相關(guān)專利申請(qǐng)的交叉參考

本申請(qǐng)要求2014年11月25日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?2/084,505的優(yōu)先權(quán)，該文通過引用納入本文。

發(fā)明背景

對(duì)于各種應(yīng)用，天然或重組熱穩(wěn)定聚合酶已廣泛用于熱循環(huán)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，例如pcr或qpcr，用于各種應(yīng)用。對(duì)于長(zhǎng)期儲(chǔ)存穩(wěn)定性，熱穩(wěn)定聚合酶通常儲(chǔ)存在含有一種或多種非離子型洗滌劑，例如np-40，吐溫20，和曲通x的緩沖液中。參見例如美國專利6,127,155。根據(jù)美國專利申請(qǐng)2008/0064071a1和2010/0099150a1，還發(fā)現(xiàn)兩性離子洗滌劑如chaps，chapso和surfynol增強(qiáng)聚合酶儲(chǔ)存穩(wěn)定性和活性，盡管以前的出版物表明兩性離子洗滌劑，如chaps可潛在地造成蛋白質(zhì)變性(hielmeland，1980)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

在一些實(shí)施方式中，本文提供了用于儲(chǔ)存多核苷酸操縱酶(例如本文所述的聚合酶或其它酶)的液體儲(chǔ)存溶液。在一些實(shí)施方式中，所述溶液包含酶(例如聚合酶或限制性內(nèi)切酶)，游離精氨酸或其鹽或精氨酸衍生物(例如但不限于精氨酸乙酯，精氨酰胺二鹽酸鹽)或其鹽，和5％或更多的冷凍保護(hù)劑。在一些實(shí)施方式中，所述冷凍保護(hù)劑是二醇，三醇，多元醇，一元醇或亞砜。在一些實(shí)施方式中，所述游離精氨酸或其鹽或精氨酸衍生物或其鹽的濃度是0.01-5m(例如0.01-2.5m)。

在一些實(shí)施方式中，所述儲(chǔ)存溶液還包含一種或多種緩沖劑，kcl，乙二胺四乙酸(edta)，或二硫蘇糖醇(dtt)。在一些實(shí)施方式中，所述液體溶液包含緩沖劑并且該緩沖劑是goods緩沖劑。在一些實(shí)施方式中，所述goods緩沖劑選自下組：mes，bis-tris，ada，aces，pipes，bis-6tris丙烷，mopso，bes，mops，tes，hepes，dipso，mpos，tapso，heppso，popso，epps，n-三(羥甲基)甲基甘氨酸，tris，amp，重碳酸鹽，n-二(羥乙基)甘氨酸，硼酸鹽，卡可酸鹽，caps，capso，ches，檸檬酸鹽，dipso，甘氨酸，甘氨酰甘氨酸，磷酸鹽，taps，tapso和tea。

在一些實(shí)施方式中，所述精氨酸或其鹽或精氨酸衍生物或其鹽濃度是0.1-1.0m。

在一些實(shí)施方式中，所述溶液缺乏足以維持模板多核苷酸的聚合的組分。在一些實(shí)施方式中，所述溶液缺乏以下至少一種：模板多核苷酸；或寡核苷酸引物。

在一些實(shí)施方式中，所述溶液溫度是-80到5℃。在一些實(shí)施方式中，所述溶液溫度是-30到5℃。在一些實(shí)施方式中，所述溶液溫度是-80到10℃。在一些實(shí)施方式中，所述溶液溫度是-80到50℃。在一些實(shí)施方式中，所述溶液溫度是-80到90℃。在一些實(shí)施方式中，所述溶液溫度是-80到100℃。

在一些實(shí)施方式中，所述溶液不含洗滌劑。在一些實(shí)施方式中，所述溶液包含一種或多種洗滌劑。

在一些實(shí)施方式中，所述溶液不含三糖。

在一些實(shí)施方式中，所述聚合酶是熱穩(wěn)定聚合酶。

在一些實(shí)施方式中，所述聚合酶是反轉(zhuǎn)錄酶。

在一些實(shí)施方式中，所述聚合酶是或包括b家族聚合酶。

還提供了在儲(chǔ)存期間保持聚合酶穩(wěn)定性的方法。在一些實(shí)施方式中，所述方法包括提供如以上所述或他處所述的液體溶液；和，儲(chǔ)存溶液至少3(例如至少7，14，21，28，50，100)天。在一些實(shí)施方式中，所述儲(chǔ)存發(fā)生在-80和5℃之間。在一些實(shí)施方式中，所述儲(chǔ)存發(fā)生在-80和10℃之間。在一些實(shí)施方式中，所述儲(chǔ)存發(fā)生在-80和50℃之間。在一些實(shí)施方式中，所述儲(chǔ)存發(fā)生在-80和90℃之間。在一些實(shí)施方式中，所述儲(chǔ)存發(fā)生在-80和100℃之間。在一些實(shí)施方式中，所述方法還包括在儲(chǔ)存后，在酶促反應(yīng)中使用該聚合酶。

例如，在一些實(shí)施方式中，所述方法包括提供包含所述酶(例如聚合酶或限制性內(nèi)切酶)和0.01-5.0m精氨酸或其鹽或精氨酸衍生物或其鹽的液體溶液；和，儲(chǔ)存所述溶液至少3(例如至少7，14，21，28，50，100)天。在一些實(shí)施方式中，所述儲(chǔ)存發(fā)生在-80和5℃之間。在一些實(shí)施方式中，所述儲(chǔ)存發(fā)生在-80和10℃之間。在一些實(shí)施方式中，所述儲(chǔ)存發(fā)生在-80和50℃之間。在一些實(shí)施方式中，所述儲(chǔ)存發(fā)生在-80和90℃之間。在一些實(shí)施方式中，所述儲(chǔ)存發(fā)生在-80和100℃之間。在一些實(shí)施方式中，所述方法還包括：在儲(chǔ)存后，在酶促反應(yīng)中使用該聚合酶。

定義

術(shù)語“聚合酶”指進(jìn)行多核苷酸合成的酶。在一些實(shí)施方式中，該聚合酶是模板依賴性聚合酶。在一些實(shí)施方式中，所述聚合酶是非模板依賴性聚合酶(例如末端轉(zhuǎn)移酶或多聚a聚合酶)。該術(shù)語同時(shí)包括全長(zhǎng)多肽和具有聚合酶活性的結(jié)構(gòu)域。dna聚合酶是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，包括但不限于分離或衍生自激烈火球菌(pyrococcusfuriosus)、濱海嗜熱球菌(thermococcuslitoralis)和海棲熱袍菌(thermotogamaritime)的dna聚合酶或其修飾版本。它們包括dna依賴性聚合酶和rna依賴性聚合酶，如反轉(zhuǎn)錄酶。已知至少5個(gè)dna依賴性dna聚合酶家族，雖然大多數(shù)落入a、b和c家族。各家族之間幾乎沒有或沒有序列相似性。大多數(shù)a家族聚合酶是可含有多重酶促功能(包括聚合酶、3′到5′核酸外切酶活性和5′到3′核酸外切酶活性)的單鏈蛋白質(zhì)。b家族聚合酶通常有具有聚合酶和3′到5′核酸外切酶活性的單個(gè)催化結(jié)構(gòu)域，以及輔助因子。c家族聚合酶通常是具有聚合和3′到5′核酸外切酶活性的多亞基蛋白質(zhì)。在大腸桿菌中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了3種類型的dna聚合酶，dna聚合酶i(a家族)、dna聚合酶ii(b家族)和dna聚合酶iii(c家族)。在真核細(xì)胞中，核復(fù)制中涉及3種不同的b家族聚合酶，dna聚合酶α、δ和ε，并且a家族聚合酶，聚合酶γ用于線粒體dna復(fù)制。其它類型的dna聚合酶包括噬菌體聚合酶。相似地，rna聚合酶通常包括真核rna聚合酶i、ii和iii，和細(xì)菌rna聚合酶以及噬菌體和病毒聚合酶。rna聚合酶可以是dna依賴性和rna依賴性的。

本文所用的“熱穩(wěn)定聚合酶”或“熱穩(wěn)定性聚合酶”指使用dna或rna作為模板通過向核苷酸鏈中加入核苷酸單元以催化多核苷酸合成的任何酶且該酶在45℃和100℃之間的溫度下達(dá)到最佳活性。

術(shù)語“核酸擴(kuò)增”或“擴(kuò)增反應(yīng)”指用于倍增核酸靶序列拷貝的任何體外方法。這種方法包括但不限于聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)，dna連接酶鏈反應(yīng)(參見美國專利號(hào)4,683,195和4,683,202，《pcr方案：方法和應(yīng)用指南》(pcrprotocols：aguidetomethodsandapplications)(innis等編，1990))，(lcr)，qbetarna復(fù)制酶和基于rna轉(zhuǎn)錄(如tas和3sr)的擴(kuò)增反應(yīng)以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它反應(yīng)。

“擴(kuò)增”指將溶液置于足以允許多核苷酸擴(kuò)增的條件下的步驟(如果反應(yīng)的所有組分是完整的)。擴(kuò)增反應(yīng)的組分包括，例如，引物、多核苷酸模板、聚合酶、核苷酸等。術(shù)語擴(kuò)增一般是指靶核酸的“指數(shù)型”增長(zhǎng)。然而，本文所用的擴(kuò)增也可指核酸的選擇靶序列數(shù)量的線性增長(zhǎng)，如由循環(huán)測(cè)序所得。

“寡核苷酸引物”或“引物”指與靶核酸上的序列雜交并且用作核酸合成的起始點(diǎn)的寡核苷酸序列。引物可以是各種長(zhǎng)度并且通常長(zhǎng)度小于50個(gè)核苷酸，例如長(zhǎng)度為12-30個(gè)核苷酸?？苫诒绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的原理設(shè)計(jì)用于pcr的引物的長(zhǎng)度和序列，參見例如innis等(同上)。

“模板”指包含待擴(kuò)增的多核苷酸、側(cè)接引物雜交位點(diǎn)的多核苷酸序列。因此，“靶模板”包含側(cè)接5′引物和3′引物的雜交位點(diǎn)的靶多核苷酸序列。

術(shù)語“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互換使用以表示脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其單鏈或雙鏈形式的聚合物。該術(shù)語包括含有已知核苷酸類似物或修飾的主鏈殘基或連接的核酸，其是合成的、天然產(chǎn)生的和非天然產(chǎn)生的，其與參比核酸具有相似結(jié)合性質(zhì)，且以與參比核苷酸相似的方式代謝。這種類似物的示例包括但不限于：硫代磷酸(酯)、氨基磷酸(酯)、甲基膦酸(酯)、手性甲基膦酸(酯)、2-o-甲基核糖核苷酸和肽核酸(pnas)。

術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用以表示氨基酸殘基的聚合物。該術(shù)語適用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是相應(yīng)天然產(chǎn)生氨基酸的人造化學(xué)模擬物的氨基酸聚合物，以及天然產(chǎn)生的氨基酸聚合物和非天然產(chǎn)生的氨基酸聚合物。

術(shù)語“氨基酸”指天然產(chǎn)生的和合成的氨基酸，以及作用方式類似于天然產(chǎn)生氨基酸的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然產(chǎn)生的氨基酸是由遺傳密碼編碼的氨基酸，以及隨后修飾的氨基酸，如羥基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和o-磷酸絲氨酸。氨基酸類似物指與天然產(chǎn)生的氨基酸具有相同基本化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，即結(jié)合于氫、羧基、氨基和r基的α碳，如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍。這種類似物具有修飾的r基(如正亮氨酸)或修飾的肽主鏈，但保留了與天然產(chǎn)生的氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)。氨基酸模擬物指結(jié)構(gòu)不同于氨基酸的普通化學(xué)結(jié)構(gòu)，但作用方式類似于天然產(chǎn)生氨基酸的化合物。

本文中氨基酸可按iupac-iub生物化學(xué)命名委員會(huì)推薦的通常已知的三字母符號(hào)或單字母符號(hào)表述。核苷酸同樣可由其普遍接受的單字母代碼表述。

附圖的簡(jiǎn)要說明

圖1顯示了補(bǔ)充各種洗滌劑的儲(chǔ)存緩沖液中dna聚合酶穩(wěn)定性的sds-page分析。泳道1和2是分別在-20℃和55℃儲(chǔ)存24小時(shí)的chaps兩性離子洗滌劑儲(chǔ)存緩沖液中的pidna聚合酶；泳道3是在55℃儲(chǔ)存24小時(shí)的補(bǔ)充有2×蛋白酶抑制劑混合物的chaps兩性離子洗滌劑儲(chǔ)存緩沖液中的pidna聚合酶；泳道4是蛋白質(zhì)梯標(biāo)；泳道5和6是分別在-20℃和55℃儲(chǔ)存24小時(shí)的chaps兩性離子洗滌劑儲(chǔ)存緩沖液中的taudna聚合酶；泳道7是在55℃儲(chǔ)存24小時(shí)的補(bǔ)充有2×蛋白酶抑制劑混合物的chaps兩性離子洗滌劑儲(chǔ)存緩沖液中的taudna聚合酶；泳道8和9是分別在-20℃和55℃儲(chǔ)存24小時(shí)的np40和吐溫20非離子型聚合物洗滌劑儲(chǔ)存緩沖液中的taudna聚合酶；泳道10是在55℃儲(chǔ)存24小時(shí)的補(bǔ)充有2×蛋白酶抑制劑混合物的np40和吐溫20非離子型聚合物洗滌劑儲(chǔ)存緩沖液中的taudna聚合酶。

圖2顯示了補(bǔ)充各種洗滌劑的儲(chǔ)存緩沖液中dna聚合酶的穩(wěn)定性和其pcr性能。泳道3和9是分別在-20℃和55℃儲(chǔ)存24小時(shí)的chaps兩性離子洗滌劑儲(chǔ)存緩沖液中的pidna聚合酶；泳道4和10是分別在-20℃和55℃儲(chǔ)存24小時(shí)的補(bǔ)充有辛基-b-d-吡喃葡萄糖苷非離子型洗滌劑的chaps兩性離子洗滌劑儲(chǔ)存緩沖液中的pidna聚合酶；泳道5和11是分別在-20℃和55℃儲(chǔ)存24小時(shí)的chaps兩性離子洗滌劑儲(chǔ)存緩沖液中的taudna聚合酶；泳道6和12是分別在-20℃和55℃儲(chǔ)存24小時(shí)的np40和吐溫20非離子型洗滌劑儲(chǔ)存緩沖液中的taudna聚合酶；泳道7是100bpdna梯標(biāo)；泳道8是使用sciproofdna聚合酶的pcr對(duì)照；*在45℃儲(chǔ)存24小時(shí)和在35℃儲(chǔ)存48小時(shí)獲得同樣的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。

圖3顯示了補(bǔ)充各種洗滌劑的儲(chǔ)存緩沖液中dna聚合酶穩(wěn)定性的sds-page分析。每個(gè)泳道包含100單位的聚合酶。泳道1和14是蛋白質(zhì)梯標(biāo)；泳道2和8是分別在-20℃和55℃儲(chǔ)存24小時(shí)的chaps兩性離子洗滌劑儲(chǔ)存緩沖液中的pidna聚合酶；泳道3和9是分別在-20℃和55℃儲(chǔ)存24小時(shí)的補(bǔ)充有辛基-b-d-吡喃葡萄糖苷非離子型洗滌劑的chaps兩性離子洗滌劑儲(chǔ)存緩沖液中的pidna聚合酶；泳道4和10是分別在-20℃和55℃儲(chǔ)存24小時(shí)的補(bǔ)充有sds離子型洗滌劑的chaps兩性離子洗滌劑儲(chǔ)存緩沖液中的pidna聚合酶；泳道5和11是分別在-20℃和55℃儲(chǔ)存24小時(shí)的補(bǔ)充有ctab離子型洗滌劑的chaps兩性離子洗滌劑儲(chǔ)存緩沖液中的pidna聚合酶；泳道6和12是分別在-20℃和55℃儲(chǔ)存24小時(shí)的補(bǔ)充有sds和ctab離子型洗滌劑的chaps洗滌劑儲(chǔ)存緩沖液中的pidna聚合酶；泳道7和13是分別在-20℃和55℃儲(chǔ)存24小時(shí)的補(bǔ)充有np40和吐溫20非離子型聚合物洗滌劑的chaps洗滌劑儲(chǔ)存緩沖液中的pidna聚合酶。

圖4顯示了包含chaps兩性離子洗滌劑的補(bǔ)充有各種濃度的l-精氨酸的儲(chǔ)存緩沖液中的dna聚合酶穩(wěn)定性的sds-page分析。每個(gè)泳道包含25單位的聚合酶。泳道1和2是分別在-20℃和55℃儲(chǔ)存72小時(shí)的儲(chǔ)存緩沖液中的pidna聚合酶；泳道3和4是分別在-20℃和55℃儲(chǔ)存72小時(shí)的補(bǔ)充有0.1ml-精氨酸的儲(chǔ)存緩沖液中的pidna聚合酶；泳道5和6是分別在-20℃和55℃儲(chǔ)存72小時(shí)的補(bǔ)充有0.25ml-精氨酸的儲(chǔ)存緩沖液中的pidna聚合酶；泳道7是蛋白質(zhì)梯標(biāo)；泳道8和9是分別在-20℃和55℃儲(chǔ)存72小時(shí)的補(bǔ)充有0.5ml-精氨酸的儲(chǔ)存緩沖液中的pidna聚合酶；泳道10和11是分別在-20℃和55℃儲(chǔ)存72小時(shí)的補(bǔ)充有0.75ml-精氨酸的儲(chǔ)存緩沖液中的pidna聚合酶；泳道12和13是分別在-20℃和55℃儲(chǔ)存72小時(shí)的補(bǔ)充有1ml-精氨酸的儲(chǔ)存緩沖液中的pidna聚合酶。

圖5顯示包含np40/吐溫20非離子型聚合物洗滌劑的補(bǔ)充有各種濃度的l-精氨酸的儲(chǔ)存緩沖液中的dna聚合酶穩(wěn)定性的sds-page分析。每個(gè)泳道包含100單位的聚合酶。泳道1和2是分別在-20℃和55℃儲(chǔ)存24小時(shí)的儲(chǔ)存緩沖液中的taudna聚合酶；泳道3和4是分別在-20℃和55℃儲(chǔ)存24小時(shí)的補(bǔ)充有0.75ml-精氨酸的儲(chǔ)存緩沖液中的taudna聚合酶；泳道5和6是分別在-20℃和55℃儲(chǔ)存24小時(shí)的補(bǔ)充有1ml-精氨酸的儲(chǔ)存緩沖液中的taudna聚合酶；泳道7是蛋白質(zhì)梯標(biāo)。

圖6顯示了補(bǔ)充各種添加劑的chaps兩性離子儲(chǔ)存緩沖液中dna聚合酶穩(wěn)定性的sds-page分析。每個(gè)泳道包含25單位的聚合酶。泳道1和12是蛋白質(zhì)梯標(biāo)；泳道2和3是分別在-20℃和55℃儲(chǔ)存24小時(shí)的chaps洗滌劑儲(chǔ)存緩沖液中的pidna聚合酶；泳道4和5是分別在-20℃和55℃儲(chǔ)存24小時(shí)的補(bǔ)充有1ml-精氨酸的chaps洗滌劑儲(chǔ)存緩沖液中的pidna聚合酶；泳道6和7顯示了分別在-20℃和55℃儲(chǔ)存24小時(shí)的補(bǔ)充有0.1ml-精氨酸的chaps洗滌劑儲(chǔ)存緩沖液中的pidna聚合酶；泳道8和9顯示了分別在-20℃和55℃儲(chǔ)存24小時(shí)的補(bǔ)充有50mm氯化銨的chaps洗滌劑儲(chǔ)存緩沖液中的pidna聚合酶；泳道10和11顯示了分別在-20℃和55℃儲(chǔ)存24小時(shí)的補(bǔ)充有10mm氯化鎂的chaps洗滌劑儲(chǔ)存緩沖液中的pidna聚合酶。

發(fā)明詳述

緒論

發(fā)明者驚奇地發(fā)現(xiàn)精氨酸和精氨酸衍生物可用于液體儲(chǔ)存溶液中以使操縱多核苷酸的酶穩(wěn)定。例如，發(fā)明者已發(fā)現(xiàn)精氨酸或精氨酸衍生物可在儲(chǔ)存期間穩(wěn)定聚合酶。在精氨酸和精氨酸衍生物存在下觀察到的該酶穩(wěn)定性在不存在或存在洗滌劑的情況下出現(xiàn)。精氨酸對(duì)聚合酶穩(wěn)定性的影響出人意料地強(qiáng)，產(chǎn)生的溶液與缺乏精氨酸的對(duì)照相比可儲(chǔ)存至少長(zhǎng)九倍的時(shí)間。

精氨酸和精氨酸衍生物

游離的精氨酸(例如未連接到另一種氨基酸的l-精氨酸或d-精氨酸)或精氨酸衍生物可用于聚合酶儲(chǔ)存溶液中以穩(wěn)定溶液中的聚合酶。用于儲(chǔ)存溶液中的精氨酸或精氨酸衍生物的濃度可以變化并且以提高穩(wěn)定性的濃度提供。在一些實(shí)施方式中，所述濃度是0.01-5m，0.1-2.0m，例如0.1-1.0m，0.5-1.5m，0.6-0.9m等等。

許多精氨酸衍生物是已知的。在一些實(shí)施方式中，所述精氨酸衍生物包含精氨酸但包括一個(gè)或多個(gè)附加部分(例如，精氨酸碳主鏈中的甲基或羥基(例如5-甲基-精氨酸或c-γ-羥基精氨酸))。其它示例性精氨酸衍生物包括，例如，瓜氨酸。2-氨基-3-胍基丁酸，2-氨基-4-胍基丁酸，蕓香堿，高精氨酸，硫代瓜氨酸，l-2-氨基-3-胍基丙酸，4-胍基丁酸，3-胍基丁酸。發(fā)明人已表明，例如，包含精氨酸乙酯或精氨酰胺二鹽酸化物能提高酶穩(wěn)定性。

所述精氨酸或精氨酸衍生物可作為鹽提供。適用的鹽形式的示例包括鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、甲磺酸鹽、硝酸鹽、馬來酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、富馬酸鹽、酒石酸鹽(例如(+)-酒石酸鹽、(-)-酒石酸鹽、或其包括外消旋混合物的混合物)、琥珀酸鹽、和苯甲酸鹽。這些鹽可由本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備。還包括堿加成鹽如鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、銨鹽、有機(jī)氨鹽(organicamino)或鎂鹽，或類似鹽。當(dāng)本發(fā)明的試劑含有相對(duì)堿性的官能團(tuán)時(shí)，可通過將該化合物的中性形式接觸足量所需酸(純的或在合適的惰性溶劑中)來獲得酸加成鹽?？山邮艿乃峒映甥}的示例包括：衍生自無機(jī)酸的鹽，所述無機(jī)酸如鹽酸、氫溴酸、硝酸、碳酸、一氫碳酸、磷酸、一氫磷酸、二氫磷酸、硫酸、一氫硫酸、氫碘酸或亞磷酸等，以及衍生自有機(jī)酸的鹽，所述有機(jī)酸如乙酸、丙酸、異丁酸、馬來酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富馬酸、乳酸、扁桃酸、鄰苯二甲酸、苯磺酸、對(duì)甲基苯磺酸、檸檬酸、酒石酸、甲磺酸等。在一些實(shí)施方式中，精氨酸鹽是一鹽酸鹽，二鹽酸鹽，三鹽酸鹽或四鹽酸鹽。

聚合酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性，和由此相對(duì)于對(duì)照的儲(chǔ)存穩(wěn)定性的提高可通過例如將聚合酶在55℃下在儲(chǔ)存溶液中孵育24小時(shí)，然后使用qpcr測(cè)量聚合酶擴(kuò)增模板的能力來測(cè)量。儲(chǔ)存中的聚合酶的ct或cq值的增加表明該聚合酶的活性已經(jīng)降低，并且ct或cq變化的絕對(duì)值表明降低的量。穩(wěn)定性測(cè)試也可在環(huán)境溫度，0℃或更低溫度下進(jìn)行較長(zhǎng)時(shí)間。相比于缺乏精氨酸或精氨酸衍生物的對(duì)照儲(chǔ)存溶液，儲(chǔ)存溶液中包含精氨酸或精氨酸衍生物將導(dǎo)致cq或ct的較小增加。

多核苷酸操縱酶

本發(fā)明提供多種多核苷酸操縱酶的穩(wěn)定化。多核苷酸操縱酶的示例包括但不限于模板依賴性聚合酶，非聚合酶依賴性聚合酶和dna裂解酶(例如限制性內(nèi)切酶或dna酶)。

模板依賴性聚合酶

能夠使用多種模板依賴性聚合酶。已知至少5個(gè)dna-依賴dna聚合酶家族，雖然大多數(shù)落入a、b和c家族。各家族之間幾乎沒有或沒有序列相似性。大多數(shù)a家族聚合酶是可含有多重酶促功能(包括聚合酶、3′到5′核酸外切酶活性和5′到3′核酸外切酶活性)的單鏈蛋白質(zhì)。b家族聚合酶通常有具有聚合酶和3′到5′核酸外切酶活性的單個(gè)催化結(jié)構(gòu)域，以及輔助因子。c家族聚合酶通常是具有聚合和3′到5′核酸外切酶活性的多亞基蛋白質(zhì)。在大腸桿菌中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了3種類型的dna聚合酶，dna聚合酶i(a家族)、dna聚合酶ii(b家族)和dna聚合酶iii(c家族)。在真核細(xì)胞中，核復(fù)制中涉及3種不同的b家族聚合酶，dna聚合酶α、δ和ε，并且a家族聚合酶，聚合酶γ用于線粒體dna復(fù)制。其它類型的dna聚合酶包括噬菌體聚合酶。這些聚合酶中任一種，這些聚合酶的組合或部分，以及這種聚合酶或其等價(jià)物的2種或更多種之間的嵌合物或雜交體均可用于本文所述的儲(chǔ)存溶液中。

在一些實(shí)施方式中，所述聚合酶具有非天然產(chǎn)生的多肽序列。例如，在一些實(shí)施方式中，所述聚合酶包含改善所需聚合酶活性(例如特異性，效率等等)的一種或多種非天然產(chǎn)生的突變或是融合物或嵌合體。在一些實(shí)施方式中，所述聚合酶是重組產(chǎn)生的。

在一些實(shí)施方式中，所述聚合酶是熱穩(wěn)定的。另外，在一些實(shí)施方式中，非熱穩(wěn)定聚合酶也可根據(jù)本發(fā)明使用。例如，具有突變(d355a，e357a)的大腸桿菌dna聚合酶i(klenow)的大片段(klenow片段)消除了3′-5′核酸外切酶活性。

在一個(gè)示例性的實(shí)施方式中，所述聚合酶具有衍生自2種親本聚合酶pfu和deepvent的聚合酶結(jié)構(gòu)域。這類聚合酶描述于例如美國申請(qǐng)公開號(hào)20040219558；20040214194；20040191825；20030162173，其各自通過引用全文納入本文用于所有目的且尤其是涉及雜交聚合酶的所有教導(dǎo)。

在一些實(shí)施方式中，聚合酶是包括包含突變的聚合酶結(jié)構(gòu)域的聚合酶偶聯(lián)物的一部分，與包含不具有這種突變的聚合酶結(jié)構(gòu)域的聚合酶相比，所述突變減少或消除包含這種聚合酶結(jié)構(gòu)域的聚合酶的核酸外切酶活性?？梢栽谔烊痪酆厦附Y(jié)構(gòu)域中引入各種突變以降低或消除3’-5’核酸外切酶活性。例如，美國專利號(hào)6,015,668；5,939,301和5,948,614描述了在tma和tnedna聚合酶的3′-5′核酸外切酶結(jié)構(gòu)域中，金屬結(jié)合天冬氨酸突變成丙氨酸殘基。這種突變將這些酶的3′-5′核酸外切酶活性降低至可檢測(cè)水平以下。類似地，美國專利號(hào)5,882,904描述了白若熱球菌(thermococcusbarossi)中類似的天冬氨酸至丙氨酸的突變，并且美國專利號(hào)5,489,523教導(dǎo)了沃氏火球菌(pyrococcuswosei)dna聚合酶的雙重突變體d141ae143a。這些突變體聚合酶實(shí)際上均沒有可檢測(cè)的3′-5′核酸外切酶活性。分析3′-5′核酸外切酶活性的方法是本領(lǐng)域熟知的。參見，例如freemont等，proteins1：66(1986)；derbyshire等，emboj.16：17(1991)和derbyshire等，methodsinenzymology262：36385(1995)。應(yīng)理解，雖然上述突變最初在一種聚合酶中鑒定得到，通?？梢詫⑦@種突變引入到其他聚合酶以降低或消除核酸外切酶活性。本文所用的“核酸外切酶缺陷”指所述聚合酶具有顯著降低的核酸外切酶活性(即與野生型集合酶相比少于10％，5％，或1％的3′-5′核酸外切酶活性)或沒有核酸外切酶活性。

在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的核酸擴(kuò)增方法利用偶聯(lián)到dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域或蛋白質(zhì)，例如sso7或sso7樣結(jié)構(gòu)域上的聚合酶多肽或結(jié)構(gòu)域。已知這種聚合酶偶聯(lián)物顯示有提高的處理能力。參見例如美國專利申請(qǐng)?zhí)?2/683,950，其內(nèi)容通過引用全文納入本文用于所有目的且尤其是涉及聚合酶、聚合酶偶聯(lián)物以及用于制造和使用這種聚合酶的所有方法的所有教導(dǎo)。

sso7d和sac7d分別是來自超嗜熱古細(xì)菌硫磺礦硫化葉菌(sulfolobussolfataricus)和嗜酸熱硫化葉菌(sulfolobusacidocaldarius)的小(約7kdamw)、基本染色體蛋白(例如，參見choli等，biochimicaetbiophysicaacta950：193-203，1988；baumann等，structuralbiol.1：808-819，1994；和gao等，naturestruc.biol.5：782-786，1998)。這些蛋白質(zhì)以不依賴序列的方式結(jié)合dna，在一些情況下，一旦結(jié)合，使得dna的tm升高至40℃(mcafee等，biochemistry34：10063-10077，1995)。sso7蛋白質(zhì)及其同源物通常被認(rèn)為在升高的溫度下參與穩(wěn)定基因組dna。sso7d、sac7d、sac7e及相關(guān)序列(在這里稱為“sso7蛋白質(zhì)”或“sso7結(jié)構(gòu)域”)是本領(lǐng)域已知的(例如，參見uniprot數(shù)據(jù)庫登錄號(hào)：p39476(sso7d)；o59632(ssh7b)；p13123(sac7d)；p13125(sac7e)和q96x56(sto7e))。在一些實(shí)施方式中，通過在sso7dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域中制造一種或多種突變來從野生型sso7修飾sso7或sso7樣結(jié)構(gòu)域或蛋白質(zhì)，參見例如wo2012/138417。

在一些實(shí)施方式中，所述聚合酶包含天然不具有與異源5’-3’核酸外切酶結(jié)構(gòu)域融合的5’-3’核酸外切酶活性的聚合酶，以生成同時(shí)保留聚合酶和5’-3’核酸外切酶活性的融合蛋白。在一些實(shí)施方式中，5’-3’核酸外切酶結(jié)構(gòu)域任選通過接頭融合至b家族聚合酶的氨基端。

多種具有5’-3’核酸外切酶活性的結(jié)構(gòu)域是已知的且可用于本文所述的融合蛋白中。在一些實(shí)施方式中，該5’-3’核酸外切酶結(jié)構(gòu)域是保留5’-3’核酸外切酶活性的側(cè)翼核酸內(nèi)切酶(fen1)或其片段。fen1蛋白通常來自真核生物和古細(xì)菌且具有5’-3’核酸外切酶活性。多種fen1蛋白(以及其活性片段或變體)是已知的(參見例如williams等，j.mol.biol.371(1)：34-38(2007))且可用作本文所述的5’-3’核酸外切酶結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方式中，該fen1蛋白具有熱穩(wěn)定的5’-3’核酸外切酶活性。熱穩(wěn)定的fen1蛋白包括但不限于：詹氏甲烷球菌(methanococcusjannaschii)fen1蛋白(參見例如rao等，j.bacteriol.180(20)：5406-5412(1998))、激烈火球菌(pyrococcusfuriosus)fen1蛋白(參見例如hosfield等，cell95：135-146(1998))或解淀粉類硫還原球菌(desulfurococcusamylolyticus)fen1蛋白(參見例如mase等，actacrystallographicasectionff67：209-213(2011))，以及其活性變體(例如其基本等同的形式)或片段。一種示例性活性fen1蛋白片段是缺少pcna相互作用蛋白基序(pip)盒的fen1蛋白。pip盒描述于例如querol-audi等，proc.natl.acad.sciusa109(22)：8528-8533(2012)。

在一些實(shí)施方式中，該5’-3’核酸外切酶結(jié)構(gòu)域來自異源性聚合酶。例如，a家族聚合酶具有5’-3’活性并且因此a家族聚合酶的片段可用作5’-3’核酸外切酶結(jié)構(gòu)域。已描述了大腸桿菌聚合酶(poli)的5’-3’核酸外切酶結(jié)構(gòu)域內(nèi)的保守位點(diǎn)。參見例如，gutman等，nucleicacidsres.21(18)：4406-7(1993)。還已鑒定了多種熱穩(wěn)定聚合酶的5’-3’核酸外切酶結(jié)構(gòu)域并以保留的活性單獨(dú)表達(dá)。參見例如choi等，biotechnol.letts.23：1647-52(2001)和kaiser等，j.chem.biol.274(30)：21387-21394(1999)?？捎糜诒疚乃龅鞍兹诤衔锏?’-3’核酸外切酶結(jié)構(gòu)域的來源的示例性列表包括但不限于：嗜熱棲熱菌(thermusthermophilus(tth))dna聚合酶、水生棲熱菌(thermusaquaticus(taq))dna聚合酶、那不勒斯棲熱袍菌(thermotoganeapolitana(tne))dna聚合酶、嗜熱脂肪地芽胞桿菌(bacillusstearothermophilus)dna聚合酶和棲熱袍菌(thermotogamaritima(tma))dna聚合酶，及其突變體和變體(例如其基本等同的形式)和衍生物。

可用于以上所述融合物的示例性聚合酶包括但不限于：極端嗜熱火球菌(pyrococcushorikoshii)(例如登錄號(hào)o59610)、深?；鹎蚓?p.abyssi)(例如登錄號(hào)p77916)、格氏火球菌(p.glycovorans)(例如登錄號(hào)cac12849)、火球菌ge23(pyrococcussp.ge23)(例如登錄號(hào)caa90887)、火球菌gb-d(pyrococcussp.gb-d)(例如登錄號(hào)q51334)、強(qiáng)烈熾熱火球菌(p.furiosus)(例如登錄號(hào)p61875)、烏茲火球菌(p.woesei)(例如登錄號(hào)p61876)、鹿兒島熱球菌(thermococcuskodakaraensis)(例如登錄號(hào)p77933)、高氏熱球菌(t.gorgonarius)(例如登錄號(hào)p56689)、弗氏熱球菌(t.fumicolans)(例如登錄號(hào)p74918)、熱球菌9on-7(t.sp.9on-7)(例如登錄號(hào)q56366)、超嗜熱熱球菌na1(t.onnurineusna1)(例如登錄號(hào)abc11972)、海濱熱球菌(t.litoralis)(例如登錄號(hào)p30317)和聚集熱球菌(t.aggregans)(例如登錄號(hào)o33845)，及其保留聚合酶活性的片段和變體(例如其基本等同的形式)。在一些實(shí)施方式中，該聚合酶衍生自兩種親本聚合酶，例如pfu和deepvent。這種聚合酶在例如美國申請(qǐng)專利公開號(hào)20040219558；20040214194；20040191825；20030162173中描述。

在一些實(shí)施方式中，該模板依賴性聚合酶是rna聚合酶。在一些實(shí)施方式中，該rna聚合酶是反轉(zhuǎn)錄聚合酶。示例性的反轉(zhuǎn)錄酶包括但不限于鼠白血病病毒(mlv)反轉(zhuǎn)錄酶、禽類成髓細(xì)胞血癥病毒(amv)反轉(zhuǎn)錄酶、呼吸道合胞病毒(rsv)反轉(zhuǎn)錄酶、犬感染性貧血病毒(eiav)反轉(zhuǎn)錄酶、勞氏-相關(guān)病毒-2(rav2)反轉(zhuǎn)錄酶、superscriptii反轉(zhuǎn)錄酶、superscripti反轉(zhuǎn)錄酶、thermoscript反轉(zhuǎn)錄酶和mmlvrna酶h-反轉(zhuǎn)錄酶。

非模板依賴性聚合酶

在一些實(shí)施方式中，所述多核苷酸操縱酶是非模板依賴性聚合酶。示例性非模板依賴性聚合酶包括例如末端轉(zhuǎn)移酶或聚a聚合酶。示例性末端轉(zhuǎn)移酶包括但不限于末端轉(zhuǎn)移酶tdt。示例性聚a聚合酶包括但不限于大腸桿菌聚a聚合酶。

限制性內(nèi)切酶

在一些實(shí)施方式中，所述多核苷酸操縱酶是限制性內(nèi)切酶。因此，在這些實(shí)施方式中，導(dǎo)入基因組dna的修飾是序列特異性單鏈(例如切口)或雙鏈切割事件。許多種限制性內(nèi)切酶是已知的并可用于本發(fā)明。

可使用任何類型的限制性內(nèi)切酶。i型酶在遠(yuǎn)離其識(shí)別序列的位置上隨機(jī)切割dna。ii型酶在靠近或在其識(shí)別序列內(nèi)的確定的位置切割dna。一些ii型酶在其識(shí)別序列內(nèi)切割dna。ii-s型酶在其識(shí)別序列一側(cè)外切割。第三大類ii型酶，更適合稱為“iv型”，在其識(shí)別序列外切割。例如，識(shí)別連續(xù)序列(例如acui：ctgaag)的酶僅在一側(cè)切割；識(shí)別非連續(xù)序列(例如bcgi：cgannnnnntgc)的酶在兩側(cè)切割釋放包含識(shí)別序列的小片段。iii型酶在識(shí)別序列外切割并且在相同的dna分子內(nèi)相反的方向需要兩個(gè)這種序列以完成切割。

冷凍保護(hù)劑

冷凍保護(hù)劑是用來保護(hù)酶(例如聚合酶)免受凍害的物質(zhì)。示例性冷凍保護(hù)劑包括但不限于多元醇，包括例如二醇，三醇；多元醇；一元醇；單糖；多糖；或亞砜。示例性二醇冷凍保護(hù)劑包括，例如乙二醇，丙二醇和甘油。其它冷凍保護(hù)劑包括，例如二甲亞砜(dmso)。

在一些實(shí)施方式中，所述冷凍保護(hù)劑以5-80％的濃度，例如10-80％，10-60％，25-70％等等包含在儲(chǔ)存溶液中。

其它組分

在一些實(shí)施方式中，所述儲(chǔ)存溶液是僅具有冷凍保護(hù)劑、精氨酸或精氨酸衍生物，和聚合酶的液體溶液。在一些實(shí)施方式中，所述儲(chǔ)存溶液包含其他組分。

例如，在一些實(shí)施方式中，所述儲(chǔ)存溶液還包含一種或多種緩沖液。在一些實(shí)施方式中，所述緩沖液是“good”緩沖液(good，n.e.等(1966)biochemistry5，467-477；good，n.e.和izawa，s.(1972)methodsenzymol.24，53-68；ferguson，w.j.等(1980)anal.biochem.104，300-310)。示例性good緩沖液包括例如mes，bis-tris，ada，aces，pipes，bis-6tris丙烷，mopso，bes，mops，tes，hepes，dipso，mpos，tapso，heppso，popso，epps，n-三(羥甲基)甲基甘氨酸，tris，amp，重碳酸鹽，n-二(羥乙基)甘氨酸，硼酸鹽，卡可酸鹽，caps，capso，ches，檸檬酸鹽，dipso，甘氨酸，甘氨酰甘氨酸，磷酸鹽，taps，tapso和tea。

緩沖液可以對(duì)酶的最終使用以及提高儲(chǔ)存穩(wěn)定性有用的量包含。根據(jù)儲(chǔ)存的酶的使用，儲(chǔ)存溶液的緩沖液濃縮物可以是使用的濃度或酶的最佳濃度的“母液”濃度，例如10×，50×，100×等等。

在一些實(shí)施方式中，所述儲(chǔ)存溶液將缺乏一種或多種組分使得該儲(chǔ)存溶液在之后不再添加組分的情況下不支持多核苷酸的聚合。例如，在一些實(shí)施方式中，所述儲(chǔ)存溶液缺乏一種或多種模板多核苷酸或寡核苷酸引物。

在一些實(shí)施方式中，所述儲(chǔ)存溶液缺乏洗滌劑(例如，不含兩性離子洗滌劑，不含非離子洗滌劑)等等。在一些實(shí)施方式中，所述儲(chǔ)存溶液缺乏三糖。

所述儲(chǔ)存溶液可被儲(chǔ)存在各種所需的溫度下，在一些實(shí)施例中期望溫度低于4℃。所述儲(chǔ)存溶液可被儲(chǔ)存在，例如-80到5℃，或-30到5℃的溫度下至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10周和長(zhǎng)達(dá)1、2、3、4或5年。

還提供了包含本文所述的穩(wěn)定聚合酶溶液的試劑盒。

實(shí)施例

以下實(shí)施例旨在說明但不限于所要求保護(hù)的發(fā)明。

使用兩種熱穩(wěn)定dna聚合酶pi和tau，表明通過在儲(chǔ)存緩沖液中補(bǔ)充精氨酸或精氨酸衍生物，例如精氨酸胺和精氨酸乙酯提高聚合酶的穩(wěn)定性。精氨酸的保護(hù)或穩(wěn)定作用如此突出以至于它的存在顯著增加了聚合酶的穩(wěn)定性并使儲(chǔ)存保質(zhì)期延長(zhǎng)了9倍，并且超過了非離子型聚合物洗滌劑或兩性離子洗滌劑補(bǔ)充物所達(dá)到的穩(wěn)定性。pi聚合酶指與pfu/vent雜交dna聚合酶連接的側(cè)翼核酸內(nèi)切酶(fen1)的5’-3’核酸外切酶結(jié)構(gòu)域的融合物，pfu/vent雜交dna聚合酶轉(zhuǎn)而與具有k28突變(seqidno：22)的羧基末端sso7d結(jié)構(gòu)域融合，然后與聚-his標(biāo)簽融合。tau聚合酶指與pfu/vent雜交dna聚合酶連接的taq聚合酶的5’-3’核酸外切酶結(jié)構(gòu)域的融合物，pfu/vent雜交dna聚合酶轉(zhuǎn)而與具有k28突變(seqidno：22)的羧基末端sso7d結(jié)構(gòu)域融合，然后與聚-his標(biāo)簽融合。

已經(jīng)描述非離子型和兩性離子洗滌劑以提高熱穩(wěn)定聚合酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。例如，參見美國專利號(hào)6,127155和美國專利申請(qǐng)?zhí)?008/0064071。然而，sds-page分析揭示了dna聚合酶pi和tau在包含任一種洗滌劑的聚合酶儲(chǔ)存緩沖液中是不穩(wěn)定的。如圖1所示，當(dāng)在55℃加熱24小時(shí)后，pi和taudna聚合酶在包含chaps兩性離子洗滌劑或np40/吐溫20非離子型洗滌劑的混合物的儲(chǔ)存緩沖液中都不穩(wěn)定。加熱時(shí)pi和tau儲(chǔ)存母液的這種不穩(wěn)定與蛋白酶活性無關(guān)，因?yàn)檠a(bǔ)充有2×蛋白酶抑制劑混合物的儲(chǔ)存緩沖液不提供保護(hù)?；趯?shí)時(shí)穩(wěn)定性測(cè)試，包含chaps洗滌劑的儲(chǔ)存緩沖液中的pidna聚合酶的最大儲(chǔ)存穩(wěn)定性在4℃下僅為39天。

通過使用pcr的功能測(cè)試證明了聚合酶儲(chǔ)存穩(wěn)定性和功能活性之間的相關(guān)性。如圖2所示，當(dāng)在55℃加熱24小時(shí)后，pi和tau熱穩(wěn)定dna聚合酶在包含chaps或np40/吐溫20洗滌劑的混合物的儲(chǔ)存母液中都失去其聚合酶活性。非離子型洗滌劑，辛基-b-d-吡喃葡萄糖苷的補(bǔ)充對(duì)恢復(fù)聚合酶活性沒有效果。

為了鑒定優(yōu)良的補(bǔ)充物，我們?cè)诎鞣N洗滌劑包括非離子型(辛基-b-d-吡喃葡萄糖苷，np40，吐溫20)，離子型(sds，ctab)和兩性離子型(chaps)洗滌劑的儲(chǔ)存緩沖溶液中進(jìn)行聚合酶的sds-page分析，并將儲(chǔ)存緩沖液中升高溫度下的聚合酶穩(wěn)定性與儲(chǔ)存在-20℃下的相同緩沖液進(jìn)行比較。如圖3所示，沒有一種測(cè)試的洗滌劑對(duì)熱穩(wěn)定pidna聚合酶顯示穩(wěn)定性增強(qiáng)作用。

我們后來測(cè)試了幾種添加劑，包括非洗滌劑磺基甜菜堿，聚乙烯吡咯烷酮，多胺，氧化胺，精氨酸和精氨酸衍生物。在所有檢測(cè)的添加劑中，發(fā)現(xiàn)僅精氨酸和其衍生物，包括精氨酸乙酯和精氨酰胺，有效增強(qiáng)pi和taudna聚合酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。(表1)

表1

使用補(bǔ)充有精氨酸或其衍生物的chaps儲(chǔ)存緩沖液中pidna聚合酶的基于qpcr的功能分析顯示了從dcq值反映的顯著增強(qiáng)的聚合酶活性，dcq值比較了55℃預(yù)熱的聚合酶母液與儲(chǔ)存在-20℃下的母液。精氨酸始終顯示突出的穩(wěn)定性增強(qiáng)作用(表2)。

表2

表2顯示了精氨酸和其衍生物對(duì)pidna聚合酶穩(wěn)定性的影響和qpcr性能。通過使用儲(chǔ)存在包含chaps兩性離子洗滌劑的分別補(bǔ)充有0.1m精氨酸，0.1ml-精氨酸乙酯二鹽酸鹽，或0.1m精氨酰胺二鹽酸鹽的儲(chǔ)存緩沖液中的dna聚合酶產(chǎn)生該制劑。儲(chǔ)存緩沖液中的dna聚合酶在被用于制劑制備前在55℃預(yù)孵育24小時(shí)。通過將預(yù)熱聚合酶制備的制劑與儲(chǔ)存在-20℃的聚合酶制備的對(duì)照制劑比較得出δcq值(dcq)。

精氨酸的聚合酶穩(wěn)定性增強(qiáng)作用似乎是普遍的并與洗滌劑無關(guān)。包含兩性離子或非離子型洗滌劑的儲(chǔ)存緩沖液中的dna聚合酶的sds-page分析的結(jié)果表明當(dāng)在55℃加熱超過72小時(shí)后精氨酸保護(hù)并穩(wěn)定dna聚合酶(圖4和5)。

為了評(píng)估精氨酸對(duì)長(zhǎng)期儲(chǔ)存穩(wěn)定性的提高，進(jìn)行了加速穩(wěn)定性測(cè)試。分別在50℃，60℃和70℃孵育補(bǔ)充有0.75m精氨酸的包含chaps洗滌劑的儲(chǔ)存緩沖液中的pidna聚合酶持續(xù)指定時(shí)間(表3)。

表3

表3顯示了精氨酸對(duì)提高pidna聚合酶的長(zhǎng)期儲(chǔ)存穩(wěn)定性的影響。穩(wěn)定性提高通過qpcr性能反映。通過使用儲(chǔ)存在補(bǔ)充有(+)或沒有(-)0.75ml-精氨酸的包含chaps兩性離子洗滌劑的儲(chǔ)存緩沖液中的dna聚合酶產(chǎn)生該制劑。儲(chǔ)存緩沖液中的dna聚合酶在被用于制劑制備前以相應(yīng)溫度(50℃，60℃和70℃)和時(shí)間(2，3，8，11和12天)預(yù)孵育。通過將預(yù)熱聚合酶制備的制劑與儲(chǔ)存在-20℃的聚合酶制備的對(duì)照制劑比較得出δcq值。與-20℃對(duì)照比較的正cq值指示cq延遲。

這些預(yù)熱的聚合酶母液用于qpcr反應(yīng)，與儲(chǔ)存在-20℃的聚合酶母液相比，以評(píng)價(jià)其功能活性。如表3所示，沒有精氨酸補(bǔ)充，預(yù)熱的pi熱穩(wěn)定dna聚合酶母液在所有測(cè)試溫度下都沒有聚合酶活性。相比之下，使用精氨酸補(bǔ)充，預(yù)熱聚合酶母液的聚合酶活性恢復(fù)。該結(jié)果表明精氨酸提高熱穩(wěn)定聚合酶在儲(chǔ)存條件下的長(zhǎng)期儲(chǔ)存穩(wěn)定性。盡管在各種溫度下儲(chǔ)存溶液延長(zhǎng)加熱時(shí)仍然觀察到cq延遲，但依據(jù)arrhenius方程預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充有精氨酸的pidna聚合酶儲(chǔ)存母液的保質(zhì)期從39天顯著延長(zhǎng)到1年左右。

我們還檢測(cè)了包含精氨酸的溶液中的sso7d-taq融合物并也已經(jīng)觀察到提高的穩(wěn)定性(數(shù)據(jù)未顯示)。

表4顯示了精氨酸對(duì)各種聚合酶的熱穩(wěn)定性提高效果。顯示了在相應(yīng)的溫度和持續(xù)時(shí)間下加熱儲(chǔ)存在相應(yīng)的含或不含精氨酸補(bǔ)充物的儲(chǔ)存緩沖液中的(a)sso-taq融合物dna聚合酶，(b)mmlv反轉(zhuǎn)錄酶和(c)大腸桿菌多聚a聚合酶。加熱的聚合酶隨后用來構(gòu)建反應(yīng)物制劑，其隨后根據(jù)一般方案說明書用于基于qpcr的性能評(píng)估。顯示重復(fù)的平均cq值。

表4

a)sso-taqdna聚

合酶

b)mmlv反轉(zhuǎn)錄

酶

c)大腸桿菌多聚a聚

合酶

顯示平均cq值

n.d.-未檢測(cè)到檢

測(cè)到

ntc無模板對(duì)照

應(yīng)理解，本文所述的實(shí)施例和實(shí)施方式僅用于說明目的，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解據(jù)此作出的各種修飾或改變，且它們包括在本申請(qǐng)的主旨和權(quán)益以及所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。本文引用的所有發(fā)表物、專利和專利申請(qǐng)通過引用全文納入本文以用于所有目的。