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發(fā)明背景
發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及包括蛋白酶變體的組合物，這些蛋白酶變體適用于在例如高ph清潔或洗滌劑組合物中使用，如衣物洗滌洗滌劑組合物和餐具洗滌組合物，包括自動(dòng)餐具洗滌組合物。
相關(guān)領(lǐng)域描述
在洗滌劑工業(yè)中，在洗滌配制品中酶已經(jīng)應(yīng)用了數(shù)十年。在此類配制物中使用的酶包括淀粉酶、纖維素酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、和蛋白酶連同其他酶，或其混合物。商業(yè)上最重要的酶是蛋白酶。傳統(tǒng)上用于清潔過程中的許多蛋白酶是通常具有ph最佳值為9左右的堿性蛋白酶，因此適用于相當(dāng)堿性的洗滌劑。然而，一些具體的液體洗滌劑具有高于10的ph，并且由于非?？量痰臈l件以及酶在此類洗滌劑中作為結(jié)果的低儲(chǔ)存穩(wěn)定性，先前尚未認(rèn)為這些洗滌劑適合于酶。此外，在液體洗滌劑中，特別是當(dāng)含水量高時(shí)，酶傾向于更不穩(wěn)定。
已描述了許多有用的蛋白酶變體，其中許多在不同洗滌劑中具有改進(jìn)的活性、穩(wěn)定性和溶解性。
然而，這些變體不適用于非常高的ph洗滌劑，因?yàn)檫@些洗滌劑的堿性環(huán)境將使酶在非常短的時(shí)間之后分解并因此降低它們的活性。
發(fā)明概述
本發(fā)明涉及在堿性條件下穩(wěn)定并適用于高ph液體清潔的蛋白酶變體和包括此類變體的洗滌劑組合物。
本發(fā)明涉及具有ph為10或更高的液體清潔組合物，該組合物包括至少0.01wt％的蛋白酶，其中該蛋白酶是親本蛋白酶的變體，并且其中該蛋白酶變體具有與seqidno:2的氨基酸序列具有至少60％序列一致性的氨基酸序列，并且其中所述蛋白酶變體的特征在于當(dāng)在40℃下在具有ph為10的液體洗滌劑中4小時(shí)后進(jìn)行測(cè)量時(shí)，具有比親本蛋白酶高至少10％的殘留活性。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及具有ph為10或更高的液體清潔組合物，該組合物包括：(a)至少0.01wt％的蛋白酶，其中該蛋白酶是親本蛋白酶的變體，并且其中該蛋白酶變體具有與seqidno:2的氨基酸序列具有至少60％序列一致性的氨基酸序列，并且其中所述蛋白酶變體的特征在于當(dāng)在40℃下在具有ph為10的液體洗滌劑中4小時(shí)后進(jìn)行測(cè)量時(shí)，具有比親本蛋白酶高至少10％的殘留活性；以及(b)任選地，蛋白酶抑制劑，優(yōu)選所述蛋白酶抑制劑是肽醛蛋白酶抑制劑。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種液體清潔組合物，該組合物包括：(a)從20％至95％wt，優(yōu)選從40％至95％wt，進(jìn)一步優(yōu)選地從約70％至約90％wt的水；(b)至少0.01wt％的蛋白酶，其中該蛋白酶是親本蛋白酶的變體，并且其中該蛋白酶變體具有與seqidno:2的氨基酸序列具有至少60％序列一致性的氨基酸序列，并且其中所述蛋白酶變體的特征在于當(dāng)在40℃下在具有ph為10的液體洗滌劑中4小時(shí)后進(jìn)行測(cè)量時(shí)，具有比親本蛋白酶高至少10％的殘留活性；以及(c)任選地，蛋白酶抑制劑，優(yōu)選所述蛋白酶抑制劑是肽醛蛋白酶抑制劑。
本發(fā)明還涉及一種液體清潔組合物，該組合物包括：
(a)從0％至20％wt，優(yōu)選0.1％至2.5％wt的洗滌劑表面活性劑；
(b)從40％至95％wt，優(yōu)選從約70％至約90％wt的水；
(c)從1％至30％wt的堿性緩沖液系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括堿金屬硅酸鹽或堿金屬氫氧化物或其混合物，以提供從約11至13.5的ph；以及
(d)從0.001％至10％wt，優(yōu)選0.1％至5％wt的蛋白酶變體。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種液體清潔組合物，該組合物包括：
(a)從0％至20％wt，優(yōu)選0.1％至2.5％wt的洗滌劑表面活性劑；
(b)從0.001％至10％wt，優(yōu)選0.1％至5％wt的蛋白酶變體；以及
(c1)從20％至95％wt，優(yōu)選從40％至95％wt，進(jìn)一步優(yōu)選從約70％至約90％wt的水；和/或
(c2)從1％至30％wt的堿性緩沖液系統(tǒng)，該堿性緩沖液系統(tǒng)包括堿金屬硅酸鹽或堿金屬氫氧化物或其混合物，以提供約11至13.5的ph，優(yōu)選ph為從約12至13.5；
(e)任選地，蛋白酶抑制劑，優(yōu)選所述蛋白酶抑制劑是肽醛蛋白酶抑制劑。
在所述實(shí)施例中，(c1)和(c2)可以用作彼此的替代物，或者它們可以彼此組合使用。
定義
術(shù)語“等位基因變體”意指占用同一染色體位點(diǎn)的基因的兩個(gè)或更多個(gè)替代形式中的任一者。等位基因變異由突變天然產(chǎn)生，并且可以導(dǎo)致群體內(nèi)多態(tài)性。基因突變可以是沉默的(在所編碼的多肽中沒有改變)或可編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因變體是由基因的等位基因變體編碼的多肽。
術(shù)語“cdna”意指可以通過從得自真核或原核細(xì)胞的成熟的、剪接的mrna分子進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄而制備的dna分子。cdna缺乏可以存在于對(duì)應(yīng)基因組dna中的內(nèi)含子序列。早先的初始rna轉(zhuǎn)錄本是mrna的前體，其在呈現(xiàn)為成熟的剪接的mrna之前要經(jīng)一系列的步驟進(jìn)行加工，包括剪接。
術(shù)語“編碼序列”意指一種多核苷酸，該多核苷酸直接規(guī)定了一種變體的氨基酸序列。編碼序列的邊界一般由開放閱讀框架決定，該開放閱讀框架從起始密碼子(如atg、gtg或ttg)開始并且以終止密碼子(如taa、tag或tga)結(jié)束。編碼序列可以是基因組dna、cdna、合成dna或其組合。
術(shù)語“控制序列”意指為編碼本發(fā)明的一種變體的一種多核苷酸的表達(dá)所需的核酸序列。每個(gè)控制序列對(duì)于編碼該變體的多核苷酸來說可以是原生(native)的(即，來自相同基因)或外源的(即，來自不同基因)，或相對(duì)于彼此是原生的或外源的。此類控制序列包括但不限于前導(dǎo)子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動(dòng)子、信號(hào)肽序列以及轉(zhuǎn)錄終止子。至少，控制序列包括啟動(dòng)子以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)。出于引入有利于將這些控制序列與編碼變體的多核苷酸的編碼區(qū)連接的特異性限制酶切位點(diǎn)的目的，這些控制序列可以提供有多個(gè)接頭。
在此將術(shù)語“洗滌劑組分”定義為意指可以用于清潔組合物，如洗滌劑組合物中的化學(xué)品的類型。洗滌劑組分的實(shí)例是表面活性劑、助水溶劑、助洗劑、共助洗劑、螯合劑(chelator)或螯合試劑(chelatingagent)、漂白系統(tǒng)或漂白組分、聚合物、織物調(diào)色劑、織物調(diào)理劑、增泡劑、抑泡劑、分散劑、染料轉(zhuǎn)移抑制劑、熒光增白劑、香料、光學(xué)增亮劑、殺細(xì)菌劑、殺真菌劑、污物懸浮劑、污物釋放聚合物、抗再沉積劑、酶抑制劑或穩(wěn)定劑、酶激活劑、抗氧化劑以及增溶劑。該洗滌劑組合物可以包括一種或多種任何類型的洗滌劑組分。
術(shù)語“清潔組合物”包括“洗滌劑組合物”，并且除非另外指明，包括所有形式的洗滌劑組合物，如棒、均勻片劑、具有兩個(gè)或更多個(gè)層的片劑、具有一個(gè)或多個(gè)室的袋、規(guī)則的或壓縮的粉末、凝膠、顆粒、液體(例如規(guī)則的、壓縮的或濃縮的液體)、糊狀、粉末、噴霧或片劑組合物，包括重垢液(hdl)、精細(xì)織物液體洗滌劑、液體和/或固體衣物洗滌劑和精細(xì)織物洗滌劑；硬表面清潔配制品，用于例如玻璃、木材、陶瓷和金屬臺(tái)面以及窗戶；地毯清潔劑；爐灶清潔劑；織物清新劑；織物柔軟劑；紡織品和衣物預(yù)去污劑(pre-spotter)，連同餐具洗滌劑，例如手洗餐具洗滌劑、輕垢餐具洗滌劑、機(jī)洗餐具洗滌劑；通用或重垢清洗劑，液體、凝膠或糊狀形式的通用清洗劑、液體清潔和消毒劑，包括抗細(xì)菌手洗類型、清潔棒、漱口水、義齒清潔劑、汽車或地毯香波、浴室清潔劑；頭發(fā)香波和頭發(fā)漂洗劑(hair-rinse)；淋浴露、泡沫??；金屬清潔劑；連同清潔輔助劑，例如漂白添加劑和“去污棒(stain-stick)”或預(yù)處理類型。袋可以被配置為單個(gè)或多個(gè)的室。它可以具有適合保存該組合物的任何形式、形狀和材料，例如在與水接觸之前，不允許該組合物從袋中釋放出來。袋由封裝內(nèi)體積的水溶性膜制成?？梢詫⑺鰞?nèi)體積分為具有袋的室。優(yōu)選的膜是形成膜或片的聚合材料，優(yōu)選是聚合物。優(yōu)選的聚合物、共聚物或其衍生物選自聚丙烯酸酯、和水溶性丙烯酸酯共聚物、甲基纖維素、羧甲基纖維素、糊精鈉、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、麥芽糊精、聚甲基丙烯酸酯，最優(yōu)選的是聚乙烯醇共聚物以及羥丙基甲基纖維素(hpmc)。優(yōu)選地，聚合物在膜例如pva中的水平是至少約60％。優(yōu)選的平均分子量將典型地是約20,000至約150,000。膜還可以是共混組合物，該共混組合物包括可水解降解并且水可溶的聚合物共混物，例如聚乳酸和聚乙烯醇(已知在貿(mào)易參考m8630下，如由美國印第安納州的monosolllc公司銷售)加增塑劑，像甘油、乙二醇、丙二醇、山梨醇及其混合物。這些袋可以包括固體衣物清潔組合物或部分組分和/或液體清潔組合物或由水溶性膜分開的部分組分。用于液體組分的室在組成上可以與包括固體的室不同：us2009/0011970a1。
可以由水可溶的袋中或片劑的不同層中的室來將洗滌劑成分(或組分)物理地彼此分開。因此，可以避免組分間的不良的存儲(chǔ)相互作用。在洗滌溶液中，每個(gè)室的不同溶解曲線還可以引起選擇的組分的延遲溶解。
如在此所述的清潔組合物(例如液體清潔組合物)適用于清潔過程，如衣物洗滌或硬表面清潔，包括餐具洗滌和工業(yè)清潔。示例性衣物洗滌過程可以選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：住宅衣物洗滌過程、工業(yè)衣物洗滌過程和公共機(jī)構(gòu)衣物洗滌過程。
除了包含本發(fā)明的蛋白酶變體之外，該洗滌劑配制品還可以包含一種或多種另外的酶(如過水解酶、淀粉酶、過氧化氫酶、纖維素酶(例如內(nèi)切葡聚糖酶)、角質(zhì)酶、鹵代過氧合酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、果膠酶、木葡聚糖酶、果膠酶、果膠裂解酶、過氧化物酶、蛋白酶、dna酶、黃原膠酶、以及木葡聚糖酶，或其任何混合物)，和/或組分，如表面活性劑、助洗劑、螯合劑(chelator)或螯合試劑(chelatingagent)、漂白系統(tǒng)或漂白組分、聚合物、織物調(diào)理劑、增泡劑、抑泡劑、染料、香料、晦暗抑制劑、光學(xué)增亮劑、殺細(xì)菌劑、殺真菌劑、污物懸浮劑、防蝕劑、酶抑制劑或穩(wěn)定劑、酶激活劑、一種或多種轉(zhuǎn)移酶、水解酶、氧化還原酶、上藍(lán)劑和熒光染料、抗氧化劑、以及增溶劑。
術(shù)語“餐具洗滌”是指所有形式的洗滌餐具，例如手動(dòng)或自動(dòng)餐具洗滌。洗滌餐具包括但不限于，清潔所有形式的陶器，例如盤子、杯子、玻璃杯、碗，所有形式的用餐工具，例如匙、刀、叉，以及上菜用具連同陶瓷，塑料(例如三聚氰胺)，金屬，瓷器，玻璃及丙烯酸酯。
術(shù)語“餐具洗滌組合物”是指用于清潔硬表面的所有形式的組合物。本發(fā)明不局限于任何具體類型的餐具洗滌組合物或任何具體洗滌劑。
術(shù)語“表達(dá)”包括涉及一種變體的產(chǎn)生的任何步驟，包括(但不限于)轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾以及分泌。
術(shù)語“表達(dá)載體”意指一種直鏈或環(huán)狀dna分子，該分子包括編碼一種變體的一種多核苷酸并且可操作地連接至提供用于其表達(dá)的控制序列。
在此將術(shù)語“硬表面清潔”定義為清潔硬表面，其中硬表面可以包括地板、桌子、墻壁、屋頂?shù)?，連同硬物體的表面，例如汽車(汽車洗滌)和餐具(餐具洗滌)。餐具洗滌包括但不限于，清潔盤子、杯子、玻璃杯、碗、及用餐工具(例如匙、刀、叉)、上菜用具、陶瓷、塑料(例如三聚氰胺)、金屬、瓷器、玻璃及丙烯酸酯。
術(shù)語“宿主細(xì)胞”意指易于用包括本發(fā)明的多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等的任何細(xì)胞類型。術(shù)語“宿主細(xì)胞”涵蓋由于復(fù)制期間發(fā)生的突變而與親本細(xì)胞不同的親本細(xì)胞的任何后代。
術(shù)語“改進(jìn)的特性”意指與相對(duì)于親本蛋白酶有所改進(jìn)的一種蛋白酶變體相關(guān)的特征。此類改進(jìn)的特性包括但不限于洗滌性能、蛋白酶活性、熱活性曲線、熱穩(wěn)定性、ph活性曲線、ph穩(wěn)定性、底物/輔因子特異性、改進(jìn)的表面特性、底物特異性、產(chǎn)物特異性、增加的穩(wěn)定性、在存儲(chǔ)條件下的改進(jìn)的穩(wěn)定性、以及化學(xué)穩(wěn)定性。
術(shù)語“穩(wěn)定性(stability)”包括儲(chǔ)存穩(wěn)定性和在使用過程中的穩(wěn)定性，例如在清洗過程中的穩(wěn)定性，并且反應(yīng)了作為時(shí)間函數(shù)的根據(jù)本發(fā)明的蛋白酶變體的穩(wěn)定性，例如當(dāng)?shù)鞍酌缸凅w置于溶液中時(shí)，尤其是在洗滌劑溶液中時(shí)，能夠保留多少活性。這種穩(wěn)定性受到許多因素的影響，例如ph、溫度、洗滌劑組合物，例如助洗劑、表面活性劑的量等等?？墒褂萌缭趯?shí)例3中所描述的測(cè)定來對(duì)蛋白酶穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)量。術(shù)語“改進(jìn)的穩(wěn)定性”或“增加的穩(wěn)定性”在此處被定義為一種變體蛋白酶相對(duì)于親本蛋白酶(例如相對(duì)于seqidno:2)的穩(wěn)定性顯示在溶液中增加的穩(wěn)定性。
在本發(fā)明的一個(gè)具體方面，該改進(jìn)的穩(wěn)定性是在具有ph在10或更高的液體洗滌劑中的改進(jìn)的穩(wěn)定性。術(shù)語“洗滌劑穩(wěn)定性”或“改進(jìn)的洗滌劑穩(wěn)定性”具體是當(dāng)本發(fā)明的蛋白酶變體混入具有ph在10或更高的液體洗滌劑配制品中并且然后在15℃和50℃之間的溫度(例如20℃、30℃或40℃)下儲(chǔ)存時(shí)蛋白酶活性的改進(jìn)的穩(wěn)定性。
術(shù)語“改進(jìn)的洗滌性能”在此定義為根據(jù)本發(fā)明的蛋白酶變體相對(duì)于親本蛋白酶的洗滌性能，例如通過增加的去污顯示改進(jìn)的洗滌性能。術(shù)語“洗滌性能”包括衣物洗滌中的，但亦包括例如在餐具洗滌中的洗滌性能。洗滌性能可以被量化，如在此的“洗滌性能”定義下所描述的。
術(shù)語“分離的”意指在自然界中不存在的一種形式或環(huán)境中的一種物質(zhì)。分離的物質(zhì)的非限制性實(shí)例包括(1)任何非天然發(fā)生的物質(zhì)，(2)包括但不限于任何酶、變體、核酸、蛋白質(zhì)、肽或輔因子的任何物質(zhì)，該物質(zhì)至少部分地從與其本質(zhì)相關(guān)的一種或多種或所有天然存在的的成分中去除；(3)相對(duì)于天然發(fā)現(xiàn)的物質(zhì)通過人工修飾的任何物質(zhì)；或(4)通過相對(duì)于與其天然相關(guān)聯(lián)的其他組分，增加該物質(zhì)的量而修飾的任何物質(zhì)(例如，編碼該物質(zhì)的基因的多個(gè)拷貝；比與編碼該物質(zhì)的基因天然相關(guān)聯(lián)的啟動(dòng)子更強(qiáng)的啟動(dòng)子的使用)。分離的物質(zhì)可以存在于發(fā)酵液樣品中。
術(shù)語“衣物洗滌”涉及家用衣物洗滌和工業(yè)衣物洗滌兩者并且意指用一種包含本發(fā)明的洗滌劑組合物的溶液處理紡織品和/或織物的過程。衣物洗滌過程可以例如使用例如家用或工業(yè)洗滌機(jī)進(jìn)行或可以手動(dòng)進(jìn)行。
術(shù)語“成熟多肽”意指在翻譯和任何翻譯后修飾如n-末端加工、c-末端截短、糖基化、磷酸化、自催化活化等之后處于其最終形式的多肽。在一方面，成熟多肽是seqidno:2的氨基酸1至269和seqidno:1的氨基酸1至275。本領(lǐng)域已知，宿主細(xì)胞可以產(chǎn)生由同一多核苷酸表達(dá)的兩種或更多種不同成熟多肽(即，具有不同c-末端和/或n-末端氨基酸)的混合物。
術(shù)語“成熟多肽編碼序列”意指編碼具有蛋白酶活性的成熟多肽的一種多核苷酸。
術(shù)語“核酸構(gòu)建體”意指單-鏈或雙-鏈的核酸分子，該核酸分子是從天然存在的基因中分離的，或以本來不存在于自然界中的方式被修飾成包含核酸的區(qū)段，或是合成的，該核酸分子包括一個(gè)或多個(gè)控制序列。
術(shù)語“可操作地連接”意指以下配置，其中控制序列相對(duì)于多核苷酸的編碼序列放置在適當(dāng)位置，以使得控制序列指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)。
術(shù)語“親本”意指對(duì)其做出改變以產(chǎn)生本發(fā)明的酶變體的一種蛋白酶。應(yīng)理解的是，在上下文中的“具有相同的氨基酸序列”的表達(dá)涉及100％的序列一致性。在一個(gè)具體實(shí)施例中，該親本是與seqidno:1或2的多肽具有至少60％的一致性，如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的一致性的蛋白酶。
術(shù)語“蛋白酶”在此被定義為水解肽鍵的酶。它包括任何屬于ec3.4酶組的酶(包括其13個(gè)亞類中的每一種)。ec編號(hào)參考加利福尼亞州(california)的圣迭戈(sandiego)的nc-iubmb學(xué)術(shù)出版社(academicpress)的1992年酶命名法，分別包括出版于歐洲生物化學(xué)雜志(eur.j.biochem.)1223:1-5(1994)；歐洲生物化學(xué)雜志232:1-6(1995)；歐洲生物化學(xué)雜志237:1-5(1996)；歐洲生物化學(xué)雜志250:1-6(1997)；以及歐洲生物化學(xué)雜志264:610-650(1999)的增刊1-5。洗滌劑工業(yè)如衣物和餐具洗滌中最廣泛使用的蛋白酶是絲氨酸蛋白酶或絲氨酸肽酶，絲氨酸蛋白酶或絲氨酸肽酶是以下蛋白酶的亞組，這些蛋白酶特征在于在活性位點(diǎn)具有絲氨酸，該絲氨酸與底物形成共價(jià)加合物。另外，枯草桿菌酶(以及絲氨酸蛋白酶)的特征為除了絲氨酸以外，還具有兩個(gè)活性位點(diǎn)氨基酸殘基，即組氨酸殘基和天冬氨酸殘基?？莶輻U菌酶是指根據(jù)斯艾森(siezen)等人，1991，蛋白質(zhì)工程學(xué)(proteinengng.)4:719-737和斯艾森(siezen)等人，1997，蛋白質(zhì)科學(xué)(proteinscience)6:501-523的絲氨酸蛋白酶亞組。枯草桿菌酶可以劃分為6個(gè)亞部，即，枯草桿菌蛋白酶家族、嗜熱蛋白酶(thermitase)家族、蛋白酶k家族、羊毛硫抗生素肽酶家族、kexin家族和pyrolysin家族。術(shù)語“蛋白酶活性”意指蛋白水解活性(ec3.4)?？捎糜谙礈靹┲械牡鞍酌钢饕莾?nèi)肽酶(ec3.4.21)。存在若干蛋白酶活性類型：三種主要的活性類型是：胰蛋白酶樣，其中在arg或lys后在p1處存在酰胺底物的切割；糜蛋白酶樣，其中切割發(fā)生在p1處，在疏水性氨基酸中的一個(gè)之后；以及彈性蛋白酶樣，其中切割在p1處ala之后。出于本發(fā)明的目的，根據(jù)如在以下材料與方法部分中所述的suc-aapf-pna活性測(cè)定確定蛋白酶活性。在一方面，本發(fā)明的蛋白酶變體具有親本酶的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的酶活性。在一個(gè)具體方面，本發(fā)明的蛋白酶變體具有seqidno:2的多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的酶活性。
術(shù)語“蛋白酶活性”意指蛋白水解活性(ec3.4)。本發(fā)明的蛋白酶是內(nèi)肽酶(ec3.4.21)。存在若干蛋白酶活性類型：三種主要的活性類型是：胰蛋白酶樣，其中在arg或lys后在p1處存在酰胺底物的切割；糜蛋白酶樣，其中切割發(fā)生在p1處，在疏水性氨基酸中的一個(gè)之后；以及彈性蛋白酶樣，其中切割在p1處ala之后。出于本發(fā)明的目的，根據(jù)以下“材料與方法(materialsandmethods)”所述的程序確定蛋白酶活性。本發(fā)明的這些蛋白酶變體優(yōu)選具有seqidno:2的多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、以及至少100％的蛋白酶活性。
術(shù)語“殘留活性”在此上下文中意指在儲(chǔ)存后，特別是在液體洗滌劑中儲(chǔ)存后留下的或剩余的蛋白酶活性。在將蛋白酶添加至洗滌劑中之后，當(dāng)測(cè)量殘留活性時(shí)，在t1測(cè)量該蛋白酶的活性。然后在儲(chǔ)存一定量的時(shí)間之后，典型的數(shù)分鐘或數(shù)周后，在t2測(cè)量殘留活性。本發(fā)明的蛋白酶變體在ph為10的高ph液體洗滌劑中、在30℃的溫度下儲(chǔ)存之前(在t1)，并在t＝4小時(shí)或更長時(shí)間測(cè)量時(shí)，優(yōu)選具有至少10％、至少20％、例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％的蛋白酶活性的殘留活性。在此上下文中，高ph液體洗滌劑是ph為10或更高的液體洗滌劑，并且在此上下文中，非常高ph的液體洗滌劑是ph為12或更高的液體洗滌劑。根據(jù)本發(fā)明的蛋白酶變體優(yōu)選更穩(wěn)定，即與親本蛋白酶(例如例如具有seqidno2的蛋白酶)相比，在高ph液體洗滌劑(ph＝10或更高)中儲(chǔ)存后具有更高的殘留活性，和/或根據(jù)本發(fā)明的蛋白酶變體是更穩(wěn)定的，即與親本蛋白酶(例如具有seqidno2的蛋白酶)相比，在液體洗滌劑(即在包括40％水或更多水的液體洗滌劑)中儲(chǔ)存后具有更高的殘留活性。優(yōu)選地，與親本蛋白酶的殘留活性相比，例如與seqidno2相比，當(dāng)在30℃下在具有ph為10的液體洗滌劑和/或具有至少40％水的液體洗滌劑中儲(chǔ)存4小時(shí)后測(cè)量時(shí)，本發(fā)明的蛋白酶變體的殘留活性是至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％如至少50％更高的。如實(shí)例3中所述。
具體地，根據(jù)本發(fā)明的蛋白酶變體及其相應(yīng)的親本蛋白酶的相對(duì)穩(wěn)定性在高ph、高于或在ph10下不同于其在中性ph、高于或在ph7下的相對(duì)穩(wěn)定性。
兩個(gè)氨基酸序列之間或兩個(gè)核苷酸序列之間的相關(guān)性由參數(shù)“序列一致性”描述。出于本發(fā)明的目的，使用尼德爾曼-翁施算法(尼德爾曼(needleman)和翁施(wunsch)，1970，分子生物學(xué)雜志(j.mol.biol.)48:443-453)確定兩個(gè)氨基酸序列之間的序列一致性，如在emboss軟件包(emboss：歐洲分子生物學(xué)開放軟件包(emboss:theeuropeanmolecularbiologyopensoftwaresuite)，賴斯(rice)等人，2000，遺傳學(xué)趨勢(shì)(trendsgenet.)16:276-277)的尼德爾(needle)程序，優(yōu)選地5.0.0版或更新版本中所執(zhí)行的。所使用的參數(shù)是空位開放罰分10、空位延伸罰分0.5，和eblosum62(blosum62的emboss版本)取代矩陣。將標(biāo)記為“最長一致性”的尼德爾(needle)輸出(使用-非簡化(nobrief)選項(xiàng)獲得)用作百分比一致性并且是如下計(jì)算的：
(一致的殘基x100)/(比對(duì)長度-比對(duì)中的空位總數(shù))
出于本發(fā)明的目的，使用如在emboss包(emboss：歐洲分子生物學(xué)開放軟件套件，賴斯等人，2000，見上文)(優(yōu)選5.0.0版或更新版本)的尼德爾程序中所實(shí)施的尼德爾曼-翁施算法(尼德爾曼和翁施，1970，見上文)來確定兩個(gè)脫氧核糖核苷酸序列之間的序列一致性。所使用的參數(shù)是空位開放罰分10，空位延伸罰分0.5，以及ednafull(ncbinuc4.4的emboss版)取代矩陣。將標(biāo)記為“最長一致性”的尼德爾(needle)輸出(使用-非簡化(nobrief)選項(xiàng)獲得)用作百分比一致性并且是如下計(jì)算的：
(一致的脫氧核糖核苷酸x100)/(比對(duì)長度-比對(duì)中的空位總數(shù))
不同的嚴(yán)格條件定義如下。
術(shù)語“基本上純的變體”意指按重量計(jì)包含最多10％、最多8％、最多6％、最多5％、最多4％、最多3％、最多2％、最多1％、以及最多0.5％的其他多肽材料的制劑，這些其他多肽材料是與其天然或重組地相關(guān)的。優(yōu)選地，該變體按存在于制劑中的總多肽材料的重量計(jì)是至少92％純的，例如至少94％純的、至少95％純的、至少96％純的、至少97％純的、至少98％純的、至少99％純的、至少99.5％純的、以及100％純的。本發(fā)明的這些變體優(yōu)選以基本上純的形式存在。例如，這可通過經(jīng)由眾所周知的重組方法或經(jīng)由經(jīng)典的純化方法制備變體來完成。
術(shù)語“基本上純的多核苷酸”意指不含其他外部或不想要的核苷酸并且處在適用于基因工程化多肽生產(chǎn)系統(tǒng)內(nèi)的形式的多核苷酸制劑。因而，基本上純的多核苷酸包含按重量計(jì)最多10％、最多8％、最多6％、最多5％、最多4％、最多3％、最多2％、最多1％和最多0.5％與該多核苷酸天然或重組關(guān)聯(lián)的其他多核苷酸物質(zhì)。然而，基本上純的多核苷酸可以包括天然存在的5’-和3’-非翻譯區(qū)，如啟動(dòng)子和終止子。優(yōu)選的是，基本上純的多核苷酸按重量計(jì)是至少90％純的，例如至少92％純的、至少94％純的、至少95％純的、至少96％純的、至少97％純的、至少98％純的、至少99％純的、以及至少99.5％純的。本發(fā)明的這些多核苷酸優(yōu)選以基本上純的形式存在。
術(shù)語“紡織品”意指包括紗線、紗線中間體、纖維、非機(jī)織物材料、天然材料、合成材料的任何紡織品材料，連同由這些材料制成的織物，例如服裝、衣服和其他物品。當(dāng)使用術(shù)語織物或衣服時(shí)，旨在也包括廣義術(shù)語紡織品。
術(shù)語“變體”意指具有蛋白酶活性的、在三個(gè)或更多個(gè)(例如，若干個(gè))位置處包含改變(即，取代、插入和/或缺失)的一個(gè)多肽。取代意指占據(jù)位置的氨基酸替換不同的氨基酸；缺失意指去除占據(jù)位置的氨基酸；并且插入意指鄰近于并且緊跟著占據(jù)一個(gè)位置的氨基酸之后添加一個(gè)或多個(gè)(例如，若干個(gè))氨基酸(例如，1、2、3、4或5個(gè)氨基酸)。術(shù)語蛋白酶變體可以是枯草桿菌酶親本的變體，即蛋白酶變體是與親本蛋白酶相比在三個(gè)或更多個(gè)(例如，若干個(gè))位置處包括改變(即取代、插入和/或缺失)的枯草桿菌酶。
術(shù)語“洗滌性能”被用作酶在例如洗滌(如衣物洗滌或硬表面清潔)過程中去除存在于有待清潔的物體上的污漬的能力。洗滌性能的改進(jìn)可以通過計(jì)算在amsa測(cè)定中定義的所謂強(qiáng)度值(int)來量化。
術(shù)語“野生型蛋白酶”意指由天然存在的有機(jī)體(例如在自然界中發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌、古生菌、酵母、真菌、植物或動(dòng)物)表達(dá)的一種蛋白酶。野生型枯草桿菌酶的實(shí)例是枯草桿菌蛋白酶savinase，即seqidno:2的氨基酸1至269。
變體命名規(guī)則
為了本發(fā)明的目的，使用枯草桿菌蛋白酶bpn'(seqidno:1的氨基酸1-275的序列(斯艾森(siezen)等人，1991，蛋白質(zhì)工程(proteineng.)4:719-737))來確定另一種蛋白酶中對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基。將另一種蛋白酶的氨基酸序列與在seqidno:1中披露的成熟多肽比對(duì)，并且基于比對(duì)，使用尼德曼-翁施算法(尼德爾曼和翁施，1970，分子生物學(xué)雜志48:443-453)如在emboss軟件包(emboss：歐洲分子生物學(xué)開放軟件包，賴斯等人，2000，遺傳學(xué)趨勢(shì)16:276-277)的尼德爾程序，優(yōu)選地5.0.0版或更新版本中所執(zhí)行的，確定與在seqidno:1中披露的多肽中的任何氨基酸殘基相應(yīng)的氨基酸位置編號(hào)。所使用的參數(shù)是空位開放罰分10、空位延伸罰分0.5，和eblosum62(blosum62的emboss版本)取代矩陣。
另一種蛋白酶中對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基的鑒別可以通過使用若干計(jì)算機(jī)程序使用其對(duì)應(yīng)的缺省參數(shù)比對(duì)多個(gè)多肽序列來確定，這些計(jì)算機(jī)程序包括但不限于muscle(通過對(duì)數(shù)期望值的多序列比較；3.5版或更新版本；埃德加(edgar)，2004，核酸研究(nucleicacidsresearch)32:1792-1797)；mafft(6.857版或更新版本；加藤(katoh)和庫瑪(kuma)，2002，核酸研究30:3059-3066；加藤等人，2005，核酸研究33:511-518；加藤和朝都(toh)，2007，生物信息學(xué)(bioinformatics)23:372-374；加藤等人，2009，分子生物學(xué)中的方法(methodsinmolecularbiology)537:39-64；加藤和朝都，2010，生物信息學(xué)26:1899-1900)；以及采用clustalw的embossemma(1.83版或更新版本；湯普森(thompson)等人，1994，核酸研究22:4673-4680)。
當(dāng)其他酶與seqidno:1的成熟多肽相背離使得傳統(tǒng)的基于序列的比較方法不能檢測(cè)其相互關(guān)系時(shí)(林達(dá)爾(lindahl)和埃洛弗松(elofsson)，2000，分子生物學(xué)雜志(j.mol.biol.)295:613-615)，可應(yīng)用其他成對(duì)序列比較算法。在基于序列的搜索中的更大靈敏度可以使用搜索程序來獲得，這些搜索程序利用多肽家族的概率表示(譜(profile))來搜索數(shù)據(jù)庫。例如，psi-blast程序通過迭代數(shù)據(jù)庫搜索過程來產(chǎn)生多個(gè)譜，并且能夠檢測(cè)遠(yuǎn)距離同源物(阿特休爾(atschul)等人，1997，核酸研究(nucleicacidsres.)25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族在蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中具有一個(gè)或多個(gè)代表，則可以實(shí)現(xiàn)甚至更大的靈敏度。程序如genthreader(瓊斯(jones)，1999，分子生物學(xué)雜志(j.mol.biol.)287:797-815；麥古芬(mcguffin)和瓊斯，2003，生物信息學(xué)(bioinformatics)19:874-881)利用來自不同來源(psi-blast、二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、結(jié)構(gòu)比對(duì)譜以及溶劑化勢(shì))的信息作為預(yù)測(cè)查詢序列的結(jié)構(gòu)折疊的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的輸入。類似地，高夫(gough)等人，2000，分子生物學(xué)雜志(j.mol.biol.)313:903-919的方法可以用于比對(duì)未知結(jié)構(gòu)的序列與存在于scop數(shù)據(jù)庫中的超家族模型。這些比對(duì)進(jìn)而可以用于產(chǎn)生多肽的同源性模型，并且使用出于該目的而開發(fā)的多種工具可以評(píng)定此類模型的準(zhǔn)確度。
對(duì)于已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，可獲取若干工具和資源以供找回(retrieve)和生成結(jié)構(gòu)比對(duì)。例如，蛋白的scop超家族已經(jīng)在結(jié)構(gòu)上進(jìn)行比對(duì)，并且那些比對(duì)是可訪問的并且可下載的?？梢允褂枚喾N算法如距離比對(duì)矩陣(奧爾姆(holm)和桑德(sander)，1998，蛋白質(zhì)(proteins)33:88-96)或組合延伸(辛迪亞洛夫(shindyalov)和伯恩(bourne)，1998，蛋白質(zhì)工程(proteinengineering)11:739-747)比對(duì)兩種或更多種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，并且這些算法的實(shí)施可以另外用于查詢具有感興趣結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫，以便發(fā)現(xiàn)可能的結(jié)構(gòu)同源物(例如，奧爾姆和帕克(park)，2000，生物信息學(xué)(bioinformatics)16:566-567)。
在描述本發(fā)明的變體中，以下所述的命名法適于引用方便。采用了已接受的iupac單個(gè)字母和三字母的氨基酸縮寫。
取代：對(duì)于氨基酸取代，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、取代氨基酸。因此，在位置226處的蘇氨酸被丙氨酸取代表示為“thr226ala”或者“t226a”。多個(gè)突變由加號(hào)(“+”)分開，例如“gly205arg+ser411phe”或“g205r+s411f”代表分別在位置205和位置411處甘氨酸(g)被精氨酸(r)取代，并且絲氨酸(s)被苯丙氨酸(f)取代。位置之前的“x”意指該位置處的任何原始氨基酸都可以被取代。
缺失：對(duì)于氨基酸缺失，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、*。因此，在位置195處的甘氨酸缺失表示為“gly195*”或者“g195*”。多重缺失通過加號(hào)(“+”)分開，例如，“gly195*+ser411*”或“g195*+s411*”。
插入：另外的氨基酸殘基的插入，例如像在g195之后插入賴氨酸可表示為：gly195glylys或g195gk。可替代地，另外的氨基酸殘基的插入，如在g195之后插入賴氨酸可表示為：*195ak。當(dāng)插入一個(gè)以上氨基酸殘基時(shí)，例如像在g195之后插入lys和ala可表示為：gly195glylysala或g195gka。在此類情況下，還可以通過將小寫字母添加到在所插入的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基之前的氨基酸殘基位置編號(hào)處來對(duì)所插入的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基進(jìn)行編號(hào)，在這個(gè)實(shí)例中：*195ak*195ba。在以上的實(shí)例中，序列194至196因此為：
在取代和插入發(fā)生在相同的位置的情況下，這可表示為s99sd+s99a，或簡寫為s99ad。相同修飾也可以表示為s99a+*99ad。
在其中插入與所存在的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的情況下，顯然是在命名中出現(xiàn)了簡并。如果例如在以上實(shí)例中，在甘氨酸之后插入甘氨酸，則將它表示為g195gg或*195gag。對(duì)于以下變化，相同的實(shí)際變化也可以僅表示為a194ag或者*194ag，從：
這類情況對(duì)于技術(shù)人員來說是顯而易見的，并且因此表示式g195gg和這種類型插入的相應(yīng)表示式旨在包括這類等同簡并表示式。
多個(gè)改變：包括多個(gè)改變的變體由加號(hào)(“+”)分開，例如“arg170tyr+gly195glu”或者“r170y+g195e”代表在位置170和位置195處的精氨酸和甘氨酸分別被酪氨酸和谷氨酸取代?？商娲?，空格或逗號(hào)可將多個(gè)改變分隔開，例如分別為a170yg195e或a170y，g195e。
不同的改變：可以在一個(gè)位置上引入不同的改變時(shí)，這些不同的改變由一個(gè)逗號(hào)分開，例如“arg170tyr,glu”代表在位置170上的精氨酸被酪氨酸或谷氨酸取代。因此，“tyr167gly,ala+arg170gly,ala”表示以下變體：
“tyr167gly+arg170gly”、“tyr167gly+arg170ala”、“tyr167ala+arg170gly”、和“tyr167ala+arg170ala”。
可替代地，不同改變或可任選的取代可用括號(hào)表示，例如arg170[tyr，gly]或arg170{tyr，gly}或簡寫為r170[y，g]或r170{y，g}。
發(fā)明詳述
具有高ph的堿性液體洗滌劑廣泛用于清潔，如衣物洗滌和餐具洗滌清潔。尤其在北美，消費(fèi)者尤其常用具有升高的ph的液體洗滌劑。高ph清潔組合物還用于工業(yè)清潔過程。
堿性洗滌劑是具有洗滌劑特性的液體。此類洗滌劑的ph通常在ph為9至12.5的范圍內(nèi)。高ph洗滌劑典型地包括組分如表面活性劑、助洗劑和漂白組分，并且此外，它們還可以包含大量的水和堿，如naoh、tsp(磷酸三鈉)、氨、碳酸鈉、氫氧化鉀(koh)，這些堿通常以對(duì)應(yīng)于0.1％至30％重量(wt)的量添加。
商業(yè)高ph值洗滌劑的實(shí)例包括但不限于艾禾美(arm&hammer)(丘奇&德懷特(church&dwight))、瑟夫閃(surf)閃閃發(fā)光的海洋(sparklingocean)(聯(lián)合利華(unilever))、可伶布爾斯特(cleanburst)、sun三重清潔熱帶微風(fēng)(suntriplecleantropicalbreeze)(sun產(chǎn)品)、普雷克斯自由清新(purexfreeandclear)(漢高(henkel))和xtra熱帶激情(tropicalpassion)(丘奇&德懷特(church&dwight))。
向洗滌劑中添加酶是非常有利的，因?yàn)檫@些酶的比活性有效地從表面如織物和餐具中去除了特定的污漬。然而，在高ph液體洗滌劑中維持可接受的酶穩(wěn)定性的困難已多年來阻止將酶包含在這些洗滌劑中。
本發(fā)明涉及包括適用于此類組合物的堿性穩(wěn)定蛋白酶變體的高ph液體清潔組合物。
本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種液體清潔組合物，該組合物包括：
(a)從0％至20％wt，優(yōu)選0.1％至2.5％wt的洗滌劑表面活性劑；
(b)從40％至95％wt，優(yōu)選從約70％至約90％wt的水；
(c)從1％至30％wt的堿性緩沖液系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括堿金屬硅酸鹽或堿金屬氫氧化物或其混合物，以提供從約11至13.5的ph；以及
(d)從0.001％至10％wt，優(yōu)選0.1％至5％wt的蛋白酶變體。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種液體清潔組合物，該組合物包括：
(a)從0％至20％wt，優(yōu)選0.1％至2.5％wt的洗滌劑表面活性劑；
(b)從0.001％至10％wt，優(yōu)選0.1％至5％wt的蛋白酶變體；以及
(c1)從20％至95％wt，優(yōu)選從40％至95％wt，進(jìn)一步優(yōu)選從約70％至約90％wt的水；和/或
(c2)從1％至30％wt的堿性緩沖液系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括堿金屬硅酸鹽或堿金屬氫氧化物或其混合物，以提供從約7.5至13.5的ph，優(yōu)選ph為從約10至13.5；
(d)任選地，蛋白酶抑制劑，優(yōu)選所述蛋白酶抑制劑是肽醛蛋白酶抑制劑。
本發(fā)明的組合物優(yōu)選包含堿性緩沖液系統(tǒng)以提供ph為至少約7.5、至少約8、至少約9，優(yōu)選ph為10或更高。優(yōu)選地，ph為從約9至約13。為了達(dá)到高ph，有必要根據(jù)產(chǎn)品所需的ph，使存在堿金屬氫氧化物、尤其是氫氧化鈉或氫氧化鉀，通常以按重量計(jì)組合物的0.1％至約30％(重量百分比，縮寫wt％)，并且優(yōu)選1.0％至2.5％的量，或更高量的適合的堿金屬硅酸鹽，如金屬硅酸鹽。
本發(fā)明的組合物優(yōu)選包含20％至95％wt，優(yōu)選40％至95％wt，進(jìn)一步優(yōu)選從約70％至約90％wt的水。優(yōu)選從約75％至80％wt的水，優(yōu)選從約80％至85％wt的水，優(yōu)選從約70％-75％wt的水，或優(yōu)選從約75％-80％wt的水。優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物包括10％wt或更多的水，如至少20％wt、至少25％wt、至少30％wt、至少35％wt、至少40％wt、至少45％wt、至少50％wt、至少55％wt、至少60％wt、至少65％wt、至少70％wt、至少75％wt、至少80％wt、至少85％wt、至少90％wt、或至少95％wt或更多、但小于100％wt重量百分?jǐn)?shù)(wt)的水。
可以將這些蛋白酶變體以對(duì)應(yīng)于每升的洗滌液0.01-200mg的酶蛋白、優(yōu)選每升的洗滌液0.05-50mg的酶蛋白、特別是每升的洗滌液0.1-10mg的酶蛋白的量添加至根據(jù)本發(fā)明的高ph清潔組合物中。
用于在衣物洗滌液中使用的組合物例如可以包括按該組合物的重量計(jì)0.0001％-10％，如0.001％-7％，如0.1％-5％的根據(jù)本發(fā)明的蛋白酶變體。
用于在自動(dòng)洗碗機(jī)(adw)中使用的組合物例如可以包含按該組合物的重量計(jì)0.0001％-50％，如0.001％-30％，如0.01％-20％，如0.5％-15％的酶蛋白。
本發(fā)明涉及具有ph為10或更高的液體清潔組合物，該組合物包括至少0.01wt％的蛋白酶，其中該蛋白酶是親本蛋白酶的變體，并且其中該蛋白酶變體具有與seqidno:2的氨基酸序列具有至少60％序列一致性的氨基酸序列，并且其中所述蛋白酶變體的特征在于當(dāng)在40℃下在具有ph為10的液體洗滌劑中4小時(shí)后進(jìn)行測(cè)量時(shí)，具有比親本蛋白酶高至少10％的殘留活性。
添加至根據(jù)本發(fā)明的清潔組合物中的蛋白酶變體顯示改進(jìn)至一定程度的半衰期，使得它能夠在高ph(ph>10.0)液體清潔組合物如洗滌劑中儲(chǔ)存和使用蛋白酶。此外，蛋白酶變體在高ph液體中顯示顯著的洗滌性能，并且因此開啟了改進(jìn)高ph液體洗滌劑的洗滌性能和/或降低用來達(dá)到相同洗滌性能的這些洗滌劑配制品中存在的洗滌劑濃度的可能性。。此外，蛋白酶變體在高ph液體中顯示顯著的洗滌性能，并且因此開啟了改進(jìn)高ph液體洗滌劑的洗滌性能和/或降低用來達(dá)到相同洗滌性能的這些洗滌劑配制品中存在的蛋白酶濃度的可能性。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例涉及包括蛋白酶的具有ph為10或更高的液體清潔組合物，其中該蛋白酶是與seqidno:1或2的氨基酸序列具有至少60％一致性的變體蛋白酶，其中所述變體包括在以下一個(gè)或多個(gè)位置處的取代，這些位置選自對(duì)應(yīng)于bpn'(seqidno1)的位置3、9、18、43、49、61、76、115、120、182、185、188、194、205、206、209、216、217、218、222、255、256、259、260、261和262的位置。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了具有ph為10或更高并包括蛋白酶的液體清潔組合物，其中該蛋白酶是與seqidno:1或2的氨基酸序列具有至少60％一致性的變體蛋白酶，其中所述變體包括在對(duì)應(yīng)于bpn'(seqidno:1)的位置205和209的位置處的取代，優(yōu)選地，所述變體包括在對(duì)應(yīng)于bpn'(seqidno:1)的位置205和209的位置處的取代以及在以下一個(gè)或多個(gè)位置處的取代，這些位置選自對(duì)應(yīng)于bpn'(seqidno:1)的位置3、9、18、43、49、61、76、115、120、182、185、188、194、206、216、217、218、222、255、256、259、260、261和262的位置。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例涉及包括蛋白酶的具有ph為從約7至約13或更高的液體清潔組合物，其中該蛋白酶是與seqidno:1或2的氨基酸序列具有至少60％一致性的變體蛋白酶，并且其中所述變體包括在以下一個(gè)或多個(gè)位置處的取代，這些位置選自對(duì)應(yīng)于bpn'(seqidno:1)的位置3、9、18、43、49、61、76、115、120、182、185、188、194、205、206、209、216、217、218、222、255、256、259、260、261和262的位置。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及包括蛋白酶的具有ph為從約7至約13或更高的液體清潔組合物，其中該蛋白酶是與seqidno:1或2的氨基酸序列具有至少60％一致性的變體蛋白酶，并且其中所述變體包括在對(duì)應(yīng)于bpn'(seqidno:1)的位置205和209的位置處的取代，優(yōu)選地，所述變體包括在對(duì)應(yīng)于bpn'(seqidno:1)的位置205和209的位置處的取代以及在以下一個(gè)或多個(gè)位置處的取代，這些位置選自對(duì)應(yīng)于bpn'(seqidno:1)的位置3、9、18、43、49、61、76、115、120、182、185、188、194、206、216、217、218、222、255、256、259、260、261和262的位置。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例涉及包括蛋白酶的具有ph為從約8至約13或更高的液體清潔組合物，其中該蛋白酶是與seqidno:1或2的氨基酸序列具有至少60％一致性的變體蛋白酶，并且其中所述變體包括在以下一個(gè)或多個(gè)位置處的取代，這些位置選自對(duì)應(yīng)于bpn'(seqidno:1)的位置3、9、18、43、49、61、76、115、120、182、185、188、194、205、206、209、216、217、218、222、255、256、259、260、261和262的位置。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及包括蛋白酶的具有ph為從約8至約13或更高的液體清潔組合物，其中該蛋白酶是與seqidno:1或2的氨基酸序列具有至少60％一致性的變體蛋白酶，并且其中所述變體包括在對(duì)應(yīng)于bpn'(seqidno:1)的位置205和209的位置處的取代，優(yōu)選地，所述變體包括在對(duì)應(yīng)于bpn'(seqidno:1)的位置205和209的位置處的取代以及在以下一個(gè)或多個(gè)位置處的取代，這些位置選自對(duì)應(yīng)于bpn'(seqidno:1)的位置3、9、18、43、49、61、76、115、120、182、185、188、194、206、216、217、218、222、255、256、259、260、261和262的位置。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例涉及包括蛋白酶的具有ph為從約9至約13或更高的液體清潔組合物，其中該蛋白酶是與seqidno:1或2的氨基酸序列具有至少60％一致性的變體蛋白酶，并且其中所述變體包括在以下一個(gè)或多個(gè)位置處的取代，這些位置選自對(duì)應(yīng)于bpn'(seqidno:1)的位置3、9、18、43、49、61、76、115、120、182、185、188、194、205、206、209、216、217、218、222、255、256、259、260、261和262的位置。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及包括蛋白酶的具有ph為從約9至約13或更高的液體清潔組合物，其中該蛋白酶是與seqidno:1或2的氨基酸序列具有至少60％一致性的變體蛋白酶，并且其中所述變體包括在對(duì)應(yīng)于bpn'(seqidno:1)的位置205和209的位置處的取代，優(yōu)選地，所述變體包括在對(duì)應(yīng)于bpn'(seqidno:1)的位置205和209的位置處的取代以及在以下一個(gè)或多個(gè)位置處的取代，這些位置選自對(duì)應(yīng)于bpn'(seqidno:1)的位置3、9、18、43、49、61、76、115、120、182、185、188、194、206、216、217、218、222、255、256、259、260、261和262的位置。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例涉及包括蛋白酶的具有ph為從約10至約13或更高的液體清潔組合物，其中該蛋白酶是與seqidno:1或2的氨基酸序列具有至少60％一致性的變體蛋白酶，并且其中所述變體包括在以下一個(gè)或多個(gè)位置處的取代，這些位置選自對(duì)應(yīng)于bpn'(seqidno:1)的位置3、9、18、43、49、61、76、115、120、182、185、188、194、205、206、209、216、217、218、222、255、256、259、260、261和262的位置。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及包括蛋白酶的具有ph為從約10至約13或更高的液體清潔組合物，其中該蛋白酶是與seqidno:1或2的氨基酸序列具有至少60％一致性的變體蛋白酶，并且其中所述變體包括在對(duì)應(yīng)于bpn'(seqidno:1)的位置205和209的位置處的取代，優(yōu)選地，所述變體包括在對(duì)應(yīng)于bpn'(seqidno:1)的位置205和209的位置處的取代以及在以下一個(gè)或多個(gè)位置處的取代，這些位置選自對(duì)應(yīng)于bpn'(seqidno:1)的位置3、9、18、43、49、61、76、115、120、182、185、188、194、206、216、217、218、222、255、256、259、260、261和262的位置。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例涉及包括蛋白酶的具有ph為從約11至約13或更高的液體清潔組合物，其中該蛋白酶是與seqidno:1或2的氨基酸序列具有至少60％一致性的變體蛋白酶，并且其中所述變體包括在以下一個(gè)或多個(gè)位置處的取代，這些位置選自對(duì)應(yīng)于bpn'(seqidno1)的位置3、9、18、43、49、61、76、115、120、182、185、188、194、205、206、209、216、217、218、222、255、256、259、260、261和262的位置。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及包括蛋白酶的具有ph為從約11至約13或更高的液體清潔組合物，其中該蛋白酶是與seqidno:1或2的氨基酸序列具有至少60％一致性的變體蛋白酶，并且其中所述變體包括在對(duì)應(yīng)于bpn'(seqidno:1)的位置205和209的位置處的取代，優(yōu)選地，所述變體包括在對(duì)應(yīng)于bpn'(seqidno:1)的位置205和209的位置處的取代以及在以下一個(gè)或多個(gè)位置處的取代，這些位置選自對(duì)應(yīng)于bpn'(seqidno:1)的位置3、9、18、43、49、61、76、115、120、182、185、188、194、206、216、217、218、222、255、256、259、260、261和262的位置。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例涉及包括蛋白酶的具有ph為從約7至約13或更高的液體清潔組合物，其中該蛋白酶是與seqidno:1或2的氨基酸序列具有至少60％一致性的變體蛋白酶，并且其中所述變體包括一個(gè)或多個(gè)取代，這些取代對(duì)應(yīng)于bpn’(seqidno:1)的取代x3v、x9d、x9e、x18s、x43r、x43k、x49t、x61d、x76d、x115w、x120t、x120v、x120d、x182d、x182e、x185e、x185d、x188e、x188d、x194p、x205i、x206l、x209w、x216v、x217m、x218t、x222s、x255e、x255d、x256d、x256e、x259d、x259e、x260a、x260e、x260d、x261m、x261w、x262e和x262d。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及具有ph為從約7至約13或更高的液體清潔組合物，其中該蛋白酶是與seqidno:1或2的氨基酸序列具有至少60％一致性的變體蛋白酶，并且其中所述變體包括對(duì)應(yīng)于bpn’(seqidno:1)的取代x205i和x209w的取代，優(yōu)選地，所述變體包括對(duì)應(yīng)于bpn’(seqidno:1)的取代x205i和x209w的取代以及對(duì)應(yīng)于bpn’(seqidno:1)的取代x3v、x9d、x9e、x18s、x43r、x43k、x49t、x61d、x76d、x115w、x120t、x120v、x120d、x182d、x182e、x185e、x185d、x188e、x188d、x194p、x206l、x216v、x217m、x218t、x222s、x255e、x255d、x256d、x256e、x259d、x259e、x260a、x260e、x260d、x261m、x261w、x262e和x262d的一個(gè)或多個(gè)取代。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例涉及包括蛋白酶的具有ph為從約8至約13或更高的液體清潔組合物，其中該蛋白酶是與seqidno:1或2的氨基酸序列具有至少60％一致性的變體蛋白酶，并且其中所述變體包括一個(gè)或多個(gè)取代，這些取代對(duì)應(yīng)于bpn’(seqidno:1)的取代x3v、x9d、x9e、x18s、x43r、x43k、x49t、x61d、x76d、x115w、x120t、x120v、x120d、x182d、x182e、x185e、x185d、x188e、x188d、x194p、x205i、x206l、x209w、x216v、x217m、x218t、x222s、x255e、x255d、x256d、x256e、x259d、x259e、x260a、x260e、x260d、x261m、x261w、x262e和x262d。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及具有ph為從約8至約13或更高的液體清潔組合物，其中該蛋白酶是與seqidno:1或2的氨基酸序列具有至少60％一致性的變體蛋白酶，并且其中所述變體包括對(duì)應(yīng)于bpn’(seqidno:1)的取代x205i和x209w的取代，優(yōu)選地，所述變體包括對(duì)應(yīng)于bpn’(seqidno:1)的取代x205i和x209w的取代以及對(duì)應(yīng)于bpn’(seqidno:1)的取代x3v、x9d、x9e、x18s、x43r、x43k、x49t、x61d、x76d、x115w、x120t、x120v、x120d、x182d、x182e、x185e、x185d、x188e、x188d、x194p、x206l、x216v、x217m、x218t、x222s、x255e、x255d、x256d、x256e、x259d、x259e、x260a、x260e、x260d、x261m、x261w、x262e和x262d的一個(gè)或多個(gè)取代。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例涉及包括蛋白酶的具有ph為從約9至約13或更高的液體清潔組合物，其中該蛋白酶是與seqidno:1或2的氨基酸序列具有至少60％一致性的變體蛋白酶，并且其中所述變體包括一個(gè)或多個(gè)取代，這些取代對(duì)應(yīng)于bpn’(seqidno:1)的取代x3v、x9d、x9e、x18s、x43r、x43k、x49t、x61d、x76d、x115w、x120t、x120v、x120d、x182d、x182e、x185e、x185d、x188e、x188d、x194p、x205i、x206l、x209w、x216v、x217m、x218t、x222s、x255e、x255d、x256d、x256e、x259d、x259e、x260a、x260e、x260d、x261m、x261w、x262e和x262d。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及具有ph為從約9至約13或更高的液體清潔組合物，其中該蛋白酶是與seqidno:1或2的氨基酸序列具有至少60％一致性的變體蛋白酶，并且其中所述變體包括對(duì)應(yīng)于bpn’(seqidno:1)的取代x205i和x209w的取代，優(yōu)選地，所述變體包括對(duì)應(yīng)于bpn’(seqidno:1)的取代x205i和x209w的取代以及對(duì)應(yīng)于bpn’(seqidno:1)的取代x3v、x9d、x9e、x18s、x43r、x43k、x49t、x61d、x76d、x115w、x120t、x120v、x120d、x182d、x182e、x185e、x185d、x188e、x188d、x194p、x206l、x216v、x217m、x218t、x222s、x255e、x255d、x256d、x256e、x259d、x259e、x260a、x260e、x260d、x261m、x261w、x262e和x262d的一個(gè)或多個(gè)取代。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例涉及包括蛋白酶的具有ph為從約10至約13或更高的液體清潔組合物，其中該蛋白酶是與seqidno:1或2的氨基酸序列具有至少60％一致性的變體蛋白酶，并且其中所述變體包括一個(gè)或多個(gè)取代，這些取代對(duì)應(yīng)于bpn’(seqidno:1)的取代x3v、x9d、x9e、x18s、x43r、x43k、x49t、x61d、x76d、x115w、x120t、x120v、x120d、x182d、x182e、x185e、x185d、x188e、x188d、x194p、x205i、x206l、x209w、x216v、x217m、x218t、x222s、x255e、x255d、x256d、x256e、x259d、x259e、x260a、x260e、x260d、x261m、x261w、x262e和x262d。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及具有ph為從約10至約13或更高的液體清潔組合物，其中該蛋白酶是與seqidno:1或2的氨基酸序列具有至少60％一致性的變體蛋白酶，并且其中所述變體包括對(duì)應(yīng)于bpn’(seqidno:1)的取代x205i和x209w的取代，優(yōu)選地，所述變體包括對(duì)應(yīng)于bpn’(seqidno:1)的取代x205i和x209w的取代以及對(duì)應(yīng)于bpn’(seqidno:1)的取代x3v、x9d、x9e、x18s、x43r、x43k、x49t、x61d、x76d、x115w、x120t、x120v、x120d、x182d、x182e、x185e、x185d、x188e、x188d、x194p、x206l、x216v、x217m、x218t、x222s、x255e、x255d、x256d、x256e、x259d、x259e、x260a、x260e、x260d、x261m、x261w、x262e和x262d的一個(gè)或多個(gè)取代。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例涉及包括蛋白酶的具有ph為從約11至約13或更高的液體清潔組合物，其中該蛋白酶是與seqidno:1或2的氨基酸序列具有至少60％一致性的變體蛋白酶，并且其中所述變體包括一個(gè)或多個(gè)取代，這些取代對(duì)應(yīng)于bpn’(seqidno:1)的取代x3v、x9d、x9e、x18s、x43r、x43k、x49t、x61d、x76d、x115w、x120t、x120v、x120d、x182d、x182e、x185e、x185d、x188e、x188d、x194p、x205i、x206l、x209w、x216v、x217m、x218t、x222s、x255e、x255d、x256d、x256e、x259d、x259e、x260a、x260e、x260d、x261m、x261w、x262e和x262d。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及具有ph為從約11至約13或更高的液體清潔組合物，其中該蛋白酶是與seqidno:1或2的氨基酸序列具有至少60％一致性的變體蛋白酶，并且其中所述變體包括對(duì)應(yīng)于bpn’(seqidno:1)的取代x205i和x209w的取代，優(yōu)選地，所述變體包括對(duì)應(yīng)于bpn’(seqidno:1)的取代x205i和x209w的取代以及對(duì)應(yīng)于bpn’(seqidno:1)的取代x3v、x9d、x9e、x18s、x43r、x43k、x49t、x61d、x76d、x115w、x120t、x120v、x120d、x182d、x182e、x185e、x185d、x188e、x188d、x194p、x206l、x216v、x217m、x218t、x222s、x255e、x255d、x256d、x256e、x259d、x259e、x260a、x260e、x260d、x261m、x261w、x262e和x262d的一個(gè)或多個(gè)取代。
在一些優(yōu)選實(shí)施例中，該蛋白酶選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：
s9e+n43r+g61e+n76d+g115w+h120v+a194p+q206l+s259d+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+q182e+a194p+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+y209w+s216v+m222s+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+s256d+s259d+n261w+l262e；
s9e+n18s+n43r+n76d+g115w+h120v+a194p+v205i+q206l+s259d+l262e；
s9e+n43r+n76d+g115w+h120v+a194p+v205i+q206l+s259d+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+s256d+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+q182e+a194p+v205i+q206l+y209w+s256d+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+s188e+a194p+v205i+q206l+y209w+s216v+l262e；
s9e+n76d+g115w+g160p+q182e+v205i+q206l+y209w+s256d+t260e+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+h120t+a194p+q206l+s256d+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+h120t+a194p+v205i+q206l+y209w+s216v+l262e；
s9e+n76d+g160p+q182e+v205i+q206l+y209w+s256d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+q182e+a194p+v205i+q206l+s259d+n261w+l262e；
s9e+n76d+q182e+v205i+q206l+y209w+s256d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+q182e+a194p+v205i+q206l+s259d+n261w+l262e+*275ah；
s9e+n43r+n76d+q182e+n185e+s188e+a194p+q206l+y209w+s259d+l262e；
s9e+n43r+n76d+n185e+a194p+v205i+q206l+y209w+s216v+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+y209w+s216v+n261m+l262e；
s9e+n43r+i72a+n76d+a194p+q206l+s259d+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+s259d+l262e；
s9e+n43r+n76d+h120v+q182e+a194p+v205i+q206l+y209w+s256d+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+q182e+a194p+v205i+q206l+y209w+s256d+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+h120v+q182e+a194p+v205i+q206l+y209w+s256d+n261w+l262e+*275ah+*275bh；
s3v+n76d+h120v+q182e+n185e+s188e+v205i+q206l+y209w+s216v+s256d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a158e+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+s212g+s216v+l262e；
s9e+n43r+n76d+a158e+g160p+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a158e+g160p+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+s212g+s216v+l262e；
s9e+n43r+n76d+a158e+g160p+s161e+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+s216v+l262e+*275ah+*275bh；
s9e+n43r+n76d+a158e+g160p+s161e+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a158e+g160p+s161e+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+s212g+s216v+l262e+*275ah+*275bh；
s9e+n43r+n76d+a158e+g160p+s161e+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+s212g+l262e；
s9e+n43r+n76d+a158e+a194p+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a158e+g160p+s161e+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+s212g+l262e+*275ah+*275bh；
s9e+n43r+n76d+a158e+g160p+s161e+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+s216v+l262e；
s9e+n43r+n76d+a158e+g160p+s161e+a194p+q206l+y209w+s259d+l262e+*275ah+*275bh；
s9e+n43r+n76d+a158e+g160p+s161e+a194p+v205i+q206l+y209w+s212g+s216v+l262e；
s9e+n43r+n76d+a158e+s161e+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a158e+g160p+s161e+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a158e+s161e+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+s212g+s216v+l262e；
s9e+n43r+n76d+g160p+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+s212g+s216v+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+q206l+y209w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+q206l+y209w+s256d+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+q206l+y209w+t255e+s256d+s259d+t260e+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+g115w+h120v+a194p+q206l+y209w+s259d+l262e；
s9e+n43r+n76d+g115w+h120v+p129d+a194p+q206l+y209w+s259d+l262e；
s9e+n43r+n76d+g160p+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+s212g+s216v+l262e；
s9e+n43r+n76d+g160p+s161e+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+s212g+s216v+l262e；
s9e+n43r+n76d+g160p+s161e+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+s212g+s216v+l262e+*275ah+*275bh；
s9e+n43r+n76d+n204d+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+g160p+s161e+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+h120v+q182e+a194p+v205i+q206l+y209w+s256d+n261w+l262e+*275ah+*275bh；
s9e+n43r+n76d+v205i+q206l+y209w+s216v+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+s161e+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+p131*+a194p+q206l+y209w+s259d+l262e；
s9e+n43r+n76d+h120v+q182e+a194p+v205i+q206l+y209w+s256d+n261w+l262e+*275ah+*275bh；
s9e+n43r+n76d+s161e+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+s212g+s216v+l262e+*275ah+*275bh；
s9e+n43r+n76d+v205i+q206l+y209w+s212g+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+n204d+v205i+q206l+y209w+s212g+s216v+s259d+n261w+l262e。
在一些優(yōu)選實(shí)施例中，在此提供的這些清潔組合物被這樣配制，使得其具有以下ph：從約7.5至約13.5、或約8.0至約13.5、約8.5至約13.5、約9.0至13.5，或者在替代性實(shí)施例中，甚至從約9.5至約13.5，如從約10至約13.5、從約10至約13、從約10至約12.5、從約10至約12、從約10至約11.5、從約10至約11、從約10至約10.5。在一些優(yōu)選實(shí)施例中，液體清潔組合物被這樣配制，使得ph為從約10至約13.5。在其他優(yōu)選實(shí)施例中，液體清潔組合物被這樣配制，使得ph為從約12至13.5。
本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種液體清潔組合物，該組合物包括：
(a)從0％至20％wt，優(yōu)選0.1％至2.5％wt的洗滌劑表面活性劑；
(b)從40％至95％wt，優(yōu)選從約70％至約90％wt的水；
(c)從1％至30％wt的堿性緩沖液系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括堿金屬硅酸鹽或堿金屬氫氧化物或其混合物，以提供從約11至13.5的ph；以及
(d)從0.001％至10％wt，優(yōu)選0.1％至5％wt的蛋白酶變體，其中所述變體包括在一個(gè)或多個(gè)位置處的取代，這些位置選自對(duì)應(yīng)于bpn'(seqidno:1)的位置3、9、18、43、49、61、76、115、120、182、185、188、194、205、206、209、216、217、218、222、255、256、259、260、261和262的位置。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種液體清潔組合物，該組合物包括：
(a)從0％至20％wt，優(yōu)選0.1％至2.5％wt的洗滌劑表面活性劑；
(b)從0.001％至10％wt，優(yōu)選0.1％至5％wt的蛋白酶變體，其中所述變體包括在一個(gè)或多個(gè)位置處的取代，這些位置選自對(duì)應(yīng)于bpn'(seqidno:1)的位置3、9、18、43、49、61、76、115、120、182、185、188、194、205、206、209、216、217、218、222、255、256、259、260、261和262的位置；以及
(c1)從20％至95％wt，優(yōu)選從40％至95％wt，進(jìn)一步優(yōu)選從約70％至約90％wt的水；和/或
(c2)從1％至30％wt的堿性緩沖液系統(tǒng)，該堿性緩沖液系統(tǒng)包括堿金屬硅酸鹽或堿金屬氫氧化物或其混合物，以提供約8至13.5的ph，優(yōu)選ph為從約10至13.5；
(d)任選地，蛋白酶抑制劑，優(yōu)選所述蛋白酶抑制劑是肽醛蛋白酶抑制劑。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，該蛋白酶變體包括取代x3v、x9d、x9e、x18s、x43r、x43k、x49t、x61d、x76d、x115w、x120t、x120v、x120d、x182d、x182e、x185e、x185d、x188e、x188d、x194p、x205i、x206l、x209w、x216v、x217m、x218t、x222s、x255e、x255d、x256d、x256e、x259d、x259e、x260a、x260e、x260d、x261m、x261w、x262e和x262d。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例涉及一種液體清潔組合物，該組合物包括：
(a)從0％至20％wt，優(yōu)選0.1％至2.5％wt的洗滌劑表面活性劑；
(b)從40％至95％wt，優(yōu)選從約70％至約90％wt的水；
(c)從1％至30％wt的堿性緩沖液系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括堿金屬硅酸鹽或堿金屬氫氧化物或其混合物，以提供從約11至13.5的ph；以及
(d)從0.001％至10％wt，優(yōu)選0.1％至5％wt的蛋白酶變體，其中所述變體包括一個(gè)或多個(gè)取代，這些取代對(duì)應(yīng)于bpn'(seqidno1)的取代x3v、x9d、x9e、x18s、x43r、x43k、x49t、x61d、x76d、x115w、x120t、x120v、x120d、x182d、x182e、x185e、x185d、x188e、x188d、x194p、x205i、x206l、x209w、x216v、x217m、x218t、x222s、x255e、x255d、x256d、x256e、x259d、x259e、x260a、x260e、x260d、x261m、x261w、x262e和x262d，優(yōu)選地，所述變體包括對(duì)應(yīng)于bpn’(seqidno1)的取代x205i和x209w的取代，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述變體包括對(duì)應(yīng)于bpn’(seqidno1)的取代x205i和x209w的取代以及對(duì)應(yīng)于bpn’(seqidno1)的取代x3v、x9d、x9e、x18s、x43r、x43k、x49t、x61d、x76d、x115w、x120t、x120v、x120d、x182d、x182e、x185e、x185d、x188e、x188d、x194p、x206l、x216v、x217m、x218t、x222s、x255e、x255d、x256d、x256e、x259d、x259e、x260a、x260e、x260d、x261m、x261w、x262e和x262d的一個(gè)或多個(gè)取代。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例涉及一種液體清潔組合物，該組合物包括：
(a)從0％至20％wt，優(yōu)選0.1％至2.5％wt的洗滌劑表面活性劑；
(b)從0.001％至10％wt，優(yōu)選0.1％至5％wt的蛋白酶變體，其中所述變體包括一個(gè)或多個(gè)取代，這些取代對(duì)應(yīng)于bpn'(seqidno:1)的取代x3v、x9d、x9e、x18s、x43r、x43k、x49t、x61d、x76d、x115w、x120t、x120v、x120d、x182d、x182e、x185e、x185d、x188e、x188d、x194p、x205i、x206l、x209w、x216v、x217m、x218t、x222s、x255e、x255d、x256d、x256e、x259d、x259e、x260a、x260e、x260d、x261m、x261w、x262e和x262d，優(yōu)選地，所述變體包括對(duì)應(yīng)于bpn’(seqidno:1)的取代x205i和x209w的取代，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述變體包括對(duì)應(yīng)于bpn’(seqidno:1)的取代x205i和x209w的取代以及對(duì)應(yīng)于bpn’(seqidno:1)的取代x3v、x9d、x9e、x18s、x43r、x43k、x49t、x61d、x76d、x115w、x120t、x120v、x120d、x182d、x182e、x185e、x185d、x188e、x188d、x194p、x206l、x216v、x217m、x218t、x222s、x255e、x255d、x256d、x256e、x259d、x259e、x260a、x260e、x260d、x261m、x261w、x262e和x262d的一個(gè)或多個(gè)取代；以及
(c1)從20％至95％wt，優(yōu)選從40％至95％wt，進(jìn)一步優(yōu)選從約70％至約90％wt的水；和/或
(c2)從1％至30％wt的堿性緩沖液系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括堿金屬硅酸鹽或堿金屬氫氧化物或其混合物，以提供從約8至13.5的ph，優(yōu)選ph為從約10至13.5；
(d)任選地，蛋白酶抑制劑，優(yōu)選所述蛋白酶抑制劑是肽醛蛋白酶抑制劑。
在一些優(yōu)選實(shí)施例中，該蛋白酶選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：
s9e+n43r+g61e+n76d+g115w+h120v+a194p+q206l+s259d+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+q182e+a194p+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+y209w+s216v+m222s+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+s256d+s259d+n261w+l262e；
s9e+n18s+n43r+n76d+g115w+h120v+a194p+v205i+q206l+s259d+l262e；
s9e+n43r+n76d+g115w+h120v+a194p+v205i+q206l+s259d+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+s256d+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+q182e+a194p+v205i+q206l+y209w+s256d+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+s188e+a194p+v205i+q206l+y209w+s216v+l262e；
s9e+n76d+g115w+g160p+q182e+v205i+q206l+y209w+s256d+t260e+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+h120t+a194p+q206l+s256d+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+h120t+a194p+v205i+q206l+y209w+s216v+l262e；
s9e+n76d+g160p+q182e+v205i+q206l+y209w+s256d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+q182e+a194p+v205i+q206l+s259d+n261w+l262e；
s9e+n76d+q182e+v205i+q206l+y209w+s256d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+q182e+a194p+v205i+q206l+s259d+n261w+l262e+*275ah；
s9e+n43r+n76d+q182e+n185e+s188e+a194p+q206l+y209w+s259d+l262e；
s9e+n43r+n76d+n185e+a194p+v205i+q206l+y209w+s216v+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+y209w+s216v+n261m+l262e；
s9e+n43r+i72a+n76d+a194p+q206l+s259d+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+s259d+l262e；
s9e+n43r+n76d+h120v+q182e+a194p+v205i+q206l+y209w+s256d+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+q182e+a194p+v205i+q206l+y209w+s256d+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+h120v+q182e+a194p+v205i+q206l+y209w+s256d+n261w+l262e+*275ah+*275bh；
s3v+n76d+h120v+q182e+n185e+s188e+v205i+q206l+y209w+s216v+s256d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a158e+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+s212g+s216v+l262e；
s9e+n43r+n76d+a158e+g160p+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a158e+g160p+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+s212g+s216v+l262e；
s9e+n43r+n76d+a158e+g160p+s161e+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+s216v+l262e+*275ah+*275bh；
s9e+n43r+n76d+a158e+g160p+s161e+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a158e+g160p+s161e+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+s212g+s216v+l262e+*275ah+*275bh；
s9e+n43r+n76d+a158e+g160p+s161e+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+s212g+l262e；
s9e+n43r+n76d+a158e+a194p+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a158e+g160p+s161e+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+s212g+l262e+*275ah+*275bh；
s9e+n43r+n76d+a158e+g160p+s161e+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+s216v+l262e；
s9e+n43r+n76d+a158e+g160p+s161e+a194p+q206l+y209w+s259d+l262e+*275ah+*275bh；
s9e+n43r+n76d+a158e+g160p+s161e+a194p+v205i+q206l+y209w+s212g+s216v+l262e；
s9e+n43r+n76d+a158e+s161e+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a158e+g160p+s161e+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a158e+s161e+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+s212g+s216v+l262e；
s9e+n43r+n76d+g160p+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+s212g+s216v+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+q206l+y209w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+q206l+y209w+s256d+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+q206l+y209w+t255e+s256d+s259d+t260e+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+g115w+h120v+a194p+q206l+y209w+s259d+l262e；
s9e+n43r+n76d+g115w+h120v+p129d+a194p+q206l+y209w+s259d+l262e；
s9e+n43r+n76d+g160p+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+s212g+s216v+l262e；
s9e+n43r+n76d+g160p+s161e+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+s212g+s216v+l262e；
s9e+n43r+n76d+g160p+s161e+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+s212g+s216v+l262e+*275ah+*275bh；
s9e+n43r+n76d+n204d+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+g160p+s161e+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+h120v+q182e+a194p+v205i+q206l+y209w+s256d+n261w+l262e+*275ah+*275bh；
s9e+n43r+n76d+v205i+q206l+y209w+s216v+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+s161e+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+p131*+a194p+q206l+y209w+s259d+l262e；
s9e+n43r+n76d+h120v+q182e+a194p+v205i+q206l+y209w+s256d+n261w+l262e+*275ah+*275bh；
s9e+n43r+n76d+s161e+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+s212g+s216v+l262e+*275ah+*275bh；
s9e+n43r+n76d+v205i+q206l+y209w+s212g+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+n204d+v205i+q206l+y209w+s212g+s216v+s259d+n261w+l262e。
當(dāng)與親本蛋白酶如具有seqidno:2的蛋白酶相比時(shí)，本發(fā)明的蛋白酶變體在ph為10或更高的液體清潔組合物中具有改進(jìn)的穩(wěn)定性。這使得這些變體適用于高ph液體洗滌劑，用于例如衣物洗滌或餐具洗滌。
在一個(gè)實(shí)施例中，該蛋白酶變體相比于親本蛋白酶在高ph液體清潔組合物中具有改進(jìn)的穩(wěn)定性，特別是改進(jìn)的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，該蛋白酶變體相比于親本蛋白酶具有改進(jìn)的穩(wěn)定性，特別是改進(jìn)的儲(chǔ)存穩(wěn)定性，和同等或改進(jìn)的洗滌性能。
在一個(gè)實(shí)施例中，該蛋白酶變體相比于親本蛋白酶在高ph液體清潔組合物中具有改進(jìn)的穩(wěn)定性以及同等或改進(jìn)的洗滌性能，其中儲(chǔ)存穩(wěn)定性可以使用‘加速儲(chǔ)存穩(wěn)定性測(cè)定’進(jìn)行測(cè)量，并且洗滌性能可以使用自動(dòng)機(jī)械應(yīng)力測(cè)定(amsa)進(jìn)行測(cè)量。
在一個(gè)實(shí)施例中，該蛋白酶變體與該親本蛋白酶具有至少60％但小于100％的序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該蛋白酶變體與該親本蛋白酶具有至少70％但小于100％的序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該蛋白酶變體與該親本蛋白酶具有至少75％但小于100％的序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該蛋白酶變體與該親本蛋白酶具有至少80％但小于100％的序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該蛋白酶變體與該親本蛋白酶具有至少85％但小于100％的序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該蛋白酶變體與該親本蛋白酶具有至少90％但小于100％的序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該蛋白酶變體與該親本蛋白酶具有至少93％但小于100％的序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該蛋白酶變體與該親本蛋白酶具有至少95％但小于100％的序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該蛋白酶變體與該親本蛋白酶具有至少96％但小于100％的序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該蛋白酶變體與該親本蛋白酶具有至少97％但小于100％的序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該蛋白酶變體與該親本蛋白酶具有至少98％但小于100％的序列一致性。
在一個(gè)實(shí)施例中，該變體具有以下氨基酸序列，該氨基酸序列與seqidno:1至少60％一致，例如與seqidno:1的氨基酸序列具有至少60％，如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％序列一致性。
在另一個(gè)實(shí)施例中，該變體具有以下氨基酸序列，該氨基酸序列與seqidno:2至少60％一致，例如與seqidno:2的氨基酸序列具有至少60％，如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％序列一致性。
在一方面，該親本蛋白酶中的改變的總數(shù)在3與30之間，優(yōu)選在3與20之間，更優(yōu)選在3與15之間，甚至更優(yōu)選在3與10之間，最優(yōu)選在3與8個(gè)改變之間。在另一方面，該親本蛋白酶中的改變的總數(shù)是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個(gè)改變。
親本或前體蛋白酶可以是任何蛋白酶,或甚至更優(yōu)選的如下定義的任何枯草桿菌酶。該親本蛋白酶優(yōu)選是與seqidno:2具有至少60％一致性的蛋白酶，但是該親本可以是任何絲氨酸蛋白酶。絲氨酸蛋白酶是催化肽鍵水解并且在活性位點(diǎn)處存在一個(gè)必需絲氨酸殘基的酶(懷特(white)、漢德勒(handler)和史密斯(smith)，1973，“生物化學(xué)原理(principlesofbiochemistry)”，第五版，麥格勞-希爾圖書公司(mcgraw-hillbookcompany)，紐約，第271-272頁)。細(xì)菌絲氨酸蛋白酶的分子量范圍是20,000至45,000道爾頓。它們受到二異丙基氟磷酸的抑制。它們水解簡單末端酯并且在活性上與同樣是絲氨酸蛋白酶的真核糜蛋白酶相似。甚至更優(yōu)選的親本是堿性蛋白酶，其涵蓋一個(gè)亞組，反映了一些絲氨酸蛋白酶從ph9.0至11.0的高最適ph(綜述參見普里斯特(priest)(1977)細(xì)菌學(xué)評(píng)論(bacteriologicalrev.)41:711-753)。
該親本蛋白酶可以是枯草桿菌酶，它是已經(jīng)由斯艾森(siezen)等人(1991)，蛋白質(zhì)工程(proteineng.)4:719-737以及斯艾森等人(1997)，蛋白質(zhì)科學(xué)(proteinscience)6:501-523提出的絲氨酸蛋白酶的一個(gè)亞組。它們是通過對(duì)先前稱為枯草桿菌蛋白酶樣蛋白酶的絲氨酸蛋白酶的170多個(gè)氨基酸序列進(jìn)行同源性分析而定義的。枯草桿菌蛋白酶先前通常被定義為由革蘭氏陽性細(xì)菌或真菌產(chǎn)生的絲氨酸蛋白酶，而現(xiàn)在根據(jù)斯艾森(siezen)等人則為枯草桿菌酶的一個(gè)亞組。已鑒定了多種多樣的枯草桿菌酶，并且已確定許多枯草桿菌酶的氨基酸序列。對(duì)于此類枯草桿菌酶及其氨基酸序列的更詳細(xì)描述，參見斯艾森(siezen)等人(1997)?？莶輻U菌蛋白酶如上所述是枯草桿菌酶的一個(gè)亞組，所述枯草桿菌酶是來自s8家族、特別是來自s8a子族的絲氨酸蛋白酶，如merops數(shù)據(jù)庫(http://merops.sanger.ac.uk/cgi-bin/famsum？family＝s8)所定義的?？莶輻U菌蛋白酶的實(shí)例是枯草桿菌蛋白酶bpn’(seqidno:1)和枯草桿菌蛋白酶309(seqidno:2)，它們分別具有merops編號(hào)s08.034和s08.003。親本蛋白酶也可以是從自然來源中分離的枯草桿菌酶，其中在保留枯草桿菌酶特征的同時(shí)，已對(duì)其進(jìn)行后續(xù)修飾(例如一條或多條氨基酸側(cè)鏈的一個(gè)或多個(gè)置換，一個(gè)或多個(gè)取代、一個(gè)或多個(gè)缺失和/或一個(gè)或多個(gè)插入)。此外，親本蛋白酶可以是一種通過dna改組技術(shù)制備的枯草桿菌酶，如由內(nèi)斯(ness)等人，1999，自然生物技術(shù)(naturebiotechnology)，17:893-896所描述的。
可替代地，術(shù)語“親本蛋白酶”可以稱為“前體蛋白酶”，并且用于描述其中進(jìn)行突變以獲得本發(fā)明的變體的起始蛋白酶。該親本蛋白酶優(yōu)選屬于枯草桿菌蛋白酶亞組。
枯草桿菌酶的一個(gè)亞組，i-s1或“真”枯草桿菌蛋白酶，包括“標(biāo)準(zhǔn)的”枯草桿菌蛋白酶，如枯草桿菌蛋白酶168(bss168)、枯草桿菌蛋白酶bpn’、嘉士伯枯草桿菌蛋白酶(subtilisincarlsberg)(
兩個(gè)氨基酸序列之間的同源性是在出于本發(fā)明的目的由參數(shù)“一致性”描述的背景下，兩個(gè)氨基酸序列之間的一致性程度是使用如上所述的尼德曼-翁施算法來確定的。來自程序的結(jié)果除了氨基酸比對(duì)之外還計(jì)算兩個(gè)序列之間的“百分比一致性”。
基于本描述，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，鑒別可以根據(jù)本發(fā)明來修飾的適當(dāng)同源枯草桿菌酶是相當(dāng)簡單的。
該親本蛋白酶可以是與seqidno:1的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的多肽，它具有蛋白酶活性。在一方面，該親本的氨基酸序列與seqidno:1的多肽相差多達(dá)10個(gè)氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個(gè)。在另一方面，該親本包括seqidno:1的氨基酸序列或者由其組成。
該親本蛋白酶可以是與seqidno:2的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的多肽，它具有蛋白酶活性。在一方面，該親本的氨基酸序列與seqidno:1的多肽相差多達(dá)10個(gè)氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個(gè)。在另一方面，該親本包括seqidno:2的氨基酸序列或者由其組成。
該親本蛋白酶可以是一種雜合多肽，其中一種多肽的一個(gè)區(qū)域在另一種多肽的一個(gè)區(qū)域的n-末端或c-末端處融合。
該親本蛋白酶可以從任何屬的微生物中獲得。出于本發(fā)明的目的，如在此結(jié)合一種給定的來源所用的術(shù)語“從...中獲得”應(yīng)意指由多核苷酸編碼的親本是由該來源或由其中已經(jīng)插入來自該來源的多核苷酸的一種菌株產(chǎn)生的。在一方面，該親本是胞外分泌的。
該親本可以是細(xì)菌蛋白酶。例如，該親本可以是一種革蘭氏陽性細(xì)菌多肽，如芽孢桿菌屬(bacillus)、梭菌屬(clostridium)、腸球菌屬(enterococcus)、土芽孢桿菌屬(geobacillus)、乳桿菌屬(lactobacillus)、乳球菌屬(lactococcus)、海洋芽孢桿菌屬(oceanobacillus)、葡萄球菌屬(staphylococcus)、鏈球菌屬(streptococcus)、或鏈霉菌屬(streptomyces)蛋白酶；或一種革蘭氏陰性細(xì)菌多肽，如彎曲桿菌屬(campylobacter)、大腸桿菌(e.coli)、黃桿菌屬(flavobacterium)、梭桿菌屬(fusobacterium)、螺桿菌屬(helicobacter)、泥桿菌屬(ilyobacter)、奈瑟氏菌屬(neisseria)、假單胞菌屬(pseudomonas)、沙門菌屬(salmonella)或脲原體屬(ureaplasma)蛋白酶。
在一方面，該親本是嗜堿芽孢桿菌(bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)、短芽孢桿菌(bacillusbrevis)、環(huán)狀芽孢桿菌(bacilluscirculans)、克勞氏芽孢桿菌(bacillusclausii)、凝結(jié)芽孢桿菌(bacilluscoagulans)、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(bacillusfirmus)、燦爛芽孢桿菌(bacilluslautus)、遲緩芽孢桿菌(bacilluslentus)、地衣芽孢桿菌(bacilluslicheniformis)、巨大芽孢桿菌(bacillusmegaterium)、短小芽孢桿菌(bacilluspumilus)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)、或蘇云金桿菌(bacillusthuringiensis)蛋白酶。
這些物種的菌株可以容易地在許多培養(yǎng)物保藏中心為公眾所獲得，如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(atcc)、德國微生物菌種保藏中心(deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturengmbh，dsmz)、荷蘭菌種保藏中心(centraalbureauvoorschimmelcultures，cbs)、以及美國農(nóng)業(yè)研究菌種保藏中心，北方地區(qū)研究中心(nrrl)。
可以使用以上提到的探針從其他來源，包括從自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分離的微生物或直接從自然材料(例如，土壤、堆肥、水等)獲得的dna樣品鑒定和獲得該親本。用于直接地從自然生活環(huán)境分離微生物和dna的技術(shù)是本領(lǐng)域中熟知的。然后可通過在另一種微生物或混合dna樣品的基因組dna或cdna文庫中類似地進(jìn)行篩選來獲得編碼親本的多核苷酸。一旦已經(jīng)用一個(gè)或多個(gè)探針檢測(cè)到編碼親本的多核苷酸，則可以通過利用對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說已知的技術(shù)來分離或克隆該多核苷酸(參見例如，薩拉布魯克(sambrook)等人，1989，見上文)。
根據(jù)本發(fā)明的高ph穩(wěn)定的蛋白酶變體可以通過包括以下方法來制備,該方法包括以下步驟：
(a)將取代x3v、x9d、x9e、x18s、x43r、x43k、x49t、x61d、x76d、x115w、x120t、x120v、x120d、x182d、x182e、x185e、x185d、x188e、x188d、x194p、x205i、x206l、x209w、x216v、x217m、x218t、x222s、x255e、x255d、x256d、x256e、x259d、x259e、x260a、x260e、x260d、x261m、x261w、x262e和x262d引入親本蛋白酶中，其中這些位置對(duì)應(yīng)于seqidno:1的位置，以及
(b)回收該變體。
可以使用本領(lǐng)域已知的任何誘變程序來制備這些變體，如定點(diǎn)誘變、合成基因構(gòu)建、半合成基因構(gòu)建、隨機(jī)誘變、改組等。
定點(diǎn)誘變是在編碼該親本的多核苷酸中的一個(gè)或多個(gè)限定位點(diǎn)處引入一個(gè)或多個(gè)(例如，若干個(gè))突變的技術(shù)。
通過使用涉及包含所希望的突變的寡核苷酸引物的pcr可以體外實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)誘變。也可以通過盒式誘變進(jìn)行體外定點(diǎn)誘變，所述盒式誘變涉及由限制酶在包括編碼親本的多核苷酸的質(zhì)粒中的位點(diǎn)處切割并且隨后將包含突變的寡核苷酸連接在多核苷酸中。通常，消化該質(zhì)粒與該寡核苷酸的限制酶是相同的，以允許該質(zhì)粒的粘性末端以及插入片段彼此連接。參見，例如謝勒(scherer)和戴維斯(davis)，1979，美國國家科學(xué)院院刊(proc.natl.acad.sci.usa)76:4949-4955；和巴頓(barton)等人，1990，核酸研究(nucleicacidsres.)18:7349-4966。
還可以通過本領(lǐng)域已知的方法體內(nèi)實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)誘變。參見，例如，us2004/0171154；斯道瑞希(storici)等人，2001，自然生物技術(shù)(naturebiotechnol.)19:773-776；卡倫(kren)等人，1998，自然醫(yī)學(xué)(nat.med.)4:285-290；以及凱利薩諾(calissano)和馬奇諾(macino)，1996，真菌遺傳學(xué)簡訊(fungalgenet.newslett.)43:15-16。
在本發(fā)明中可以使用任何定點(diǎn)誘變程序。存在可以用于制備變體的很多可商購的試劑盒。
合成基因構(gòu)建需要體外合成設(shè)計(jì)的多核苷酸分子以編碼感興趣的多肽。基因合成可以利用多種技術(shù)來進(jìn)行，如由田(tian)等人(2004，自然(nature)432:1050-1054)所述的基于多路微芯片的技術(shù)、以及其中在光可編程的微流芯片上合成并組裝寡核苷酸的類似技術(shù)。
可以做出單個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用誘變、重組和/或改組的已知方法進(jìn)行測(cè)試，隨后進(jìn)行相關(guān)篩選程序，如由里德哈爾-奧爾森(reidhaar-olson)和薩奧爾(sauer)，1988，科學(xué)(science)241:53-57；博維(bowie)和薩奧爾，1989，美國國家科學(xué)院院刊(proc.natl.acad.sci.usa)86:2152-2156；wo95/17413；或wo95/22625披露的那些?？梢允褂玫钠渌椒òㄒ族e(cuò)pcr、噬菌體展示(例如洛曼(lowman)等人，1991，生物化學(xué)(biochemistry)30:10832-10837；us5,223,409、wo92/06204)以及區(qū)域定向誘變(德比什爾(derbyshire)等人，1986，基因(gene)46:145；內(nèi)爾(ner)等人，1988，dna7:127)。
誘變/改組方法可以與高通量自動(dòng)化篩選方法組合以檢測(cè)由宿主細(xì)胞表達(dá)的克隆的誘變多肽的活性(奈斯(ness)等人，1999，自然生物技術(shù)(naturebiotechnology)17:893-896)。可以從宿主細(xì)胞回收編碼活性多肽的誘變的dna分子，并且使用本領(lǐng)域內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)方法快速測(cè)序。這些方法允許迅速確定多肽中單個(gè)氨基酸殘基的重要性。
通過組合合成基因構(gòu)建、和/或定點(diǎn)誘變、和/或隨機(jī)誘變、和/或改組的多個(gè)方面來實(shí)現(xiàn)半合成基因構(gòu)建。半合成構(gòu)建典型地是利用合成的多核苷酸片段的過程結(jié)合pcr技術(shù)。因此，基因的限定的區(qū)域可以從頭合成，而其他區(qū)域可以使用位點(diǎn)特異性誘變引物來擴(kuò)增，而還有其他區(qū)域可以經(jīng)受易錯(cuò)pcr或非易錯(cuò)pcr擴(kuò)增。然后可以對(duì)多核苷酸子序列進(jìn)行改組。
除了根據(jù)本發(fā)明的蛋白酶之外，根據(jù)本發(fā)明的液體清潔組合物還包括另外的組分，如以下列出的非限制性組分。對(duì)于織物護(hù)理，組分的選擇可以包括以下考慮：有待清潔的織物的類型、污漬的類型和/或程度、進(jìn)行清潔時(shí)的溫度、以及洗滌劑產(chǎn)品的配制。
在一個(gè)具體實(shí)施例中，該高ph液體清潔組合物包括本發(fā)明的蛋白酶變體以及一種或多種洗滌劑組分，如表面活性劑、助水溶劑、助洗劑、共助洗劑、螯合劑(chelator)或螯合試劑(chelatingagent)、漂白系統(tǒng)或漂白組分、聚合物、織物調(diào)色劑、織物調(diào)理劑、增泡劑、抑泡劑、分散劑、染料轉(zhuǎn)移抑制劑、熒光增白劑、香料、光學(xué)增亮劑、殺細(xì)菌劑、殺真菌劑、污物懸浮劑、污物釋放聚合物、抗再沉積劑、酶抑制劑或穩(wěn)定劑、酶激活劑、抗氧化劑、以及增溶劑。
可以使用常規(guī)穩(wěn)定劑和蛋白酶抑制劑來穩(wěn)定本發(fā)明的清潔組合物的蛋白酶變體，例如多元醇(如丙二醇或甘油)、糖或糖醇、不同的鹽(如nacl、kcl)、乳酸、甲酸、硼酸、或硼酸衍生物(例如，芳族硼酸酯；或苯基硼酸衍生物如4-甲酰苯基硼酸(例如，如wo96/41859中的))、或肽醛(如二肽醛、三肽醛或四肽醛或醛類似物)(或者具有形式b1-b0-r，其中r是h、ch3、cx3、chx2、或ch2x(x＝鹵素)，b0是單個(gè)氨基酸殘基(優(yōu)選地具有一個(gè)任選取代的脂肪族或芳香族側(cè)鏈)；并且b1由一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基組成(優(yōu)選一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè))，任選地包括一個(gè)n-末端保護(hù)基團(tuán)(例如，如wo2009/118375、wo2013/004635中的)，或者如描述于wo2005/105826、wo2009/118375、wo98/13459中的)或者蛋白類型的蛋白酶抑制劑，如rasi、basi、wasi(水稻、大麥和小麥的雙功能α-淀粉酶/枯草桿菌蛋白酶抑制劑)(例如，如wo2009/095425中的)或ci2或ssi。
此外，在pct公開wo94/04651和wo98/13460中已經(jīng)披露了肽醛用于穩(wěn)定液體洗滌劑中的某些蛋白酶的用途。更具體地，wo94/04651披露了肽醛phe-gly-ala-pheh和phe-gly-ala-leuh用于穩(wěn)定枯草桿菌蛋白酶型蛋白酶的用途。為了穩(wěn)定胰凝乳蛋白酶型蛋白酶，wo94/04651披露了leu-leu-tyrh作為適合的肽醛。此外，wo94/04651建議使用氨基甲酸甲酯或甲基脲作為肽醛的n-末端保護(hù)基團(tuán)。wo98/13460披露了肽蛋白酶抑制劑，肽醛抑或三氟甲基酮的用途，其中該肽鏈包含2-5個(gè)氨基酸，并且該醛/三氟甲基酮來源于氨基酸丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯甘氨酸(phenylglycine)、苯丙氨酸或高苯丙氨酸(homophenylalanine)，并且其中該n-末端保護(hù)基團(tuán)優(yōu)選為磺酰胺(sulphonamide)或酰胺基磷酸(amidophosphate)。作為實(shí)例，可以使用ch3so2phe-gly-ala-leuh。
在另一個(gè)實(shí)施例中，具有通式i的化合物：
其中r選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：氫、ch3、cx3、chx2、ch2x，其中x是鹵素原子，b1是單個(gè)氨基酸殘基，并且b2是一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，b2任選地包括n-末端保護(hù)基團(tuán)，條件是如果b1是亮氨酸，那么b2不能是亮氨酸；可用于穩(wěn)定和/或抑制本發(fā)明的蛋白酶變體。
在另一個(gè)實(shí)施例中，蛋白酶抑制劑是具有化學(xué)式b2-b1-b0-r的肽化合物，其中：
r是氫、ch3、cx3、chx2或ch2x，其中x是鹵素原子；
b0是在對(duì)位和/或間位有oh取代的苯丙氨酸殘基；
b1是單個(gè)氨基酸殘基；并且
b2由一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基組成，任選地包括一個(gè)n端保護(hù)基團(tuán)。
如上所述的具有化學(xué)式b2-b1-b0-r的所述蛋白酶抑制劑可用作本發(fā)明意義上的任選的蛋白酶抑制劑(例如與如在此所披露的本發(fā)明的任何實(shí)施例組合或作為其一部分)。
因此，在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及具有ph為10或更高的液體清潔組合物，該組合物包括：
(a)至少0.01wt％的蛋白酶，其中該蛋白酶是親本蛋白酶的變體，并且其中該蛋白酶變體具有與seqidno:2的氨基酸序列具有至少60％序列一致性的氨基酸序列，并且其中所述蛋白酶變體的特征在于當(dāng)在40℃下在具有ph為10的液體洗滌劑中4小時(shí)后進(jìn)行測(cè)量時(shí)，具有比親本蛋白酶高至少10％的殘留活性；
(b)任選地，一種蛋白酶抑制劑，優(yōu)選地，所述蛋白酶抑制劑是一種肽醛蛋白酶抑制劑，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述蛋白酶抑制劑是具有通式i的化合物，其中r選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：氫、ch3、cx3、chx2、ch2x，其中x是鹵素原子，b1是單個(gè)氨基酸殘基，并且b2是一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，b2任選地包括n-末端保護(hù)基團(tuán)，條件是如果b1是亮氨酸，那么b2不能是亮氨酸。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種液體清潔組合物，該組合物包括：
(a)從20％至95％wt，優(yōu)選從40％至95％wt，進(jìn)一步優(yōu)選從約70％至約90％wt的水；
(b)至少0.01wt％的蛋白酶，其中該蛋白酶是親本蛋白酶的變體，并且其中該蛋白酶變體具有與seqidno:2的氨基酸序列具有至少60％序列一致性的氨基酸序列，并且其中所述蛋白酶變體的特征在于當(dāng)在40℃下在具有ph為10的液體洗滌劑中4小時(shí)后進(jìn)行測(cè)量時(shí)，具有比親本蛋白酶高至少10％的殘留活性；
(c)任選地，一種蛋白酶抑制劑，優(yōu)選地，所述蛋白酶抑制劑是一種肽醛蛋白酶抑制劑，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述蛋白酶抑制劑是具有通式i的化合物，其中r選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：氫、ch3、cx3、chx2、ch2x，其中x是鹵素原子，b1是單個(gè)氨基酸殘基，并且b2是一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，b2任選地包括n-末端保護(hù)基團(tuán)，條件是如果b1是亮氨酸，那么b2不能是亮氨酸。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種液體清潔組合物，該組合物包括：
(a)從0％至20％wt，優(yōu)選0.1％至2.5％wt的洗滌劑表面活性劑；
(b)從0.001％至10％wt，優(yōu)選0.1％至5％wt的蛋白酶變體；以及
(c1)從20％至95％wt，優(yōu)選從40％至95％wt，進(jìn)一步優(yōu)選從約70％至約90％wt的水；和/或
(c2)從1％至30％wt的堿性緩沖液系統(tǒng)，該堿性緩沖液系統(tǒng)包括堿金屬硅酸鹽或堿金屬氫氧化物或其混合物，以提供約11至13.5的ph，優(yōu)選ph為從約12至13.5；
(d)任選地，一種蛋白酶抑制劑，優(yōu)選地，所述蛋白酶抑制劑是一種肽醛蛋白酶抑制劑，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述蛋白酶抑制劑是具有通式i的化合物，其中r選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：氫、ch3、cx3、chx2、ch2x，其中x是鹵素原子，b1是單個(gè)氨基酸殘基，并且b2是一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，b2任選地包括n-末端保護(hù)基團(tuán)，條件是如果b1是亮氨酸，那么b2不能是亮氨酸。
在所述實(shí)施例中，(c1)和(c2)可以用作彼此的替代物或它們可以彼此組合使用。
因此，在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及具有ph為10或更高的液體清潔組合物，該組合物包括：
(a)至少0.01wt％的蛋白酶，其中該蛋白酶是親本蛋白酶的變體，并且其中該蛋白酶變體具有與seqidno:2的氨基酸序列具有至少60％序列一致性的氨基酸序列，并且其中所述蛋白酶變體的特征在于當(dāng)在40℃下在ph為10的液體洗滌劑中4小時(shí)后進(jìn)行測(cè)量時(shí)，具有比親本蛋白酶高至少10％的殘留活性，優(yōu)選地，所述變體包括在一個(gè)或多個(gè)位置處的取代，這些位置選自對(duì)應(yīng)于bpn'(seqidno1)位置3、9、18、43、49、61、76、115、120、182、185、188、194、205、206、209、216、217、218、222、255、256、259、260、261和262的位置；
(b)任選地，一種蛋白酶抑制劑，優(yōu)選地，所述蛋白酶抑制劑是一種肽醛蛋白酶抑制劑，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述蛋白酶抑制劑是具有通式i的化合物，其中r選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：氫、ch3、cx3、chx2、ch2x，其中x是鹵素原子，b1是單個(gè)氨基酸殘基，并且b2是一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，b2任選地包括n-末端保護(hù)基團(tuán)，條件是如果b1是亮氨酸，那么b2不能是亮氨酸。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種液體清潔組合物，該組合物包括：
(a)從20％至95％wt，優(yōu)選從40％至95％wt，進(jìn)一步優(yōu)選從約70％至約90％wt的水；
(b)至少0.01wt％的蛋白酶，其中該蛋白酶是親本蛋白酶的變體，并且其中該蛋白酶變體具有與seqidno:2的氨基酸序列具有至少60％序列一致性的氨基酸序列，并且其中所述蛋白酶變體的特征在于當(dāng)在40℃下在ph為10的液體洗滌劑中4小時(shí)后進(jìn)行測(cè)量時(shí)，具有比親本蛋白酶高至少10％的殘留活性，優(yōu)選地，所述變體包括在一個(gè)或多個(gè)位置處的取代，這些位置選自對(duì)應(yīng)于bpn'(seqidno1)位置3、9、18、43、49、61、76、115、120、182、185、188、194、205、206、209、216、217、218、222、255、256、259、260、261和262的位置；
(c)任選地，一種蛋白酶抑制劑，優(yōu)選地，所述蛋白酶抑制劑是一種肽醛蛋白酶抑制劑，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述蛋白酶抑制劑是具有通式i的化合物，其中r選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：氫、ch3、cx3、chx2、ch2x，其中x是鹵素原子，b1是單個(gè)氨基酸殘基，并且b2是一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，b2任選地包括n-末端保護(hù)基團(tuán)，條件是如果b1是亮氨酸，那么b2不能是亮氨酸。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種液體清潔組合物，該組合物包括：
(a)從0％至20％wt，優(yōu)選0.1％至2.5％wt的洗滌劑表面活性劑；
(b)從0.001％至10％wt，優(yōu)選0.1％至5％wt的蛋白酶變體，優(yōu)選地，所述變體包括在一個(gè)或多個(gè)位置處的取代，這些位置選自對(duì)應(yīng)于bpn'(seqidno:1)的位置3、9、18、43、49、61、76、115、120、182、185、188、194、205、206、209、216、217、218、222、255、256、259、260、261和262的位置；以及
(c1)從20％至95％wt，優(yōu)選從40％至95％wt，進(jìn)一步優(yōu)選從約70％至約90％wt的水；和/或
(c2)從1％至30％wt的堿性緩沖液系統(tǒng)，該堿性緩沖液系統(tǒng)包括堿金屬硅酸鹽或堿金屬氫氧化物或其混合物，以提供約11至13.5的ph，優(yōu)選ph為從約12至13.5；
(d)任選地，一種蛋白酶抑制劑，優(yōu)選地，所述蛋白酶抑制劑是一種肽醛蛋白酶抑制劑，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述蛋白酶抑制劑是具有通式i的化合物，其中r選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：氫、ch3、cx3、chx2、ch2x，其中x是鹵素原子，b1是單個(gè)氨基酸殘基，并且b2是一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，b2任選地包括n-末端保護(hù)基團(tuán)，條件是如果b1是亮氨酸，那么b2不能是亮氨酸。
在所述實(shí)施例中，(c1)和(c2)可以用作彼此的替代物或它們可以彼此組合使用。
因此，在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及具有ph為10或更高的液體清潔組合物，該組合物包括：
(a)至少0.01wt％的蛋白酶，其中該蛋白酶是親本蛋白酶的變體，并且其中該蛋白酶變體具有與seqidno:2的氨基酸序列具有至少60％序列一致性的氨基酸序列，并且其中所述蛋白酶變體的特征在于當(dāng)在40℃下在ph為10的液體洗滌劑中4小時(shí)后進(jìn)行測(cè)量時(shí)，具有比親本蛋白酶高至少10％的殘留活性，優(yōu)選地，所述變體包括在對(duì)應(yīng)于bpn’(seqidno:1)的位置205和209的位置處的取代，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述變體包括在對(duì)應(yīng)于bpn’(seqidno:1)的位置205和209的位置處的取代以及在以下一個(gè)或多個(gè)位置處的取代，這些位置選自對(duì)應(yīng)于bpn’(seqidno:1)的位置3、9、18、43、49、61、76、115、120、182、185、188、194、206、216、217、218、222、255、256、259、260、261和262的位置；
(b)任選地，一種蛋白酶抑制劑，優(yōu)選地，所述蛋白酶抑制劑是一種肽醛蛋白酶抑制劑，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述蛋白酶抑制劑是具有通式i的化合物，其中r選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：氫、ch3、cx3、chx2、ch2x，其中x是鹵素原子，b1是單個(gè)氨基酸殘基，并且b2是一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，b2任選地包括n-末端保護(hù)基團(tuán)，條件是如果b1是亮氨酸，那么b2不能是亮氨酸。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種液體清潔組合物，該組合物包括：
(a)從20％至95％wt，優(yōu)選從40％至95％wt，進(jìn)一步優(yōu)選從約70％至約90％wt的水；
(b)至少0.01wt％的蛋白酶，其中該蛋白酶是親本蛋白酶的變體，并且其中該蛋白酶變體具有與seqidno:2的氨基酸序列具有至少60％序列一致性的氨基酸序列，并且其中所述蛋白酶變體的特征在于當(dāng)在40℃下在ph為10的液體洗滌劑中4小時(shí)后進(jìn)行測(cè)量時(shí)，具有比親本蛋白酶高至少10％的殘留活性，優(yōu)選地，所述變體包括在對(duì)應(yīng)于bpn’(seqidno:1)的位置205和209的的位置處的取代，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述變體包括在對(duì)應(yīng)于bpn’(seqidno:1)的位置205和209的位置處的取代以及在以下一個(gè)或多個(gè)位置處的取代，這些位置選自對(duì)應(yīng)于bpn’(seqidno1)的位置3、9、18、43、49、61、76、115、120、182、185、188、194、206、216、217、218、222、255、256、259、260、261和262的位置；
(c)任選地，一種蛋白酶抑制劑，優(yōu)選地，所述蛋白酶抑制劑是一種肽醛蛋白酶抑制劑，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述蛋白酶抑制劑是具有通式i的化合物，其中r選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：氫、ch3、cx3、chx2、ch2x，其中x是鹵素原子，b1是單個(gè)氨基酸殘基，并且b2是一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，b2任選地包括n-末端保護(hù)基團(tuán)，條件是如果b1是亮氨酸，那么b2不能是亮氨酸。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種液體清潔組合物，該組合物包括：
(a)從0％至20％wt，優(yōu)選0.1％至2.5％wt的洗滌劑表面活性劑；
(b)從0.001％至10％wt，優(yōu)選0.1％至5％wt的蛋白酶變體，優(yōu)選地，所述變體包括在對(duì)應(yīng)于bpn'(seqidno:1)的位置205和209的位置處的取代，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述變體包括在對(duì)應(yīng)于bpn'(seqidno:1)的位置205和209的位置處的取代以及在以下一個(gè)或多個(gè)位置處的取代，這些位置選自對(duì)應(yīng)于bpn'(seqidno:1)的位置3、9、18、43、49、61、76、115、120、182、185、188、194、206、216、217、218、222、255、256、259、260、261和262的位置；以及
(c1)從20％至95％wt，優(yōu)選從40％至95％wt，進(jìn)一步優(yōu)選從約70％至約90％wt的水；和/或
(c2)從1％至30％wt的堿性緩沖液系統(tǒng)，該堿性緩沖液系統(tǒng)包括堿金屬硅酸鹽或堿金屬氫氧化物或其混合物，以提供約11至13.5的ph，優(yōu)選ph為從約12至13.5；
(d)任選地，一種蛋白酶抑制劑，優(yōu)選地，所述蛋白酶抑制劑是一種肽醛蛋白酶抑制劑，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述蛋白酶抑制劑是具有通式i的化合物，其中r選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：氫、ch3、cx3、chx2、ch2x，其中x是鹵素原子，b1是單個(gè)氨基酸殘基，并且b2是一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，b2任選地包括n-末端保護(hù)基團(tuán)，條件是如果b1是亮氨酸，那么b2不能是亮氨酸。
在所述實(shí)施例中，(c1)和(c2)可以用作彼此的替代物或它們可以彼此組合使用。
因此，在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及具有ph為10或更高的液體清潔組合物，該組合物包括：
(a)至少0.01wt％的蛋白酶，其中該蛋白酶是親本蛋白酶的變體，并且其中該蛋白酶變體具有與seqidno:2的氨基酸序列具有至少60％序列一致性的氨基酸序列，并且其中所述蛋白酶變體的特征在于當(dāng)在40℃下在ph為10的液體洗滌劑中4小時(shí)后進(jìn)行測(cè)量時(shí)，具有比親本蛋白酶高至少10％的殘留活性，優(yōu)選地，所述變體包括一個(gè)或多個(gè)取代，這些取代對(duì)應(yīng)于bpn'(seqidno1)的取代x3v、x9d、x9e、x18s、x43r、x43k、x49t、x61d、x76d、x115w、x120t、x120v、x120d、x182d、x182e、x185e、x185d、x188e、x188d、x194p、x205i、x206l、x209w、x216v、x217m、x218t、x222s、x255e、x255d、x256d、x256e、x259d、x259e、x260a、x260e、x260d、x261m、x261w、x262e和x262d；
(b)任選地，一種蛋白酶抑制劑，優(yōu)選地，所述蛋白酶抑制劑是一種肽醛蛋白酶抑制劑，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述蛋白酶抑制劑是具有通式i的化合物，其中r選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：氫、ch3、cx3、chx2、ch2x，其中x是鹵素原子，b1是單個(gè)氨基酸殘基，并且b2是一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，b2任選地包括n-末端保護(hù)基團(tuán)，條件是如果b1是亮氨酸，那么b2不能是亮氨酸。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種液體清潔組合物，該組合物包括：
(d)從20％至95％wt，優(yōu)選從40％至95％wt，進(jìn)一步優(yōu)選從約70％至約90％wt的水；
(e)至少0.01wt％的蛋白酶，其中該蛋白酶是親本蛋白酶的變體，并且其中該蛋白酶變體具有與seqidno:2的氨基酸序列具有至少60％序列一致性的氨基酸序列，并且其中所述蛋白酶變體的特征在于當(dāng)在40℃下在ph為10的液體洗滌劑中4小時(shí)后進(jìn)行測(cè)量時(shí)，具有比親本蛋白酶高至少10％的殘留活性，優(yōu)選地，所述變體包括一個(gè)或多個(gè)取代，這些取代對(duì)應(yīng)于bpn'(seqidno1)的取代x3v、x9d、x9e、x18s、x43r、x43k、x49t、x61d、x76d、x115w、x120t、x120v、x120d、x182d、x182e、x185e、x185d、x188e、x188d、x194p、x205i、x206l、x209w、x216v、x217m、x218t、x222s、x255e、x255d、x256d、x256e、x259d、x259e、x260a、x260e、x260d、x261m、x261w、x262e和x262d；
(f)任選地，一種蛋白酶抑制劑，優(yōu)選地，所述蛋白酶抑制劑是一種肽醛蛋白酶抑制劑，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述蛋白酶抑制劑是具有通式i的化合物，其中r選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：氫、ch3、cx3、chx2、ch2x，其中x是鹵素原子，b1是單個(gè)氨基酸殘基，并且b2是一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，b2任選地包括n-末端保護(hù)基團(tuán)，條件是如果b1是亮氨酸，那么b2不能是亮氨酸。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種液體清潔組合物，該組合物包括：
(a)從0％至20％wt，優(yōu)選0.1％至2.5％wt的洗滌劑表面活性劑；
(b)從0.001％至10％wt，優(yōu)選0.1％至5％wt的蛋白酶變體，優(yōu)選地，所述變體包括一個(gè)或多個(gè)取代，這些取代對(duì)應(yīng)于bpn’(seqidno:1)的取代x3v、x9d、x9e、x18s、x43r、x43k、x49t、x61d、x76d、x115w、x120t、x120v、x120d、x182d、x182e、x185e、x185d、x188e、x188d、x194p、x205i、x206l、x209w、x216v、x217m、x218t、x222s、x255e、x255d、x256d、x256e、x259d、x259e、x260a、x260e、x260d、x261m、x261w、x262e和x262d；以及
(c1)從20％至95％wt，優(yōu)選從40％至95％wt，進(jìn)一步優(yōu)選從約70％至約90％wt的水；和/或
(c2)從1％至30％wt的堿性緩沖液系統(tǒng)，該堿性緩沖液系統(tǒng)包括堿金屬硅酸鹽或堿金屬氫氧化物或其混合物，以提供約11至13.5的ph，優(yōu)選ph為從約12至13.5；
(d)任選地，一種蛋白酶抑制劑，優(yōu)選所述蛋白酶抑制劑是一種肽醛蛋白酶抑制劑，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述蛋白酶抑制劑是具有通式i的化合物，其中r選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：氫、ch3、cx3、chx2、ch2x，其中x是鹵素原子，b1是單個(gè)氨基酸殘基，并且b2是一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，b2任選地包括n-末端保護(hù)基團(tuán)，條件是如果b1是亮氨酸，那么b2不能是亮氨酸。
在所述實(shí)施例中，(c1)和(c2)可以用作彼此的替代物或它們可以彼此組合使用。
因此，在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及具有ph為10或更高的液體清潔組合物，該組合物包括：
(a)至少0.01wt％的蛋白酶，其中該蛋白酶是親本蛋白酶的變體，并且其中該蛋白酶變體具有與seqidno:2的氨基酸序列具有至少60％序列一致性的氨基酸序列，并且其中所述蛋白酶變體的特征在于當(dāng)在40℃下在ph為10的液體洗滌劑中4小時(shí)后進(jìn)行測(cè)量時(shí)，具有比親本蛋白酶高至少10％的殘留活性，優(yōu)選地，所述變體包括對(duì)應(yīng)于bpn'(seqidno1)的取代x205i和x209w的取代，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述變體包括對(duì)應(yīng)于bpn'(seqidno1)的取代x205i和x209w的取代以及對(duì)應(yīng)于bpn'(seqidno1)的取代x3v、x9d、x9e、x18s、x43r、x43k、x49t、x61d、x76d、x115w、x120t、x120v、x120d、x182d、x182e、x185e、x185d、x188e、x188d、x194p、x206l、x216v、x217m、x218t、x222s、x255e、x255d、x256d、x256e、x259d、x259e、x260a、x260e、x260d、x261m、x261w、x262e和x262d的一個(gè)或多個(gè)取代；
(b)任選地，一種蛋白酶抑制劑，優(yōu)選地，所述蛋白酶抑制劑是一種肽醛蛋白酶抑制劑，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述蛋白酶抑制劑是具有通式i的化合物，其中r選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：氫、ch3、cx3、chx2、ch2x，其中x是鹵素原子，b1是單個(gè)氨基酸殘基，并且b2是一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，b2任選地包括n-末端保護(hù)基團(tuán)，條件是如果b1是亮氨酸，那么b2不能是亮氨酸。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種液體清潔組合物，該組合物包括：
(a)從20％至95％wt，優(yōu)選從40％至95％wt，進(jìn)一步優(yōu)選從約70％至約90％wt的水；
(b)至少0.01wt％的蛋白酶，其中該蛋白酶是親本蛋白酶的變體，并且其中該蛋白酶變體具有與seqidno:2的氨基酸序列具有至少60％序列一致性的氨基酸序列，并且其中所述蛋白酶變體的特征在于當(dāng)在40℃下在ph為10的液體洗滌劑中4小時(shí)后進(jìn)行測(cè)量時(shí)，具有比親本蛋白酶高至少10％的殘留活性，優(yōu)選地，所述變體包括對(duì)應(yīng)于bpn'(seqidno1)的取代x205i和x209w的取代，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述變體包括對(duì)應(yīng)于bpn'(seqidno1)的取代x205i和x209w的取代以及對(duì)應(yīng)于bpn'(seqidno1)的取代x3v、x9d、x9e、x18s、x43r、x43k、x49t、x61d、x76d、x115w、x120t、x120v、x120d、x182d、x182e、x185e、x185d、x188e、x188d、x194p、x206l、x216v、x217m、x218t、x222s、x255e、x255d、x256d、x256e、x259d、x259e、x260a、x260e、x260d、x261m、x261w、x262e和x262d的一個(gè)或多個(gè)取代；
(c)任選地，一種蛋白酶抑制劑，優(yōu)選地，所述蛋白酶抑制劑是一種肽醛蛋白酶抑制劑，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述蛋白酶抑制劑是具有通式i的化合物，其中r選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：氫、ch3、cx3、chx2、ch2x，其中x是鹵素原子，b1是單個(gè)氨基酸殘基，并且b2是一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，b2任選地包括n-末端保護(hù)基團(tuán)，條件是如果b1是亮氨酸，那么b2不能是亮氨酸。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種液體清潔組合物，該組合物包括：
(a)從0％至20％wt，優(yōu)選0.1％至2.5％wt的洗滌劑表面活性劑；
(b)從0.001％至10％wt，優(yōu)選0.1％至5％wt的蛋白酶變體，優(yōu)選地，所述變體包括對(duì)應(yīng)于bpn’(seqidno:1)的取代x205i和x209w的取代，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述變體包括對(duì)應(yīng)于bpn’(seqidno1)的取代x205i和x209w的取代以及對(duì)應(yīng)于bpn’(seqidno1)的取代x3v、x9d、x9e、x18s、x43r、x43k、x49t、x61d、x76d、x115w、x120t、x120v、x120d、x182d、x182e、x185e、x185d、x188e、x188d、x194p、x206l、x216v、x217m、x218t、x222s、x255e、x255d、x256d、x256e、x259d、x259e、x260a、x260e、x260d、x261m、x261w、x262e和x262d的一個(gè)或多個(gè)取代；以及
(c1)從20％至95％wt，優(yōu)選從40％至95％wt，進(jìn)一步優(yōu)選從約70％至約90％wt的水；和/或
(c2)從1％至30％wt的堿性緩沖液系統(tǒng)，該堿性緩沖液系統(tǒng)包括堿金屬硅酸鹽或堿金屬氫氧化物或其混合物，以提供約11至13.5的ph，優(yōu)選ph為從約12至13.5；
(d)任選地，一種蛋白酶抑制劑，優(yōu)選地，所述蛋白酶抑制劑是一種肽醛蛋白酶抑制劑，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述蛋白酶抑制劑是具有通式i的化合物，其中r選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：氫、ch3、cx3、chx2、ch2x，其中x是鹵素原子，b1是單個(gè)氨基酸殘基，并且b2是一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，b2任選地包括n-末端保護(hù)基團(tuán)，條件是如果b1是亮氨酸，那么b2不能是亮氨酸。
在所述實(shí)施例中，(c1)和(c2)可以用作彼此的替代物或它們可以彼此組合使用。
在一些優(yōu)選實(shí)施例中，該蛋白酶選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：
s9e+n43r+g61e+n76d+g115w+h120v+a194p+q206l+s259d+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+q182e+a194p+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+y209w+s216v+m222s+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+s256d+s259d+n261w+l262e；
s9e+n18s+n43r+n76d+g115w+h120v+a194p+v205i+q206l+s259d+l262e；
s9e+n43r+n76d+g115w+h120v+a194p+v205i+q206l+s259d+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+s256d+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+q182e+a194p+v205i+q206l+y209w+s256d+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+s188e+a194p+v205i+q206l+y209w+s216v+l262e；
s9e+n76d+g115w+g160p+q182e+v205i+q206l+y209w+s256d+t260e+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+h120t+a194p+q206l+s256d+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+h120t+a194p+v205i+q206l+y209w+s216v+l262e；
s9e+n76d+g160p+q182e+v205i+q206l+y209w+s256d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+q182e+a194p+v205i+q206l+s259d+n261w+l262e；
s9e+n76d+q182e+v205i+q206l+y209w+s256d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+q182e+a194p+v205i+q206l+s259d+n261w+l262e+*275ah；
s9e+n43r+n76d+q182e+n185e+s188e+a194p+q206l+y209w+s259d+l262e；
s9e+n43r+n76d+n185e+a194p+v205i+q206l+y209w+s216v+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+y209w+s216v+n261m+l262e；
s9e+n43r+i72a+n76d+a194p+q206l+s259d+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+s259d+l262e；
s9e+n43r+n76d+h120v+q182e+a194p+v205i+q206l+y209w+s256d+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+q182e+a194p+v205i+q206l+y209w+s256d+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+h120v+q182e+a194p+v205i+q206l+y209w+s256d+n261w+l262e+*275ah+*275bh；
s3v+n76d+h120v+q182e+n185e+s188e+v205i+q206l+y209w+s216v+s256d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a158e+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+s212g+s216v+l262e；
s9e+n43r+n76d+a158e+g160p+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a158e+g160p+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+s212g+s216v+l262e；
s9e+n43r+n76d+a158e+g160p+s161e+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+s216v+l262e+*275ah+*275bh；
s9e+n43r+n76d+a158e+g160p+s161e+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a158e+g160p+s161e+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+s212g+s216v+l262e+*275ah+*275bh；
s9e+n43r+n76d+a158e+g160p+s161e+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+s212g+l262e；
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該組合物可以如在例如wo92/19709、wo92/19708和us6,472,364中描述的來配制。在一些實(shí)施例中，在此利用的這些酶由存在于為這些酶提供此類離子的成品組合物中的鋅(ii)、鈣(ii)和/或鎂(ii)離子的水溶性來源，連同其他金屬離子(例如，鋇(ii)、鈧(ii)、鐵(ii)、錳(ii)、鋁(iii)、錫(ii)、鈷(ii)、銅(ii)、鎳(ii)以及氧釩(iv)穩(wěn)定化。
本發(fā)明的蛋白酶變體還可以摻入到wo97/07202(通過引用結(jié)合在此)中所披露的洗滌劑配制品中。
本發(fā)明的液體清潔組合物的特征在于具有高ph(在ph10或高于ph10)。液體高ph清潔組合物可以進(jìn)一步包括高量的水。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面，該液體清潔組合物包括：
(a)從0％至20％wt，優(yōu)選0.1％至2.5％wt的洗滌劑表面活性劑；
(b)從40％至95％wt，優(yōu)選從約70％至約90％wt的水；
(c)從1％至30％wt的堿性緩沖液系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括堿金屬硅酸鹽或堿金屬氫氧化物或其混合物，以提供從約11至13.5的ph；以及
(d)從0.001％至10％wt，優(yōu)選0.1％至5％wt的蛋白酶變體。
表面活性劑可以是陰離子的和/或陽離子的和/或非離子的和/或半極性的和/或兼性離子的，或其混合物。在一個(gè)具體實(shí)施例中，該清潔組合物包括一種或多種非離子型表面活性劑和與一種或多種陰離子表面活性劑的化合物。表面活性劑典型地以按重量計(jì)約0.1％至60％、如約1％至約40％、或約3％至約20％、或約3％至約10％的水平存在。當(dāng)被包括在根據(jù)本發(fā)明的清潔組合物中時(shí)，表面活性劑通常將包含按重量計(jì)從約1％至約40％，如從約1％至約20％，優(yōu)選按重量計(jì)從約0％至約5％。陰離子表面活性劑的非限制性實(shí)例包括硫酸鹽和磺酸鹽，具體地，直鏈烷基苯磺酸鹽(las)，las的異構(gòu)體，支鏈烷基苯磺酸鹽(babs)，苯基鏈烷磺酸鹽，α-烯烴磺酸鹽(aos)，烯烴磺酸鹽，鏈烯烴磺酸鹽，鏈烷-2,3-二基雙(硫酸鹽)，羥基鏈烷磺酸鹽以及二磺酸鹽，烷基硫酸鹽(as)(例如十二烷基硫酸鈉(sds))，脂肪醇硫酸鹽(fas)，伯醇硫酸鹽(pas)，醇醚硫酸鹽(aes或aeos或fes，也被稱為醇乙氧基硫酸鹽或脂肪醇醚硫酸鹽)，仲鏈烷磺酸鹽(sas)，石蠟烴磺酸鹽(ps)，酯磺酸鹽，磺化的脂肪酸甘油酯，α-磺酸基脂肪酸甲酯(α-sfme或ses)(包括甲酯磺酸鹽(mes))，烷基琥珀酸或烯基琥珀酸，十二烯基/十四烯基琥珀酸(dtsa)，氨基酸的脂肪酸衍生物，磺酸基琥珀酸或皂的二酯和單酯，以及其組合。
當(dāng)被包括在根據(jù)本發(fā)明的清潔組合物中時(shí)，它將通常包含按重量計(jì)從約0％至約10％的陽離子表面活性劑。陽離子表面活性劑的非限制性實(shí)例包括烷基二甲基乙醇季胺(admeaq)、十六烷基三甲基溴化銨(ctab)、二甲基二硬脂酰氯化銨(dsdmac)、以及烷基芐基二甲基銨、烷基季銨化合物、烷氧基化季銨(aqa)化合物及其組合。
非離子型表面活性劑的非限制性實(shí)例包括醇乙氧基化物(ae或aeo)、醇丙氧基化物、丙氧基化的脂肪醇(pfa)、烷氧基化的脂肪酸烷基酯(例如乙氧基化的和/或丙氧基化的脂肪酸烷基酯)、烷基酚乙氧基化物(ape)、壬基酚乙氧基化物(npe)、烷基多糖苷(apg)、烷氧基化胺，脂肪酸單乙醇酰胺(fam)、脂肪酸二乙醇酰胺(fada)、乙氧基化的脂肪酸單乙醇酰胺(efam)、丙氧基化的脂肪酸單乙醇酰胺(pfam)、多羥基烷基脂肪酸酰胺，或葡萄糖胺的n-酰基n-烷基衍生物(葡糖酰胺(ga)、或脂肪酸葡糖酰胺(faga))、連同在span和tween商品名下可獲得的產(chǎn)品及其組合。
半極性表面活性劑的非限制性實(shí)例包括氧化胺(ao)(例如烷基二甲基氧化胺)、n-(椰油基烷基)-n,n-二甲基氧化胺和n-(牛油-烷基)-n,n-雙(2-羥乙基)氧化胺、脂肪酸鏈烷醇酰胺和乙氧基化的脂肪酸鏈烷醇酰胺及其組合。
兼性離子表面活性劑的非限制性實(shí)例包括甜菜堿、烷基二甲基甜菜堿、磺基甜菜堿及其組合。
特別優(yōu)選的表面活性劑包括las、mes、醇醚硫酸鹽、乙氧基化月桂醇或十二烷基苯磺酸鈉。
根據(jù)本發(fā)明的液體高ph清潔組合物典型地包含按重量計(jì)至少20％并且按重量計(jì)高達(dá)95％的水，如高達(dá)約70％wt的水、高達(dá)約65％wt的水、高達(dá)約55％wt的水、高達(dá)約45％wt的水、高達(dá)約35％wt的水。包括但不局限于鏈烷醇、胺、二醇、醚以及多元醇的其他類型的液體可以被包括在液體清潔組合物中。該清潔組合物可以包含從0％-30％的有機(jī)溶劑。
該清潔組合物還可以包含這樣一種助水溶劑，它是將疏水化合物溶解于水溶液中(或相反地，將極性物質(zhì)溶劑于非極性環(huán)境中)的化合物。典型地，助水溶劑同時(shí)具有親水的和疏水的特征(如從表面活性劑已知的所謂兩親特性)；然而助水溶劑的分子結(jié)構(gòu)一般并不有利于自發(fā)自聚集，參見例如霍奇登(hodgdon)和卡勒(kaler)(2007)的綜述，膠體&界面科學(xué)新見(currentopinionincolloid&interfacescience)，12:121-128。助水溶劑并不顯示一個(gè)臨界濃度，高于該濃度就會(huì)發(fā)生如對(duì)表面活性劑而言所發(fā)現(xiàn)的自聚集以及脂質(zhì)形成膠束、薄層或其他很好地定義的中間相。相反，許多助水溶劑示出連續(xù)類型的聚集過程，其中聚集物的大小隨著濃度增加而增長。然而，很多助水溶劑改變了包含極性和非極性特征的物質(zhì)的系統(tǒng)(包括水、油、表面活性劑、和聚合物的混合物)的相行為、穩(wěn)定性、和膠體特性。經(jīng)典地從制藥、個(gè)人護(hù)理、食品跨行業(yè)至技術(shù)應(yīng)用使用助水溶劑。助水溶劑在清潔組合物中的使用允許例如更濃的表面活性劑配制品(如在通過去除水而壓縮液體洗滌劑的過程中)而不引起不希望的現(xiàn)象，例如相分離或高黏度。根據(jù)本發(fā)明的清潔組合物可以包含按重量計(jì)0-5％、如約0.5％至約5％、或約3％至約5％wt的助水溶劑?？梢岳帽绢I(lǐng)域中已知的用于在洗滌劑中使用的任何助水溶劑。助水溶劑的非限制性實(shí)例包括苯磺酸鈉、對(duì)甲苯磺酸鈉(sts)、二甲苯磺酸鈉(sxs)、枯烯磺酸鈉(scs)、傘花烴磺酸鈉、氧化胺、醇和聚乙二醇醚、羥基萘甲酸鈉、羥基萘磺酸鈉、乙基己基磺酸鈉及其組合。根據(jù)本發(fā)明的清潔組合物可以包含按重量計(jì)約0-65％，如約5％至約45％的洗滌劑助洗劑或共助洗劑、或其混合物。在餐具洗滌洗滌劑中，助洗劑的水平典型地為40％-65％，特別是50％-65％。助洗劑和螯合劑例如通過從液體中去除金屬離子來軟化洗滌水。助洗劑和/或共助洗劑可以特別是與ca和mg形成水溶性絡(luò)合物的螯合劑?？梢岳帽绢I(lǐng)域中已知的用于在衣物洗滌劑中使用的任何助洗劑和/或共-助洗劑。助洗劑的非限制性實(shí)例包括沸石、二磷酸鹽(焦磷酸鹽)、三磷酸鹽例如三磷酸鈉(stp或stpp)、碳酸鹽例如碳酸鈉、可溶性硅酸鹽例如硅酸鈉、層狀硅酸鹽(例如來自赫斯特公司(hoechst)的sks-6)、乙醇胺例如2-氨基乙-1-醇(mea)、二乙醇胺(dea，也稱為亞氨基二乙醇)、三乙醇胺(tea，也稱為2,2’,2”-次氨基三乙醇)、以及羧甲基菊粉(cmi)及其組合。
根據(jù)本發(fā)明的清潔組合物還可以包含按重量計(jì)0-20％，如約5％至約10％wt的洗滌劑共助洗劑、或其混合物。洗滌劑組合物可以只包括共助洗劑，或結(jié)合助洗劑，例如沸石助洗劑。共助洗劑的非限制性實(shí)例包括聚丙烯酸酯均聚物或其共聚物，如聚(丙烯酸)(paa)或共聚(丙烯酸/馬來酸)(paa/pma)。另外的非限制性實(shí)例包括檸檬酸鹽，螯合劑，如氨基羧酸鹽、氨基多羧酸鹽和膦酸鹽，以及烷基-或烯基琥珀酸。另外的具體實(shí)例包括2,2’,2”-次氨基三乙酸(nta)、乙二胺四乙酸(edta)、二亞乙基三胺五乙酸(dtpa)、亞氨基二丁二酸(iminodisuccinicacid)(ids)、乙二胺-n,n’-二丁二酸(edds)、甲基甘氨酸二乙酸(mgda)、谷氨酸-n,n-二乙酸(glda)、1-羥基乙烷-1,1-二膦酸(hedp)、乙二胺四-(亞甲基膦酸)(edtmpa)、二亞乙基三胺五(亞甲基膦酸)(dtpmpa或dtmpa)、n-(2-羥乙基)亞氨基二乙酸(edg)、天冬氨酸-n-單乙酸(asma)、天冬氨酸-n,n-二乙酸(asda)、天冬氨酸-n-單丙酸(asmp)、亞氨基二丁二酸(iminodisuccinicacid)(ida)、n-(2-磺甲基)-天冬氨酸(smas)、n-(2-磺乙基)-天冬氨酸(seas)、n-(2-磺甲基)-谷氨酸(smgl)、n-(2-磺乙基)-谷氨酸(segl)、n-甲基亞氨基二乙酸(mida)、α-丙氨酸-n,n-二乙酸(α-alda)、絲氨酸-n,n-二乙酸(seda)、異絲氨酸-n,n-二乙酸(isda)、苯丙氨酸-n,n-二乙酸(phda)、鄰氨基苯甲酸-n,n-二乙酸(anda)、磺胺酸-n,n-二乙酸(slda)、牛磺酸-n,n-二乙酸(tuda)以及磺甲基-n,n-二乙酸(smda)、n-(2-羥乙基)-亞乙基二胺-n,n’,n’-三乙酸鹽(hedta)、二乙醇甘氨酸(deg)、二亞乙基三胺五(亞甲基膦酸)(dtpmp)、氨基三(亞甲基膦酸)(atmp)及其組合和鹽。另外的示例性助洗劑和/或共助洗劑描述于例如wo2009/102854和us5,977,053中。
根據(jù)本發(fā)明的清潔組合物可以包含按重量計(jì)0-50％，如約0.1％至約25％的漂白系統(tǒng)。漂白系統(tǒng)經(jīng)常通過氧化去除顏色，并且許多漂白劑還具有強(qiáng)殺細(xì)菌特性，并且用于消毒和滅菌。可以利用本領(lǐng)域中已知的用于在衣物洗滌劑中使用的任何漂白系統(tǒng)。適合的漂白系統(tǒng)組分包括漂白催化劑、次氯酸鹽、光漂白劑、漂白活化劑、過氧化氫源如過碳酸鈉和過硼酸鈉、預(yù)形成的過酸及其混合物。
可用于本發(fā)明組合物中的漂白催化劑的一些非限制性實(shí)例包括草酸錳、乙酸錳、錳膠原、鈷-胺催化劑和錳三氮雜環(huán)壬烷(mntacn)催化劑；特別優(yōu)選錳與1,4,7-三甲基-1,4,7-三氮雜環(huán)壬烷(me3-tacn)或1,2,4,7-四甲基-1,4,7-三氮雜環(huán)壬烷(me4-tacn)的絡(luò)合物，具體地是me3-tacn，如雙核錳絡(luò)合物[(me3-tacn)mn(o)3mn(me3-tacn)](pf6)2、和[2,2',2”-次氮基三(乙烷-1,2-二基氮烷基亞基-κn-甲亞基)三酚并-κ3o]錳(iii)。漂白催化劑還可以是其他金屬化合物，如鐵或鈷絡(luò)合物。
適合的預(yù)成型過酸包括但不限于：過氧羧酸及鹽、過碳酸及鹽、過亞氨酸(perimidicacid)及鹽、過氧單硫酸及鹽(例如過硫酸氫鉀(oxone(r))、及其混合物。漂白系統(tǒng)的非限制性實(shí)例包括與過酸形成漂白活化劑組合的基于過氧化物的漂白體系，其可以包含例如無機(jī)鹽，包括堿金屬鹽例如過硼酸鹽的鈉鹽(通常為單或四水合物)、過碳酸鹽、過硫酸鹽、過磷酸鹽、過硅酸鹽。術(shù)語漂白活化劑在此意指一種與過氧化物漂白劑(像過氧化氫)反應(yīng)以形成過酸的化合物。因此形成的過酸構(gòu)成活化的漂白劑。有待在此使用的適合漂白活化劑包括屬于酯酰胺、酰亞胺或酸酐類別的那些。適合的實(shí)例是四乙?；叶?taed)、4-[(3,5,5-三甲基己酰)氧基]苯磺酸鈉(isonobs)、二過氧月桂酸、4-(十二酰基氧基)苯磺酸鹽(lobs)、4-(癸酰基氧基)苯磺酸鹽、4-(癸酰基氧基)苯甲酸鹽(dobs)、4-(壬?；趸?-苯磺酸鹽(nobs)和/或披露于wo98/17767中的那些。漂白活化劑的具體家族披露于ep624154中并且特別是乙酰檸檬酸三乙酯(atc)。atc或短鏈甘油三酸酯(像三醋汀)具有以下優(yōu)點(diǎn)，它是環(huán)境友好的，因?yàn)樗罱K降解為檸檬酸和醇。此外，乙酰檸檬酸三乙酯和三醋汀在存儲(chǔ)時(shí)在產(chǎn)品中具有良好的水解穩(wěn)定性，并且它是有效的漂白活化劑。最后，atc為衣物添加劑提供良好的助洗能力?？商娲?，漂白系統(tǒng)可以包括例如酰胺、酰亞胺、或砜型的過氧酸。該漂白系統(tǒng)還可以包括過酸，如6-(苯二甲酰亞氨基)過己酸(pap)。該漂白系統(tǒng)還可以包括漂白催化劑。
在一些實(shí)施方案中，漂白組分可以是選自具有以下化學(xué)式的有機(jī)催化劑的有機(jī)催化劑：
(iii)及其混合物；其中每個(gè)r1獨(dú)立地是包含從9至24個(gè)碳的支鏈烷基基團(tuán)或包含從11至24個(gè)碳的直鏈烷基基團(tuán)，優(yōu)選地，每個(gè)r1獨(dú)立地是包含從9至18個(gè)碳的支鏈烷基基團(tuán)或包含從11至18個(gè)碳的直鏈烷基基團(tuán)，更優(yōu)選地，每個(gè)r1獨(dú)立地選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：2-丙基庚基、2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、正-十二烷基、正-十四烷基、正-十六烷基、正-十八烷基、異-壬基、異-癸基、異-十三基和異-十五烷基。其他示例性漂白系統(tǒng)描述于例如wo2007/087258、wo2007/087244、wo2007/087259以及wo2007/087242中。適合的光漂白劑可以例如是磺化的酞菁鋅。
一種具體的漂白劑是次氯酸鹽，如次氯酸鈉(naclo)。次氯酸鹽通過高ph穩(wěn)定，并且此外，次氯酸鹽是抗細(xì)菌劑。通常，根據(jù)本發(fā)明的清潔組合物包含3％-8％次氯酸鈉和0.01％-0.05％氫氧化鈉；使用氫氧化鈉以減緩次氯酸鈉分解成氯化鈉和氯酸鈉。次氯酸鹽可能不是洗滌劑配方的一部分，但是在洗滌過程期間添加了單獨(dú)的產(chǎn)品。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明的高ph清潔組合物不包括任何漂白劑，即該清潔組合物可以無漂白劑。
根據(jù)本發(fā)明的清潔組合物可以包含按重量計(jì)0-10％，如0.5％-5％、2％-5％、0.5％-2％或0.2％-1％的聚合物?？梢岳帽绢I(lǐng)域中已知的用于在洗滌劑中使用的任何聚合物。該聚合物可以作為如以上提到的共助洗劑起作用，或可以提供抗再沉積、纖維保護(hù)、污物釋放、染料轉(zhuǎn)移抑制、油污清潔和/或防沫特性。一些聚合物可以具有多于一種的以上提到的特性和/或多于一種的以下提到的基序。示例性聚合物包括(羧甲基)纖維素(cmc)、聚(乙烯醇)(pva)、聚(乙烯吡咯烷酮)(pvp)、聚(乙二醇)或聚(環(huán)氧乙烷)(peg)、乙氧基化的聚(亞乙基亞胺)、羧甲基菊粉(cmi)、和聚羧化物，例如paa、paa/pma、聚-天冬氨酸、和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物、疏水修飾cmc(hm-cmc)和硅酮、對(duì)苯二甲酸和低聚乙二醇的共聚物、聚(對(duì)苯二甲酸乙二酯)和聚(氧乙烯對(duì)苯二甲酸乙二酯)的共聚物(pet-poet)、pvp、聚(乙烯基咪唑)(pvi)、聚(乙烯吡啶-n-氧化物)(pvpo或pvpno)以及聚乙烯吡咯烷酮-乙烯基咪唑(pvpvi)。另外的示例性聚合物包括磺化的聚羧酸酯、聚環(huán)氧乙烷和聚環(huán)氧丙烷(peo-ppo)以及乙氧基硫酸二季銨鹽。其他示例性聚合物披露于例如wo2006/130575中。也考慮了以上提到的聚合物的鹽。本發(fā)明的清潔組合物還可以包括織物調(diào)色劑，例如染料或色素，當(dāng)配制在洗滌劑組合物中時(shí)，當(dāng)該織物與一種洗滌液接觸時(shí)織物調(diào)色劑可以沉積在織物上，該洗滌液包括該洗滌劑組合物，并且因此通過可見光的吸收/反射改變?cè)摽椢锏纳?。熒光增白劑發(fā)射至少一些可見光。相比之下，因?yàn)樗鼈兾罩辽僖徊糠挚梢姽夤庾V，所以織物調(diào)色劑改變表面的色彩。適合的織物調(diào)色劑包括染料和染料-粘土軛合物，并且還可以包括色素。適合的染料包括小分子染料和聚合物染料。適合的小分子染料包括選自下組的小分子染料，該組由落入顏色索引(colourindex)(c.i.)分類的以下染料組成：直接藍(lán)、直接紅、直接紫、酸性藍(lán)、酸性紅、酸性紫、堿性藍(lán)、堿性紫和堿性紅或其混合物，例如如描述于wo2005/003274、wo2005/003275、wo2005/003276以及ep1876226(通過引用而特此結(jié)合)中。該洗滌劑組合物優(yōu)選包括從約0.00003wt％至約0.2wt％、從約0.00008wt％至約0.05wt％、或甚至從約0.0001wt％至約0.04wt％的織物調(diào)色劑。該組合物可以包括從0.0001wt％至0.2wt％的織物調(diào)色劑，當(dāng)該組合物處于單位劑量袋的形式時(shí)，這可以是尤其優(yōu)選的。適合的調(diào)色劑還披露于例如wo2007/087257和wo2007/087243中。
根據(jù)本發(fā)明的清潔組合物可以包括一種或多種(另外的)酶，如淀粉酶、過水解酶、阿拉伯糖酶、糖酶、纖維素酶(例如內(nèi)切葡聚糖酶)、角質(zhì)酶、半乳聚糖酶、鹵代過氧合酶、脂肪酶、甘露聚糖酶，氧化酶，例如漆酶和/或過氧化物酶，果膠酶、果膠裂解酶、蛋白酶、dna酶、木聚糖酶、黃原膠酶、和木葡聚糖酶。
一般而言，一種或多種所選酶的特性應(yīng)與洗滌劑相容(即，最適ph，與其他酶和非酶成分的相容性，等)，并且該一種或多種酶應(yīng)以有效量存在。
適合的纖維素酶包括細(xì)菌或真菌來源的那些。包括化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程化的突變體。適合的纖維素酶包括來自芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、腐質(zhì)霉屬、鐮孢屬、梭孢殼菌屬、支頂孢屬的纖維素酶，例如披露于us4,435,307、us5,648,263、us5,691,178、us5,776,757以及wo89/09259中的由特異腐質(zhì)霉、嗜熱毀絲霉和尖孢鐮孢菌產(chǎn)生的真菌纖維素酶。
尤其適合的纖維素酶是具有顏色護(hù)理益處的堿性或中性纖維素酶?？缮藤彽睦w維素酶包括celluzymetm、和carezymetm(諾維信公司(novozymesa/s))、clazinasetm、和puradaxhatm(杰能科國際有限公司(genencorinternationalinc.))、以及kac-500(b)tm(花王株式會(huì)社(kaocorporation))。
該組合物可以包括一種或多種另外的蛋白酶，這些蛋白酶包括細(xì)菌、真菌、植物、病毒或動(dòng)物來源的那些，例如植物或微生物來源。優(yōu)選微生物來源的。包括化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程化的突變體。它可以是堿性蛋白酶，例如絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶。絲氨酸蛋白酶可以例如是s1家族(如胰蛋白酶)或s8家族(如枯草桿菌蛋白酶)。金屬蛋白酶可以例如是來自例如家族m4的嗜熱菌蛋白酶或其他金屬蛋白酶，如來自m5、m7或m8家族的那些。
金屬蛋白酶的實(shí)例是如描述于wo2007/044993(杰能科國際公司(genencorint.))中的中性金屬蛋白酶，如來源于解淀粉芽孢桿菌的那些。
適合的可商購蛋白酶包括以下列商品名出售的那些：
適合的脂肪酶和角質(zhì)酶包括細(xì)菌來源或真菌來源的那些。包括化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程化的突變酶。實(shí)例包括來自嗜熱真菌屬的脂肪酶，例如，如描述于ep258068和ep305216中的來自疏綿狀嗜熱絲孢菌(早先命名為疏棉狀腐質(zhì)霉)；來自腐質(zhì)霉屬的角質(zhì)酶，例如特異腐質(zhì)霉(wo96/13580)；來自假單胞菌屬的菌株的脂肪酶(這些中的一些現(xiàn)在改名為伯克霍爾氏菌屬)，例如產(chǎn)堿假單胞菌或類產(chǎn)堿假單胞菌(ep218272)、洋蔥假單胞菌(ep331376)、假單胞菌屬菌株sd705(wo95/06720&wo96/27002)、威斯康星假單胞菌(p.wisconsinensis)(wo96/12012)；gdsl-型鏈霉菌屬脂肪酶(wo2010/065455)；來自稻瘟病菌的角質(zhì)酶(wo2010/107560)；來自門多薩假單胞菌的角質(zhì)酶(us5,389,536)；來自褐色嗜熱裂孢菌(thermobifidafusca)的脂肪酶(wo2011/084412)；嗜熱脂肪土芽孢桿菌脂肪酶(wo2011/084417)；來自枯草芽孢桿菌的脂肪酶(wo2011/084599)；以及來自灰色鏈霉菌(wo2011/150157)和始旋鏈霉菌(s.pristinaespiralis)的脂肪酶(wo2012/137147)。優(yōu)選的商業(yè)化脂肪酶產(chǎn)品包括lipolasetm、lipextm；lipolextm和lipocleantm(諾維信公司)，lumafast(來自杰能科公司(genencor))以及l(fā)ipomax(來自吉斯特-博克德斯公司(gist-brocades))。
再其他實(shí)例是有時(shí)稱為?；D(zhuǎn)移酶或過水解酶的脂肪酶，例如與南極假絲酵母(candidaantarctica)脂肪酶a具有同源性的?；D(zhuǎn)移酶(wo2010/111143)、來自恥垢分枝桿菌(mycobacteriumsmegmatis)的酰基轉(zhuǎn)移酶(wo2005/056782)、來自ce7家族的過水解酶(wo2009/067279)以及恥垢分枝桿菌過水解酶的變體(尤其是來自亨斯邁紡織品染化有限公司(huntsmantextileeffectspteltd)的商業(yè)產(chǎn)品gentlepowerbleach中所用的s54v變體)(wo2010/100028)。
適合的淀粉酶可以是α-淀粉酶或葡糖淀粉酶并且可以是細(xì)菌或真菌來源的。包括化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程化的突變體。可商購的淀粉酶是duramyltm、特妙淀粉酶tm、fungamyltm、stainzymetm、stainzymeplustm、natalasetm、liquozymex及bantm(來自諾維信公司)，以及rapidasetm、purastartm/effectenztm、powerase、preferenzs1000、preferenzs100及preferenzs110(來自杰能科國際有限公司/杜邦公司(genencorinternationalinc./dupont))。
適合的過氧化物酶/氧化酶包括植物、細(xì)菌或真菌來源的那些。包括化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程化的突變體。有用的過氧化物酶的實(shí)例包括來自鬼傘屬，例如來自灰蓋鬼傘的過氧化物酶，及其變體，如在wo93/24618、wo95/10602、以及wo98/15257中描述的那些。
可商購的過氧化物酶包括guardzymetm(諾維信公司)。
該一種或多種洗滌劑酶可以通過添加包括一種或多種酶的獨(dú)立添加劑，或通過添加包括所有這些酶的組合添加劑而被包括于清潔組合物中。本發(fā)明的洗滌劑添加劑，即單獨(dú)的或組合的添加劑，可以配制成例如顆粒、液體、漿液等，優(yōu)選的洗滌劑添加劑劑型為顆粒，尤其是無粉塵顆粒；液體，尤其是穩(wěn)定化液體；或者漿液。
還可以利用本領(lǐng)域中已知的用于在衣物洗滌清潔組合物中使用的任何洗滌劑組分。其他任選的洗滌劑組分包括防腐劑、防縮劑、抗污垢再沉積劑、抗皺劑、殺細(xì)菌劑、粘合劑、腐蝕抑制劑、崩解劑(disintegrant)/崩解試劑(disintegrationagent)、染料、酶穩(wěn)定劑(包括硼酸、硼酸鹽、cmc和/或多元醇如丙二醇)、織物整理劑(包括粘土)、填充劑/加工助劑、熒光增白劑/光學(xué)增亮劑、增泡劑、泡沫(泡)調(diào)節(jié)劑、香料、污垢助懸劑、軟化劑、抑泡劑、晦暗抑制劑以及芯吸劑，單獨(dú)抑或組合使用?？梢岳帽绢I(lǐng)域中已知的用于在衣物洗滌劑中使用的任何成分。此類成分的選擇完全在普通技術(shù)人員的技術(shù)范圍內(nèi)。
本發(fā)明的清潔組合物還可以包含分散劑。適合的水溶性有機(jī)材料包括均聚合或共聚合的酸或其鹽，其中聚羧酸包括至少兩個(gè)羧基，這兩個(gè)羧基被不多于兩個(gè)碳原子彼此分開。適合的分散劑例如描述于粉末洗滌劑，表面活性劑科學(xué)系列(surfactantscienceseries)，第71卷中，馬塞爾·德克爾公司(marceldekker)。
本發(fā)明的清潔組合物還可以包括一種或多種染料轉(zhuǎn)移抑制劑。適合的聚合物染料轉(zhuǎn)移抑制劑包括但不局限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺n-氧化物聚合物、n-乙烯吡咯烷酮和n-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮和聚乙烯咪唑或其混合物。當(dāng)存在于主題組合物中時(shí)，染料轉(zhuǎn)移抑制劑可以按組合物重量計(jì)的以下水平存在：從約0.0001％至約10％、從約0.01％至約5％或甚至從約0.1％至約3％。
本發(fā)明的清潔組合物還將優(yōu)選地包含另外的組分，這些組分可以給正在清潔的物品著色，例如熒光增白劑或光學(xué)增亮劑。其中增亮劑優(yōu)選以約0.01％至約05％的水平存在。在本發(fā)明的組合物中可以使用適合用于在衣物洗滌洗滌劑組合物中使用的任何熒光增白劑。最常用的熒光增白劑是屬于以下類別的那些：二氨芪-磺酸衍生物、二芳基吡唑啉衍生物和二苯基-聯(lián)苯乙烯基衍生物。熒光增白劑的二氨芪-磺酸衍生物型的實(shí)例包括以下各項(xiàng)的鈉鹽：4,4'-雙-(2-二乙醇氨基-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸鹽；4,4'-雙-(2,4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2.2'-二磺酸鹽；4,4'-雙-(2-苯胺基-4(n-甲基-n-2-羥基-乙氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸鹽，4,4'-雙-(4-苯基-2,1,3-三唑-2-基)芪-2,2'-二磺酸鹽；4,4'-雙-(2-苯胺基-4(1-甲基-2-羥基-乙氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸鹽和2-(二苯乙烯基-4"-萘-1.,2':4,5)-1,2,3-三唑-2"-磺酸鹽。優(yōu)選的熒光增白劑是可從汽巴-嘉基股份有限公司(ciba-geigyag)(巴塞爾，瑞士)獲得的天來寶(tinopal)dms和天來寶cbs。天來寶dms是4,4'-雙-(2-嗎啉基-4苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪二磺酸鹽的二鈉鹽。天來寶cbs是2,2'-雙-(苯基-苯乙烯基)二磺酸鹽的二鈉鹽。還優(yōu)選熒光增白劑，是可商購的parawhitekx，由派拉蒙礦物與化學(xué)(paramountmineralsandchemicals)，孟買，印度供應(yīng)。適合用于本發(fā)明的其他熒光劑包括1-3-二芳基吡唑啉和7-氨烷基香豆素。適合的熒光增白劑水平包括從約0.01wt％、從0.05wt％、從約0.1wt％或甚至從約0.2wt％的較低水平至0.5wt％或甚至0.75wt％的較高水平。
本發(fā)明的清潔組合物還可以包括一種或多種污垢釋放聚合物，這些聚合物幫助從織物(如棉布和基于聚酯的織物)移除污垢，特別是從基于聚酯的織物去除疏水性污垢。污垢釋放聚合物可以例如是基于非離子型或陰離子型對(duì)苯二甲酸的聚合物、聚乙烯基己內(nèi)酰胺和相關(guān)共聚物、乙烯基接枝共聚物、聚酯聚酰胺，參見例如粉末洗滌劑(powdereddetergents)，表面活性劑科學(xué)系列(surfactantscienceseries)第71卷第7章，馬塞爾·德克爾公司(marceldekker，inc.)。另一種類型的污垢釋放聚合物是包括核心結(jié)構(gòu)和連接至該核心結(jié)構(gòu)的多個(gè)烷氧基化基團(tuán)的兩親性烷氧基化油污清潔聚合物。核心結(jié)構(gòu)可以包括聚烷基亞胺結(jié)構(gòu)或聚烷醇胺結(jié)構(gòu)，如wo2009/087523中詳細(xì)描述的(將其通過引用而特此結(jié)合)。此外，任意接枝共聚物是適合的污物釋放聚合物。適合的接枝共聚物更詳細(xì)地描述于wo2007/138054、wo2006/108856以及wo2006/113314中(將其通過引用而特此結(jié)合)。其他污垢釋放聚合物是取代的多糖結(jié)構(gòu)，尤其是取代的纖維素結(jié)構(gòu)，例如改性纖維素衍生物，例如ep1867808或wo03/040279中描述的那些(將二者都通過引用而特此結(jié)合)。適合的纖維素聚合物包括纖維素、纖維素醚、纖維素酯、纖維素酰胺及其混合物。適合的纖維素聚合物包括陰離子修飾的纖維素、非離子修飾的纖維素、陽離子修飾的纖維素、兼性離子修飾的纖維素及其混合物。適合的纖維素聚合物包括甲基纖維素、羧甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、酯羧甲基纖維素及其混合物。
本發(fā)明的清潔組合物還可以包括一種或多種抗再沉積劑，例如羧甲基纖維素(cmc)、聚乙烯醇(pva)、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、聚氧乙烯和/或聚乙二醇(peg)、丙烯酸的均聚物、丙烯酸和馬來酸的共聚物、和乙氧基化的聚乙亞胺。以上在污物釋放聚合物下描述的基于纖維素的聚合物的功能還可以是抗再沉積劑。
其他適合的輔料包括但不限于防縮劑、抗皺劑、殺細(xì)菌劑、粘合劑、載體、染料、酶穩(wěn)定劑、織物柔軟劑、填充劑、泡沫調(diào)節(jié)劑、助水溶劑、香料、色素、抑泡劑、溶劑以及用于液體洗滌劑的結(jié)構(gòu)劑和/或結(jié)構(gòu)彈性劑。
本發(fā)明的清潔組合物可以配制成袋，這些袋可以被配置為單一隔室或多隔室。它可以具有適合保存該組合物的任何形式、形狀和材料，例如在與水接觸之前，不允許該組合物從袋中釋放出來。袋由封裝內(nèi)體積的水溶性膜制成。該內(nèi)部體積可以被分成袋的區(qū)室。優(yōu)選的膜是形成膜或片的聚合材料，優(yōu)選是聚合物。優(yōu)選的聚合物、共聚物或其衍生物選自聚丙烯酸酯、和水溶性丙烯酸酯共聚物、甲基纖維素、羧甲基纖維素、糊精鈉、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、麥芽糊精、聚甲基丙烯酸酯，最優(yōu)選的是聚乙烯醇共聚物以及羥丙基甲基纖維素(hpmc)。優(yōu)選地，聚合物在膜例如pva中的水平是至少約60％。優(yōu)選的平均分子量將典型地是約20,000至約150,000。膜還可以是共混物組合物，該共混物組合物包括可水解降解并且水可溶的聚合物共混物，例如聚乳酸和聚乙烯醇(已知在貿(mào)易參考m8630下，如由美國印第安納州蓋里(gary,indiana,us)的克里斯克拉夫特工業(yè)產(chǎn)品公司(chriscraftin.prod.)銷售)加增塑劑，像甘油、乙二醇、丙二醇、山梨醇及其混合物。這些袋可以包括固體衣物洗滌洗滌劑組合物或部分組分和/或液體清潔組合物或由水溶性膜分開的部分組分。用于液體組分的室在組成上可以與包含固體的室不同。參見例如us2009/0011970。
可以由水可溶的袋中或片劑的不同層中的室來將洗滌劑成分物理地彼此分開。因此，可以避免組分間的不良的存儲(chǔ)相互作用。在洗滌溶液中，每個(gè)室的不同溶解曲線還可以引起選擇的組分的延遲溶解。
本發(fā)明還針對(duì)根據(jù)本發(fā)明的清潔組合物在紡織品和織物洗滌中的使用方法，如家用衣物洗滌以及工業(yè)衣物洗滌。此類方法包括在清潔硬表面如地板、桌子、墻壁、屋頂?shù)龋B同硬物體的表面如汽車(汽車洗滌)和餐具(餐具洗滌)中使用根據(jù)本發(fā)明的組合物或其組合物的方法。
可以將本發(fā)明的蛋白酶變體添加至根據(jù)本發(fā)明的高ph清潔組合物中并且因此使其成為該高ph清潔組合物的組分。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及蛋白酶變體在高ph清潔過程如在ph為10或高于ph10下的衣物洗滌和/或硬表面清潔中的用途。
本發(fā)明的清潔組合物可以配制為(例如)手洗或機(jī)洗衣物洗滌洗滌劑組合物，包括適用于預(yù)處理有污跡的織物的衣物洗滌添加劑組合物，和漂洗添加的織物軟化劑組合物，或配制為用于一般家用硬表面清潔操作的洗滌劑組合物，或配制用于手洗或機(jī)洗餐具洗滌操作。
清潔過程或者紡織品護(hù)理過程可以例如是衣物洗滌過程、餐具洗滌過程或硬表面(如浴室瓷磚、地板、桌面、排水管、水槽以及臉盆)清潔。衣物洗滌過程可以例如是家用衣物洗滌，但是它也可以是工業(yè)衣物洗滌。此外，本發(fā)明涉及一種用于洗滌織物和/或服裝的方法，其中該方法包括用包含根據(jù)本發(fā)明的高ph清潔組合物和本發(fā)明的至少一種蛋白酶變體的洗滌溶液處理織物。清潔過程或紡織品護(hù)理過程可以是例如以機(jī)器洗滌過程或以手洗過程或以預(yù)去漬劑(pre-spotter)過程進(jìn)行的。洗滌溶液可以例如是包含清潔組合物的水洗溶液。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及本發(fā)明的清潔組合物在蛋白質(zhì)污漬去除過程中的用途。蛋白質(zhì)污漬可能是如食品污漬等污漬，如嬰兒食品、皮脂、可可、雞蛋、血液、牛奶、墨水、草、或其組合。
優(yōu)選實(shí)施例涉及清潔方法，該方法包括在適合于清潔物體的條件下將該物體與包括本發(fā)明的蛋白酶變體的高ph清潔組合物接觸的步驟。在優(yōu)選實(shí)施例中，該清潔組合物用于衣物或餐具洗滌過程中。
仍另一個(gè)實(shí)施例涉及用于從織物或餐具上去除污漬的方法，該方法包括在適合于清潔該物體的條件下將該織物或餐具與包括本發(fā)明的蛋白酶的高ph清潔組合物接觸。
還考慮了使用本發(fā)明的清潔組合物處理織物(例如，使紡織品脫漿)的組合物和方法?？梢栽谌魏慰椢锾幚矸椒ㄖ惺褂酶遬h清潔組合物，這些方法在本領(lǐng)域是熟知的(參見，例如，us6,077,316)。例如，在一方面，通過一種方法改進(jìn)織物的觸感和外觀，該方法包括將該織物與溶液中的蛋白酶接觸。在一方面，在壓力下用該溶液處理該織物。
本發(fā)明的高ph清潔組合物適合用于在液體衣物洗滌和液體硬表面應(yīng)用(包括餐具洗滌和汽車洗滌)中使用。因此，本發(fā)明包括用于洗滌織物或洗滌硬表面的方法。該方法包括使有待清潔的織物/餐具與包括根據(jù)本發(fā)明的高ph清潔組合物的溶液接觸的步驟?？椢锟梢园軌蛟诔Ｒ?guī)消費(fèi)者使用條件下被洗滌的任何織物。硬表面可以包括任何餐具，如陶器、刀具、陶瓷、塑料(如三聚氰胺)、金屬、瓷器、玻璃、丙烯酸樹脂或其他硬表面(如汽車、地板等)。該溶液優(yōu)選具有從約9至約13.5的ph?？稍谌芤褐邪匆韵聺舛仁褂媒M合物：從約100ppm，優(yōu)選500ppm至約15,000ppm。水溫范圍典型地是從約5℃至約95℃，包括約10℃、約15℃、約20℃、約25℃、約30℃、約35℃、約40℃、約45℃、約50℃、約55℃、約60℃、約65℃、約70℃、約75℃、約80℃、約85℃和約90℃。水與織物之比典型地是從約1:1至約30:1。
在一些優(yōu)選實(shí)施例中，在此提供的這些高ph清潔組合物被典型地這樣配制，使得用于水性清潔操作過程中，洗滌水具有以下ph：從約9至約13.5，或在替代性實(shí)施例中，或從約10至約13.5，甚至從約11至約13.5。在一些優(yōu)選實(shí)施例中，液體衣物洗滌產(chǎn)品被配制成具有從約12至約13.5的ph。用于將ph控制在推薦的使用水平的技術(shù)包括使用緩沖劑、酸、堿等，并且是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟知的。在本發(fā)明的上下文中，使用堿將ph調(diào)節(jié)至約9至13.5，優(yōu)選約10至13.5。
在下面各段中對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了進(jìn)一步的概述：
1.一種具有ph為10或更高的液體清潔組合物，包括：
(a)至少0.01wt％的蛋白酶，其中該蛋白酶是親本蛋白酶的變體，并且其中該蛋白酶變體具有與seqidno:2的氨基酸序列具有至少60％序列一致性的氨基酸序列，并且其中所述蛋白酶變體的特征在于當(dāng)在40℃下在具有ph為10的液體洗滌劑中4小時(shí)后進(jìn)行測(cè)量時(shí)，具有比親本蛋白酶高至少10％的殘留活性
(b)任選地，蛋白酶抑制劑，優(yōu)選所述蛋白酶抑制劑是肽醛蛋白酶抑制劑。
2.一種液體清潔組合物，包括：
(a)從20％至95％wt，優(yōu)選從40％至95％wt，進(jìn)一步優(yōu)選從約70％至約90％wt的水；
(b)至少0.01wt％的蛋白酶，其中該蛋白酶是親本蛋白酶的變體，并且其中該蛋白酶變體具有與seqidno:2的氨基酸序列具有至少60％序列一致性的氨基酸序列，并且其中所述蛋白酶變體的特征在于當(dāng)在40℃下在具有ph為7.5或更高、優(yōu)選10的液體洗滌劑中4小時(shí)后進(jìn)行測(cè)量時(shí)，具有比親本蛋白酶高至少10％的殘留活性；
(c)任選地，蛋白酶抑制劑，優(yōu)選所述蛋白酶抑制劑是肽醛蛋白酶抑制劑。
3.如段落1所述的液體清潔組合物，其中所述ph為從約12至13.5。
4.如段落1-3中任一項(xiàng)所述的液體清潔組合物，其中該蛋白酶是與seqidno:2的氨基酸序列具有至少60％一致性的蛋白酶的變體，其中所述變體包括在一個(gè)或多個(gè)位置的取代，這些位置選自對(duì)應(yīng)于bpn'(seqidno:1)的位置3、9、18、43、49、61、76、115、120、182、185、188、194、205、206、209、216、217、218、222、255、256、259、260、261和262的位置。
5.如段落1-4中任一項(xiàng)所述的液體清潔組合物，其中該蛋白酶是與seqidno:2的氨基酸序列具有至少60％一致性的蛋白酶的變體，其中所述變體包括一個(gè)或多個(gè)取代，這些取代對(duì)應(yīng)于bpn’(seqidno:1)的取代x3v、x9d、x9e、x18s、x43r、x43k、x49t、x61d、x76d、x115w、x120t、x120v、x120d、x182d、x182e、x185e、x185d、x188e、x188d、x194p、x205i、x206l、x209w、x216v、x217m、x218t、x222s、x255e、x255d、x256d、x256e、x259d、x259e、x260a、x260e、x260d、x261m、x261w、x262e和x262d。
6.如段落1-5中任一項(xiàng)所述的液體清潔組合物，其中該變體包括一個(gè)或多個(gè)取代，這些取代對(duì)應(yīng)于取代x209w、x262e、x76d、x194p、x204d、x206l。
7.根據(jù)前述段落中任一項(xiàng)所述的液體清潔組合物，其中該變體具有以下氨基酸序列，該氨基酸序列與seqidno:2至少60％一致，例如與seqidno:2的氨基酸序列具有至少60％，如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％序列一致性。
8.根據(jù)前述段落中任一項(xiàng)所述的液體清潔組合物，其中所述蛋白酶變體在40℃下具有大于至少一種穩(wěn)定的蛋白酶變體的儲(chǔ)存穩(wěn)定性，該至少一種穩(wěn)定的蛋白酶變體選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：
s9e+n43r+n76d+g115w+h120v+a194p+q206l+s259d+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+q182e+a194p+v205i+q206l+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+y209w+s216v+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+q206l+s256d+s259d+n261w+l262e；
s9e+n18s+n43r+n76d+g115w+h120v+a194p+q206l+s259d+l262e；
s9e+n43r+n76d+g115w+h120v+a194p+q206l+s259d+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+q206l+y209w+s259d+n261w+l262es9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+q182e+a194p+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+y209w+s216v+l262e；
s9e+n76d+g115w+g160p+q182e+v205i+q206l+y209w+s256d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+q206l+s256d+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+y209w+s216v+l262e；
s9e+n76d+q182e+v205i+q206l+y209w+s256d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+s259d+n261w+l262e；
s9e+n76d+v205i+q206l+y209w+s256d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+s259d+n261w+l262e+*275ah；
s9e+n43r+n76d+n185e+s188e+a194p+q206l+y209w+s259d+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+y209w+s216v+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+y209w+s216v+l262e；
s9e+n43r+i72a+n76d+a194p+q206l+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+l262e。
9.根據(jù)前述段落中任一項(xiàng)所述的液體清潔組合物，其中所述蛋白酶變體選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：
s9e+n43r+g61e+n76d+g115w+h120v+a194p+q206l+s259d+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+q182e+a194p+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+y209w+s216v+m222s+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+s256d+s259d+n261w+l262e；
s9e+n18s+n43r+n76d+g115w+h120v+a194p+v205i+q206l+s259d+l262e；
s9e+n43r+n76d+g115w+h120v+a194p+v205i+q206l+s259d+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+s256d+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+q182e+a194p+v205i+q206l+y209w+s256d+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+s188e+a194p+v205i+q206l+y209w+s216v+l262e；
s9e+n76d+g115w+g160p+q182e+v205i+q206l+y209w+s256d+t260e+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+h120t+a194p+q206l+s256d+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+h120t+a194p+v205i+q206l+y209w+s216v+l262e；
s9e+n76d+g160p+q182e+v205i+q206l+y209w+s256d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+q182e+a194p+v205i+q206l+s259d+n261w+l262e；
s9e+n76d+q182e+v205i+q206l+y209w+s256d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+q182e+a194p+v205i+q206l+s259d+n261w+l262e+*275ah；
s9e+n43r+n76d+q182e+n185e+s188e+a194p+q206l+y209w+s259d+l262e；
s9e+n43r+n76d+n185e+a194p+v205i+q206l+y209w+s216v+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+y209w+s216v+n261m+l262e；
s9e+n43r+i72a+n76d+a194p+q206l+s259d+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+s259d+l262e；
s9e+n43r+n76d+h120v+q182e+a194p+v205i+q206l+y209w+s256d+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+q182e+a194p+v205i+q206l+y209w+s256d+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+h120v+q182e+a194p+v205i+q206l+y209w+s256d+n261w+l262e+*275ah+*275bh；
s3v+n76d+h120v+q182e+n185e+s188e+v205i+q206l+y209w+s216v+s256d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a158e+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+s212g+s216v+l262e；
s9e+n43r+n76d+a158e+g160p+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a158e+g160p+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+s212g+s216v+l262e；
s9e+n43r+n76d+a158e+g160p+s161e+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+s216v+l262e+*275ah+*275bh；
s9e+n43r+n76d+a158e+g160p+s161e+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a158e+g160p+s161e+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+s212g+s216v+l262e+*275ah+*275bh；
s9e+n43r+n76d+a158e+g160p+s161e+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+s212g+l262e；
s9e+n43r+n76d+a158e+a194p+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a158e+g160p+s161e+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+s212g+l262e+*275ah+*275bh；
s9e+n43r+n76d+a158e+g160p+s161e+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+s216v+l262e；
s9e+n43r+n76d+a158e+g160p+s161e+a194p+q206l+y209w+s259d+l262e+*275ah+*275bh；
s9e+n43r+n76d+a158e+g160p+s161e+a194p+v205i+q206l+y209w+s212g+s216v+l262e；
s9e+n43r+n76d+a158e+s161e+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a158e+g160p+s161e+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a158e+s161e+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+s212g+s216v+l262e；
s9e+n43r+n76d+g160p+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+s212g+s216v+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+q206l+y209w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+q206l+y209w+s256d+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+q206l+y209w+t255e+s256d+s259d+t260e+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+g115w+h120v+a194p+q206l+y209w+s259d+l262e；
s9e+n43r+n76d+g115w+h120v+p129d+a194p+q206l+y209w+s259d+l262e；
s9e+n43r+n76d+g160p+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+s212g+s216v+l262e；
s9e+n43r+n76d+g160p+s161e+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+s212g+s216v+l262e；
s9e+n43r+n76d+g160p+s161e+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+s212g+s216v+l262e+*275ah+*275bh；
s9e+n43r+n76d+n204d+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+g160p+s161e+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+h120v+q182e+a194p+v205i+q206l+y209w+s256d+n261w+l262e+*275ah+*275bh；
s9e+n43r+n76d+v205i+q206l+y209w+s216v+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+s161e+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+p131*+a194p+q206l+y209w+s259d+l262e；
s9e+n43r+n76d+h120v+q182e+a194p+v205i+q206l+y209w+s256d+n261w+l262e+*275ah+*275bh；
s9e+n43r+n76d+s161e+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+s212g+s216v+l262e+*275ah+*275bh；
s9e+n43r+n76d+v205i+q206l+y209w+s212g+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+n204d+v205i+q206l+y209w+s212g+s216v+s259d+n261w+l262e。
10.一種液體清潔組合物，包括：
(a)從0％至20％wt，優(yōu)選0.1％至2.5％wt的洗滌劑表面活性劑；
(b)從0.001％至10％wt，優(yōu)選0.1％至5％wt的蛋白酶變體；以及
(c1)從20％至95％wt，優(yōu)選從40％至95％wt，進(jìn)一步優(yōu)選從約70％至約90％wt的水；和/或
(c2)從1％至30％wt的堿性緩沖液系統(tǒng)，該堿性緩沖液系統(tǒng)包括堿金屬硅酸鹽或堿金屬氫氧化物或其混合物，以提供約7.5至13.5的ph，優(yōu)選ph為從約12至13.5；
(d)任選地，蛋白酶抑制劑，優(yōu)選所述蛋白酶抑制劑是肽醛蛋白酶抑制劑。
11.如段落10所述的液體清潔組合物，其中該蛋白酶變體包括在一個(gè)或多個(gè)位置處的取代，這些位置選自對(duì)應(yīng)于bpn'(seqidno:1)的位置3、9、18、43、49、61、76、115、120、182、185、188、194、205、206、209、216、217、218、222、255、256、259、260、261和262的位置。
12.根據(jù)段落11所述的液體清潔組合物，其中該蛋白酶變體包括一個(gè)或多個(gè)取代，這些取代對(duì)應(yīng)于bpn’(seqidno:1)的取代x3v、x9d、x9e、x18s、x43r、x43k、x49t、x61d、x76d、x115w、x120t、x120v、x120d、x182d、x182e、x185e、x185d、x188e、x188d、x194p、x205i、x206l、x209w、x216v、x217m、x218t、x222s、x255e、x255d、x256d、x256e、x259d、x259e、x260a、x260e、x260d、x261m、x261w、x262e和x262d。
13.根據(jù)段落10至12中任一項(xiàng)所述的液體清潔組合物，其中該蛋白酶變體與seqidno:2的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、但小于100％的序列一致性。
14.根據(jù)段落10-13中任一項(xiàng)所述的液體清潔組合物，其中所述蛋白酶變體選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：
s9e+n43r+g61e+n76d+g115w+h120v+a194p+q206l+s259d+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+q182e+a194p+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+y209w+s216v+m222s+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+s256d+s259d+n261w+l262e；
s9e+n18s+n43r+n76d+g115w+h120v+a194p+v205i+q206l+s259d+l262e；
s9e+n43r+n76d+g115w+h120v+a194p+v205i+q206l+s259d+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+s256d+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+q182e+a194p+v205i+q206l+y209w+s256d+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+s188e+a194p+v205i+q206l+y209w+s216v+l262e；
s9e+n76d+g115w+g160p+q182e+v205i+q206l+y209w+s256d+t260e+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+h120t+a194p+q206l+s256d+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+h120t+a194p+v205i+q206l+y209w+s216v+l262e；
s9e+n76d+g160p+q182e+v205i+q206l+y209w+s256d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+q182e+a194p+v205i+q206l+s259d+n261w+l262e；
s9e+n76d+q182e+v205i+q206l+y209w+s256d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+q182e+a194p+v205i+q206l+s259d+n261w+l262e+*275ah；
s9e+n43r+n76d+q182e+n185e+s188e+a194p+q206l+y209w+s259d+l262e；
s9e+n43r+n76d+n185e+a194p+v205i+q206l+y209w+s216v+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+y209w+s216v+n261m+l262e；
s9e+n43r+i72a+n76d+a194p+q206l+s259d+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+s259d+l262e；
s9e+n43r+n76d+h120v+q182e+a194p+v205i+q206l+y209w+s256d+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+q182e+a194p+v205i+q206l+y209w+s256d+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+h120v+q182e+a194p+v205i+q206l+y209w+s256d+n261w+l262e+*275ah+*275bh；
s3v+n76d+h120v+q182e+n185e+s188e+v205i+q206l+y209w+s216v+s256d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a158e+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+s212g+s216v+l262e；
s9e+n43r+n76d+a158e+g160p+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a158e+g160p+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+s212g+s216v+l262e；
s9e+n43r+n76d+a158e+g160p+s161e+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+s216v+l262e+*275ah+*275bh；
s9e+n43r+n76d+a158e+g160p+s161e+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a158e+g160p+s161e+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+s212g+s216v+l262e+*275ah+*275bh；
s9e+n43r+n76d+a158e+g160p+s161e+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+s212g+l262e；
s9e+n43r+n76d+a158e+a194p+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a158e+g160p+s161e+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+s212g+l262e+*275ah+*275bh；
s9e+n43r+n76d+a158e+g160p+s161e+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+s216v+l262e；
s9e+n43r+n76d+a158e+g160p+s161e+a194p+q206l+y209w+s259d+l262e+*275ah+*275bh；
s9e+n43r+n76d+a158e+g160p+s161e+a194p+v205i+q206l+y209w+s212g+s216v+l262e；
s9e+n43r+n76d+a158e+s161e+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a158e+g160p+s161e+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a158e+s161e+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+s212g+s216v+l262e；
s9e+n43r+n76d+g160p+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+s212g+s216v+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+q206l+y209w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+q206l+y209w+s256d+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+a194p+q206l+y209w+t255e+s256d+s259d+t260e+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+g115w+h120v+a194p+q206l+y209w+s259d+l262e；
s9e+n43r+n76d+g115w+h120v+p129d+a194p+q206l+y209w+s259d+l262e；
s9e+n43r+n76d+g160p+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+s212g+s216v+l262e；
s9e+n43r+n76d+g160p+s161e+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+s212g+s216v+l262e；
s9e+n43r+n76d+g160p+s161e+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+s212g+s216v+l262e+*275ah+*275bh；
s9e+n43r+n76d+n204d+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+g160p+s161e+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+h120v+q182e+a194p+v205i+q206l+y209w+s256d+n261w+l262e+*275ah+*275bh；
s9e+n43r+n76d+v205i+q206l+y209w+s216v+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+s161e+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+p131*+a194p+q206l+y209w+s259d+l262e；
s9e+n43r+n76d+h120v+q182e+a194p+v205i+q206l+y209w+s256d+n261w+l262e+*275ah+*275bh；
s9e+n43r+n76d+s161e+a194p+n204d+v205i+q206l+y209w+s212g+s216v+l262e+*275ah+*275bh；
s9e+n43r+n76d+v205i+q206l+y209w+s212g+s259d+n261w+l262e；
s9e+n43r+n76d+n204d+v205i+q206l+y209w+s212g+s216v+s259d+n261w+l262e。
15.根據(jù)前述段落中任一項(xiàng)所述的清潔組合物，該清潔組合物包括一種或多種選自下組的另外的酶，該組由以下各項(xiàng)組成：淀粉酶、過氧化氫酶、纖維素酶(例如內(nèi)切葡聚糖酶)、角質(zhì)酶、鹵代過氧合酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、果膠酶、果膠裂解酶、過氧化物酶、蛋白酶、黃原膠酶、和木葡聚糖酶、或其任何混合物。
16.如前述段落中任一項(xiàng)所述的液體清潔組合物在清潔過程如衣物洗滌或硬表面清潔，包括餐具洗滌和工業(yè)清潔中的用途。
17.如段落16所述的用途，其中該衣物洗滌過程選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：住宅衣物洗滌過程、工業(yè)衣物洗滌過程和公用衣物洗滌過程。
通過以下實(shí)例進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描述，但不應(yīng)將其理解為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。
實(shí)例
材料與方法
suc-aapf-pna活性測(cè)定
蛋白水解活性可以通過采用suc-aapf-pna作為底物的方法來確定。suc-aapf-pna是n-琥珀?；?丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-對(duì)硝基苯胺的縮寫，并且是可以通過內(nèi)切蛋白酶切割的一種封閉肽。在切割后，一個(gè)游離pna分子被釋放出來，它具有黃色顏色并且因此可以通過可見光分光光度法在波長405nm處進(jìn)行測(cè)量。該suc-aapf-pna底物由巴亨公司(bachem)(目錄號(hào)l1400，溶解于dmso中)來生產(chǎn)。
待分析的蛋白酶樣品被稀釋在殘留活性緩沖液(100mmtrisph8.6)中。通過轉(zhuǎn)移30μl的稀釋的酶樣品至96孔微量滴定板并添加70μl底物工作溶液(0.72mg/ml于100mmtrisph8.6中)進(jìn)行該測(cè)定。將該溶液在室溫混合并且在od405nm經(jīng)5分鐘每20秒測(cè)量吸收。
在一組給定條件下，時(shí)間相關(guān)吸收曲線的斜率(每分鐘的吸光度)與所討論的蛋白酶的活性成正比例。將蛋白酶樣品稀釋至其中斜率為線性的水平。
實(shí)例1：蛋白酶變體的制備和表達(dá)
下面總結(jié)了突變和表達(dá)盒到枯草芽孢桿菌的引入。所有dna操縱是通過pcr(例如薩姆布魯克(sambrook)等人；分子克隆(molecularcloning)；冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(coldspringharborlaboratorypress))進(jìn)行的。
使用編碼蛋白酶變體的重組枯草桿菌構(gòu)建體來接種包含富營養(yǎng)培養(yǎng)基(例如，100g/l蔗糖(丹尼斯克目錄號(hào)109-0429)、40g/l大豆殼(大豆粉)、10g/lna2hpo4.12h2o(默克(merck)目錄號(hào)6579)、0.1ml/l替換-dowfax63n10(陶氏化學(xué)(dow))的搖瓶中。典型地在30℃下在220rpm的振搖下進(jìn)行4天的培養(yǎng)。
實(shí)例2：蛋白酶變體的純化
將培養(yǎng)液以26000xg離心20分鐘，并且將上清液小心地與沉淀物潷析分開。上清液通過耐潔(nalgene)0.2μm過濾裝置過濾以便去除剩余芽孢桿菌宿主細(xì)胞。用3mtris堿將0.2μm濾液中的ph調(diào)節(jié)至ph8，并將經(jīng)ph調(diào)節(jié)的濾液施加至在20mmtris/hcl、1mmcacl2(ph8.0)中平衡的mephypercel柱(頗爾公司(pallcorporation))上。將柱用平衡緩沖液洗滌后，將該柱用20mmch3cooh/naoh、1mmcacl2(ph4.5)逐步洗脫。使用在ph9下的suc-aapf-pna測(cè)定將來自柱的級(jí)分針對(duì)蛋白酶活性進(jìn)行分析，并且合并峰級(jí)分。將來自該mephypercel柱的合并物的ph用20％(v/v)ch3cooh或3mtris堿調(diào)節(jié)至ph6，并且將經(jīng)ph調(diào)節(jié)的合并物用去離子水稀釋至與20mmmes/naoh、2mmcacl2(ph6.0)相同的電導(dǎo)率。將經(jīng)稀釋的合并物施加至在20mmmes/naoh、2mmcacl2(ph6.0)中平衡的sp-瓊脂糖(sepharose)
實(shí)例3：加速儲(chǔ)存穩(wěn)定性測(cè)定
在升高的溫度下孵育長達(dá)24小時(shí)的情況下，使用加速測(cè)定評(píng)估蛋白酶變體在液體洗滌劑中的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。
基于280nm處的吸光度和理論消光系數(shù)，使用0.01％tritonx-100將所有純化的蛋白酶樣品稀釋至0.2和0.1mg/ml的濃度。針對(duì)每個(gè)變體，包括具有高蛋白酶濃度的2個(gè)孔和具有低濃度的2個(gè)孔。作為參照，在每個(gè)微量滴定板上包括savinase(seqidno2)或經(jīng)穩(wěn)定的蛋白酶變體。使用磁棒(在zephyr移液臺(tái)(caliperlifesciences公司)上持續(xù)30min)，將30μl蛋白酶樣品與270μl洗滌劑(瑟夫(surf)閃閃發(fā)光的海洋(sparklingocean)，dc-2014-0009)在微量滴定板(nuncu96pp0.5ml)的孔中混合。然后將20μl的這種混合物轉(zhuǎn)移至另一個(gè)微量滴定板(加有磁棒的nuncu96pp0.5ml)中，并且與150μl100mmtris(ph8.6)混合(在zephyr上至少5min)。將30μl的這種稀釋液轉(zhuǎn)移至nuncf96-mtp中，并且在添加70μl底物溶液后，通過每20sec在405nm下測(cè)量吸光度持續(xù)5min來確定非應(yīng)激樣品的初始活性(在spectramaxplus上)。在密封后，將洗滌劑板在艾本德恒溫混勻儀(eppendorfthermomixer)中在50℃和ph11下進(jìn)行孵育(未振蕩)。在1、3-4和23-24小時(shí)孵育后，抽取20μl樣品，并且像初始非應(yīng)激活性一樣，測(cè)量應(yīng)激樣品的殘留活性。
在用洗滌劑孵育過程中的活性下降被假定為指數(shù)式的。從log(活性)對(duì)比孵育時(shí)間的線性回歸發(fā)現(xiàn)半衰期(t1/2)。savinase(seqidno2)在該實(shí)驗(yàn)的條件下具有非常短的半衰期，并且因此相對(duì)于已經(jīng)穩(wěn)定的蛋白酶變體測(cè)量這些突變的影響。
變體t1/2if在40℃下的加速儲(chǔ)存穩(wěn)定性：單突變的半衰期改進(jìn)影響
突變g61e
s9e+n43r+n76d+g115w+h120v+a194p+q206l+s259d+l262e，t1/2：0.9
s9e+n43r+g61e+n76d+g115w+h120v+a194p+q206l+s259d+l262e，t1/2：4.8
突變y209w
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+s259d+n261w+l262e，t1/2：4.5
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e，t1/2：13.0
s9e+n43r+n76d+q182e+a194p+v205i+q206l+s259d+n261w+l262e，t1/2：4.6
s9e+n43r+n76d+q182e+a194p+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e，t1/2：12.4
突變m222s
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+y209w+s216v+l262e，t1/2：12.0
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+y209w+s216v+m222s+l262e，t1/2：14.5
突變v205i
s9e+n43r+n76d+a194p+q206l+t255e+s256d+s259d+t260e+n261w+l262e，t1/2：5.0
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+t255e+s256d+s259d+t260e+n261w+l262e，t1/2：1.2
s9e+n43r+n76d+n117h+h120d+a194p+q206l+s259d+l262e，t1/2：5.0
s9e+n43r+n76d+n117h+h120d+a194p+v205i+q206l+s259d+l262e，t1/2：1.6
s9e+n43r+n76d+a194p+q206l+s256d+s259d+n261w+l262e，t1/2：3.0
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+s256d+s259d+n261w+l262e，t1/2：6.6
s9e+n18s+n43r+n76d+g115w+h120v+a194p+q206l+s259d+l262e，t1/2：1.0
s9e+n18s+n43r+n76d+g115w+h120v+a194p+v205i+q206l+s259d+l262e，t1/2：4.6
s9e+n43r+n76d+g115w+h120v+a194p+q206l+s259d+l262e，t1/2：0.9
s9e+n43r+n76d+g115w+h120v+a194p+v205i+q206l+s259d+l262e，t1/2：5.0
s9e+n43r+n76d+a194p+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e，t1/2：9.9
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e，t1/2：13.0
突變s256d
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+s259d+n261w+l262e，t1/2：4.5
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+s256d+s259d+n261w+l262e，t1/2：6.6
s9e+n43r+n76d+q182e+a194p+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e，t1/2：12.4
s9e+n43r+n76d+q182e+a194p+v205i+q206l+y209w+s256d+s259d+n261w+l262e，t1/2：13.3
突變s188e
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+y209w+s216v+l262e，t1/2：12.0
s9e+n43r+n76d+s188e+a194p+v205i+q206l+y209w+s216v+l262e，t1/2：13.7
突變t260e
s9e+n76d+g115w+g160p+q182e+v205i+q206l+y209w+s256d+n261w+l262e，t1/2：13.5
s9e+n76d+g115w+g160p+q182e+v205i+q206l+y209w+s256d+t260e+n261w+l262e，t1/2：15.1
突變h120t
s9e+n43r+n76d+a194p+q206l+s256d+s259d+n261w+l262e，t1/2：3.0
s9e+n43r+n76d+h120t+a194p+q206l+s256d+s259d+n261w+l262e，t1/2：5.4
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+y209w+s216v+l262e，t1/2：12.0
s9e+n43r+n76d+h120t+a194p+v205i+q206l+y209w+s216v+l262e，t1/2：12.2
突變g160p
s9e+n76d+q182e+v205i+q206l+y209w+s256d+n261w+l262e，t1/2：13.2
s9e+n76d+g160p+q182e+v205i+q206l+y209w+s256d+n261w+l262e，t1/2：14.3
突變q182e
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+s259d+n261w+l262e，t1/2：4.5
s9e+n43r+n76d+q182e+a194p+v205i+q206l+s259d+n261w+l262e，t1/2：4.6
s9e+n76d+v205i+q206l+y209w+s256d+n261w+l262e，t1/2：12.3
s9e+n76d+q182e+v205i+q206l+y209w+s256d+n261w+l262e，t1/2：13.2
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+s259d+n261w+l262e+*275ah，t1/2：4.2
s9e+n43r+n76d+q182e+a194p+v205i+q206l+s259d+n261w+l262e+*275ah，t1/2：4.6
s9e+n43r+n76d+n185e+s188e+a194p+q206l+y209w+s259d+l262e，t1/2：11.5
s9e+n43r+n76d+q182e+n185e+s188e+a194p+q206l+y209w+s259d+l262e，t1/2：14.0
突變n185e
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+y209w+s216v+l262e，t1/2：12.0
s9e+n43r+n76d+n185e+a194p+v205i+q206l+y209w+s216v+l262e，t1/2：12.4
突變n261m
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+y209w+s216v+l262e，t1/2：12.0
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+y209w+s216v+n261m+l262e，t1/2：12.7
突變s259d
s9e+n43r+i72a+n76d+a194p+q206l+l262e，t1/2：6.0
s9e+n43r+i72a+n76d+a194p+q206l+s259d+l262e，t1/2：7.2
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+l262e，t1/2：6.0
s9e+n43r+n76d+a194p+v205i+q206l+s259d+l262e，t1/2：6.5
實(shí)例4：本發(fā)明的蛋白酶的滿量程洗滌結(jié)果
在滿量程洗滌(fullscalewash)中，測(cè)試本發(fā)明的蛋白酶的洗滌性能。在衣物洗滌液體洗滌劑中，在22種不同的污漬上以劑量反應(yīng)測(cè)試洗滌性能。
洗滌并漂洗之后，將小塊布樣攤開鋪平并且允許在室溫下風(fēng)干過夜。在洗滌的次日評(píng)估所有洗滌。使用具有非常小孔徑的macbethcoloreye7000反射分光光度計(jì)進(jìn)行小塊布樣的光反射評(píng)估。在入射光中沒有uv的情況下進(jìn)行測(cè)量并且提取460nm處的反射。在未洗滌的和洗滌的小塊布樣上進(jìn)行測(cè)量。將有待測(cè)量的測(cè)試小塊布樣放置在相同類型和顏色的另一個(gè)小塊布樣的頂部。
通過取得來自用酶洗滌的小塊布樣的測(cè)量值并且與來自未用酶洗滌的小塊布樣的測(cè)量值相減來計(jì)算針對(duì)每種污漬的酶效果，δrem酶。將洗滌性能表示為δ反射值(δrem)。
使用洗滌劑組合物和小塊布樣在以下表21中所指定的實(shí)驗(yàn)條件下執(zhí)行實(shí)驗(yàn)。
表21：用于滿量程洗滌衣物洗滌實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)條件
通過向測(cè)試系統(tǒng)添加cacl2、mgcl2和nahco3(ca2+:mg2+:co3-＝3:1:6)，將水硬度調(diào)節(jié)至6.7°dh。
表22：在所有free&clear中，在15℃下，與不具有蛋白酶的洗滌劑相比，包括蛋白酶的洗滌劑的δ反射值(測(cè)試的酶如下：
1：s9e+n43r+n76d+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
2：s9e+n43r+n76d+h120v+q182e+a194p+v205i+q206l+y209w+s256d+n261w+l262e+*275ah+*275bh；
3：s3v+n76d+h120v+q182e+n185e+s188e+v205i+q206l+y209w+s216v+s256d+n261w+l262e)；
δ(對(duì)比空白)
表23：在所有free&clear中，在30℃下，與不具有蛋白酶的洗滌劑相比，包括蛋白酶的洗滌劑的δ反射值(在以下“結(jié)果(酶-空白)”中所測(cè)試的酶如下：
1：s9e+n43r+n76d+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
2：s9e+n43r+n76d+q182e+a194p+v205i+q206l+y209w+s256d+s259d+n261w+l262e；
3：s9e+n43r+n76d+h120v+q182e+a194p+v205i+q206l+y209w+s256d+n261w+l262e+*275ah+*275bh；
4：s3v+n76d+h120v+q182e+n185e+s188e+v205i+q206l+y209w+s216v+s256d+n261w+l262e)；
所有free&clear30℃
表24：在所有艾禾美(arm&hammer)中，在30℃下，與不具有蛋白酶的洗滌劑相比，包括蛋白酶的洗滌劑的δ反射值(測(cè)試的酶如下：
1：s9e+n43r+n76d+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
2：s9e+n43r+n76d+h120v+q182e+a194p+v205i+q206l+y209w+s256d+n261w+l262e+*275ah+*275bh；
3：s3v+n76d+h120v+q182e+n185e+s188e+v205i+q206l+y209w+s216v+s256d+n261w+l262e)；
δ(對(duì)比空白)洗滌劑艾禾美(arm&hammer)
表25：在普雷克斯(purex)中，在30℃下，與不具有蛋白酶的洗滌劑相比，包括蛋白酶的洗滌劑的δ反射值(測(cè)試的酶如下：
1：s9e+n43r+n76d+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
2：s9e+n43r+n76d+h120v+q182e+a194p+v205i+q206l+y209w+s256d+n261w+l262e+*275ah+*275bh；
3：s3v+n76d+h120v+q182e+n185e+s188e+v205i+q206l+y209w+s216v+s256d+n261w+l262e)；
purex
表26：在sun三重清潔(tripleclean)中，在30℃下，與不具有蛋白酶的洗滌劑相比，包括蛋白酶的洗滌劑的δ反射值(測(cè)試的酶如下：
1：s9e+n43r+n76d+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
2：s9e+n43r+n76d+h120v+q182e+a194p+v205i+q206l+y209w+s256d+n261w+l262e+*275ah+*275bh；
3：s3v+n76d+h120v+q182e+n185e+s188e+v205i+q206l+y209w+s216v+s256d+n261w+l262e)；
δ(對(duì)比空白)洗滌劑suntripleclean
表27：在30℃下，在xtra中，與沒有蛋白酶的洗滌劑相比，包括蛋白酶的洗滌劑的δ反射值。測(cè)試的酶包括以下項(xiàng)：
1：s9e+n43r+n76d+v205i+q206l+y209w+s259d+n261w+l262e；
2：s9e+n43r+n76d+h120v+q182e+a194p+v205i+q206l+y209w+s256d+n261w+l262e+*275ah+*275bh；
3：s3v+n76d+h120v+q182e+n185e+s188e+v205i+q206l+y209w+s216v+s256d+n261w+l262e：
δ(對(duì)比空白)洗滌劑xtra
實(shí)例5：在微型洗滌中測(cè)試枯草桿菌蛋白酶309變體
使用微型洗滌系統(tǒng)，使用衣物洗滌液體洗滌劑在一種技術(shù)污漬上測(cè)試本發(fā)明的蛋白酶的洗滌性能。
微型洗滌測(cè)定是如下測(cè)試方法，其中污染的紡織品被連續(xù)地提起放進(jìn)測(cè)試溶液中并且隨后漂洗。
表28：在以下指定的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行洗滌實(shí)驗(yàn)：
測(cè)試材料從empa試驗(yàn)材料ag(empatestmaterialsag，
隨后將紡織品風(fēng)干并且將洗滌性能測(cè)量為這些紡織品的顏色的亮度。還可以將亮度表示為反射比(r)，反射比是當(dāng)用白光照射時(shí)，從測(cè)試材料反射或發(fā)射的光的量度。使用zeissmcs521vis分光光度計(jì)在460nm處測(cè)量紡織品的反射比(r)。根據(jù)制造商的方案進(jìn)行測(cè)量。
通過取得來自用酶洗滌的小塊布樣的測(cè)量值并且與來自未用酶洗滌的小塊布樣的測(cè)量值相減來計(jì)算針對(duì)每種污漬的酶效果，δrem酶。
如在微型洗滌測(cè)定中針對(duì)衣物洗滌方法所描述的，用該洗滌劑組合物和小塊布樣在如下表29中所指定的實(shí)驗(yàn)條件下執(zhí)行實(shí)驗(yàn)。
表29：用于微型洗滌衣物洗滌實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)條件
通過將cacl2、mgcl2和nahco3(ca2+:mg2+:co3-＝2:1:4.5)添加至測(cè)試系統(tǒng)中將水硬度調(diào)節(jié)至8.4°dh。在洗滌之后，將紡織品用自來水漂洗并干燥。
表30：在25℃下，與具有枯草桿菌蛋白酶309(seqidno2)的洗滌劑相比，蛋白酶枯草桿菌蛋白酶309變體的相對(duì)性能
結(jié)果表30示出，在25℃下，在血液/牛奶/墨水上，與枯草桿菌蛋白酶309(seqidno:2)相比，枯草桿菌蛋白酶309變體示出改進(jìn)的或同等的洗滌性能。
序列表
<110>諾維信公司（novozymesa/s）
尼耳森（nielsen）,延斯埃里克（jenserik）
<120>包括蛋白酶變體的液體清潔組合物
<130>13106-wo-pct
<160>2
<170>patentin版本3.5
<210>1
<211>275
<212>prt
<213>解淀粉芽孢桿菌（bacillusamyloliquefaciens）
<400>1
alaglnservalprotyrglyvalserglnilelysalaproalaleu
151015
hisserglnglytyrthrglyserasnvallysvalalavalileasp
202530
serglyileaspserserhisproaspleulysvalalaglyglyala
354045
sermetvalprosergluthrasnpropheglnaspasnasnserhis
505560
glythrhisvalalaglythrvalalaalaleuasnasnserilegly
65707580
valleuglyvalalaproseralaserleutyralavallysvalleu
859095
glyalaaspglyserglyglntyrsertrpileileasnglyileglu
100105110
trpalailealaasnasnmetaspvalileasnmetserleuglygly
115120125
proserglyseralaalaleulysalaalavalasplysalavalala
130135140
serglyvalvalvalvalalaalaalaglyasngluglythrsergly
145150155160
serserserthrvalglytyrproglylystyrproservalileala
165170175
valglyalavalaspserserasnglnargalaserpheserserval
180185190
glyprogluleuaspvalmetalaproglyvalserileglnserthr
195200205
leuproglyasnlystyrglyalatyrasnglythrsermetalaser
210215220
prohisvalalaglyalaalaalaleuileleuserlyshisproasn
225230235240
trpthrasnthrglnvalargserserleugluasnthrthrthrlys
245250255
leuglyaspserphetyrtyrglylysglyleuileasnvalglnala
260265270
alaalagln
275
<210>2
<211>269
<212>prt
<213>遲緩芽孢桿菌（bacilluslentus）
<400>2
alaglnservalprotrpglyileserargvalglnalaproalaala
151015
hisasnargglyleuthrglyserglyvallysvalalavalleuasp
202530
thrglyileserthrhisproaspleuasnileargglyglyalaser
354045
phevalproglygluproserthrglnaspglyasnglyhisglythr
505560
hisvalalaglythrilealaalaleuasnasnserileglyvalleu
65707580
glyvalalaproseralagluleutyralavallysvalleuglyala
859095
serglyserglyservalserserilealaglnglyleuglutrpala
100105110
glyasnasnglymethisvalalaasnleuserleuglyserproser
115120125
proseralathrleugluglnalavalasnseralathrserarggly
130135140
valleuvalvalalaalaserglyasnserglyalaglyserileser
145150155160
tyrproalaargtyralaasnalametalavalglyalathraspgln
165170175
asnasnasnargalaserpheserglntyrglyalaglyleuaspile
180185190
valalaproglyvalasnvalglnserthrtyrproglyserthrtyr
195200205
alaserleuasnglythrsermetalathrprohisvalalaglyala
210215220
alaalaleuvallysglnlysasnprosertrpserasnvalglnile
225230235240
argasnhisleulysasnthralathrserleuglyserthrasnleu
245250255
tyrglyserglyleuvalasnalaglualaalathrarg
260265