本發(fā)明涉及一種化合物，具體涉及一種能夠抑制流感病毒pa蛋白核酸內(nèi)切酶活性的化合物。

背景技術(shù)：

流感病毒由于能夠在人畜間不斷地傳播、重組和突變，已成為人類公共健康的重要威脅。由于流感疫苗的局限性，即從新爆發(fā)病毒的鑒定到針對(duì)該病毒的疫苗的臨床應(yīng)用至少會(huì)有6個(gè)月的滯后?？共《舅幬镆呀?jīng)成為人類應(yīng)對(duì)流感爆發(fā)的重要手段，這種優(yōu)勢(shì)在流感暴發(fā)和流行的初期尤為明顯。兩類抗病毒藥物已批準(zhǔn)在臨床治療使用，即m2通道蛋白抑制劑(金剛烷胺和金剛乙胺)和神經(jīng)氨酸酶(na)抑制劑(奧司他韋和扎那米韋)。然而，耐藥菌株的出現(xiàn)，如季節(jié)性h3n2，2009年甲型h1n1，h5n1和h7n9高致病性禽流感等，很大程度上削弱了這兩類藥物的臨床使用價(jià)值。所以，新開發(fā)的能夠在不同流感病毒亞型間提供交叉保護(hù)作用的抗病毒新藥備受關(guān)注。流感病毒蛋白的生物學(xué)和結(jié)構(gòu)功能學(xué)研究已在廣泛地開展，這也為新藥篩選提供了更多的靶點(diǎn)。需要特別指出的是，流感病毒rna聚合酶中相關(guān)功能結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)已被成功解析。由于這些蛋白在不同流感亞型之間相當(dāng)保守。因此，針對(duì)rna聚合酶的功能結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)抑或是篩選的藥物更有機(jī)會(huì)對(duì)流感產(chǎn)生廣譜的抗病毒效果。

流感病毒的rna聚合酶復(fù)合體(rdrp)負(fù)責(zé)病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，該復(fù)合體由pb1、pb2和pa三個(gè)亞基組成。在一個(gè)被稱為“偷帽”(cap-snatching)的過程中，病毒信使rna(mrna)轉(zhuǎn)錄所需要的起始引物，是通過pa亞基的核酸內(nèi)切酶活性(endonucleaseactivity)從宿主細(xì)胞的前體mrna上切割而來的。晶體結(jié)構(gòu)研究揭示pa亞基的氨基末端結(jié)構(gòu)域(以下簡(jiǎn)稱pan)擁有核酸內(nèi)切酶活性位點(diǎn)。該結(jié)構(gòu)域在不同的甲型流感病毒亞型間高度保守，同時(shí)能夠在原核表達(dá)系統(tǒng)中功能性表達(dá)。重要的是，相關(guān)研究已經(jīng)證實(shí)，替換pan結(jié)構(gòu)域中的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)將顯著減少病毒毒力。所以，針對(duì)pan核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域篩選而來的抗病毒藥物所誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥毒株的可能性會(huì)大大降低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足之處而提供了一種化合物，所述化合物能夠抑制流感病毒pa蛋白核酸內(nèi)切酶活性，本發(fā)明還提供了所述化合物的用途。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，所采取的技術(shù)方案：一種能夠抑制流感病毒pa蛋白核酸內(nèi)切酶活性的化合物，所述化合物為式(ⅰ)、式(ⅱ)或式(ⅲ)所示的化合物，所述式(ⅰ)所示的化合物的結(jié)構(gòu)式如下：

所述式(ⅱ)所示的化合物的結(jié)構(gòu)式如下：

所述式(ⅲ)所示的化合物的結(jié)構(gòu)式如下：

將上述所述式(ⅰ)所示的化合物命名為pa-30，將上述所述式(ⅱ)所示的化合物命名為pa-30-a-1，將上述所述式(ⅱ)所示的化合物命名為pa-30-a-2，本發(fā)明所述式(ⅰ)和式(ⅱ)所示的化合物均對(duì)多個(gè)亞型的甲型流感病毒，包括甲型h1n1、h3n2、h5n1、h7n7、h7n9和h9n2具有廣譜的抗病毒療效。扎那米韋和pa-30-a-1在細(xì)胞水平的聯(lián)合治療產(chǎn)生協(xié)同抗流感病毒作用。balb/c小鼠在感染致命劑量的h1n1流感病毒后接受pa-30-a-1的鼻腔給藥后，能夠顯著提高的存活率并減少肺組織中的病毒量。

本發(fā)明提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包括扎那米韋和上述所述的化合物。

優(yōu)選地，所述扎那米韋和權(quán)利要求1所述的化合物的摩爾比為1:10～10:1。

本發(fā)明提供了上述所述的化合物在制備抗流感病毒的藥物中的用途。

優(yōu)選地，所述流感病毒為甲型、乙型和丙型流感病毒中的至少一種。

本發(fā)明提供了上述所述的藥物組合物在制備抗流感病毒的藥物中的用途。

優(yōu)選地，所述流感病毒為甲型、乙型和丙型流感病毒中的至少一種。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明提供了一種化合物，所述化合物為式(ⅰ)、式(ⅱ)或式(ⅲ)所示的化合物，所述化合物均能夠抑制流感病毒pa蛋白核酸內(nèi)切酶活性，具有抗流感病毒的功能。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中pa-30-a-1及pa-30在多周期病毒生長(zhǎng)試驗(yàn)中的抗病毒作用圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中pa-30-a-1和pa-30的體外抗病毒效果圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例1中pa-30-a-1和pa-30的體內(nèi)抗病毒效果圖。

具體實(shí)施方式

為更好的說明本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)，下面將結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

實(shí)施例1

1材料和方法

1.1細(xì)胞、病毒及小分子化合物

犬腎細(xì)胞(mdck)在包含有10％熱滅活胎牛血清(fbs)，50單位/毫升青霉素和50微克/毫升鏈霉素(p/s)的mem培養(yǎng)基中培養(yǎng)。mdck在病毒感染后，在含有1微克/毫升的tpck胰蛋白酶但不含有胎牛血清的mem中培養(yǎng)?？偣灿?株/6種亞型的流感病毒株，即a/hk/415742/09(h1n1)、a/hongkong/1/1968(h3n2)、a/shenzhen/406h/2006(h5n1)、a/hongkong/156/97(h5n1)、a/vietnam/1194/2004(h5n1)、a/netherlands/219/2003(h7n7)、a/anhui/1/2013(h7n9)和a/hk/1073/1999(h9n2)分別在mdck細(xì)胞中增殖并在本研究中使用。此外，還有一株在balb/c小鼠體內(nèi)多次傳代獲得的小鼠致死性流感病毒株a/hk/415742md/09(h1n1)，是在雞胚中增殖并應(yīng)用于本次研究的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的。病毒的滴度通過空斑試驗(yàn)(plaqueassay)測(cè)定后，分裝并保存在-80攝氏度。所有與活病毒相關(guān)試驗(yàn)是在生物安全2級(jí)或3級(jí)設(shè)施中進(jìn)行的。

1.2選擇性指數(shù)

選擇性指數(shù)(selectivityindex)是通過50％的細(xì)胞毒性濃度(cc50)除以50％的病毒抑制濃度(ic50)計(jì)算而來的，該指標(biāo)數(shù)值越高則指示該藥物擁有越好的臨床應(yīng)用前景。我們通過mtt法測(cè)定了每種小分子化合物的cc50，再通過空斑減數(shù)試驗(yàn)確定ic50值，最終得到了每個(gè)候選化合物的選擇性指數(shù)。

1.3多周期病毒生長(zhǎng)試驗(yàn)

mdck細(xì)胞在接種了感染復(fù)數(shù)(moi)為0.002的流感h1n1病毒后，在含有20微摩的小分子化合物以及1微克/毫升tpck胰蛋白酶的mem培養(yǎng)基中培養(yǎng)。感染0、6、21、25、32、47和54小時(shí)后，收集病毒上清液并使用空斑法測(cè)定病毒滴度。

1.4交叉保護(hù)力試驗(yàn)

本發(fā)明所述化合物針對(duì)多個(gè)亞型的流感病毒，包括甲型h1n1、h3n2、h5n1、h7n7、h7n9和h9n2的抗病毒效果也進(jìn)行了測(cè)試。簡(jiǎn)單地說，mdck細(xì)胞在接種0.002個(gè)moi的流感病毒后1小時(shí)，用pbs洗去未進(jìn)入細(xì)胞的病毒粒子，并將培養(yǎng)基置換成新鮮的含有不同濃度(20、5、1.25、0.31微摩)本發(fā)明所述化合物的mem培養(yǎng)基。病毒接種24小時(shí)候后，收集細(xì)胞上清液，并采用反轉(zhuǎn)錄-實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(rt-qpcr)技術(shù)測(cè)定病毒的滴度。

1.5本發(fā)明所述化合物的協(xié)同抗病毒效果評(píng)估

在細(xì)胞水平，我們?cè)u(píng)估了本發(fā)明所述化合物pa-30-a-1和扎那米韋潛在的協(xié)同抗病毒作用。首先，mdck細(xì)胞接種0.002個(gè)moi的流感病毒，然后采用5種不同的藥物組合進(jìn)行測(cè)定。37℃培養(yǎng)24小時(shí)后，收集不同組合方案的上清液并采用空斑法測(cè)定病毒滴度。在本試驗(yàn)中，我們對(duì)pa-30-a-1和扎那米韋的在ic50比率為10:1，5:1，1:1，1:5和1:10這5種情形進(jìn)行了評(píng)估。在每個(gè)組合中，藥物從初始濃度開始進(jìn)行6次兩倍的倍比稀釋以繪制劑量抑制曲線，并通過該曲線計(jì)算在此情況下藥物的ic50值。藥物間的協(xié)同抗病毒效果通過分級(jí)抑制濃度指數(shù)(fractionalinhibitoryconcentrationindex，簡(jiǎn)稱fici)進(jìn)行評(píng)估。fici通過[(聯(lián)合使用時(shí)pa-30-a-1的ic50)/(單獨(dú)使用時(shí)pa-30-a-1的ic50)]+[(組合使用時(shí)扎那米韋的ic50)/(單獨(dú)使用時(shí)扎那米韋的ic50)].fici<0.5被認(rèn)為兩種藥物間具有顯著的協(xié)同抗病毒效果。

1.6化合物體內(nèi)抗病毒療效評(píng)估

本實(shí)驗(yàn)采用6-8周齡的balb/c雌性小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。所有實(shí)驗(yàn)遵循生物安全2級(jí)動(dòng)物設(shè)施標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)程序并得到香港大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。麻醉后,共56只小鼠(14只/組)經(jīng)鼻腔接種80％致死量(ld80)的流感h1n1病毒株a/hk/415742md/09。藥物在病毒接種6小時(shí)后由鼻腔途徑給藥，每日2次，共3天。第一組的小鼠接受20微升1毫克/毫升的pa-30-a-1(即1毫克/千克體重)。第二組的小鼠經(jīng)鼻腔接受20微升1毫克/毫升的pa-30。第三組的小鼠經(jīng)鼻腔接受20微升1毫克/毫升的扎那米韋作為陽性對(duì)照。最后一組小鼠經(jīng)鼻腔注射以20微升pbs作為陰性對(duì)照。動(dòng)物的生命體征總共監(jiān)測(cè)21天或直至死亡(處于動(dòng)物福利及倫理考慮，小鼠體重下降25％以上處死)。在病毒接種后的第4天，隨機(jī)從每組小鼠中選取四只處死后收集肺部組織。一半的肺組織碾磨后取上清采用空斑法和rt-qpcr法測(cè)定病毒滴度，另一半肺組織立即被固定在10％福爾馬林中進(jìn)行的組織病理學(xué)分析。

1.7抗病毒機(jī)理的研究

為了確定病毒生命周期中的哪個(gè)階段被pa-30-a-1干擾，mdck細(xì)胞首先接種2個(gè)moi的流感h1n1病毒。此后，pa-30-a-1(20微摩)分別在病毒進(jìn)入細(xì)胞時(shí)(-1小時(shí))或在感染后1h后添加入培養(yǎng)基。對(duì)于前者(即-1小時(shí))，病毒、細(xì)胞與pa-30-a-1共孵育1小時(shí)后替換以新鮮的不含化合物的培養(yǎng)基；對(duì)于后者，pa-30-a-1一直存在于培養(yǎng)基中。病毒接種細(xì)胞6小時(shí)后，利用rt-qpcr技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)及上清液中的病毒含量。此外，我們還檢測(cè)了病毒在rna復(fù)制和轉(zhuǎn)錄水平上的變化，即細(xì)胞內(nèi)mrna及病毒基因組rna(vrna)的數(shù)量。簡(jiǎn)單地說，mdck在接種2個(gè)moi的流感病毒后，往培養(yǎng)基中添加20微摩的pa-30-a-1。分別在感染后3小時(shí)和6小時(shí)，采用組織rna提取試劑盒(購(gòu)自qiagen)提取細(xì)胞內(nèi)總rna用于rt-qpcr分析。在實(shí)驗(yàn)中，扎那米韋(100微摩)被用于病毒釋放抑制劑的陽性對(duì)照。小分子化合物對(duì)流感病毒rna聚合酶活性的抑制功能是通過微型-復(fù)制子試驗(yàn)(mini-repliconassay)驗(yàn)證的。293t細(xì)胞經(jīng)過lipo3000轉(zhuǎn)染試劑(購(gòu)自invitrogen公司)同時(shí)轉(zhuǎn)染各50納克phw2k-pb1,phw2k-pb2,phw2k-pa,phw2k-np,pires-egfp質(zhì)粒以及100納克ppoli-fluc質(zhì)粒。五小時(shí)后，吸出含有轉(zhuǎn)染液的細(xì)胞培養(yǎng)液取代以溶液dmem的不同濃度的小分子化合物(分別為50，25,12.5,6.25,3.125及0微摩)。24小時(shí)后，采用熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)(購(gòu)自promega公司)，裂解細(xì)胞后測(cè)量讀數(shù)。

2結(jié)果

我們測(cè)定了小分子化合物pa-30及其類似物pa-30-a-1和pa-30-a-2的半數(shù)最大效應(yīng)濃度(ic50)以及半數(shù)細(xì)胞毒性濃度(cc50),并通過選擇性指數(shù)(selectivityindex＝cc50/ic50)對(duì)它們進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)(表1)。表1結(jié)果顯示，具有pa-30母核結(jié)構(gòu)的一組小分子化合物具有較高的選擇性指數(shù)和臨床應(yīng)用前景。

表1pa-30-a-1與pa-30的選擇性指數(shù)

緊接著，我們通過多周期病毒生長(zhǎng)試驗(yàn)比較了pa-30和pa-30-a-1的抗病毒療效。正如圖1顯示，在細(xì)胞感染流感病毒后，這兩種化合物可以顯著降低(即100-1000倍)上清液里的病毒滴度，而pa-30-a-1相比pa-30則表現(xiàn)出更高的選擇性指數(shù)(表1)。于是，我們進(jìn)一步評(píng)價(jià)了這兩種小分子化合物在不同亞型流感病毒間的保護(hù)效果。

2.1pa-30-a-1提供廣譜的抗甲型流感病毒作用

因?yàn)閜an的氨基酸序列在不同流感病毒株之間高度保守，我們?cè)u(píng)估了pa-30-a-1在h1n1、h3n2、h5n1、h7n7、h7n9以及h9n2這些不同亞型的流感病毒間的交叉保護(hù)作用。如圖2a所示，pa-30-a-1能夠以劑量依賴的方式抑制所有測(cè)試所用的流感毒株的復(fù)制。20微摩的pa-30-a-1可以抑制所有測(cè)試病毒復(fù)制的99.9％以上；然而，不同亞型的流感毒株對(duì)pa-30-a-1表現(xiàn)出不同的敏感性。同樣的，pa-30也能夠抑制所有測(cè)定的病毒生長(zhǎng)，并表現(xiàn)出和pa-30-a-1類似的抗病毒敏感度(圖2b)。

2.2pa-30-a-1抑制病毒在體內(nèi)的生長(zhǎng)

為了評(píng)估pa-30-a-1和pa-30在體內(nèi)的抗病毒作用，試驗(yàn)小鼠先經(jīng)過1個(gè)ld80的h1n1病毒感染，6小時(shí)之后再通過滴鼻的方式接受pa-30-a-1或pa-30的藥物治療。如圖3a所示，接受到1毫克/千克體重的pa-30-a-1或扎那米韋滴鼻治療的小鼠全部存活；接受到1毫克/千克體重的pa-30治療的小鼠80％存活，而只接受pbs治療的小鼠有80％死亡。在感染過后的第4天，我們?cè)诿總€(gè)組中隨機(jī)挑選4只小鼠取肺并通過空斑試驗(yàn)和rt-qpcr測(cè)定肺組織中的病毒含量。如圖3b結(jié)果表明，pa-30-a-1以及pa-30的治療都能夠顯著減少肺組織中的病毒量(p<0.05)。此外，如圖3c的組織病理學(xué)檢查進(jìn)一步表明，經(jīng)過pa-30-a-1和pa-30治療的小鼠，肺組織間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及肺泡損傷亦得到改善。我們的結(jié)果表明pa-30-a-1能有效抑制流感病毒在體內(nèi)的復(fù)制。

2.3pa-30-a-1和扎那米韋體外協(xié)同抗病毒作用

因?yàn)閜a-30-a-1的抗病毒機(jī)制有別于常用的抗流感處方藥扎那米韋，我們進(jìn)一步研究了兩個(gè)藥物之間潛在的協(xié)同抗病毒作用。分級(jí)抑制濃度指數(shù)(fici)常用于鑒定兩種或多種藥物之間是否存在協(xié)同作用。該指數(shù)假設(shè)藥物本身存在相加作用(即fici值為1)，而fici值小于或大于1則意味著協(xié)同作用或拮抗作用。相對(duì)應(yīng)的，這意味著需要更少(fici<1)或者更多(fici>1)的藥物才能達(dá)到相同的抗病毒效果。如表2所示，我們測(cè)試了五種不同比例的藥物組合。所有組合的分級(jí)抑制濃度指數(shù)均<0.5，提示pa-30-a-1和扎那米韋的確存在協(xié)同抗病毒作用。例如，當(dāng)0.8微摩pa-30-a-1和0.05微摩扎那米韋聯(lián)合使用時(shí)，此時(shí)的ic50比值為1:1，其分級(jí)抑制濃度指數(shù)為0.24。

表2抗病毒藥物的聯(lián)合治療結(jié)果

等效ic50濃度＝(聯(lián)合使用時(shí)該藥物的ic50)/(單獨(dú)使用時(shí)該藥物的ic50)]；

b分級(jí)抑制濃度指數(shù)是pa-30-a-1和扎那米韋在每種組合中等效ic50的相加值；

*分級(jí)抑制濃度指數(shù)<0.5就被認(rèn)為是顯著的協(xié)同作用。

最后所應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。