本發(fā)明屬于藥物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及氘代脫氫苯基阿夕斯丁類化合物的酸加成鹽及其在制備抗腫瘤的藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

((3z,6z)-3-苯亞甲基-6-((5-叔丁基-1h-咪唑-4-基)氘代亞甲基)哌嗪-2,5-二酮是以海洋曲霉菌的環(huán)二肽phenylahistin的衍生物脫氫苯基阿夕斯丁(plinabulin，處于三期臨床)為先導(dǎo)化合物，通過結(jié)構(gòu)改造獲得的一種新型微管蛋白結(jié)合劑，具有良好的抗腫瘤活性，并且能夠克服紫杉醇的耐藥性，它選擇性作用于內(nèi)皮微管蛋白的秋水仙堿結(jié)合位點附近，抑制微管蛋白聚合，阻斷微管形成，使細胞停在有絲分裂早期，進而誘導(dǎo)細胞死亡。同時抑制新生血管生成，阻斷癌細胞供養(yǎng)，從而協(xié)同抑制癌細胞的快速增值。具體結(jié)構(gòu)式為：

經(jīng)研究，(3z,6z)-3-苯亞甲基-6-((5-叔丁基-1h-咪唑-4-基)氘代亞甲基)哌嗪-2,5-二酮的ic50低于其類似物plinabulin，但其水溶性較差，嚴重制約了其在臨床藥物中的應(yīng)用。為提高((3z,6z)-3-苯亞甲基-6-((5-叔丁基-1h-咪唑-4-基)氘代亞甲基)哌嗪-2,5-二酮的成藥溶解性和生物利用度，對其酸加成鹽的研究顯得尤為重要。

同時，關(guān)于(3z,6z)-3-苯亞甲基-6-((5-叔丁基-1h-咪唑-4-基)氘代亞甲基)哌嗪-2,5-二酮酸加成鹽制備方法及其應(yīng)用還未見報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了氘代脫氫苯基阿夕斯丁類化合物的酸加成鹽及其在制備抗腫瘤的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明進一步提供了(3z,6z)-3-苯亞甲基-6-((5-叔丁基-1h-咪唑-4-基)氘代亞甲基)哌嗪-2,5-二酮酸加成鹽在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)：

本發(fā)明提供了氘代脫氫苯基阿夕斯丁類化合物的酸加成鹽，所述氘代脫氫苯基阿夕斯丁類化合物的酸加成鹽具有通式(ⅱ)所示結(jié)構(gòu)，它由具有通式(i)所示結(jié)構(gòu)的氘代脫氫苯基阿夕斯丁類化合物與酸反應(yīng)生成：

通式(i)和(ⅱ)中r1為苯環(huán)上的一取代到五取代不等的多取代取代基，取代基選自氫原子、氘原子、鹵素原子、羥基、甲氧基、氨基、苯基、氨基甲基苯基、苯甲?；?、c1-c24烷基、c2-c24烯基、c2-c24炔基、芳基烷基、雜環(huán)芳基烷基、c1-c24的?；?、c1-c24的烷氧基、羧基、羧酸酯基、酰胺基、n-單取代或n,n-雙取代酰胺基、磺酸基、磺酸酯基、磺酰胺基、n-取代磺酰胺基、烷氧基、芳基烷氧基、烷硫基、氰基、氨基、取代的氨基、硝基；環(huán)烷基、環(huán)烯基、芳香基、取代的芳香基、芳香雜環(huán)基、芳氧基、芳酰基、環(huán)氧基、環(huán)?；?、芳香硫基、芳磺酰基；

r2為氫原子或氘原子；

x1為氧原子或硫原子，x2為氧原子或硫原子；

x3為-nh、氧原子或硫原子；

(a)n中a代表酸，包括無機酸和有機酸，其中無機酸包括鹽酸、硫酸、磷酸；有機酸包括甲磺酸、三氟乙酸、對甲苯磺酸、草酸、馬來酸、富馬酸、乙酸、琥珀酸、檸檬酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、抗壞血酸、煙酸、脂肪族或芳香族的羧酸或磺酸；n代表1/2、1或2。

進一步的：所述化合物的酸加成鹽的制備方法包括以下步驟：將通式(i)所述化合物在有機溶劑中加熱溶解后，滴加有機溶劑溶解的1-2當(dāng)量的酸溶液，0-50℃攪拌反應(yīng)，析出固體，過濾，洗滌，干燥得氘代脫氫苯基阿夕斯丁類化合物的酸加成鹽固體。

進一步的：所述有機溶劑選用甲醇、乙醇、乙酸乙酯、異丙醇、四氫呋喃、二氯甲烷或丙酮中的一種或幾種。

進一步的：所述加熱溶解的溫度為加熱溶解溫度為15-50℃。

進一步的：所述氘代脫氫苯基阿夕斯丁類化合物的酸加成鹽為(3z,6z)-3-苯亞甲基-6-((5-叔丁基-1h-咪唑-4-基)氘代亞甲基)哌嗪-2,5-二酮的酸加成鹽。。

進一步的：所述(3z,6z)-3-苯亞甲基-6-((5-叔丁基-1h-咪唑-4-基)氘代亞甲基)哌嗪-2,5-二酮的酸加成鹽為其鹽酸鹽、甲磺酸鹽和草酸鹽；所述有機溶劑為甲醇、乙醇和丙酮中的一種或多種；所述加熱溶解溫度為40-50℃。

進一步的：((3z,6z)-3-苯亞甲基-6-((5-叔丁基-1h-咪唑-4-基)氘代亞甲基)哌嗪-2,5-二酮鹽酸鹽為結(jié)晶性粉末，其中化合物與鹽酸為摩爾比1:1成鹽，熔點為290-291℃，x-射線粉末衍射特征吸收峰如圖1所示。

進一步的：((3z,6z)-3-苯亞甲基-6-((5-叔丁基-1h-咪唑-4-基)氘代亞甲基)哌嗪-2,5-二酮甲磺酸鹽為結(jié)晶性粉末，其中化合物與甲磺酸為摩爾比1:1成鹽，熔點為303-305℃，x-射線粉末衍射特征吸收峰如圖2所示。

進一步的：((3z,6z)-3-苯亞甲基-6-((5-叔丁基-1h-咪唑-4-基)氘代亞甲基)哌嗪-2,5-二酮草酸鹽為結(jié)晶性粉末，其中化合物與草酸為摩爾比2:1成鹽，熔點為262-263℃，x-射線粉末衍射特征吸收峰如圖3所示。

本發(fā)明還提供了所述的氘代脫氫苯基阿夕斯丁類化合物的酸加成鹽在制備抗腫瘤的藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述腫瘤為包括非小細胞肺癌、胰腺癌、皮膚癌和白血病細胞在內(nèi)的實體瘤。

本發(fā)明的優(yōu)點和技術(shù)效果是：氘代脫氫苯基阿夕斯丁類化合物，特別是(3z,6z)-3-苯亞甲基-6-((5-叔丁基-1h-咪唑-4-基)氘代亞甲基)哌嗪-2,5-二酮存在溶解度低的問題，為了解決此問題，本發(fā)明提供了該類化合物的酸加成鹽及其制備工藝，此類化合物酸加成鹽的溶解度有明顯提高，這對于提高此類化合物活性成分在藥物應(yīng)用中的生物利用度具有重要意義，同時可以拓寬此類化合物在藥物應(yīng)用中的劑型選擇。

附圖說明

圖1是本發(fā)明((3z,6z)-3-苯亞甲基-6-((5-叔丁基-1h-咪唑-4-基)氘代亞甲基)哌嗪-2,5-二酮鹽酸鹽的x射線粉末衍射譜圖。

圖2是本發(fā)明((3z,6z)-3-苯亞甲基-6-((5-叔丁基-1h-咪唑-4-基)氘代亞甲基)哌嗪-2,5-二酮甲磺酸鹽的x射線粉末衍射譜圖。

圖3是本發(fā)明((3z,6z)-3-苯亞甲基-6-((5-叔丁基-1h-咪唑-4-基)氘代亞甲基)哌嗪-2,5-二酮草酸鹽的x射線粉末衍射譜圖。

具體實施方式

以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步詳細的說明。

實施例1

本發(fā)明所述具有通式(i)所示結(jié)構(gòu)的氘代脫氫苯基阿夕斯丁類化合物的制備方法包括以下步驟：

(1)氘醛化合物b的合成：從所述5-叔丁基-1h-咪唑-4-甲醛出發(fā)，經(jīng)由nabd4還原和二氧化錳氧化，得到5-叔丁基-1h-咪唑-4-氘代甲醛，

(2)第一步縮合反應(yīng)：先將二乙?；哙憾?dkp)與所述醛中間體a或者氘醛化合物b發(fā)生縮合反應(yīng)，形成雜環(huán)化合物c或者含氘雜環(huán)化合物d；

(3)第二步縮合反應(yīng)：再將所述雜環(huán)化合物c或者含氘雜環(huán)化合物d與第二縮合反應(yīng)醛發(fā)生縮合反應(yīng)形成所述氘代脫氫苯基阿夕斯丁類化合物；所述第二縮合反應(yīng)醛為苯甲醛、氘代苯甲醛或苯環(huán)上帶有取代基的苯甲醛衍生物、氘代苯甲醛衍生物；

實施例2

((3z,6z)-3-苯亞甲基-6-((5-叔丁基-1h-咪唑-4-基)氘代亞甲基)哌嗪-2,5-二酮鹽酸鹽的制備

其具體制備過程包括以下步驟：取((3z,6z)-3-苯亞甲基-6-((5-叔丁基-1h-咪唑-4-基)氘代亞甲基)哌嗪-2,5-二酮(100mg，0.30mmol)用3ml丙酮溶解，滴加丙酮稀釋的鹽酸(16mg，0.44mmol)。室溫攪拌反應(yīng)1.5h，抽濾，濾餅用丙酮洗，得白色固體，與鹽酸以摩爾比1:1成鹽，收率為72％。m.p.290-291℃；1hnmr(500mhz,dmso-d6)δ13.07(brs,1h),11.61(brs,1h),10.19(s,1h),8.36(brs,1h),7.51(d,j＝7.7hz,2h),7.41(t,j＝7.6hz,2h),7.31(t,j＝7.3hz,1h),6.77(s,1h),1.35(s,9h)，經(jīng)x射線粉末衍射測試，具體的特征吸收峰見圖1。

實施例3

((3z,6z)-3-苯亞甲基-6-((5-叔丁基-1h-咪唑-4-基)氘代亞甲基)哌嗪-2,5-二酮甲磺酸鹽的制備

其具體制備過程包括以下步驟：取((3z,6z)-3-苯亞甲基-6-((5-叔丁基-1h-咪唑-4-基)氘代亞甲基)哌嗪-2,5-二酮(200mg，0.59mmol)用4ml丙酮室溫下溶解，滴加丙酮稀釋的甲磺酸(86mg，0.89mmol)。室溫下攪拌反應(yīng)1.5h，抽濾，濾餅用丙酮洗。得白色固體229mg，收率89％，與甲磺酸以摩爾比1:1成鹽。m.p.303-305℃；1hnmr(500mhz,dmso-d6)δ12.92(brs,1h),11.69(brs,1h),10.20(s,1h),8.31(brs,1h),7.53(d,j＝7.6hz,2h),7.43(t,j＝7.7hz,2h),7.33(t,j＝7.3hz,1h),6.78(s,1h),2.33(s,3h),1.37(s,9h)，經(jīng)x射線粉末衍射測試，具體的特征吸收峰見圖2。

實施例4

((3z,6z)-3-苯亞甲基-6-((5-叔丁基-1h-咪唑-4-基)氘代亞甲基)哌嗪-2,5-二酮草酸鹽的制備

其具體制備過程包括以下步驟：取((3z,6z)-3-苯亞甲基-6-((5-叔丁基-1h-咪唑-4-基)氘代亞甲基)哌嗪-2,5-二酮(200mg，0.59mmol)用4ml丙酮室溫下溶解，緩慢加入草酸(112mg，0.89mmol)。室溫下攪拌反應(yīng)1.5h，抽濾，濾餅用丙酮洗。得白色固體219mg，收率80％，與草酸以摩爾比2:1成鹽。m.p.262-263℃；1hnmr(500mhz,dmso-d6)δ12.33(s,1h),12.23(s,1h),10.01(s,1h),7.86(s,1h),7.53(d,j＝7.6hz,2h),7.42(t,j＝7.6hz,2h),7.32(t,j＝7.4hz,1h),6.75(s,1h),1.39(s,9h)，經(jīng)x射線粉末衍射測試，具體的特征吸收峰見圖3。

實施例5：平衡溶解度的測定

分別稱取適量化合物，溶于dmso中，配成1mg/ml的母液。再用甲醇稀釋母液為不同濃度點，制作樣品的標(biāo)準曲線。

取1.5ml的棕色ep管，加入1ml的超純水。再分別取化合物適量，加入至棕色ep管中，渦旋振蕩，超聲至藥物不再溶解(溶液呈渾濁狀或有懸浮顆粒)。放入孵育振蕩器中，溫度保持(37±1)℃，100r/min，振搖24h，使其達到充分溶解平衡。24h之后，將飽和溶液取出，取上清液迅速用0.45um微孔濾膜過濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液用甲醇稀釋一倍。每組平行配制3份樣品。按照色譜條件進樣，測定峰面積并計算各化合物在純水中的平衡溶解度。測試結(jié)果見表1。

表1化合物的平衡溶解度數(shù)據(jù)

表1實驗結(jié)果表明，成鹽后，能大幅提高化合物的溶解度。

實施例6

通過mtt分析方法測定所選化合物對腫瘤細胞bxpc-3和jurkat生長的ic50。

實驗材料：

1)細胞株：人胰腺癌細胞bxpc-3、人急性t細胞白血病細胞jurkat。細胞生長于rpmi-1640培養(yǎng)基和高糖dmem(gibcobrl,rockville,md,usa)+10％胎牛血清(含2mml-glutamine,penicillinandstreptomycin)中，置37℃(5％co2–95％air)孵箱中生長，以0.25％的胰蛋白酶消化傳代，1～2d換液1次。

2)化合物的溶解與稀釋：根據(jù)化合物的分子量和質(zhì)量，分別用dmso(sigma)配制成10mm的母液，再以rpmi-1640培養(yǎng)基稀釋至需要濃度100μm(dmso含量≤3‰)。稀釋后的藥物-20℃保存。

3)rpmi1640細胞培養(yǎng)基，gibco公司；胎牛血清，hyclone公司；細胞消化液，0.25％trypsin+0.02％edta。

4)mtt液，mtt干粉(sigma)，用pbs充分溶解配成5mg/ml，0.22μm微孔濾膜過濾后分裝，-20℃保存。

實驗步驟：

1)細胞接種：取對數(shù)生長期的細胞，用胰酶消化后分散成單個細胞，計數(shù)，將細胞懸液調(diào)整至8.0×10⁴個/ml，每孔180μl接種于96孔板中，使接種的細胞數(shù)量為4.0×10³個/孔。細胞貼壁后，分別加入含有不同濃度化合物的新鮮培養(yǎng)基，使化合濃度分別是100nm、50nm、25nm、12.5nm、6.25nm、3.125nm，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔，操作時避光，并調(diào)整各濃度所含dmso含量一致。

2)藥物孵育72h后，每孔加入20μlmtt(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromide,sigma；5mg/ml)，置孵箱孵育4h后去上清，每孔加150μldmso溶解，用酶標(biāo)儀測定在570nm下的吸光度值。根據(jù)公式：抑制率＝[(a570對照孔-a570給藥孔)/a570對照孔]×100％，計算各濃度的抑制率，再算得ic50，結(jié)果見表2。

表2化合物對人體細胞株的ic50值(nm)

表2實驗結(jié)果表明，成鹽酸鹽后的體外抗腫瘤活性基本一致；成甲磺酸鹽的活性略有下降。

以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其進行限制；盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，依然可以對前述實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進行等同替換；而這些修改或替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明所要求保護的技術(shù)方案的精神和范圍。