.5～5∶1。

所述n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)與1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc·hcl)的摩爾比為1∶1。

在步驟3)中，聚-ε-賴氨酸與鹽酸羥胺的摩爾比為1∶1～50。優(yōu)選地，聚-ε-賴氨酸與鹽酸羥胺的摩爾比為1∶1。

步驟2)中，反應(yīng)溫度控制在0～35℃。此條件是為了保證聚-ε-賴氨酸在反應(yīng)液中具有足夠的活性，低于零度水可能會(huì)結(jié)冰，影響反應(yīng)活性。

優(yōu)選地，步驟4)中，采用去離子水透析反應(yīng)所得聚-ε-賴氨酸改性殼聚糖，以去除小分子副產(chǎn)物或雜質(zhì)，純化樣品。優(yōu)選地，去離子水透析過(guò)程中，每5～10小時(shí)換水一次，換水6～8次。此優(yōu)選條件是為了保證在合適的時(shí)間內(nèi)充分去除反應(yīng)液中的小分子反應(yīng)物或副產(chǎn)物。另外，殼聚糖經(jīng)聚-ε-賴氨酸改性后進(jìn)行透析處理，還避免了殼聚糖工業(yè)生產(chǎn)中常用的醇析法純化產(chǎn)品所造成的雜質(zhì)去除不盡的缺點(diǎn)。透析后的水溶液通過(guò)冷凍干燥的方法干燥得到最后的產(chǎn)品。

步驟5)中，優(yōu)選地采用冷凍干燥的方法干燥聚-ε-賴氨酸改性殼聚糖溶 液。采用冷凍干燥的方法來(lái)處理樣品，既避免了傳統(tǒng)樣品烘干過(guò)程改性功能基團(tuán)因變溫分解而導(dǎo)致的抑菌功能或生物安全性下降，同時(shí)冷凍干燥使樣品具有三維大孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，有利于溶解過(guò)程中溶劑的快速滲入提高了樣品的溶解速度。

本發(fā)明的有益效果如下：

1.由于聚-ε-賴氨酸改性殼聚糖有天然氨基酸-賴氨酸聚合物的修飾，在提高了抗菌性能的同時(shí)又具有較高的生物安全性。

2.反應(yīng)主要原料殼聚糖來(lái)源廣泛，價(jià)格相對(duì)便宜。

3.殼聚糖具有生物可降解性，本身無(wú)毒，生產(chǎn)過(guò)程中不會(huì)產(chǎn)生污染。

4.未改性的殼聚糖一般需要ph小于6.0才能使用，而本發(fā)明聚-ε-賴氨酸改性殼聚糖使用的ph范圍變寬，在酸性條件至弱堿性(小于9.0)條件下均可使用。

5.由于采用了凍干技術(shù)，產(chǎn)品具有三維大孔結(jié)構(gòu)，有利于溶解過(guò)程中水分子的快速滲入，水溶性好。

6.合成條件：從酸性或混合溶劑到緩沖溶液，條件溫和，節(jié)能環(huán)保。

附圖說(shuō)明

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。

圖1示出原料殼聚糖的h¹nmr譜圖。

圖2示出本發(fā)明實(shí)施例1制備的聚-ε-賴氨酸改性殼聚糖h¹nmr譜圖。

圖3示出本發(fā)明實(shí)施例1制備的聚-ε-賴氨酸改性殼聚糖采用涂板法對(duì)金色葡萄球菌進(jìn)行抗菌性能測(cè)試的結(jié)果照片。

圖4示出對(duì)比例殼聚糖采用涂板法對(duì)金色葡萄球菌進(jìn)行抗菌性能測(cè)試的結(jié)果照片。

圖5示出對(duì)比例聚賴氨酸采用涂板法對(duì)金色葡萄球菌進(jìn)行抗菌性能測(cè)試的結(jié)果照片。

圖6示出聚-ε-賴氨酸改性殼聚糖的制備線路圖。

具體實(shí)施方式

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明，下面結(jié)合優(yōu)選實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。附圖中相似的部件以相同的附圖標(biāo)記進(jìn)行表示。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，下面所具體描述的內(nèi)容是說(shuō)明性的而非限制性的，不應(yīng)以此限制 本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1：制備聚-ε-賴氨酸改性殼聚糖及抗菌測(cè)試

一種聚-ε-賴氨酸改性殼聚糖，其分子結(jié)構(gòu)式如下所示

其中，x、y、n和a為自然數(shù)，0＜x≤10⁷，0＜y≤10⁷，10²≤n≤10⁷，25≤a≤30。

上述殼聚糖衍生物的具體制備方法如下：

稱取0.1克殼聚糖加入到100毫升ph4.8的mes緩沖溶液中，室溫下機(jī)械攪拌半小時(shí)，以便殼聚糖溶解完全，從而得到質(zhì)量體積百分比濃度為0.1％的均勻殼聚糖溶液；然后，在冰水混合浴中，將聚-ε-賴氨酸、n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc·hcl)溶于25mmol/l的ph4.8的mes緩沖溶液中，溶解3小時(shí)，獲得活化的聚-ε-賴氨酸溶液；將20ml活化的聚-ε-賴氨酸溶液加入殼聚糖溶液中，于室溫下持續(xù)攪拌反應(yīng)48小時(shí)，其中殼聚糖、聚-ε-賴氨酸、nhs和edc的摩爾比為50:1:5:5；然后將反應(yīng)液裝入透析袋，將透析袋兩端扎緊放入去離子水中透析處理，每隔五小時(shí)換水一次，換水八次后將透析液放入-86℃冰箱冷凍一小時(shí)后，放入凍干機(jī)直至凍干為止即可得所述聚-ε-賴氨酸改性的殼聚糖。

圖1示出原料殼聚糖的h¹nmr譜圖。圖2示出本發(fā)明實(shí)施例1制備的聚-ε-賴氨酸改性殼聚糖h¹nmr譜圖。

圖3示出本發(fā)明實(shí)施例1制備的聚-ε-賴氨酸改性殼聚糖采用涂板法對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行抗菌性能測(cè)試的結(jié)果照片，從左到右依次是采用濃度為1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.1mg/ml、0.05mg/ml本實(shí)施例制備的聚-ε-賴氨酸改性殼聚糖(溶解在中性的生理鹽水中)以及空白對(duì)照組(不添加任何抗菌劑)的培養(yǎng)基，涂菌后在37℃的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36小時(shí)后的抗菌測(cè)試結(jié)果。該結(jié)果表明：本實(shí)施例制備的聚-ε-賴氨酸改性殼聚糖對(duì)金色葡萄球菌具有良好抑制性能。

對(duì)本實(shí)施例制備的產(chǎn)品采用涂板法對(duì)金色葡萄球菌抑菌率的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié) 果如下表：

表1聚-ε-賴氨酸改性殼聚糖抑菌性能測(cè)試結(jié)果

以上各數(shù)據(jù)結(jié)果說(shuō)明：聚-ε-賴氨酸改性的殼聚糖不但具有良好的抗菌性能。

實(shí)施例2：制備聚-ε-賴氨酸改性殼聚糖

一種聚-ε-賴氨酸改性殼聚糖，其分子結(jié)構(gòu)式如下所示

其中，x、y、n和a為自然數(shù)，0＜x≤10⁷，0＜y≤10⁷，10²≤n≤10⁷，

25≤a≤30。

上述殼聚糖衍生物的具體制備方法如下：

稱取0.5克殼聚糖加入到100毫升ph4.8的mes緩沖溶液中，室溫下機(jī)械攪拌半小時(shí)，以便殼聚糖溶解完全，從而得到質(zhì)量體積百分比濃度為0.5％的均勻殼聚糖溶液；然后，在冰水混合浴中，將聚-ε-賴氨酸、n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc·hcl)溶于25mmol/l的ph4.8的mes的緩沖溶液中，溶解3小時(shí)，獲得活化的聚-ε-賴氨酸溶液；將20ml活化的聚-ε-賴氨酸溶液加入殼聚糖溶液中，于室溫下持續(xù)攪拌反應(yīng)48小時(shí)，其中聚-ε-賴氨酸、nhs和edc的摩爾比為20:1:4:4；然后將反應(yīng)液裝入透析袋，將透析袋兩端扎緊放入去離子水中透析處理，每隔五小時(shí)換水一次，換水八次后將透析液放入-86℃冰箱冷凍一小時(shí)后，放入凍干機(jī)直至凍干為止即可得所述聚-ε-賴氨酸改性的殼聚糖衍生物。對(duì)該實(shí)施 例制備的聚-ε-賴氨酸改性的殼聚糖衍生物參照實(shí)施例1進(jìn)行抗菌性能與安全性能測(cè)試，其結(jié)果與實(shí)施例1類似。

實(shí)施例3：制備聚-ε-賴氨酸改性殼聚糖

一種聚-ε-賴氨酸改性殼聚糖，其分子結(jié)構(gòu)式如下所示

其中，x、y、n和a為自然數(shù)，0＜x≤10⁷，0＜y≤10⁷，10²≤n≤10⁷，25≤a≤30。

上述殼聚糖衍生物的具體制備方法如下：

稱取1.0克殼聚糖加入到100毫升ph4.8的mes緩沖溶液中，室溫下機(jī)械攪拌一小時(shí)，以便殼聚糖溶解完全，從而得到質(zhì)量體積百分比濃度為1％的均勻殼聚糖溶液；然后，在室溫中，將聚-ε-賴氨酸、n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc·hcl)溶于25mmol/l的ph4.8的mes緩沖溶液中，溶解2小時(shí)，獲得活化的聚-ε-賴氨酸溶液；將20ml活化的聚-ε-賴氨酸溶液加入殼聚糖溶液中，于室溫下持續(xù)攪拌反應(yīng)24小時(shí)，其中殼聚糖、聚-ε-賴氨酸、nhs和edc的摩爾比為10:1:2:2；然后將反應(yīng)液裝入透析袋，將透析袋兩端扎緊放入去離子水中透析處理，每隔五小時(shí)換水一次，換水八次后將透析液放入-86℃冰箱冷凍一小時(shí)后，放入凍干機(jī)直至凍干為止即可得所述聚-ε-賴氨酸改性的殼聚糖衍生物。對(duì)該實(shí)施例制備的聚-ε-賴氨酸改性的殼聚糖衍生物參照實(shí)施例1進(jìn)行抗菌性能與安全性能測(cè)試，其結(jié)果與實(shí)施例1類似。

實(shí)施例4：制備聚-ε-賴氨酸改性殼聚糖

一種聚-ε-賴氨酸改性殼聚糖，其分子結(jié)構(gòu)式如下所示

其中，x、y、n和a為自然數(shù)，0＜x≤10⁷，0＜y≤10⁷，10²≤n≤10⁷，25≤a≤30。

上述殼聚糖衍生物的具體制備方法如下：

稱取2.0克殼聚糖加入到100毫升ph4.8的mes緩沖溶液中，45℃水浴下機(jī)械攪拌一小時(shí)，以便殼聚糖溶解完全，從而得到質(zhì)量體積百分比濃度為2％的均勻殼聚糖溶液；然后，在室溫中，將聚-ε-賴氨酸、n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc·hcl)溶于(25mmol/l的ph4.8的mes的緩沖溶液中，溶解2小時(shí)，獲得活化的聚-ε-賴氨酸溶液；將20ml活化的聚-ε-賴氨酸溶液加入殼聚糖溶液中，于室溫下持續(xù)攪拌反應(yīng)24小時(shí)，其中殼聚糖、聚-ε-賴氨酸、nhs和edc的摩爾比為5:1:2:2；然后將反應(yīng)液裝入透析袋，將透析袋兩端扎緊放入去離子水中透析處理，每隔8小時(shí)換水一次，換水八次后將透析液放入-86℃冰箱冷凍一小時(shí)后，放入凍干機(jī)直至凍干為止即可得所述聚-ε-賴氨酸改性的殼聚糖衍生物。對(duì)該實(shí)施例制備的聚-ε-賴氨酸改性的殼聚糖衍生物參照實(shí)施例1進(jìn)行抗菌性能與安全性能測(cè)試，其結(jié)果與實(shí)施例1類似。

實(shí)施例5：制備聚-ε-賴氨酸改性殼聚糖

一種聚-ε-賴氨酸改性殼聚糖，其分子結(jié)構(gòu)式如下所示

其中，x、y、n和a為自然數(shù)，0＜x≤10⁷，0＜y≤10⁷，10²≤n≤10⁷，25≤a≤30。

上述殼聚糖衍生物的具體制備方法如下：

稱取5.0克殼聚糖加入到100毫升ph4.8的mes緩沖液中，50℃水浴下 機(jī)械攪拌一小時(shí)，以便殼聚糖溶解完全，從而得到質(zhì)量體積百分比濃度為5％的均勻殼聚糖溶液；然后，在室溫下，將聚-ε-賴氨酸、n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc·hcl)溶于25mmol/l的ph4.8的mes的緩沖溶液中，溶解2小時(shí)，獲得活化的聚-ε-賴氨酸溶液；將20ml活化的聚-ε-賴氨酸溶液加入殼聚糖溶液中，于室溫下持續(xù)攪拌反應(yīng)24小時(shí)，其中殼聚糖、聚-ε-賴氨酸、nhs和edc的摩爾比為5:1:4:4；然后將反應(yīng)液裝入透析袋，將透析袋兩端扎緊放入去離子水中透析處理，每隔八小時(shí)換水一次，換水八次后將透析液放入-86℃冰箱冷凍一小時(shí)后，放入凍干機(jī)直至凍干為止即可得所述聚-ε-賴氨酸改性的殼聚糖衍生物。對(duì)該實(shí)施例制備的聚-ε-賴氨酸改性的殼聚糖衍生物參照實(shí)施例1進(jìn)行抗菌性能與安全性能測(cè)試，其結(jié)果與實(shí)施例1類似。

實(shí)施例6：制備聚-ε-賴氨酸改性殼聚糖

一種聚-ε-賴氨酸改性殼聚糖，其分子結(jié)構(gòu)式如下所示

其中，x、y、n、a為自然數(shù)，0＜x≤10⁷，0＜y≤10⁷，10²≤n≤10⁷，25≤a≤30。

上述殼聚糖衍生物的具體制備方法如下：

稱取7.0克殼聚糖加入到100毫升ph4.8的mes緩沖液中，60℃的水浴條件下機(jī)械攪拌二小時(shí)，以便殼聚糖溶解完全，從而得到質(zhì)量體積百分比濃度為7％的均勻溶液；然后，將室溫下，將聚-ε-賴氨酸、n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc·hcl)溶于(25mmol/l的2-(n-嗎啉代)乙烷磺酸(mes)的緩沖溶液)中，溶解2小時(shí)，獲得活化的聚-ε-賴氨酸溶液；將30ml活化的聚-ε-賴氨酸溶液加入殼聚糖溶液中，于35℃水浴中持續(xù)攪拌反應(yīng)24小時(shí)，其中殼聚糖、聚-ε-賴氨酸、nhs和edc的摩爾比為4:1:3:3；然后將反應(yīng)液裝入透析袋，將透析袋兩端扎緊放入去離子水中透析處理，每隔十小時(shí)換水一次，換水六次后將透析液放入-86℃冰箱冷凍一小時(shí)后，放入凍干機(jī)直至凍干為止即可得所述聚-ε-賴氨酸改性的 殼聚糖衍生物。對(duì)該實(shí)施例制備的聚-ε-賴氨酸改性的殼聚糖衍生物參照實(shí)施例1進(jìn)行抗菌性能與安全性能測(cè)試，其結(jié)果與實(shí)施例1類似。

實(shí)施例7：制備聚-ε-賴氨酸改性殼聚糖

一種聚-ε-賴氨酸改性殼聚糖，其分子結(jié)構(gòu)式如下所示

其中，x、y、n和a為自然數(shù)，0＜x≤10⁷，0＜y≤10⁷，10²≤n≤10⁷，25≤a≤30。

上述殼聚糖衍生物的具體制備方法如下：

稱取10.0克殼聚糖加入到100毫升ph4.8的mes緩沖液中，60℃的水浴條件下機(jī)械攪拌兩小時(shí)，以便殼聚糖溶解完全，從而得到質(zhì)量體積百分比濃度為10％的均勻溶液；然后，在35℃水浴中，將聚-ε-賴氨酸、n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc·hcl)溶于25mmol/l的ph4.8的mes緩沖溶液中，溶解0.5小時(shí)，獲得活化的聚-ε-賴氨酸溶液；將40ml活化的聚-ε-賴氨酸溶液加入殼聚糖溶液中，于室溫下持續(xù)攪拌反應(yīng)6小時(shí)，其中殼聚糖、聚-ε-賴氨酸、nhs和edc的摩爾比為2:1:2:2；然后將反應(yīng)液裝入透析袋，將透析袋兩端扎緊放入去離子水中透析處理，每隔五小時(shí)換水一次，換水八次后將透析液放入-86℃冰箱冷凍一小時(shí)后，放入凍干機(jī)直至凍干為止即可得所述聚-ε-賴氨酸改性的殼聚糖衍生物。對(duì)該實(shí)施例制備的聚-ε-賴氨酸改性的殼聚糖衍生物參照實(shí)施例1進(jìn)行抗菌性能與安全性能測(cè)試，其結(jié)果與實(shí)施例1類似。

實(shí)施例8：制備聚-ε-賴氨酸改性殼聚糖

一種聚-ε-賴氨酸改性殼聚糖，其分子結(jié)構(gòu)式如下所示

其中，a、x、y和n為自然數(shù)，0＜x≤10⁷，0＜y≤10⁷，10²≤n≤10⁷，25≤a≤30。

上述殼聚糖衍生物的具體制備方法如下：

稱取15.0克殼聚糖加入到100毫升ph4.8的mes緩沖溶液中，80℃的水浴條件下機(jī)械攪拌兩小時(shí)，以便殼聚糖溶解完全，從而得到質(zhì)量體積百分比濃度為2％的均勻溶液；然后，在35℃水浴中，將聚-ε-賴氨酸、n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc·hcl)溶于ph4.8的mes的緩沖溶液中，溶解0.5小時(shí)，獲得活化的聚-ε-賴氨酸溶液；將50ml活化的聚-ε-賴氨酸溶液加入殼聚糖溶液中，于35℃水浴中持續(xù)攪拌反應(yīng)24小時(shí)，其中殼聚糖、聚-ε-賴氨酸、nhs、edc的摩爾比為2:2:1:1；然后將反應(yīng)液裝入透析袋，將透析袋兩端扎緊放入去離子水中透析處理，每隔十小時(shí)換水一次，換水六次后將透析液放入-86℃冰箱冷凍一小時(shí)后，放入凍干機(jī)直至凍干為止即可得所述聚-ε-賴氨酸改性的殼聚糖衍生物。對(duì)該實(shí)施例制備的聚-ε-賴氨酸改性的殼聚糖衍生物參照實(shí)施例1進(jìn)行抗菌性能與安全性能測(cè)試，其結(jié)果與實(shí)施例1類似。

實(shí)施例9：制備聚-ε-賴氨酸改性殼聚糖

一種聚-ε-賴氨酸改性殼聚糖，其分子結(jié)構(gòu)式如下所示

其中，x、y、n和a為自然數(shù)，0＜x≤10⁷，0＜y≤10⁷，10²≤n≤10⁷，25≤a≤30。

上述殼聚糖衍生物的具體制備方法如下：

稱取20.0克殼聚糖加入到100毫升ph4.8的mes緩沖溶液中，80℃的水浴條件下機(jī)械攪拌兩小時(shí)，以便殼聚糖溶解完全，從而得到質(zhì)量體積百分比濃度為20％的均勻溶液；然后，在35℃水浴中，將聚-ε-賴氨酸、n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc·hcl)溶于25mmol/l的ph4.8的mes的緩沖溶液中，溶解0.5小時(shí)，獲得活化的聚-ε-賴氨酸溶液；將50ml活化的聚-ε-賴氨酸溶液加入殼聚糖溶液中，于35℃ 水浴中持續(xù)攪拌反應(yīng)48小時(shí)，其中殼聚糖、聚-ε-賴氨酸、nhs和edc的摩爾比為1:1:1:1；然后將反應(yīng)液裝入透析袋，將透析袋兩端扎緊放入去離子水中透析處理，每隔十小時(shí)換水一次，換水六次后將透析液放入-86℃冰箱冷凍一小時(shí)后，放入凍干機(jī)直至凍干為止即可得所述聚-ε-賴氨酸改性的殼聚糖衍生物。對(duì)該實(shí)施例制備的聚-ε-賴氨酸改性的殼聚糖衍生物參照實(shí)施例1進(jìn)行抗菌性能與安全性能測(cè)試，其結(jié)果與實(shí)施例1類似。

對(duì)比例1：殼聚糖抗菌性能測(cè)試

殼聚糖采用涂板法對(duì)金色葡萄球菌進(jìn)行抗菌性能測(cè)試。將殼聚糖分散在中性的生理鹽水中，配成5mg/ml和2.5mg/ml殼聚糖溶液，涂于平板培養(yǎng)板上。并設(shè)置空白對(duì)照組，該平板培養(yǎng)基不添加任何抗菌劑。在待測(cè)試的平板培養(yǎng)基上涂菌后，在37℃的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36小時(shí)后，檢測(cè)抗菌測(cè)試結(jié)果。測(cè)試結(jié)果如圖4，從左到右依次是采用濃度為5mg/ml、2.5mg/ml和空白對(duì)照組。結(jié)果表明殼聚糖濃度為5mg/ml才能有效抑制金黃色葡萄球菌。

對(duì)比例2：殼聚糖抗菌性能測(cè)試

聚-ε-賴氨酸采用涂板法對(duì)金色葡萄球菌進(jìn)行抗菌性能測(cè)試。將聚-ε-賴氨酸溶解在中性的生理鹽水中，配成5mg/ml和2.5mg/ml的聚-ε-賴氨酸溶液，涂于平板培養(yǎng)板上。并設(shè)置空白對(duì)照組，該平板培養(yǎng)基不添加任何抗菌劑。在待測(cè)試的平板培養(yǎng)基上涂菌后，在37℃的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36小時(shí)后，檢測(cè)抗菌測(cè)試結(jié)果。測(cè)試結(jié)果如圖5，從左到右依次是采用濃度為5mg/ml、2.5mg/ml和空白對(duì)照組。結(jié)果表明聚-ε-賴氨酸濃度為2.5mg/ml時(shí)能有效地抑制金黃色葡萄球菌。

顯然，本發(fā)明的上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說(shuō)明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式的限定，對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在上述說(shuō)明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)，這里無(wú)法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉，凡是屬于本發(fā)明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見(jiàn)的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之列。