本申請(qǐng)涉及一種作為選擇性的c-kit激酶抑制劑的化合物、包含這樣的化合物的藥物組合物、以及使用這樣的化合物或組合物抑制c-kit激酶活性的方法和用途。

背景技術(shù)：

c-kit是一種原癌基因，是hz4貓科肉瘤病毒的胞漿逆轉(zhuǎn)錄病毒同源物，位于4號(hào)染色體4q11-12，編碼一種相對(duì)分子質(zhì)量為145kd的跨膜糖蛋白，該蛋白屬受體酪氨酸激酶家族成員。c-kit受體分為膜外區(qū)、跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)三部分。c-kit的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，在許多惡性腫瘤中均有c-kit的高表達(dá)，包括胃腸道間質(zhì)瘤、前列腺癌、生殖細(xì)胞瘤、乳腺癌及小細(xì)胞肺癌等。受體酪氨酸激酶c-kit(又稱cd117)是由逆轉(zhuǎn)錄病毒原癌基因c-kit編碼的一類具有酪氨酸激酶活性的跨膜受體蛋白，與血小板衍生生長(zhǎng)因子受體(pdgfr)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子-1受體(csf-1r)和fms樣酪氨酸激酶受體3(flt3)共同組成ⅲ型受體酪氨酸激酶超家族，其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及侵襲、遷移和復(fù)發(fā)過程中起著十分重要的作用。抑制c-kit介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑以達(dá)到治療腫瘤的目的已成為近年來腫瘤治療的熱點(diǎn)，因此，c-kit是目前腫瘤分子靶向治療的熱門靶標(biāo)之一。

胃腸間質(zhì)瘤(gist)是人體消化系統(tǒng)常見的腫瘤疾病。胃腸間質(zhì)瘤的概念最早由mazur和clark在1983年提出，胃腸間質(zhì)瘤病理特征是平滑肌和神經(jīng)源性的消化道腫瘤表現(xiàn)特異。胃腸間質(zhì)瘤的發(fā)病率雖只約為十萬分之一至十萬分之二之間(我國每年新發(fā)gist病例約20000-30000)，然而，67％的胃腸間質(zhì)瘤是惡性的。胃腸間質(zhì)瘤多發(fā)于中老年人，主要集中在50-65歲年齡段，男女性別發(fā)病率無明顯差異性。據(jù)統(tǒng)計(jì)，胃腸間質(zhì)瘤約60-70％發(fā)生在胃部，20-30％發(fā)生在小腸，約10％發(fā)生在食管、直腸以及結(jié)腸。

胃腸間質(zhì)瘤的免疫組織化學(xué)的診斷特征是細(xì)胞表面抗原cd117(c-kit蛋白)陽性，cd117在胃腸間質(zhì)瘤的細(xì)胞表面和細(xì)胞漿內(nèi)廣泛表達(dá)，而在所有非胃腸間質(zhì)瘤的腫瘤細(xì)胞內(nèi)均不表達(dá)，cd117的高靈敏性和特異性使得它一直是胃腸間質(zhì)瘤的確診指標(biāo)。對(duì)于胃腸間質(zhì)瘤的治療，除了外科手術(shù)之外，近年興起的靶向激酶c-kit的抑制劑藥物已經(jīng)成為胃腸間質(zhì)瘤治療的另一種重要手段。目前，主要采用靶向c-kit的藥物伊馬替尼(imatinib)用于胃腸間質(zhì)瘤初期治療。但是，伊馬替尼由于抑制激酶bcr-abl，因而存在潛在的心臟毒性，部分患者服用伊馬替尼后會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的心臟毒性(r.等人,cardiotoxicityofthecancertherapeuticagentimatinibmesylate,nat.med.2006,12,908-916；perik,p.j.等人,resultsofplasman-terminalprob-typenatriureticpeptideandcardiactroponinmonitoringingistpatientsdonotsupporttheexistenceofimatinib-inducedcardiotoxicity,ann.oncol.2008,19,359-361；gianantonio,r.等人,inreplyto'cardiotoxicityofthecancertherapeuticagentimatinibmesylate',nat.med.2007,13,13-4)。

同時(shí)，采用伊馬替尼進(jìn)行治療的另一問題是患者對(duì)該藥物產(chǎn)生耐藥性。據(jù)統(tǒng)計(jì)，伊馬替尼的耐藥發(fā)生率可高達(dá)63％(包括原發(fā)耐藥和繼發(fā)耐藥)。研究發(fā)現(xiàn)，胃腸間質(zhì)瘤患者對(duì)伊馬替尼耐藥與c-kit基因突變有關(guān)，其導(dǎo)致其酪氨酸激酶活性持續(xù)活化，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控。c-kit基因突變多發(fā)生在其外顯子11、9、13以及17，c-kit基因突變多預(yù)示腫瘤的惡性程度高。

因此，研究者期望能夠開發(fā)出選擇性高的c-kit激酶抑制劑，排除潛在的心臟毒性風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)研究者還期望能夠開發(fā)出不僅對(duì)c-kit基因野生型表現(xiàn)出抑制作用、還對(duì)突變型c-kit基因表現(xiàn)出抑制作用的靶向藥物來替代伊馬替尼，從而解決耐藥性的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種選擇性的c-kit激酶抑制劑，包括式(i)的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽、溶劑化物、酯、酸、代謝物或前藥：

式(i)

其中，y選自ch和n；r1選自h、c1-6烷基、c1-6烷氧基和鹵素；r2選自c1-6烷基、c2-6烯基、苯基和雜芳基。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，y為ch。

在另外優(yōu)選的實(shí)施方式中，r1選自h、甲基、甲氧基和氯，特別是甲基。

在又一優(yōu)選的實(shí)施方式中，r2選自乙基、乙烯基、苯基、吡啶基、異噁唑基、噻吩基。特別地，r2進(jìn)一步優(yōu)選為2-吡啶基、3-吡啶基或4-吡啶基，最優(yōu)選4-吡啶基。

本發(fā)明還涉及包括以上化合物或其藥學(xué)可接受的鹽、溶劑化物、酯、酸、代謝物或前藥的藥物組合物，以及該化合物或藥物組合物抑制酪氨酸激酶c-kit(野生型或各種突變或其組合)和/或pdgfr(野生型或各種突變或其組合)活性的方法和用途，及其治療、預(yù)防或改善由酪氨酸激酶c-kit(野生型或各種突變或其組合)活性調(diào)節(jié)的或者受其影響的或者其中涉及酪氨酸激酶c-kit(野生型或各種突變或其組合)活性的疾病、障礙或病癥的方法和用途。

附圖說明

圖1a示出化合物4和伊馬替尼對(duì)人胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞gist-t1中的信號(hào)通路的蛋白的影響；圖1b示出化合物4和伊馬替尼對(duì)人胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞gist-882中的信號(hào)通路的蛋白的影響；圖1c示出化合物4、伊馬替尼和達(dá)沙替尼對(duì)慢性髓性白血病細(xì)胞k562中的信號(hào)通路的蛋白的影響；圖1d示出對(duì)比化合物a、伊馬替尼和達(dá)沙替尼對(duì)慢性髓性白血病細(xì)胞k562中的信號(hào)通路的蛋白的影響。

圖2a和2b分別示出化合物4和伊馬替尼對(duì)人胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞gist-t1以及對(duì)人胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞gist-882的細(xì)胞凋亡的影響。

圖3a和3b分別示出化合物4、伊馬替尼和舒尼替尼對(duì)人胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞gist-t1以及對(duì)人胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞gist-882中的細(xì)胞周期的影響。

圖4示出化合物4對(duì)c-kit激酶的體外抑制活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖5示出使用不同濃度的化合物4和伊馬替尼、溶媒對(duì)照分別對(duì)人胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞gist-t1細(xì)胞的小鼠腫瘤模型及人胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞gist-882細(xì)胞的小鼠腫瘤模型進(jìn)行處理得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中圖5a示出在人胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞gist-t1細(xì)胞的小鼠腫瘤模型中，不同處理組中的腫瘤的平均大小隨時(shí)間的變化；圖5b示出在人胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞gist-882細(xì)胞的小鼠腫瘤模型中，不同處理組中的腫瘤的平均大小隨時(shí)間的變化；圖5c示出在gist-t1細(xì)胞的小鼠腫瘤模型中，不同處理組中的小鼠的平均相對(duì)體重(以實(shí)驗(yàn)開始時(shí)的小鼠重量為基準(zhǔn)計(jì)算的百分?jǐn)?shù))隨時(shí)間的變化；圖5d示出在gist-882細(xì)胞的小鼠腫瘤模型中，不同處理組中的小鼠的平均相對(duì)體重(以實(shí)驗(yàn)開始時(shí)的小鼠重量為基準(zhǔn)計(jì)算的百分?jǐn)?shù))隨時(shí)間的變化；圖5e示出在gist-t1細(xì)胞的小鼠腫瘤模型中使用不同濃度的化合物4、伊馬替尼和溶媒處理小鼠28天后計(jì)算出的抑瘤率；圖5f示出在gist-882細(xì)胞的小鼠腫瘤模型中使用不同濃度的化合物4、伊馬替尼和溶媒處理小鼠21天后計(jì)算出的抑瘤率。

具體實(shí)施方式

術(shù)語

除非另外定義，所有本文使用的科技術(shù)語都具有與要求保護(hù)的主題所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員一般理解相同的含義。

除非另有說明，本發(fā)明采用本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的質(zhì)譜、nmr、hplc、蛋白質(zhì)化學(xué)、生物化學(xué)、重組dna技術(shù)和藥理學(xué)等常規(guī)方法。除非提供具體的定義，否則與本文描述的分析化學(xué)、合成有機(jī)化學(xué)、以及醫(yī)學(xué)和藥物化學(xué)等化學(xué)上相關(guān)的命名和實(shí)驗(yàn)室操作和技術(shù)，是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。一般而言，前述技術(shù)和步驟可以通過本領(lǐng)域眾所周知的和在各種一般文獻(xiàn)和更具體文獻(xiàn)中描述的常規(guī)方法來實(shí)施，這些文獻(xiàn)在本說明書中被引用和討論。

“烷基”是指脂肪族烴基團(tuán)，可以是支鏈或直鏈的烷基。根據(jù)結(jié)構(gòu)，烷基可以是單價(jià)基團(tuán)或雙價(jià)基團(tuán)(即亞烷基)。在本發(fā)明中，烷基優(yōu)選是具有1-8個(gè)碳原子的“低級(jí)烷基”。典型的烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、戊基、己基等。

“烷氧基”是指-o-烷基，其中烷基如本文中定義。典型的烷氧基包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基、己氧基等。

術(shù)語“鹵”或“鹵素”是指氟、氯、溴和碘。

術(shù)語“雜芳基”是指芳基中包括一個(gè)或多個(gè)選自氮、氧和硫的環(huán)雜原子。含n“雜芳基”部分是指芳香基中環(huán)上至少有一個(gè)骨架原子是氮原子。根據(jù)結(jié)構(gòu)，雜芳基可以是單價(jià)基團(tuán)或雙價(jià)基團(tuán)(即亞雜芳基)。雜芳基的實(shí)例包括但不限于吡啶基、咪唑基、嘧啶基、吡唑基、三唑基、吡嗪基、四唑基、呋喃基、噻吩基、異噁唑基、噻唑基、噁唑基、異噻唑基、吡咯基、喹啉基、異喹啉基、吲哚基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、吲唑基、吲嗪基、酞嗪基、噠嗪基、異吲哚基、蝶啶基、嘌呤基、噁二唑基、噻二唑基、呋喃基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、喹唑啉基、萘啶基和呋喃并吡啶基等。

本文使用的術(shù)語“酪氨酸激酶(tyrosineproteinkinase，tpk)”是一類催化atp上γ-磷酸轉(zhuǎn)移到蛋白酪氨酸殘基上的激酶，能催化多種底物蛋白質(zhì)酪氨酸殘基磷酸化，在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化中具有重要作用。

本文使用的術(shù)語激酶的“抑制”、“抑制的”或“抑制劑”，是指磷酸轉(zhuǎn)移酶活性被抑制。

本文公開的化合物的“代謝物”是當(dāng)該化合物被代謝時(shí)形成的化合物的衍生物。術(shù)語“活性代謝物”是指當(dāng)該化合物被代謝時(shí)形成的化合物的生物活性衍生物。本文使用的術(shù)語“被代謝”，是指特定物質(zhì)被生物體改變的過程總和(包括但不限于水解反應(yīng)和由酶催化的反應(yīng)，例如氧化反應(yīng))。因此，酶可以產(chǎn)生特定的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)榛衔?。例如，?xì)胞色素p450催化各種氧化和還原反應(yīng)，同時(shí)二磷酸葡萄糖甘酸基轉(zhuǎn)移酶催化活化的葡萄糖醛酸分子至芳香醇、脂肪族醇、羧酸、胺和游離的巰基的轉(zhuǎn)化。新陳代謝的進(jìn)一步的信息可以從《thepharmacologicalbasisoftherapeutics》，第九版，mcgraw-hill(1996)獲得。本文公開的化合物的代謝物可以通過將化合物給予宿主并分析來自該宿主的組織樣品、或通過將化合物與肝細(xì)胞在體外孵育并且分析所得化合物來鑒別。這兩種方法都是本領(lǐng)域已知的。在一些實(shí)施方式中，化合物的代謝物是通過氧化過程形成并與相應(yīng)的含羥基化合物對(duì)應(yīng)。在一些實(shí)施方式中，化合物被代謝為藥物活性代謝物。本文使用的術(shù)語“調(diào)節(jié)”，是指直接或間接與靶標(biāo)相互作用，以改變靶標(biāo)的活性，僅僅舉例來說，包括增強(qiáng)靶標(biāo)的活性、抑制靶標(biāo)的活性、限制靶標(biāo)的活性或者延長(zhǎng)靶標(biāo)的活性。

本文使用的術(shù)語“靶蛋白”是指能被選擇性結(jié)合化合物所結(jié)合的蛋白質(zhì)分子或部分蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方式中，靶蛋白是酪氨酸激酶c-kit(野生型或各種突變或其組合)和/或pdgfr(野生型或各種突變或其組合)。在某些實(shí)施方式中，靶蛋白是野生型酪氨酸激酶c-kit(野生型或各種突變或其組合)。在某些實(shí)施方式中，靶蛋白是野生型酪氨酸激酶c-kit。

本文使用的gi50是指使50％細(xì)胞生長(zhǎng)被抑制所需的藥物濃度，即藥物使50％細(xì)胞(如癌細(xì)胞)的生長(zhǎng)得到抑制或控制時(shí)的藥物濃度。

本文使用的ic50是指在測(cè)量這樣的效應(yīng)的分析中獲得最大效應(yīng)的50％抑制的特定測(cè)試化合物的量、濃度或劑量。

本文使用的ec50是指測(cè)定化合物的劑量、濃度或量，其引起特定測(cè)定化合物誘導(dǎo)、刺激或加強(qiáng)的特定反應(yīng)的50％的最大表達(dá)的劑量依賴反應(yīng)。

在本申請(qǐng)中，特定的基因或其所編碼的蛋白質(zhì)用相同的字母組合符號(hào)(部分符號(hào)中還使用阿拉伯?dāng)?shù)字)表示，而不考慮其中的字母是為大寫或是小寫。舉例來說，本文使用的kit和/或kit和/或ckit和/或c-kit和/或kit均指代kit基因和/或kit蛋白；本文所使用的bcr-abl和/或bcr-abl和/或bcr-abl和/或bcr/abl和/或bcr/abl1和/或bcr/abl1和/或bcr/abl1均指代bcr-abl基因和/或bcr-abl蛋白。并且，根據(jù)本申請(qǐng)的上下文，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定特定表述中的字母符號(hào)是指代基因還是蛋白質(zhì)。

本發(fā)明新型的激酶抑制劑

本發(fā)明提供一種選擇性的c-kit激酶抑制劑，包括式(i)的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽、溶劑化物、酯、酸、代謝物或前藥：

式(i)

其中，y選自ch和n；r1選自h、c1-6烷基、c1-6烷氧基和鹵素；r2選自c1-6烷基、c2-6烯基、苯基和雜芳基。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，y為ch。

在另外優(yōu)選的實(shí)施方式中，r1選自h、甲基、甲氧基和氯，特別是甲基。

在又一優(yōu)選的實(shí)施方式中，r2選自乙基、乙烯基、苯基、吡啶基、異噁唑基、噻吩基。特別地，r2進(jìn)一步優(yōu)選為2-吡啶基、3-吡啶基或4-吡啶基，最優(yōu)選4-吡啶基。

本發(fā)明特別優(yōu)選的化合物包括下述化合物：

對(duì)于各個(gè)變量，上述基團(tuán)的任意組合也在本文考慮之中。可以理解的是：本文所提供的化合物上的取代基和取代模式可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行選擇，以便提供化學(xué)上穩(wěn)定的且可以使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)以及本文闡述的技術(shù)合成的化合物。

本文描述的是新型的激酶抑制劑。本文也描述了此化合物的藥學(xué)可接受的鹽、溶劑化物、酯、酸、藥物活性代謝物和前藥。

在另外的或進(jìn)一步的實(shí)施方式中，將本文描述的化合物給予有需要的生物體后在其體內(nèi)代謝產(chǎn)生代謝物，所產(chǎn)生的代謝物然后用于產(chǎn)生期望的效果，包括期望的治療效果。

本文描述的化合物可以被制成和/或被用作藥學(xué)可接受的鹽。藥學(xué)可接受的鹽的類型包括但不限于：(1)酸加成鹽、通過將化合物的游離堿形式與藥學(xué)可接受的無機(jī)酸反應(yīng)形成，所述無機(jī)酸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、偏磷酸等；或與有機(jī)酸反應(yīng)形成，所述有機(jī)酸如乙酸、丙酸、己酸、環(huán)戊烷丙酸、羥基乙酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸、馬來酸、酒石酸、反丁烯二酸、三氟乙酸、苯甲酸、3-(4-羥基苯甲酰基)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、1,2-乙二磺酸、2-羥基乙磺酸、苯磺酸、甲苯磺酸、4-甲基雙環(huán)-[2.2.2]辛-2-烯-1-甲酸、2-萘磺酸、叔丁基乙酸、葡庚糖酸、4,4'-亞甲基雙-(3-羥基-2-烯-1-甲酸)、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、十二烷基硫酸、葡糖酸、谷氨酸、水楊酸、羥基萘酸、硬脂酸、粘康酸等；(2)堿加成鹽，其在母體化合物中的酸性質(zhì)子被金屬離子置換時(shí)形成，例如堿金屬離子(例如鋰、鈉、鉀)、堿土金屬離子(例如鎂或鈣)或鋁離子；或與有機(jī)堿配位。可接受的有機(jī)堿包括乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、三甲胺、n-甲基葡萄糖胺，等等?？山邮艿臒o機(jī)堿包括氫氧化鋁、氫氧化鈣、氫氧化鉀、碳酸鈉、氫氧化鈉等。

藥學(xué)可接受的鹽的相應(yīng)的平衡離子可以使用各種方法分析和鑒定，所述方法包括但不限于離子交換色譜、離子色譜、毛細(xì)管電泳、電感耦合等離子體、原子吸收光譜、質(zhì)譜或它們的任何組合。

使用以下技術(shù)的至少一種回收所述鹽：過濾、用非溶劑沉淀接著過濾、溶劑蒸發(fā)，或水溶液的情況下使用凍干法。

篩選和表征藥學(xué)可接受的鹽、多晶型和/或溶劑化物可以使用多種技術(shù)完成，所述技術(shù)包括但不限于熱分析、x射線衍射、光譜、顯微鏡方法、元素分析。使用的各種光譜技術(shù)包括但不限于raman、ftir、uvis和nmr(液體和固體狀態(tài))。各種顯微鏡技術(shù)包括但不限于ir顯微鏡檢術(shù)和拉曼(raman)顯微鏡檢術(shù)。

本發(fā)明的藥物組合物

本申請(qǐng)還提供藥物組合物，其包含至少一種式(i)的化合物或所述化合物的藥學(xué)可接受的鹽、溶劑化物、酯、酸、藥物活性代謝物或前藥，以及藥學(xué)可接受的載體或賦形劑，以及者任選的其它治療劑。

在治療過程中，可以根據(jù)情況單獨(dú)或與一種或多種其它的治療劑組合使用?？梢酝ㄟ^注射、口服、吸入、直腸和經(jīng)皮施用中的至少一種將包含本發(fā)明化合物的藥物施用給患者。其它的治療劑可以選自以下藥物：免疫抑制劑(例如他克莫司、環(huán)抱菌素、雷帕霉素、甲氨蝶嶺、環(huán)磷酰胺、硫唑嘌呤、巰嘌呤、麥考酚酯或fty720)、糖皮質(zhì)激素類藥(例如潑尼松、醋酸可的松、潑尼松龍、甲潑尼龍、地塞米松、倍他米松、曲安西龍、氫羥強(qiáng)的松龍、倍氯米松、醋酸氟氫可的松、醋酸脫氧皮質(zhì)酮、醛固酮)、非甾體抗炎藥(例如水楊酸鹽、芳基烷酸、2-芳基丙酸、n-芳基鄰氨基苯甲酸、昔康類、考昔類或硫酰替苯胺)、變態(tài)反應(yīng)疫苗、抗組胺藥、抗白三烯藥、β-激動(dòng)劑、茶堿、抗膽堿藥或其它選擇性激酶抑制劑(例如mtor抑制劑、c-met抑制劑)或her2抗體-藥物。另外，所提及的其它治療劑還可以是雷帕霉素(rapamycin)、克唑替尼(crizotinib)、他莫昔芬、雷洛昔芬、阿那曲唑、依西美坦、來曲唑、赫賽汀^tm(曲妥珠單抗)、格列衛(wèi)^tm(伊馬替尼)、紫杉醇^tm(紫杉醇)、環(huán)磷酰胺、洛伐他汀、美諾四環(huán)素(minosine)、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶(5-fu)、甲氨蝶呤(mtx)、紫杉特爾^tm(多西他賽)、諾雷德^tm(戈舍瑞林)、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、諾考達(dá)唑、替尼泊苷、依托泊苷、健擇^tm(吉西他濱)、埃博霉素(epothilone)、諾唯本、喜樹堿、柔紅霉素(daunonibicin)、更生霉素、米托蒽醌、安吖啶、多柔比星(亞德里亞霉素)、表柔比星或伊達(dá)比星?；蛘?，其它治療劑也可以是細(xì)胞因子例如g-csf(粒細(xì)胞集落刺激因子)?；蛘?，其它治療劑也可以是，例如但不限于，cmf(環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶)、caf(環(huán)磷酰胺、亞德里亞霉素和5-氟尿嘧啶)、ac(亞德里亞霉素和環(huán)磷酰胺)、fec(5-氟尿嘧啶、表柔比星和環(huán)磷酰胺)、act或atc(亞德里亞霉素、環(huán)磷酰胺和紫杉醇)或cmfp(環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶和潑尼松)。

在本發(fā)明的實(shí)施方式中，在根據(jù)本發(fā)明對(duì)患者進(jìn)行治療時(shí)，給定藥物的量取決于諸多因素，如具體的給藥方案、疾病或病癥類型及其嚴(yán)重性、需要治療的受治療者或宿主的獨(dú)特性(例如體重)，但是，根據(jù)特定的周圍情況，包括例如已采用的具體藥物、給藥途徑、治療的病癥、以及治療的受治療者或宿主，施用劑量可由本領(lǐng)域已知的方法常規(guī)決定。通常，就成人治療使用的劑量而言，施用劑量典型地在0.02-5000mg/天，例如約1-1500mg/天的范圍。該所需劑量可以方便地被表現(xiàn)為一劑、或同時(shí)給藥的(或在短時(shí)間內(nèi))或在適當(dāng)?shù)拈g隔的分劑量，例如每天二、三、四劑或更多分劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，盡管給出了上述劑量范圍，但具體的有效量可根據(jù)患者的情況并結(jié)合醫(yī)師診斷而適當(dāng)調(diào)節(jié)。

本發(fā)明的藥物的用途

式(i)的化合物能包括其藥學(xué)可接受的鹽、溶劑化物、酯、酸、代謝物或前藥、或藥物組合物抑制一種用于抑制酪氨酸激酶c-kit(野生型或各種突變或其組合)和/或pdgfr(野生型或各種突變或其組合)活性。式(i)的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽、溶劑化物、酯、酸、代謝物或前藥，或其藥物組合物可用于治療、預(yù)防或改善一種或多種選自下組的疾?。簩?shí)體瘤(包括良性或者尤其惡性類型)、尤其肉瘤、胃腸道間質(zhì)腫瘤(gastrointestinalstromaltumors，gist)、結(jié)直腸癌(coloncancer)、急性粒細(xì)胞白血病(acutemyeloblasticleukemia，aml)、慢性髓性白血病(chronicmyelogenousleukemia,cml)、瘤形成、甲狀腺癌、系統(tǒng)性肥大細(xì)胞病、嗜酸性粒細(xì)胞增多綜合征、纖維變性、紅斑狼瘡、移植物抗宿主病、神經(jīng)纖維瘤、肺高壓、阿爾茨海默病、精原細(xì)胞瘤、無性細(xì)胞瘤、肥大細(xì)胞腫瘤、肺癌、支氣管癌、睪丸上皮內(nèi)瘤形成、黑色素瘤、乳癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、乳頭狀/濾泡型甲狀腺癌、惡性淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、2型多發(fā)性內(nèi)分泌瘤形成、嗜鉻細(xì)胞瘤、甲狀腺癌、甲狀旁腺增生/腺瘤、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸腺瘤、卵巢癌、前列腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、腦腫瘤、惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胰腺癌、惡性胸膜間皮瘤、成血管細(xì)胞瘤、血管瘤、腎癌、肝癌、腎上腺癌、膀胱癌、胃癌、直腸癌、陰道癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、多發(fā)性骨髓瘤、頸和頭部腫瘤、以及其他增生性或增殖性疾病或類似疾病、或其組合。特別優(yōu)選治療胃腸道間質(zhì)瘤(gastrointestinalstromaltumors,gist)、結(jié)直腸癌(colorectalcancer)、急性粒細(xì)胞白血病(acutemyeloblasticleukemia，aml)、慢性髓性白血病(chronicmyelogenousleukemia,cml)、甲狀腺癌(thyroidcarcinoma)或類似疾病、或其組合。

式(i)所述化合物或其藥學(xué)可接受的鹽、溶劑化物、酯、酸、代謝物或前藥，或其藥物組合物可用于治療、預(yù)防或改善選自下組的自身免疫性疾?。宏P(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸病、銀屑病性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、斯蒂爾病(still'sdisease)、青少年關(guān)節(jié)炎、糖尿病、重癥肌無力癥、橋本甲狀腺炎(hashimoto'sthyroiditis)、奧德甲狀腺炎(ord'shyroiditis)、格雷夫斯病(graves'disease)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎綜合征(syndrome)、多發(fā)性硬化癥、傳染性神經(jīng)元炎(guillain-barrésyndrome)、急性播散性腦脊髓炎、阿狄森病(addison'sdisease)、視性眼陣孿-肌陣孿綜合征、強(qiáng)直性脊椎炎、抗磷脂抗體綜合征、再生障礙性貧血、自身免疫性肝炎、乳糜瀉(coeliacdisease)、古德帕斯徹綜合征(goodpasture'ssyndrome)、特發(fā)性血小板減少性紫癜、視神經(jīng)炎、硬皮病、原發(fā)性膽汁性肝硬化、萊特爾綜合征(reiter'ssyndrome)、高安動(dòng)脈炎(takayasu'sarteritis)、顳動(dòng)脈炎、溫型自身免疫性溶血性貧血、韋格納肉芽腫病(wegener'sgranulomatosis)、銀屑病、全身脫毛、貝赫切特病(behcet'sdisease)、慢性疲勞、家族性自主神經(jīng)功能異常、子宮內(nèi)膜異位、間質(zhì)性膀胱炎、神經(jīng)肌強(qiáng)直、硬皮病或外陰痛。

化合物的制備

使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)合成技術(shù)或使用本領(lǐng)域已知的方法與本文描述的方法組合，可以合成式(i)的化合物。另外，本文給出的溶劑、溫度和其它反應(yīng)條件可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)而改變。作為進(jìn)一步的指導(dǎo)，也可以利用以下的合成方法。

所述反應(yīng)可以按順序使用，以提供本文描述的化合物；或它們可以用于合成片段，所述片段通過本文描述的方法和/或本領(lǐng)域已知的方法隨后加入。

在某些實(shí)施方式中，本文提供的是本文描述的酪氨酸激酶抑制劑化合物的制備方法及其使用方法。在某些實(shí)施方式中，本文描述的化合物可以使用以下合成的方案合成?？梢允褂门c下述類似的方法，通過使用適當(dāng)?shù)目蛇x擇的起始原料，合成化合物。

用于合成本文描述的化合物的起始原料可以被合成或可以從商業(yè)來源獲得。本文描述的化合物和其它相關(guān)具有不同取代基的化合物可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)和原料合成。制備本文公開的化合物的一般方法可以來自本領(lǐng)域已知的反應(yīng)，并且該反應(yīng)可以通過由本領(lǐng)域技術(shù)人員所認(rèn)為適當(dāng)?shù)脑噭┖蜅l件修改，以引入本文提供的分子中的各種部分。

如果需要，反應(yīng)產(chǎn)物可以使用常規(guī)技術(shù)分離和純化，包括但不限于過濾、蒸餾、結(jié)晶、色譜等方法。這些產(chǎn)物可以使用常規(guī)方法表征，包括物理常數(shù)和圖譜數(shù)據(jù)。

制備式(i)的化合物的合成方案的非限制性實(shí)施例參見以下合成路線。

實(shí)施例1

化合物4的合成

叔丁基4-(2-甲基-5-硝基苯氧基)哌啶-1-羧酸酯化合物a的合成

將5mmol2-甲基-5-硝基苯酚、6mmol1-叔丁氧羰基-4-甲烷磺酰氧基哌啶以及10mmol無水碳酸鉀分別依次加入15毫升無水n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中。反應(yīng)體系于80攝氏度反應(yīng)過夜，冷卻至室溫，反應(yīng)體系用乙酸乙酯萃取，合并有機(jī)相并用無水硫酸鈉干燥。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑，粗產(chǎn)品用硅膠色譜柱分離，得到產(chǎn)品叔丁基4-(2-甲基-5-硝基苯氧基)哌啶-1-羧酸酯化合物a(產(chǎn)率：89％)。exactmass(計(jì)算值):336.17；ms(esi)m/z(m+na)⁺:359.20。

叔丁基4-(2-甲基-5-氨基苯氧基)哌啶-1-羧酸酯化合物b的合成

將4mmol叔丁基4-(2-甲基-5-硝基苯氧基)哌啶-1-羧酸酯化合物a溶解于20毫升乙酸乙酯中，然后加入0.05當(dāng)量的pd/c(10％)。體系于一個(gè)大氣壓氫氣環(huán)境下反應(yīng)6小時(shí)。反應(yīng)體系用硅藻土過濾，收集濾液并除去溶劑得產(chǎn)品叔丁基4-(2-甲基-5-氨基苯氧基)哌啶-1-羧酸酯化合物b(產(chǎn)率：96％)。exactmass(計(jì)算值):306.19；ms(esi)m/z(m+na)⁺:329.23。

叔丁基4-(2-甲基-5-(3-(三氟甲基)苯甲酰氨基)苯氧基)哌啶-1-甲酸化合物c的合成

將5mmol的叔丁基4-(2-甲基-5-氨基苯氧基)哌啶-1-羧酸酯b、5mmol3-三氟甲基苯甲酸、10mmoln,n-二異丙基乙胺(dipea)以及15毫升n,n-二甲基甲酰胺(dmf)依次加入50毫升的圓底燒瓶，攪拌狀態(tài)下加入6mmol的2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hatu)。反應(yīng)體系于室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2小時(shí)。用乙酸乙酯萃取反應(yīng)體系，并經(jīng)無水硫酸鈉干燥；用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑，粗產(chǎn)品用硅膠色譜柱分離，得到產(chǎn)品叔丁基4-(2-甲基-5-(3-(三氟甲基)苯甲酰氨基)苯氧基)哌啶-1-甲酸化合物c(產(chǎn)率：82％)。exactmass(計(jì)算值):478.20；ms(esi)m/z(m+h)⁺:479.20。

n-(4-甲基-3-(哌啶-4-氧基)苯基)-3-(三氟甲基)苯甲酰胺鹽酸鹽化合物d的合成

3mmol叔丁基4-(2-甲基-5-(3-(三氟甲基)苯甲酰氨基)苯氧基)哌啶-1-甲酸化合物c于25ml圓底燒瓶中加入20ml的4n的鹽酸/乙酸乙酯溶液并在室溫?cái)嚢?h，抽濾得固體并用乙酸乙酯洗滌，然后干燥得產(chǎn)品n-(4-甲基-3-(哌啶-4-氧基)苯基)-3-(三氟甲基)苯甲酰胺鹽酸鹽化合物d(產(chǎn)率：76％)。exactmass(計(jì)算值):378.15；ms(esi)m/z(m+h)⁺:379.15。

n-(4-甲基-3-(1-異煙酸基哌啶-4-基)氧基)苯基)-3-(三氟甲基)苯甲酰胺化合物4的合成

將0.05mmol的n-(4-甲基-3-(哌啶-4-氧基)苯基)-3-(三氟甲基)苯甲酰胺鹽酸鹽d、0.05mmol異煙酸、0.1mmoln,n-二異丙基乙胺(dipea)以及1毫升n,n-二甲基甲酰胺(dmf)依次加入5毫升的圓底燒瓶，攪拌狀態(tài)下加入0.06mmol的2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hatu)。反應(yīng)體系于室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2小時(shí)。用乙酸乙酯萃取反應(yīng)體系，并經(jīng)無水硫酸鈉干燥；用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑，粗產(chǎn)品用硅膠色譜柱分離，得到產(chǎn)品n-(4-甲基-3-(1-異煙酸基哌啶-4-基)氧基)苯基)-3-(三氟甲基)苯甲酰胺化合物4(產(chǎn)率：67％)。

¹hnmr(400mhz，dmso-d6)δ10.37(s,1h),8.67(s,2h),8.27(s,2h),7.96(d,j＝6.8hz,1h),7.79-7.76(m,1h),7.48(s,1h),7.43(s,2h),7.29(d,j＝8.0hz,1h),7.14(d,j＝7.6hz,1h),4.60(s,1h),3.83-3.28(m,4h),2.16(s,3h),1.95(s,2h),1.77(s,2h)。exactmass(計(jì)算值):483.17；ms(esi)m/z(m+h)⁺:484.17。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可采用適當(dāng)?shù)脑?，根?jù)已知的標(biāo)準(zhǔn)合成技術(shù)以與以上實(shí)施例1類似的方法步驟合成本發(fā)明的其它優(yōu)選化合物。其實(shí)例如下表1所示。

表1.本發(fā)明的示例性化合物及其表征數(shù)據(jù)

實(shí)施例2

新型激酶抑制劑對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

通過測(cè)試本發(fā)明的化合物4作為c-kit抑制劑對(duì)癌細(xì)胞增殖的影響，我們對(duì)本發(fā)明的化合物在癌細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)中的活性和選擇性進(jìn)行了評(píng)估，并以尼洛替尼(nilotinib)(購自上海皓元化學(xué)科技有限公司)、伊馬替尼(購自上海皓元化學(xué)科技有限公司)、對(duì)比化合物a、b、c作為對(duì)照：

本實(shí)施例選用了慢性髓性白血病細(xì)胞k562(表達(dá)p210bcr-abl突變型基因)、人成巨核細(xì)胞白血病細(xì)胞meg-01(表達(dá)p210bcr-abl突變型基因)、人外周血嗜堿性白血病細(xì)胞ku812(表達(dá)bcr-abl突變型基因)(上述細(xì)胞均購自atcc(美國))、人胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞系細(xì)胞gist-t1(表達(dá)野生型c-kit基因)(購自cosmobioco.,ltd.(日本))、人胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞系細(xì)胞gist-882(表達(dá)野生型c-kit基因)(美國哈佛大學(xué)dana-farber癌癥研究所professorgray實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送)、小鼠原b細(xì)胞baf3(購自atcc(美國)。

此外，本實(shí)施例還選用了小鼠p210/baf3(穩(wěn)定表達(dá)p210bcr-abl突變型基因)、小鼠tel-abl-baf3(穩(wěn)定表達(dá)野生型abl激酶)、小鼠tel-ckit-baf3(穩(wěn)定表達(dá)c-kit野生型激酶)、小鼠tel-ckit/v559d-baf3(穩(wěn)定表達(dá)c-kitv559d突變型激酶)、小鼠tel-ckit/v559d/v654a-baf3(穩(wěn)定表達(dá)c-kitv559d/v654a突變型激酶)、小鼠tel-ckit/n822k-baf3(穩(wěn)定表達(dá)c-kitn822k突變型激酶)、小鼠tel-ckit/v654a-baf3(穩(wěn)定表達(dá)c-kitv654a突變型激酶)、小鼠tel-ckit/l567p-baf3(穩(wěn)定表達(dá)c-kitl567p突變型激酶)、小鼠tel-ckit/t670i-baf3(穩(wěn)定表達(dá)c-kitt670i突變型激酶)、小鼠tel-pdgfrα-baf3(穩(wěn)定表達(dá)pdgfrα激酶)、小鼠tel-pdgfrβ-baf3(穩(wěn)定表達(dá)pdgfrβ激酶)、小鼠tel-vegfr2-baf3(穩(wěn)定表達(dá)vegfr2激酶)、小鼠tel-ret-baf3(穩(wěn)定表達(dá)ret激酶)。上述細(xì)胞系均由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，構(gòu)建方法為：經(jīng)pcr分別擴(kuò)增人類p210bcr-abl、abl、c-kit、c-kitv559d、c-kitv559d/v654a、c-kitn822k、c-kitv654a、c-kitl567p、c-kitt670i、pdgfrα、pdgfrβ、vegfr2、ret激酶區(qū)序列，并分別插入到帶有n端tel片段和/或者npm片段和/或者tpr片段的mscv-puro載體(購自clontech)，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒方法，穩(wěn)定轉(zhuǎn)入小鼠baf3細(xì)胞，并且撤除il-3生長(zhǎng)因子，最終得到依賴p210bcr-abl、abl、c-kit、c-kitv559d、c-kitv559d/v654a、c-kitn822k、c-kitv654a、c-kitl567p、c-kitt670i、pdgfrα、pdgfrβ、vegfr2、ret轉(zhuǎn)入蛋白的細(xì)胞系。

在實(shí)施例中將不同濃度(0.000508μm、0.00152μm、0.00457μm、0.0137μm、0.0411μm、0.123μm、0.370μm、1.11μm、3.33μm、10μm)的化合物4及對(duì)照化合物尼洛替尼、伊馬替尼、對(duì)比化合物a、b、c(按照與實(shí)施例1類似的方法在實(shí)驗(yàn)室合成)分別加入到上述細(xì)胞中，并孵育72小時(shí)，通過cck-8(購自貝博生物公司，中國上海)細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒(cck-8可被活細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物，生成的甲瓚物數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比)對(duì)孵育后的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，通過酶標(biāo)儀對(duì)活細(xì)胞的數(shù)目進(jìn)行定量，并計(jì)算化合物和各個(gè)對(duì)照化合物的gi50(結(jié)果示于表2)。

表2所示的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的化合物4對(duì)表達(dá)野生型abl及突變型bcr-abl激酶的細(xì)胞的增殖均無明顯抑制作用(gi50均大于5μm)，對(duì)表達(dá)野生型c-kit激酶的細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用(gi50均小于0.5μm)。這樣的結(jié)果表明，對(duì)于abl激酶(野生型或突變型)和c-kit激酶(野生型或突變型)，本發(fā)明的化合物4選擇性地并且有效地抑制c-kit激酶。

相比之下，在同樣的實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照化合物尼洛替尼、伊馬替尼、對(duì)比化合物b和c不僅對(duì)表達(dá)c-kit激酶的細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用(gi50均小于0.5μm)，并且對(duì)表達(dá)野生型abl及突變型bcr-abl激酶的細(xì)胞的增殖也具有明顯的抑制作用。這樣的結(jié)果表明，對(duì)照化合物尼洛替尼、伊馬替尼、對(duì)比化合物b和c對(duì)于abl激酶(野生型或突變型)和c-kit激酶(野生型或突變型)的抑制作用相近，換言之，上述四種對(duì)照化合物表現(xiàn)出的選擇性較差。

上述比較說明，本發(fā)明的化合物4表現(xiàn)出優(yōu)于對(duì)照化合物尼洛替尼、伊馬替尼、對(duì)比化合物b和c的c-kit激酶選擇性。

另外，表2的結(jié)果還反映出本發(fā)明的化合物4對(duì)表達(dá)突變型c-kit激酶的細(xì)胞(例如tel-ckit/v559d-baf3細(xì)胞)的抑制作用。由于在胃腸間質(zhì)瘤(gist)治療中出現(xiàn)的耐藥性與c-kit激酶的突變有關(guān)，本實(shí)施例的結(jié)果揭示了本發(fā)明的化合物4用于gist患者二期治療的可能性，這有助于解決gist患者在服藥后出現(xiàn)與c-kit激酶突變相關(guān)的耐藥性的問題。

表2.不同的抑制劑對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響(結(jié)果示為gi50值，單位為μm)

實(shí)施例3

化合物4、對(duì)比化合物a、伊馬替尼和達(dá)沙替尼各自對(duì)細(xì)胞信號(hào)通路的影響

在人胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞系gist-t1(表達(dá)野生型c-kit基因)、人胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞系gist-882(表達(dá)野生型c-kit基因)、及慢性髓性白血病細(xì)胞k562(表達(dá)p210bcr-abl突變型基因)三株細(xì)胞上，通過測(cè)定多個(gè)細(xì)胞生化終點(diǎn)和功能性終點(diǎn)，對(duì)化合物4、及對(duì)比化合物a、伊馬替尼、達(dá)沙替尼(dasatinib)(購自上海皓元化學(xué)科技有限公司)對(duì)細(xì)胞中c-kit蛋白激酶、bcr-abl融合蛋白以及與這些蛋白密切相關(guān)的其他蛋白激酶stat5、akt、erk、s6k、s6、pdgfrα等蛋白的磷酸化的影響進(jìn)行評(píng)估。

使用不同濃度0μm、0.03μm、0.1μm、0.3μm、1μm、3μm、10μm的化合物4以及1μm的對(duì)照化合物伊馬替尼，分別處理胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞系gist-t1及gist-882兩株細(xì)胞2小時(shí)；使用不同濃度0μm、0.01μm、0.03μm、0.1μm、0.3μm、1μm、3μm的化合物4、對(duì)比化合物a以及1μm的對(duì)照化合物伊馬替尼、0.1μm的對(duì)照化合物達(dá)沙替尼處理慢性髓性白血病細(xì)胞k562(表達(dá)p210bcr-abl突變型基因)2小時(shí)；收集樣品。測(cè)定化合物4、以及對(duì)照化合物a、伊馬替尼、達(dá)沙替尼化合物對(duì)細(xì)胞中的c-kit、stat5、akt、erk、s6k、s6、pdgfrα等蛋白的磷酸化的影響。結(jié)果示于圖1。

結(jié)果表明，在胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞系gist-t1(表達(dá)c-kit基因)及人胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞系gist-882(表達(dá)c-kit基因)中，化合物4的濃度為0.1μm時(shí)就能夠明顯地抑制c-kit致癌蛋白的磷酸化，而且對(duì)細(xì)胞中關(guān)鍵信號(hào)通路中的stat5、akt、erk、s6k、s6、pdgfrα等蛋白的磷酸化也有非常明顯的抑制作用。在該實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照化合物伊馬替尼也表現(xiàn)出相似的磷酸化抑制作用。

而在慢性髓性白血病細(xì)胞k562(表達(dá)p210bcr-abl突變型基因)細(xì)胞系中，化合物4的用藥濃度為3μm時(shí)對(duì)bcr-abl激酶的磷酸化都沒有任何影響，對(duì)細(xì)胞中關(guān)鍵信號(hào)通路中的akt、erk蛋白的磷酸化也沒有影響。同樣的實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照化合物達(dá)沙替尼的用藥濃度為0.1μm時(shí)就非常強(qiáng)烈的抑制住bcr-abl激酶的磷酸化，且對(duì)其信號(hào)通路上下游相關(guān)的蛋白也有非常強(qiáng)烈的抑制作用，對(duì)照化合物伊馬替尼的用藥濃度為1μm時(shí)對(duì)bcr-abl激酶的磷酸化表現(xiàn)出抑制作用；對(duì)比化合物a的用藥濃度為0.1μm時(shí)已經(jīng)對(duì)bcr-abl激酶的磷酸化具有非常強(qiáng)烈的抑制作用，同時(shí)對(duì)其信號(hào)通路上下游相關(guān)的蛋白也有非常強(qiáng)烈的抑制作用。

這樣的結(jié)果說明，化合物4與伊馬替尼都對(duì)c-kit相關(guān)的信號(hào)通路發(fā)揮作用，并且它們可能都通過抑制致癌蛋白c-kit的磷酸化來影響攜帶c-kit致癌蛋白的胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞gist-t1及gist-882細(xì)胞的細(xì)胞增殖。同時(shí)，本發(fā)明化合物4對(duì)bcr-abl激酶的磷酸化沒有任何影響或影響較小，這表明本發(fā)明化合物4具有很好的c-kit抑制選擇性及較低的毒副作用。

實(shí)施例4

化合物4和伊馬替尼各自對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

為了研究用藥以后細(xì)胞的死亡是通過凋亡還是壞死，在胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞系gist-t1(表達(dá)野生型c-kit基因)及人胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞系gist-882(表達(dá)野生型c-kit基因)中，檢測(cè)了化合物4在細(xì)胞中對(duì)與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的dna修復(fù)酶聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶parp、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶caspase3蛋白剪切的影響。用不同濃度0μm、0.1μm、0.3μm、1μm、3μm的化合物4和1μm的對(duì)照化合物伊馬替尼處理胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞系gist-t1及胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞系gist-882細(xì)胞，然后分別在48小時(shí)、72小時(shí)后收集細(xì)胞。用westernblot檢測(cè)不同濃度的藥在不同時(shí)間段對(duì)dna修復(fù)酶聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶parp和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶caspase3的剪切蛋白的影響。結(jié)果示于圖2a和圖2b。

結(jié)果表明，在化合物4的濃度為0.3μm的情況下，在胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞系gist-t1(表達(dá)c-kit基因)中用藥48小時(shí)后及在人胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞系gist-882(表達(dá)c-kit基因)中用藥72小時(shí)后，在這兩株細(xì)胞中均能夠觀察到明顯的dna修復(fù)酶聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶parp的剪切及parp的下游caspase3的剪切。對(duì)于用藥1μm伊馬替尼的實(shí)驗(yàn)組，同樣觀察到明顯的dna修復(fù)酶聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶parp的剪切及parp的下游caspase3的剪切。這表明用化合物4和伊馬替尼處理細(xì)胞之后引起的細(xì)胞死亡屬于細(xì)胞凋亡而非細(xì)胞壞死。也就是說，化合物4和伊馬替尼能夠引起表達(dá)c-kit致癌蛋白的胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞系gist-t1及gist-882的細(xì)胞凋亡。

實(shí)施例5

化合物4和伊馬替尼各自對(duì)細(xì)胞周期的影響

為了研究用藥后細(xì)胞被阻止在哪個(gè)生長(zhǎng)周期，在胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞系gist-t1(表達(dá)野生型c-kit基因)及人胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞系gist-882(表達(dá)野生型c-kit基因)中，對(duì)化合物4、伊馬替尼和舒尼替尼(sunitinib)(購自上海皓元化學(xué)科技有限公司)對(duì)這些細(xì)胞系的細(xì)胞周期分布的影響進(jìn)行測(cè)試。

在用不同濃度(0μm、0.3μm、1μm、3μm于dmso中)的化合物4、3μm(于dmso中)的對(duì)照化合物伊馬替尼及3μm(于dmso中)的對(duì)照化合物舒尼替尼作用于上述細(xì)胞24小時(shí)或48小時(shí)后，收集細(xì)胞，用1xpbs緩沖液洗滌兩次，將其用75％的乙醇于-20℃固定24小時(shí)，用1xpbs緩沖液再洗滌兩次，加0.5ml1xpbs緩沖液和0.5ml的pi染色液(購自美國bdbioscience)到細(xì)胞中并將細(xì)胞放置于黑暗避光37℃染色15分鐘，用流式細(xì)胞儀(bdfacscalibur)檢測(cè)細(xì)胞周期分布。結(jié)果參見圖3a和圖3b。

結(jié)果顯示，在胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞系gist-t1(表達(dá)c-kit基因)細(xì)胞中作用24小時(shí)、及在人胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞系gist-882(表達(dá)c-kit基因)細(xì)胞中作用48小時(shí)后，化合物4對(duì)這兩株細(xì)胞的細(xì)胞周期有明顯的影響，其使得這兩種細(xì)胞的細(xì)胞周期均顯著地被阻止在g0-g1期。

實(shí)施例6

化合物4的體外抑制活性(酶活)檢測(cè)

在體外酶活實(shí)驗(yàn)中測(cè)定化合物4對(duì)蛋白激酶c-kit的ic50值。將蛋白激酶c-kit的激酶結(jié)構(gòu)域克隆到昆蟲表達(dá)載體pfasthta(購自invitrogenlifetechnologies)中，利用昆蟲表達(dá)體系bac-to-bacbaculovirusexpressionsystem(購自invitrogenlifetechnologies)進(jìn)行蛋白表達(dá)，帶有his標(biāo)簽。將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)染至sf9包裝病毒(購自invitrogenlifetechnologies)，用病毒感染sf9表達(dá)蛋白。利用鎳親和層析進(jìn)行純化。

取純化的c-kit蛋白激酶9μl(6ng/μl)分別與三倍梯度稀釋的上述化合物4各1μl室溫反應(yīng)4小時(shí)(藥物終濃度為10μm、3μm、1μm、0.3μm、0.1μm、0.03μm、0.01μm、0.003μm)；

加入2μlatp和3μl底物poly(4:1glu,tyr)peptide(promega，美國)(終濃度分別為10μm和0.2μg/μl)，37℃反應(yīng)1小時(shí)；

取5μl反應(yīng)后的激酶溶液，加入5μladp-glo^tm(promega，美國)試劑于室溫反應(yīng)40min，以終止激酶反應(yīng)并消耗完剩余的atp；

加入10μl激酶檢測(cè)試劑將adp轉(zhuǎn)化成atp，使用偶聯(lián)的螢光素酶/螢光素反應(yīng)檢測(cè)新合成的atp，利用envision讀數(shù)后作圖，計(jì)算ic50值。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示：本發(fā)明的化合物4對(duì)c-kit蛋白激酶具有強(qiáng)烈的抑制作用，其ic50值為99nm。該結(jié)果說明本發(fā)明的化合物4是有效的c-kit激酶抑制劑。

實(shí)施例7

化合物4和對(duì)照化合物伊馬替尼在胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞系gist-t1及胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞系gist-882的小鼠模型中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.從上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司購買飼養(yǎng)4-6周齡的balb/c雌性小鼠，飼養(yǎng)于spf級(jí)實(shí)驗(yàn)室中，飲水及墊料均經(jīng)高壓消毒無菌處理，有關(guān)小鼠的所有操作均在無菌條件下進(jìn)行；

2.第0天分別在所有小鼠左側(cè)背部皮下注入約5×10⁶個(gè)胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞系gist-t1或gist-882(購自atcc)；

3.從第15天開始，每天使對(duì)應(yīng)小鼠口服給藥甲基纖維素(hki)溶媒(6只小鼠)；劑量為25mg/kg鼠重的化合物4(6只小鼠)；劑量為50mg/kg鼠重的化合物4(6只小鼠)；劑量為100mg/kg鼠重的化合物4(6只小鼠)；劑量為100mg/kg鼠重的對(duì)照化合物伊馬替尼(6只小鼠)；

4.第15天開始，每天用游標(biāo)卡尺測(cè)量皮下腫瘤的長(zhǎng)/寬，并每天記錄小鼠體重，確定化合物4和對(duì)照化合物伊馬替尼對(duì)小鼠體重的影響；

5.第36天(對(duì)于gist-882小鼠模型)或43天(gist-t1小鼠模型)處死小鼠，取出皮下腫瘤，將腫瘤稱重比較；

6.將腫瘤樣品組織制備出蛋白裂解液樣品待用；

7.統(tǒng)計(jì)16-43天內(nèi)皮下腫瘤生長(zhǎng)趨勢(shì)，腫瘤體積計(jì)算方法：長(zhǎng)×寬×寬/2mm³。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5a-5b和5e-5f所示，在胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞系gist-t1的小鼠腫瘤模型中，在用藥第四天時(shí)，用藥劑量為25mg/kg的化合物4已經(jīng)表現(xiàn)出一定的抑制小鼠腫瘤的效果，且隨著用藥劑量及用藥天數(shù)的增加，化合物4對(duì)小鼠腫瘤的抑制作用愈發(fā)顯著。對(duì)于化合物4的用藥劑量為50mg/kg的小組，在胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞系gist-t1的小鼠模型中用藥后第28天、及胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞系gist-882的小鼠模型中用藥后第21天抑瘤率分別達(dá)到65.3％及44％；對(duì)于化合物4的用藥劑量為100mg/kg的小組，在胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞系gist-t1及胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞系gist-882的小鼠模型中，抑瘤率分別達(dá)到73.8％及58％。在同樣的試驗(yàn)中，對(duì)于對(duì)照化合物伊馬替尼的用藥劑量為100mg/kg的小組，在胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞系gist-t1的小鼠模型中用藥后第28天、及胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞系gist-882的小鼠模型中用藥后第21天抑瘤率分別為72.4％及49％；這說明本發(fā)的化合物4在動(dòng)物模型中的藥效優(yōu)于對(duì)照化合物伊馬替尼。

另外，結(jié)合圖5c-5d的結(jié)果，說明化合物4不僅有效地抑制小鼠腫瘤的生長(zhǎng)，并且對(duì)小鼠的體重基本沒有影響，表明化合物4可適用于動(dòng)物給藥。

實(shí)施例8

在胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞系gist-t1的小鼠模型中的急毒實(shí)驗(yàn)

1.從上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司購買飼養(yǎng)4-6周齡的balb/c雌性小鼠，飼養(yǎng)于spf級(jí)實(shí)驗(yàn)室中，飲水及墊料均經(jīng)高壓消毒無菌處理，有關(guān)小鼠的所有操作均在無菌條件下進(jìn)行；選擇10只健康的小鼠，按體重均衡隨機(jī)分為5組。

2.給藥具體信息

給藥途徑：口服灌胃給藥

給藥次數(shù)：1次

觀察期限：7天。

3.觀察指標(biāo)

3.1.體重

稱重頻率：分組時(shí)、給藥當(dāng)天(d0)至給藥后第七天(d7)。以d0天的小鼠體重為基準(zhǔn)(起始值為100％)，繪制相對(duì)體重隨時(shí)間變化的曲線。

3.2.臨床癥狀觀察

給藥后4小時(shí)內(nèi)嚴(yán)密觀察，以后每天觀察2次。總共觀察7天。觀察并記錄每只動(dòng)物出現(xiàn)的異常癥狀或現(xiàn)象。

3.3.死亡數(shù)

記錄觀察期內(nèi)各劑量組動(dòng)物死亡的數(shù)量。

4.結(jié)果分析

根據(jù)動(dòng)物死亡情況、臨床癥狀及體重進(jìn)行綜合判斷。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示，在化合物4的用藥劑量為1000mg/kg時(shí)，小鼠的體重沒有明顯影響，沒有老鼠死亡；化合物4的用藥量劑量為2000mg/kg時(shí)，小鼠的體重略有下降，沒有老鼠死亡。7天后解剖小鼠發(fā)現(xiàn)，小鼠各臟器沒有明顯異常。這證明本發(fā)明的化合物4具有較小的毒副作用；小鼠對(duì)化合物4的最大耐受劑量是2000mg/kg。

同樣的實(shí)驗(yàn)中，在對(duì)比化合物a的用藥量劑量為1000mg/kg時(shí)，小鼠在40min左右開始安靜、趴臥；第一天死亡1只；對(duì)比化合物a的用藥量劑量為2000mg/kg時(shí)：給藥后，小鼠步態(tài)不穩(wěn)；第一天2只全部死亡；這說明與化合物a相比，本發(fā)明的化合物4毒副作用較小。

表3.對(duì)小鼠單次灌胃化合物4的急性毒性試驗(yàn)動(dòng)物死亡信息

續(xù)表3.對(duì)小鼠單次灌胃化合物a的急性毒性試驗(yàn)動(dòng)物死亡信息