序列表的引用本申請包括計算機可讀形式的序列表，將其通過引用結(jié)合在此。發(fā)明背景發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及在液體洗滌劑組合物中表現(xiàn)出增加的穩(wěn)定性和/或改進(jìn)的洗滌性能的新穎枯草桿菌酶變體。本發(fā)明的這些變體適合用于在例如清潔或洗滌劑組合物中使用，如衣物洗滌洗滌劑組合物和餐具洗滌組合物，包括自動餐具洗滌組合物。本發(fā)明還涉及編碼這些變體的分離的dna序列、表達(dá)載體、宿主細(xì)胞以及用于產(chǎn)生和使用本發(fā)明變體的方法。相關(guān)技術(shù)說明在洗滌劑工業(yè)中，在洗滌配制品中酶已經(jīng)應(yīng)用了數(shù)十年。用于此類配制品的酶包括蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纖維素酶、甘露糖苷酶以及其他酶或其混合物。商業(yè)上最重要的酶是蛋白酶。已經(jīng)用于衣物洗滌的野生型枯草桿菌酶是wo91/02792中披露的blap蛋白酶。越來越多的商用蛋白酶是天然存在的野生型蛋白酶的蛋白質(zhì)工程化變體，和(諾維信公司(novozymesa/s))、purafect和(杰能科國際公司(genencorinternational,inc.))。另外，許多變體在本領(lǐng)域中已有描述，例如在wo2004/041979(諾維信公司)中描述了相對于親本枯草桿菌酶在例如洗滌性能、熱穩(wěn)定性、洗滌期間的穩(wěn)定性或催化活性上表現(xiàn)出改變的枯草桿菌酶變體。這些變體適合用于在例如清潔或洗滌劑組合物中使用。blap蛋白酶的變體并且適用于清潔或洗滌劑組合物已經(jīng)在例如ep701605中披露。wo99/57155披露了洗滌劑酶，例如通過將纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域附著到酶而被修飾的蛋白酶。建議將洗滌劑酶如蛋白酶與包含纖維素的織物結(jié)合，這將增強洗滌性能。然而，多種因素使得進(jìn)一步改進(jìn)蛋白酶是有利的。特別是液體洗滌劑組合物仍然是許多洗滌劑蛋白酶的挑戰(zhàn)，并且在儲存過程中的活性喪失仍然是許多良好洗滌劑蛋白酶的問題。因此，盡管蛋白酶開發(fā)的深入研究仍然需要具有令人滿意的洗滌性能和增加的穩(wěn)定性的新的并且改進(jìn)的蛋白酶。發(fā)明概述本發(fā)明涉及與親本枯草桿菌酶相比在液體洗滌劑中具有改進(jìn)的穩(wěn)定性和/或改進(jìn)的洗滌性能的變體枯草桿菌酶。本發(fā)明涉及與seqidno:3具有至少90％序列一致性，優(yōu)選與seqidno:3具有至少95％序列一致性，優(yōu)選至少96％序列一致性，優(yōu)選至少97％序列一致性，優(yōu)選至少98％序列一致性的枯草桿菌酶變體，其中該變體在位置101具有谷氨酸殘基(e)，并且其中與具有seqidno:3的氨基酸序列的枯草桿菌酶相比，該變體具有在液體洗滌劑組合物中的增加的穩(wěn)定性?？莶輻U菌酶進(jìn)一步包括選自下組的取代，該組由以下各項組成：s156d，l262e，q137h，s3t，r45e、d、q，p55n，t58w、y、l，q59d、m、n、t，g61d、r，s87e，g97s，a98d、e、r，s106a、w，n117e，h120v、d、k、n，s124m，p129d，e136q，s143w，s161t，s163a、g，y171l，a172s，n185q，v199m，y209w，m222q，n238h，v244t，n261t、d以及l(fā)262n、q、d。定義等位基因變體：術(shù)語“等位基因變體”意指占用同一染色體位點的一種基因的兩個或更多個替代形式中的任一者。等位基因變異由突變天然產(chǎn)生，并且可以導(dǎo)致群體內(nèi)多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?在編碼的多肽方面無變化)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因變體是由基因的等位基因變體編碼的多肽。cdna：術(shù)語“cdna”是指可以通過從得自真核或原核細(xì)胞的成熟的、剪接的mrna分子進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄而制備的dna分子。cdna缺少可以存在于相應(yīng)基因組dna中的內(nèi)含子序列。早先的初始rna轉(zhuǎn)錄物本是mrna的前體，其在呈現(xiàn)為成熟的剪接的mrna之前要經(jīng)一系列的步驟進(jìn)行加工，包括剪接。編碼序列：術(shù)語“編碼序列”意指直接指明變體的氨基酸序列的多核苷酸。編碼序列的邊界一般由開放閱讀框架決定，該開放閱讀框架從起始密碼子(如atg、gtg或ttg)開始并且以終止密碼子(如taa、tag或tga)結(jié)束。編碼序列可以是基因組dna、cdna、合成dna或其組合?？刂菩蛄校盒g(shù)語“控制序列”意指對于表達(dá)編碼本發(fā)明的變體的多核苷酸所必需的核酸序列。每個控制序列對于編碼該變體的多核苷酸來說可以是原生的(即，來自相同基因)或外源的(即，來自不同基因)，或相對于彼此是原生的或外源的。這些調(diào)控序列包括但不局限于前導(dǎo)子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。至少，控制序列包括啟動子，以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號。出于引入有利于將這些控制序列與編碼變體的多核苷酸的編碼區(qū)連接的特異性限制酶切位點的目的，這些控制序列可以提供有多個接頭。洗滌劑組合物：除非另外指明，術(shù)語“洗滌劑組合物”包括顆?；蚍勰┬问降耐ㄓ没蛑毓感拖礈靹绕涫乔鍧嵪礈靹?；液體、凝膠或糊狀的全效洗滌劑，尤其是所謂的重垢液(hdl)類型；液體細(xì)薄織物洗滌劑；手工洗碗劑或輕負(fù)荷洗碗劑，尤其是高起泡類型的那些；機器洗碗劑，包括用于供家庭和公共機構(gòu)使用的不同的片劑、顆粒、液體和漂洗助劑類型；液體清潔劑和消毒劑，包括抗菌性手洗型、清潔條、皂條、漱口液、義齒清潔劑、轎車或地毯香波、浴室清潔劑；洗發(fā)香波和洗發(fā)劑；沐浴凝膠、泡沫浴液；金屬清潔劑；以及清潔助劑如漂白添加劑和“去污棒(stain-stick)”或預(yù)處理型添加劑。就預(yù)期用于弄臟的物體清潔的洗滌介質(zhì)中的混合物而言，使用術(shù)語“洗滌劑組合物”和“洗滌劑配制品”。在一些實施例中，就洗滌織物和/或衣服而言，使用該術(shù)語(例如，“衣物洗滌劑”)。在替代性實施例中，該術(shù)語是指例如用于清潔餐具、刀具等的那些的其他洗滌劑(例如“餐具洗滌洗滌劑”)。它并不意圖使本發(fā)明限于任何特定的洗滌劑配制品或組合物。術(shù)語“洗滌劑組合物”不旨在限于包含表面活性劑的組合物。其意圖是，除了根據(jù)本發(fā)明的枯草桿菌酶變體以外，該術(shù)語涵蓋了可能包含以下各項的洗滌劑：例如表面活性劑、助洗劑、螯合劑(chelator)或螯合試劑(chelatingagent)、漂白系統(tǒng)或漂白組分、聚合物、織物調(diào)理劑、增泡劑、抑泡劑、染料、香料、晦暗抑制劑、光學(xué)增亮劑、殺細(xì)菌劑、殺真菌劑、污垢懸浮劑、防腐蝕劑、酶抑制劑或穩(wěn)定劑、酶激活劑、一種或多種轉(zhuǎn)移酶、水解酶、氧化還原酶、上藍(lán)劑和熒光染料、抗氧化劑、以及增溶劑。餐具洗滌：術(shù)語“餐具洗滌”是指所有形式的洗滌餐具，例如手動或自動餐具洗滌。洗滌餐具包括但不限于，清潔所有形式的陶器，例如盤子、杯子、玻璃杯、碗，所有形式的用餐工具，例如匙、刀、叉，以及上菜用具連同陶瓷，塑料(例如三聚氰胺)，金屬，瓷器，玻璃及丙烯酸酯。餐具洗滌組合物：術(shù)語“餐具洗滌組合物”是指用于清潔硬表面的所有形式的組合物。本發(fā)明不局限于任何具體類型的餐具洗滌組合物或任何具體洗滌劑。表達(dá)：術(shù)語“表達(dá)”包括涉及變體產(chǎn)生的任何步驟，包括但不限于，轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾以及分泌。表達(dá)載體：術(shù)語“表達(dá)載體”意指線性或環(huán)狀dna分子，該分子包括編碼變體的多核苷酸并且該多核苷酸可操作地與提供用于其表達(dá)的控制序列相連接。硬表面清潔：在此將術(shù)語“硬表面清潔”定義為清潔硬表面，其中硬表面可以包括地板、桌子、墻壁、屋頂?shù)龋B同硬物體的表面，例如汽車(汽車洗滌)和餐具(餐具洗滌)。餐具洗滌包括但不限于，清潔盤子、杯子、玻璃杯、碗、及用餐工具(例如匙、刀、叉)、上菜用具、陶瓷、塑料(例如三聚氰胺)、金屬、瓷器、玻璃及丙烯酸酯。宿主細(xì)胞：術(shù)語“宿主細(xì)胞”意指易于用包含本發(fā)明的多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等的任何細(xì)胞類型。該術(shù)語“宿主細(xì)胞”涵蓋親本細(xì)胞的任何后代，由于復(fù)制期間發(fā)生的突變，該后代與其親本細(xì)胞不完全相同。改進(jìn)的洗滌性能：術(shù)語“改進(jìn)的洗滌性能”在此定義為相對于親本枯草桿菌酶(即相對于具有與所述變體相同的氨基酸序列但排除所述變體中的改變的枯草桿菌酶)，例如相對于seqidno:2的成熟多肽，例如通過增加的去污而顯示洗滌性能的改變的枯草桿菌酶變體。術(shù)語“洗滌性能”包括在餐具洗滌以及還有在衣物洗滌中的洗滌性能。洗滌性能可以通過計算如在此的材料與方法部分中針對自動餐具洗滌的自動機械應(yīng)力測定(amsa)中定義的所謂的強度值(int)來確定。分離的：術(shù)語“分離的”意指處于自然界中不存在的形式或環(huán)境中的物質(zhì)。分離的物質(zhì)的非限制性實例包括(1)任何非天然存在的物質(zhì)，(2)包括但不局限于任何酶、變體、核酸、蛋白質(zhì)、肽或輔因子的任何物質(zhì)，該物質(zhì)至少部分地從與其本質(zhì)相關(guān)的一種或多種或所有天然存在的成分中去除；(3)相對于天然發(fā)現(xiàn)的物質(zhì)通過人工修飾的任何物質(zhì)；或(4)通過相對于與其天然相關(guān)聯(lián)的其他組分，增加該物質(zhì)的量而修飾的任何物質(zhì)(例如，編碼該物質(zhì)的基因的多個拷貝；比與編碼該物質(zhì)的基因天然相關(guān)聯(lián)的啟動子更強的啟動子的使用)。分離的物質(zhì)可以存在于發(fā)酵液樣品中。衣物洗滌：術(shù)語“衣物洗滌”涉及家用衣物洗滌和工業(yè)衣物洗滌兩者并且意指用一種包含本發(fā)明的洗滌劑組合物的溶液處理紡織品和/或織物的過程。衣物洗滌過程可以例如使用例如家用或工業(yè)洗衣機進(jìn)行或可以手動進(jìn)行。核酸構(gòu)建體：術(shù)語“核酸構(gòu)建體”意指單-鏈或雙鏈的核酸分子，該核酸分子是從天然存在的基因中分離的，或以本來不存在于自然界中的方式被修飾成包含核酸的區(qū)段，或是合成的，該核酸分子包括一個或多個控制序列?？刹僮鞯剡B接：術(shù)語“可操作地連接”意指如下的構(gòu)造，其中，控制序列相對于多核苷酸的編碼序列安置在適當(dāng)位置，從而使得該控制序列指導(dǎo)該編碼序列的表達(dá)。親本：術(shù)語“親本”意指對其做出改變以產(chǎn)生本發(fā)明的酶變體的蛋白酶。因此，親本是與所述變體具有相同的氨基酸序列但在一個或更多個(例如兩個或更多個)所述指定位置處不具有改變的蛋白酶。應(yīng)理解的是，在上下文中的“具有相同的氨基酸序列”的表達(dá)涉及100％的序列一致性。親本可以是天然存在的(野生型)多肽。在一個具體實施例中，該親本是與具有seqidno:2的成熟多肽的多肽具有至少60％的一致性，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的一致性的蛋白酶。蛋白酶：術(shù)語“蛋白酶”在此被定義為水解肽鍵的酶。它包括屬于ec3.4酶組的任何酶(包括其13個亞類中的每一種)。ec編號參照加利福尼亞州(california)的圣迭戈(sandiego)的nc-iubmb學(xué)術(shù)出版社(academicpress)的1992年酶命名法，分別包括出版于歐洲生物化學(xué)期刊(eur.j.biochem.)1994，223，1-5、歐洲生物化學(xué)期刊1995，232，1-6、歐洲生物化學(xué)期刊1996，237，1-5、歐洲生物化學(xué)期刊1997，250，1-6、以及歐洲生物化學(xué)期刊1999，264，610-650的增刊1-5。蛋白酶活性：術(shù)語“蛋白酶活性”意指蛋白水解活性(ec3.4)。本發(fā)明的蛋白酶是內(nèi)肽酶(ec3.4.21)。存在若干蛋白酶活性類型：三種主要的活性類型是：胰蛋白酶樣，其中在arg或lys后在p1處存在酰胺底物的切割；糜蛋白酶樣，其中切割發(fā)生在p1處，在疏水性氨基酸中的一個之后；以及彈性蛋白酶樣，其中切割在p1處ala之后。出于本發(fā)明的目的，根據(jù)以下“材料與方法(materialsandmethods)”所述的程序確定蛋白酶活性。本發(fā)明的這些枯草桿菌酶變體具有seqidno:2的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％和至少100％的蛋白酶活性。序列一致性：用參數(shù)“序列一致性”來描述兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的相關(guān)性。出于本發(fā)明的目的，使用如在emboss包(emboss：歐洲分子生物學(xué)開放軟件套件(theeuropeanmolecularbiologyopensoftwaresuite)，賴斯(rice)等人，2000，遺傳學(xué)趨勢(trendsgenet.)16:276-277)(優(yōu)選5.0.0版或更新版本)的尼德爾(needle)程序中所實施的尼德爾曼-翁施(needleman-wunsch)算法(尼德爾曼(needleman)和翁施(wunsch)，1970，分子生物學(xué)雜志(j.mol.biol.)48:443-453)來確定兩個氨基酸序列之間的序列一致性。所使用的參數(shù)是空位開放罰分10、空位延伸罰分0.5，和eblosum62(blosum62的emboss版本)取代矩陣。將標(biāo)記為“最長一致性”的尼德爾(needle)輸出(使用-非簡化(nobrief)選項獲得)用作百分比一致性并且是如下計算的：(一致的殘基x100)/(比對長度-比對中的空位總數(shù))出于本發(fā)明的目的，使用如在emboss包(emboss：歐洲分子生物學(xué)開放軟件套件，賴斯等人，2000，見上文)(優(yōu)選5.0.0版或更新版本)的尼德爾程序中所實施的尼德爾曼-翁施算法(尼德爾曼和翁施，1970，見上文)來確定兩個脫氧核糖核苷酸序列之間的序列一致性。所使用的參數(shù)是空位開放罰分10，空位延伸罰分0.5，以及ednafull(ncbinuc4.4的emboss版)取代矩陣。將標(biāo)記為“最長一致性”的尼德爾(needle)輸出(使用-非簡化(nobrief)選項獲得)用作百分比一致性并且是如下計算的：(一致的脫氧核糖核苷酸x100)/(比對長度-比對中的空位總數(shù))穩(wěn)定性：術(shù)語“穩(wěn)定性”包括儲存穩(wěn)定性和在使用過程中的穩(wěn)定性，例如在洗滌過程中的穩(wěn)定性(洗滌中穩(wěn)定性)，并且反映了作為時間函數(shù)的根據(jù)本發(fā)明的枯草桿菌酶變體的穩(wěn)定性，例如當(dāng)?shù)鞍酌钢糜谌芤褐袝r，尤其是在洗滌劑溶液中時，能夠保留多少活性。這種穩(wěn)定性受到許多因素的影響，例如ph、溫度、洗滌劑組合物，例如助洗劑的量、表面活性劑等。使用如在此的材料與方法部分中所述的‘穩(wěn)定性測定’可以測量蛋白酶穩(wěn)定性。術(shù)語“改進(jìn)的穩(wěn)定性”或“增加的穩(wěn)定性”在本文中被定義為相對于親本蛋白酶的穩(wěn)定性顯示溶液中增加的穩(wěn)定性的變體蛋白酶。術(shù)語“改進(jìn)的穩(wěn)定性”和“增加的穩(wěn)定性”包括“改進(jìn)的化學(xué)穩(wěn)定性”、“洗滌劑穩(wěn)定性”或“改進(jìn)的洗滌劑穩(wěn)定性”。術(shù)語“改進(jìn)的化學(xué)穩(wěn)定性(improvedchemicalstability)”在此定義為變體酶在一種或多種化學(xué)物存在下表現(xiàn)為在孵育一段時間之后仍保留酶活性，這種或這些種化學(xué)物是天然存在的或是合成的，可降低親本酶的酶活性。改進(jìn)的化學(xué)穩(wěn)定性還可使得這些變體在這類化學(xué)物存在下能更好地催化反應(yīng)。在本發(fā)明的一個特別的方面，這種改進(jìn)的化學(xué)穩(wěn)定性是洗滌劑的，尤其是液體洗滌劑的一種改進(jìn)的穩(wěn)定性。術(shù)語“洗滌劑穩(wěn)定性”或“改進(jìn)的洗滌劑穩(wěn)定性”具體地是當(dāng)本發(fā)明的一種蛋白酶變體被混合到一種液體洗滌劑配制品(尤其是根據(jù)表1的液體洗滌劑配制品)中并且然后保存在15℃和50℃之間的溫度(例如20℃、30℃或40℃)下時，蛋白酶活性的改進(jìn)的穩(wěn)定性。術(shù)語“改進(jìn)的熱活性”意指一種變體在特定溫度下相對于親本或相對于具有seqidno:3的蛋白酶的溫度依賴的活性曲線展示改變的溫度依賴的活性曲線。熱活性值提供了變體在一定溫度范圍內(nèi)增強水解反應(yīng)的催化的效率的測量。一種具有較大熱活性的變體將引起一種酶組合物在增強底物水解速率方面的增加，從而減少所需要的時間和/或降低活性所需要的酶濃度?？商娲兀哂袦p小的熱活性的一種變體將在比由親本的溫度依賴活性曲線定義的親本的最佳溫度更低的溫度下提高酶促反應(yīng)。嚴(yán)格條件：不同的嚴(yán)格條件定義如下。術(shù)語“非常低嚴(yán)格條件”意指對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，遵循標(biāo)準(zhǔn)dna印跡程序，在42℃下在5xsspe、0.3％sds、200微克/ml剪切并變性的鮭精dna和35％甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時。最后在60℃下使用2xssc、0.2％sds將載體材料洗滌三次，每次15分鐘。術(shù)語“低嚴(yán)格條件”意指對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，遵循標(biāo)準(zhǔn)dna印跡程序，在42℃下在5xsspe、0.3％sds、200微克/ml剪切并變性的鮭精dna和35％甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時。載體材料最終使用1xssc、0.2％sds，在60℃下洗滌三次，每次15分鐘。術(shù)語“中嚴(yán)格條件”意指對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，遵循標(biāo)準(zhǔn)dna印跡程序，在42℃下在5xsspe、0.3％sds、200微克/ml剪切并變性的鮭精dna和35％甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時。載體材料最終使用1xssc、0.2％sds，在65℃下洗滌三次，每次15分鐘。術(shù)語“中-高嚴(yán)格條件”意指對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，遵循標(biāo)準(zhǔn)dna印跡程序，在42℃下在5xsspe、0.3％sds、200微克/毫升剪切并變性的鮭精dna以及35％甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時。載體材料最終使用0.5xssc、0.2％sds，在65℃下洗滌三次，每次15分鐘。術(shù)語“高嚴(yán)格條件”意指對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，遵循標(biāo)準(zhǔn)dna印跡程序，在42℃下在5xsspe、0.3％sds、200微克/ml剪切并且變性的鮭精dna和35％甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時。載體材料最終使用0.3xssc、0.2％sds，在65℃下洗滌三次，每次15分鐘。術(shù)語“非常高嚴(yán)格條件”意指對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，遵循標(biāo)準(zhǔn)dna印跡程序，在42℃下在5xsspe、0.3％sds、200微克/ml剪切并變性的鮭精dna和35％甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時。載體材料最終使用0.15xssc、0.2％sds，在65℃下洗滌三次，每次15分鐘。基本上純的變體：術(shù)語“基本上純的變體”意指這樣一種制劑，該制劑包含與其天然關(guān)聯(lián)或重組關(guān)聯(lián)的按重量計至多10％、至多8％、至多6％、至多5％、至多4％、至多3％、至多2％、至多1％、以及至多0.5％的其他多肽材料。優(yōu)選地，該變體按存在于制劑中的總多肽材料的重量計是至少92％純的，例如至少94％純的、至少95％純的、至少96％純的、至少97％純的、至少98％純的、至少99％純的、至少99.5％純的、以及100％純的。本發(fā)明的這些變體優(yōu)選以基本上純的形式存在。例如，這可通過經(jīng)由眾所周知的重組方法或經(jīng)由經(jīng)典的純化方法制備變體來完成?；旧霞兊亩嗪塑账幔盒g(shù)語“基本上純的多核苷酸”意指不含其他外來的或不需要的核苷酸的多核苷酸制劑，并且其存在的形式適于在基因工程化多肽生產(chǎn)系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行使用。因而，基本上純的多核苷酸包含按重量計最多10％、最多8％、最多6％、最多5％、最多4％、最多3％、最多2％、最多1％和最多0.5％與該多核苷酸天然或重組關(guān)聯(lián)的其他多核苷酸材料。然而，基本上純的多核苷酸可以包括天然存在的5’-和3’-非翻譯區(qū)，如啟動子和終止子。優(yōu)選的是，基本上純的多核苷酸按重量計是至少90％純的，例如至少92％純的、至少94％純的、至少95％純的、至少96％純的、至少97％純的、至少98％純的、至少99％純的、以及至少99.5％純的。本發(fā)明的這些多核苷酸優(yōu)選以基本上純的形式存在。變體：術(shù)語“變體”意指在一個或多個(例如，若干個)位置處包括改變(即，取代、插入和/或缺失)的具有蛋白酶活性的多肽。取代意指用一個不同氨基酸置換占用一個位置的氨基酸；缺失意指去除占據(jù)一個位置的氨基酸；并且插入意指鄰近于并且緊跟著占據(jù)一個位置的氨基酸之后添加一個或多個(例如，若干個)氨基酸(例如，1、2、3、4或5個氨基酸)。洗滌性能：術(shù)語“洗滌性能”被用作酶在例如洗滌(如衣物洗滌或硬表面清潔)過程中去除存在于有待清潔的物體上的污漬的能力。洗滌性能上的改進(jìn)可以通過計算如在材料與方法部分所述的amsa測定中定義的所謂強度值(int)來定量。野生型枯草桿菌酶：術(shù)語“野生型枯草桿菌酶”意指由天然存在的生物(例如在自然界中發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌、古生菌、酵母、真菌、植物或動物)表達(dá)的蛋白酶。野生型枯草桿菌酶的實例是blap，即具有seqidno:2的氨基酸序列的枯草桿菌酶。變體命名規(guī)則出于本發(fā)明的目的，使用在seqidno:1中披露的成熟多肽bpn’來確定另一種蛋白酶中的相應(yīng)的氨基酸殘基。將另一種蛋白酶的氨基酸序列與seqidno:1中披露的成熟多肽進(jìn)行比對，并且基于該比對，使用如在emboss包(emboss：歐洲分子生物學(xué)開放軟件套件)(優(yōu)選5.0.0版或更新版本)的尼德爾程序中所實施的尼德爾曼-翁施算法來確定與seqidno:1中所披露的成熟多肽中的任何氨基酸殘基相對應(yīng)的氨基酸位置編號。所使用的參數(shù)是空位開放罰分10、空位延伸罰分0.5，和eblosum62(blosum62的emboss版本)取代矩陣。另一種蛋白酶中對應(yīng)的氨基酸殘基的鑒別可以通過使用若干計算機程序使用其對應(yīng)的缺省參數(shù)比對多個多肽序列來確定，這些計算機程序包括但不限于muscle(通過對數(shù)期望值的多序列比較；3.5版或更新版本；mafft(6.857版或更新版本)，以及采用clustalw的embossemma(1.83版或更新版本)。當(dāng)其他酶與seqidno:1的成熟多肽相背離使得傳統(tǒng)的基于序列的比較方法不能檢測其相互關(guān)系()時，可以使用其他成對序列比較算法。在基于序列的搜索中的更大靈敏度可以使用搜索程序來獲得，這些搜索程序利用多肽家族的概率表示(譜(profile))來搜索數(shù)據(jù)庫。例如，psi-blast程序通過迭代數(shù)據(jù)庫搜索過程來產(chǎn)生多個譜，并且能夠檢測遠(yuǎn)距離同源物()。如果多肽的家族或超家族在蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中具有一個或多個代表，則可以實現(xiàn)甚至更大的靈敏度。程序如genthreader()利用來自不同來源(psi-blast、二級結(jié)構(gòu)預(yù)測、結(jié)構(gòu)比對譜以及溶劑化勢)的信息作為預(yù)測查詢序列的結(jié)構(gòu)折疊的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的輸入。類似地，高夫(gough)等人，2000，分子生物學(xué)雜志(j.mol.biol.)313:903-919的方法可以用于比對未知結(jié)構(gòu)的序列與存在于scop數(shù)據(jù)庫中的超家族模型。這些比對進(jìn)而可以用于產(chǎn)生多肽的同源性模型，并且使用出于該目的而開發(fā)的多種工具可以評定此類模型的準(zhǔn)確度。對于已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，可獲取若干工具和資源以供找回(retrieve)和生成結(jié)構(gòu)比對。例如，蛋白的scop超家族已經(jīng)在結(jié)構(gòu)上進(jìn)行比對，并且那些比對是可訪問的并且可下載的。可以使用多種算法如距離比對矩陣或組合延伸比對兩種或更多種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，并且這些算法的實施可以另外用于查詢具有感興趣結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫，以便發(fā)現(xiàn)可能的結(jié)構(gòu)同源物。在描述本發(fā)明的變體中，以下所述的命名法適于引用方便。采用了已接受的iupac單個字母和三字母的氨基酸縮寫。取代.對于氨基酸取代，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、取代氨基酸。因此，在位置226的蘇氨酸被丙氨酸取代表示為“thr226ala”或者“t226a”。多個突變由加號(“+”)分開，例如，“gly205arg+ser411phe”或“g205r+s411f”代表分別在位置205和位置411處甘氨酸(g)被精氨酸(r)取代，并且絲氨酸(s)被苯丙氨酸(f)取代。缺失.對于氨基酸缺失，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、*。因此，在位置195處的甘氨酸缺失表示為“gly195*”或“g195*”。多個缺失由加號(“+”)分開，例如“gly195*+ser411*”或“g195*+s411*”。插入.另外的氨基酸殘基的插入，例如像在g195之后插入賴氨酸可表示為：gly195glylys或g195gk?？商娲兀硗獾陌被釟埢牟迦耄缭趃195之后插入賴氨酸可表示為：*195al。當(dāng)插入一個以上氨基酸殘基時，例如像在g195之后插入lys和ala可表示為：gly195glylysala或g195gka。在此類情況下，還可以通過將小寫字母添加到在所插入的一個或多個氨基酸殘基之前的氨基酸殘基位置編號處來對所插入的一個或多個氨基酸殘基進(jìn)行編號，在這個實例中：*195ak*195ba。在以上的實例中，序列194至196因此為：在取代和插入發(fā)生在相同的位置的情況下，這可表示為s99sd+s99a，或簡寫為s99ad。相同修飾也可以表示為s99a+*99ad。在其中插入與所存在的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的情況下，顯然是在命名中出現(xiàn)了簡并。如果例如在以上實例中，在甘氨酸之后插入甘氨酸，則將它表示為g195gg或者*195agbg。對于以下變化，相同的實際變化也可以僅表示為a194ag或者*194ag，從：到：這類情況對于技術(shù)人員來說是顯而易見的，并且因此表示式g195gg和這種類型插入的相應(yīng)表示式旨在包括這類等同簡并表示式。多個改變：包括多個改變的變體由加號(“+”)分開，例如“arg170tyr+gly195glu”或者“r170y+g195e”代表在位置170和位置195處的精氨酸和甘氨酸分別被酪氨酸和谷氨酸取代。可替代地，空格或逗號可將多個改變分隔開，例如分別為a170yg195e或a170y，g195e。不同的改變：可以在一個位置上引入不同的改變時，這些不同的改變由一個逗號分開，例如“arg170tyr,glu”代表在位置170上的精氨酸被酪氨酸或谷氨酸取代。因此，“tyr167gly,ala+arg170gly,ala”表示以下變體：“tyr167gly+arg170gly”、“tyr167gly+arg170ala”、“tyr167ala+arg170gly”、和“tyr167ala+arg170ala”?？商娲牟煌淖兓蚩扇芜x的取代可用括號表示，例如arg170[tyr，glu]或arg170{tyr，glu}或簡寫為r170[y,e]或r170{y，e}。氨基酸位置/殘基的編號如果沒有提及其他，則本文中使用的氨基酸編號對應(yīng)于枯草桿菌酶bpn’(basbpn)序列的編號。對于bpn’序列的進(jìn)一步描述，參見seqidno:1或斯艾森(siezen)等人，蛋白質(zhì)工程學(xué)4(1991)719-737。發(fā)明詳細(xì)說明本發(fā)明涉及在液體洗滌劑中具有改進(jìn)的穩(wěn)定性和/或改進(jìn)的洗滌性能的枯草桿菌酶變體。優(yōu)選地，該枯草桿菌酶變體還具有良好的洗滌性能，更優(yōu)選地，變體與親本枯草桿菌酶、seqidno:2或seqidno:3相比具有改進(jìn)的洗滌性能。親本枯草桿菌酶原則上可以是任何天然存在的枯草桿菌酶，或者它可以是通過本領(lǐng)域已知的方法產(chǎn)生的修飾的枯草桿菌酶，例如制備雜交體或兩個或更多個單獨的枯草桿菌酶，或者通過在給定的枯草桿菌酶中取代，缺失或插入一個或多個氨基酸殘基。許多枯草桿菌酶具有良好的洗滌性能的經(jīng)過證實的記錄，并且有大量的出版物描述了這種枯草桿菌酶及其在衣物洗滌或清潔過程中的用途，然而，為了在洗滌劑中使用，還重要的是，枯草桿菌酶在洗滌劑組合物中，如液體洗滌劑中具有令人滿意的穩(wěn)定性。優(yōu)選使用具有良好洗滌性能的親本枯草桿菌酶，以提供在液體洗滌劑中具有改進(jìn)的穩(wěn)定性的這種枯草桿菌酶的變體。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的親本枯草桿菌酶是具有seqidno:2的氨基酸序列的blap蛋白酶，或與seqidno:2具有至少60％、例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性的枯草桿菌酶。優(yōu)選的親本枯草桿菌酶可以是具有seqidno:2的氨基酸序列的枯草桿菌酶，其中與seqidno:2相比，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個氨基酸已經(jīng)被修飾，并且其中每個修飾獨立地是一個氨基酸殘基被另一個氨基酸殘基取代、氨基酸殘基的缺失或插入一個氨基酸殘基。在另一方面，該親本包括seqidno:2的氨基酸序列或由其組成。在另一方面，該親本包括seqidno:2的成熟多肽或由其組成。在另一方面，該親本包括seqidno:2的氨基酸1至269或由其組成。在另一個實施例中，該親本是seqidno:2的成熟多肽的等位基因變體。一個優(yōu)選的親本枯草桿菌酶是具有seqidno:2的氨基酸序列的枯草桿菌酶，其中在對應(yīng)于seqidno:1的位置101的位置處的精氨酸殘基取代為谷氨酸殘基(r101e)。該優(yōu)選的枯草桿菌酶的序列示于seqidno:3。根據(jù)本發(fā)明的其他優(yōu)選的親本枯草桿菌酶是具有seqidno:3的氨基酸序列的蛋白酶或與seqidno:3具有至少60％、例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性的枯草桿菌酶。在另一方面，該親本包括seqidno:3的氨基酸序列或由其組成。在另一方面，該親本包括seqidno:3的成熟多肽或由其組成。在另一方面，該親本包括seqidno:3的氨基酸1至269或由其組成。在另一個實施例中，該親本是seqidno:3的成熟多肽的等位基因變體。優(yōu)選的親本枯草桿菌酶可以是具有seqidno:3的氨基酸序列的枯草桿菌酶，其中與seqidno:3相比，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個氨基酸已經(jīng)被修飾，并且其中每個修飾獨立地是一個氨基酸殘基被另一個氨基酸殘基取代、氨基酸殘基的缺失或插入一個氨基酸殘基。本發(fā)明的另外的枯草桿菌酶變體包括與seqidno:3具有至少90％序列一致性的變體，該變體包括以下取代中的一個或多個：取代s156d；l262e；q137h；s3t；r45e、d、q；p55n；t58w、y、l；q59d、m、n、t；g61d、r；s87e；g97s；a98d、e、r；s106a、w；n117e；h120v、d、k、n；s124m；p129d；e136q；s143w；s161t；s163a、g；y171l；a172s；n185q；v199m；y209w；m222q；n238h；v244t；n261t、d；l262n、q、d，其中這些位置根據(jù)seqidno1編號。在優(yōu)選的實施例中，與具有seqidno:3的序列的枯草桿菌酶相比，本發(fā)明的枯草桿菌酶變體具有在液體洗滌劑中的改進(jìn)的穩(wěn)定性和改進(jìn)的洗滌性能。此實施例的這種優(yōu)選的枯草桿菌酶的實例包括與seqidno:3具有至少90％序列一致性的枯草桿菌酶變體且包括以下取代中的一個或多個：取代r45e、d、q；t58l；g61d；s87e；g97s；a98e；s106a；n117e；h120d、k、v；p129d；e136q、q137h；s156d；s161t；s163a、g；v199m；m222q；n261t；l262e、q、n。本發(fā)明的枯草桿菌酶變體可以具有其他取代，例如本領(lǐng)域已知的取代以賦予枯草桿菌酶變體具體的有益特性。在本領(lǐng)域已知的枯草桿菌酶中存在大量的取代，并且預(yù)期在本發(fā)明中可以使用這種已知的取代，以將這些已知的有益效果賦予本發(fā)明的枯草桿菌酶變體。本發(fā)明的枯草桿菌酶變體可以包括一個或多個可用于本發(fā)明中的另外的取代，以便賦予另外的有益效果和/或改進(jìn)現(xiàn)有效果，例如穩(wěn)定性和洗滌性能。優(yōu)選的另外的突變包括以下取代中的一個或多個：v4i、n76d、v104t、n128q、s141h、r145h、a194p、g195e、v205i、n218q、a228v、n238e或s265h。與具有seqidno:3的氨基酸序列的枯草桿菌酶相比，優(yōu)選具有改進(jìn)的穩(wěn)定性和/或在液體洗滌劑中改進(jìn)的洗滌性能的本發(fā)明的枯草桿菌酶變體的特別優(yōu)選實例包括以下變體，這些變體包括以下氨基酸序列：seqidno:3+s3t，seqidno:3+r45e、dseqidno:3+p55n，seqidno:3+t58w、y、l，seqidno:3+q59d、m、n、t，seqidno:3+g61d、r，seqidno:3+s87e，seqidno:3+g97s，seqidno:3+a98d、e、r，seqidno:3+s106a、w，seqidno:3+n117e，seqidno:3+h120v、d、k、n，seqidno:3+s124m，seqidno:3+p129dseqidno:3+e136q，seqidno:3+s143w，seqidno:3+s161t，seqidno:3+s163a、g，seqidno.3+y171l，seqidno:3+a172s，seqidno:3+n185q，seqidno:3+v199m，seqidno:3+y209w，seqidno:3+m222q，seqidno:3+n238h，seqidno:3+v244t，seqidno:3+n261t，seqidno:3+l262n、q、d、eseqidno:3+n76d+s163g+n238eseqidno:3+s156d+l262eseqidno:3+n238e+l262eseqidno:3+s3t+n76d+s156d+y209wseqidno:3+h120d+s163g+n261dseqidno:3+s163g+n128q+n238e+l262eseqidno:3+k27q+h120d+s163g+n261dseqidno:3+v104t+h120d+s156d+l262eseqidno:3+g195e+v199mseqidno:3+s3t+v4i+n261dseqidno:3+a194p+g195e+v199m+v205iseqidno:3+h120d+a228vseqidno:3+s3t+v4i+a228vseqidno:3+h120d+n261dseqidno:3+h120d+s163g+n261dseqidno:3+n76d+a228v+l262eseqidno:3+n76d+q137h+s141h+r145h+s163g+n238eseqidno:3+q137h+s141h+r145h+n238e+l262eseqidno:3+s3t+n76d+q137h+s141h+r145h+s156d+y209wseqidno:3+h120d+q137h+s141h+r145h+s163g+n261dseqidno:3+n76d+q137h+s141h+r145h+a228v+n261dseqidno:3+a194p+g195e+v199m+v205i+a228v+n261dseqidno:3+n62d+h120dseqidno:3+h120d+n261dseqidno:3+n76d+n261dseqidno:3+n76d+a228v+n261dseqidno:3+a194p+g195e+v205i+n261dseqidno:3+n76d+h120d+n261dseqidno:3+h120d+s163g+n261dseqidno:3+s3t+q59d+n76dseqidno:3+s3t+n76d+h120dseqidno:3+s3t+n76d+a194p+g195e+v199m+v205iseqidno:3+s3t+n76d+s156dseqidno:3+s3t+n76d+y209w+n261dseqidno:3+s3t+n76d+h120d+y209wseqidno:3+s3t+n76d+s156d+y209wseqidno:3+s3t+v4i+n76d+a228v+n261dseqidno:3+s3t+v4i+n76d+h120dseqidno:3+h120d+p131f+a194p+n261dseqidno:3+n76d+e136h+a228v+n261dseqidno:3+n76d+n218s+a228v+n261dseqidno:3+n76d+n218q+a228v+n261dseqidno:3+n76d+n218a+a228v+n261dseqidno:3+k27q+r45eseqidno:3+n76d+a228v+l262eseqidno:3+r45e+a88sseqidno:3+s87e+k237eseqidno:3+n261d+l262eseqidno:3+s87e+l262eseqidno:3+s87e+n238eseqidno:3+k27q+s87eseqidno:3+n76d+n117eseqidno:3+h120d+n238eseqidno:3+q59d+l262eseqidno:3+k27q+l262eseqidno:3+h120d+l262eseqidno:3+k27q+q59dseqidno:3+k27q+s156dseqidno:3+k27q+g61dseqidno:3+q59d+n261dseqidno:3+q59d+n117eseqidno:3+k237e+n261dseqidno:3+q59d+n238eseqidno:3+a15t+h120d+n261dseqidno:3+n76d+s163g+n238eseqidno:3+h120d+s163g+l262eseqidno:3+h120d+s163g+n261dseqidno:3+q59d+h120dseqidno:3+g61d+n76dseqidno:3+s3t+n76dseqidno:3+s3t+h120dseqidno:3+g61d+h120dseqidno:3+p55s+h120dseqidno:3+s163g+a228vseqidno:3+s163g+n261d；seqidno:3+s3t+s163gseqidno:3+g61d+s163gseqidno:3+s156d+s163gseqidno:3+q59d+s163gseqidno:3+n76d+s163gseqidno:3+p55s+s163gseqidno:3+h120d+s163gseqidno:3+t58l+q59dseqidno:3+p55s+t58lseqidno:3+t58l+g97dseqidno:3+t58l+s106aseqidno:3+t58l+a228vseqidno:3+s3t+t58lseqidno:3+t58l+s156dseqidno:3+t58l+y91hseqidno:3+t58l+h120dseqidno:3+t58l+s163gseqidno:3+s163g+n261d；seqidno:3+t58l+n261d；seqidno:3+t58l+n76dseqidno:3+s3t+n76d+h120dseqidno:3+s3t+n76d+a228vseqidno:3+s3t+n76d+s156dseqidno:3+s3t+n76d+y209wseqidno:3+s3t+n76d+y209w+v244tseqidno:3+n76d+h120dseqidno:3+n76d+s156dseqidno:3+h120d+s156dseqidno3+r45e+l262eseqidno3+q59d+g61dseqidno3+s87e+l262eseqidno3+g61d+l262eseqidno3+q59d+l262eseqidno3+r45e+q59dseqidno3+q59d+s156dseqidno3+s156d+l262eseqidno3+s163g+n238e+l262eseqidno3+s3t+v4i+s163g+n261dseqidno3+h120d+s163g+n261dseqidno3+y91h+n117h+n238hseqidno3+t58l+s163g+n261dseqidno3+s3t+v4i+s163g+n261dseqidno3+s87e+s163g+l262eseqidno3+s156d+s163g+l262eseqidno3+t58ls163g+n261dseqidno3+s156ds163g+l262eseqidno3+s3t+n76d+y209w+n261d+l262e本發(fā)明的枯草桿菌酶變體與親本蛋白酶相比優(yōu)選具有在液體洗滌劑中的改進(jìn)的穩(wěn)定性，優(yōu)選本發(fā)明的枯草桿菌酶變體與具有seqidno:2或seqidno:3的蛋白酶相比具有在液體洗滌劑中的改進(jìn)的穩(wěn)定性?？梢蕴岬剑鳛楸景l(fā)明的優(yōu)選的枯草桿菌酶變體的實例，其與親本酶相比，具有在液體洗滌劑中的改進(jìn)的穩(wěn)定性和/或改進(jìn)的洗滌性能：seqidno:3+r45e、d、qseqidno:3+q58lseqidno:3+q59d，seqidno:3+g61d，seqidno:3+s87e，seqidno:3+g97s，seqidno:3+a98e，seqidno:3+n117e，seqidno:3+h120d、k、vseqidno:3+p129dseqidno:3+e136q，seqidno:3+q137h，seqidno:3+s156d，seqidno:3+s160a，seqidno:3+s163a、g，seqidno:3+v199mseqidno:3+m222qseqidno:3+n261t或seqidno:3+l262eq、n。與親本枯草桿菌酶相比，本發(fā)明的這些優(yōu)選的枯草桿菌酶變體具有改進(jìn)的穩(wěn)定性，例如洗滌劑穩(wěn)定性和/或改進(jìn)的或者同等的洗滌性能。在這方面，改進(jìn)的洗滌性能旨在意指在至少一種污漬上的變體的洗滌性能比親本枯草桿菌酶的洗滌性能更高，其中洗滌性能是在適合的條件下在給定的洗滌劑組合物中使用適合的洗滌性能測定法確定的。在一個優(yōu)選實施例中，使用本申請的“方法和材料”部分中描述的amsa測試來測量改進(jìn)的洗滌性能。變體的洗滌性能為與親本枯草桿菌酶的洗滌性能相比，優(yōu)選至少1單位更高、優(yōu)選至少2單位更高、例如至少3單位更高、例如至少4單位更高、例如至少5單位更高、例如至少6單位更高、例如至少7單位更高、例如至少8單位更高、例如至少9單位更高。這些枯草桿菌酶變體可以進(jìn)一步包括在一個或多個(例如若干個)其他位置處的一個或多個另外的改變，所述其他位置選自下組，該組由以下各項組成：3、4、9、12、14、15、40、43、68、72、79、86、88、92、98、99、101、120、146、183、184、188、194、216、218、224、228、236、245、255、261、267和270，優(yōu)選位置9、15、68和/或120(根據(jù)seqidno:1編號)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員清楚如果一個位置已經(jīng)被改變一次，則其不會被改變第二次。在一個優(yōu)選實施例中，在選自下組的任何位置處的改變是取代，該組由以下各項組成：3、4、9、12、14、15、40、43、68、72、79、86、88、92、98、99、101、120、146、183、184、188、194、216、218、224、228、236、245、255、261、267和270。在更優(yōu)選的實施例中，該枯草桿菌酶變體進(jìn)一步包括選自下組的一個或多個取代，該組由以下各項組成：3{d、e、l}，4i，9{h、k、r、g}，12{d、e}，14t，15{g、m、s、t}，40{a、g、m、s、t}，43{d、e}，63g，68{a、g、i、l、m、s、t}，72{v、l}，n76{d、e}，79t，86h，88v，92s，98t，99{e、t、a、g、m、d}，101l，120{i、n}，146s，183{e、d}，184{e、d}，188g，194p，216{d、e}，218{e、d}，224{s、a、t、g、m}，228t，236d，245{h、k、r}，255{d、e}，261{e}，267{i、l、v}和/或270{g、m、s、t}(根據(jù)seqidno:1編號)。在更優(yōu)選的實施例中，該枯草桿菌酶變體進(jìn)一步包括選自下組的一個或多個取代，該組由以下各項組成：seqidno:3的成熟多肽，或與其具有至少60％，優(yōu)選至少70％、優(yōu)選至少80％、優(yōu)選至少90％、優(yōu)選至少95％的序列一致性的多肽中的s3{d、e、l}，v4i，s9{h、k、r、g}，q12{d、e}，p14t，a15{g、m、s、t}，p40{a、g、m、s、t}，n43{d、e}，v68{a、g、i、l、m、s、t}，i72{v、l}，n76{d、e}，i79t，p86h，a88v，a92s，a98t，s99{e、t、a、g、m、d}，s101l，h120{i、n}，g146s，n183{e、d}，n184{e、d}，s188g，a194p，s216{d、e}，n218{e、d}，t224{s、a、t、g、m}，a228t，s236d，q245{h、k、r}，t255{d、e}，n261{，e}，l267{i、l、v}和/或a270{g、m、s、t}，其中每個位置對應(yīng)于seqidno:1的成熟多肽的相應(yīng)位置。一個實施例進(jìn)一步涉及生產(chǎn)與具有seqidno:2和/或seqidno3的氨基酸序列的枯草桿菌酶相比，具有改進(jìn)的穩(wěn)定性和/或改進(jìn)的洗滌性能的枯草桿菌酶變體的方法，該方法包括以下步驟a)在與seqidno:2具有至少90％序列一致性的枯草桿菌酶中用谷氨酸殘基(e)取代對應(yīng)于seqidno:1的位置101的位置處的氨基酸，b)進(jìn)一步引入任一個以下取代位置s156d，l262e，q137h，s3t，r45e、d、q，p55n，t58w、y、l，q59d、m、n、t，g61d、r，s87e，g97s，a98d、e、r，s106a、w，n117e，h120v、d、k、n，s124m，p129d，e136q，s143w，s161t，s163a、g，y171l，a172s，n185q，v199m，y209w，m222q，n238h，v244t，n261t、d或l262n、q、d。c)回收該變體。根據(jù)一個實施例和/或根據(jù)上述實施例中的任一個，本發(fā)明涉及與seqidno:3具有至少90％序列一致性的枯草桿菌酶變體，其中該變體在對應(yīng)于seqidno:1的位置101的位置處具有谷氨酸殘基(e)，并且其中變體與具有seqidno:3的氨基酸序列的枯草桿菌酶相比具有減少的纖維素結(jié)合。一個實施例涉及與seqidno:3具有至少90％序列一致性的枯草桿菌酶變體，其中該變體在對應(yīng)于seqidno:1的位置101的位置處具有谷氨酸殘基(e)，并且其中該變體與具有seqidno:3的氨基酸序列的枯草桿菌酶相比，具有減少的纖維素結(jié)合，并且其中該變體包括用中性或帶負(fù)電荷的殘基取代蛋白酶表面上帶正電荷的氨基酸殘基；或者蛋白酶表面上的中性殘基被帶負(fù)電荷的殘基取代。根據(jù)一個實施例或上述實施例中的任一個，本發(fā)明涉及與seqidno:3具有至少90％序列一致性的枯草桿菌酶變體，其中該變體在對應(yīng)于seqidno:1的位置101的位置處具有谷氨酸殘基(e)，并且其中該變體與具有seqidno:3的氨基酸序列的枯草桿菌酶相比，具有減少的纖維素結(jié)合，和/或其中該變體包括用中性或帶負(fù)電荷的殘基取代蛋白酶表面上帶正電荷的氨基酸殘基；或者蛋白酶表面上的中性殘基被帶負(fù)電荷的殘基取代，其中該枯草桿菌酶變體包括選自下組的取代，該組由以下各項組成：v4d、e、i，r10n、q、d、e、s，h17d，k27s、n、q、e、d，n43e，i44v，r45e、d、q、n，g46d，s49n、d，p52e，g53d、e，q59d，g61d，n62d，l75d，n76d，i79d，s87e，g97d，a98e，*103ae，i104t，n117e，h120d，e136k、q，s156d，r170e、q、n、d、s，n185d，g195e，n218a，k235l、w、n、q、e、s，k237n、q、d、e、s，n238d、e，v244d，r246q、e、d，r247s、e、q、d，k251s、d、q、e、n，n261d，l262d、e和s265h，優(yōu)選取代選自：n117e、s156d、n238e、n261d和l262e，并且優(yōu)選地，該變體進(jìn)一步包括選自以下項的取代：s3t、n128q、q137h、s141h、r145h、s163g、a194p、v199m、v205i、n218q或a228v。根據(jù)一個實施例和/或根據(jù)上述實施例中的任一個，本發(fā)明涉及與seqidno:3具有至少90％序列一致性的枯草桿菌酶變體，其中該變體在對應(yīng)于seqidno:1的位置101的位置處具有谷氨酸殘基(e)，其中與具有seqidno:3的氨基酸序列的枯草桿菌酶相比，該變體具有減少的纖維素結(jié)合，并且其中該枯草桿菌酶變體進(jìn)一步包括選自以下項的取代：n117e+s3t、s156d+s3t、n238e+s3t、n261d+s3t、l262e+s3t、n117e+n128q、s156d+n128q、n238e+n128q、n261d+n128q、l262e+n128q、n117e+q137h、s156d+q137h、n238e+q137h、n261d+q137h、l262e+q137h、n117e+s141h、s156d+s141h、n238e+s141h、n261d+s141h、l262e+s141h、n117e+r145h、s156d+r145h、n238e+r145h、n261d+r145h、l262e+r145h、n117e+s163g、s156d+s163g、n238e+s163g、n261d+s163g、l262e+s163g、n117e+a194p、s156d+a194p、n238e+a194p、n261d+a194p、l262e+a194p、n117e+v199m、s156d+v199m、n238e+v199m、n261d+v199m、l262e+v199m、n117e+v205i、s156d+v205i、n238e+v205i、n261d+v205i、l262e+v205i、n117e+n218q、s156d+n218q、n238e+n218q、n261d+n218q、l262e+n218q、n117e+a228v、s156d+a228v、n238e+a228v、n261d+a228v、l262e+a228v、s156d+n262e。根據(jù)一個實施例和/或根據(jù)上述實施例中的任一個，本發(fā)明涉及與seqidno:3具有至少90％序列一致性的枯草桿菌酶變體，其中該變體在對應(yīng)于seqidno:1的位置101的位置處具有谷氨酸殘基(e)，其中該變體與具有seqidno:3的氨基酸序列的枯草桿菌酶相比具有減少的纖維素結(jié)合，并且其中該枯草桿菌酶變體進(jìn)一步包括選自以下項的取代：seqidno:3+v4d、e、iseqidno:3+r10n、q、d、e、s，seqidno:3+h17d，seqidno:3+k27s、n、q、e、d，seqidno:3+r45e、d、q、n，seqidno:3+g53d，seqidno:3+q59d，seqidno:3+g61d，seqidno:3+l75d，seqidno:3+n76d，seqidno:3+i79d，seqidno:3+s87e，seqidno:3+g97d，seqidno:3+a98e，seqidno:3+*103ae，seqidno:3+n117e，seqidno:3+h120d，seqidno:3+e136k、q，seqidno.3+s156d，seqidno:3+r170e、q、n、d，seqidno:3+n185d，seqidno:3+g195e，seqidno:3+k235l、w、n、q、e、s，seqidno:3+k237n、q、d、e、s，seqidno:3+n238d、e，seqidno:3+v244dseqidno:3+r246q、e、d，seqidno:3+r247s、e，seqidno:3+k251s、d、q、e、n，seqidno:3+n261d，seqidno:3+l262d、eseqidno:3+s265hseqidno:3+a194p+g195eseqidno:3+g195e+v199mseqidno:3+n76d+a228v+n261d；seqidno:3+n76d+s163g+n238eseqidno:3+s156d+l262eseqidno:3+n238e+l262eseqidno:3+s3t+n76d+s156d+y209wseqidno:3+k27q+h120d+s163g+n261dseqidno:3+v104t+h120d+s156d+l262eseqidno:3+v104t+s156d+l262eseqidno:3+q137h+s141h+r145h+n238e+l262eseqidno:3+s3t+v4i+a228v；seqidno:3+h120ds163gn261dseqidno:3+n76d+s101e+a228v+l262e；seqidno:3+n76d+q137h+s141h+r145h+s163g+n238eseqidno:3+s3t+n76d+q137h+s141h+r145h+s156d+y209wseqidno:3+h120d+q137h+s141h+r145h+s163g+n261dseqidno:3+a194p+g195e+v199m+v205i；seqidno:3+s3t+n76d+a194p+g195e+v199m+v205i；seqidno:3+a228v+n261d；seqidno:3+n76d+a228v；seqidno:3+s3t+v4i+n261d；seqidno:3+h120d+a228v；seqidno:3+n76d+n261d；seqidno:3+a194p+g195e+v199m+v205i+a228v+n261d；seqidno:3+a194p+g195e+v205i+a228v；或seqidno:3+h120d+n261d。優(yōu)選地，這些變體選自下組,該組由以下各項組成：seqidno:3+n238e+l262eseqidno:3+s156d+l262eseqidno:3+s3t+v4i+a228v；seqidno:3+g195e+v199mseqidno:3+h120ds163gn261dseqidno:3+n76d+a228v+n261d；seqidno:3+s3t+n76d+s156d+y209wseqidno:3+q137h+s141h+r145h+n238e+l262eseqidno:3+q137h+s141h+r145h+s156d+l262eseqidno:3+n76d+q137h+s141h+r145h+a228v+n261d；seqidno:3+n76d+q137h+s141h+r145h+s163g+n238eseqidno:3+h120d+q137h+s141h+r145h+s163g+n261dseqidno:3+s3t+n76d+q137h+s141h+r145h+s156d+y209w，其中這些位置對應(yīng)于seqidno:1中的位置，并且其中該枯草桿菌酶變體與seqidno:3具有至少60％，例如至少70％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少98％或至少99％的序列一致性。一個實施例涉及編碼根據(jù)上述實施例中的任一個的變體的核苷酸序列，包含該核苷酸序列的表達(dá)載體，包含該核苷酸序列或該表達(dá)載體的重組宿主細(xì)胞。一個實施例進(jìn)一步涉及用于生產(chǎn)與具有seqidno:2的氨基酸序列的枯草桿菌酶相比具有減少的纖維素結(jié)合的枯草桿菌酶變體的方法，該方法包括以下步驟a)在與seqidno:2具有至少90％序列一致性的枯草桿菌酶中用谷氨酸殘基(e)取代對應(yīng)于seqidno:1的位置101的位置處的氨基酸，b)進(jìn)一步引入以下取代位置中的任一個：4d、e、i，10n、q、d、e、s，h17d，k27s、n、q、e、d，n43e，i44v，r45e、d、q、n，g46d，s49n、d，p52e，g53d、e，q59d，g61d，n62d，l75d，n76d，i79d，s87e，g97d，a98e，*103ae，i104t，n117e，h120d，e136k、q，s156d，r170e、q、n、d、s，n185d，g195e，n218a，k235l、w、n、q、e、s，k237n、q、d、e、s，n238d、e，v244d，r246q、e、d，r247s、e、q、d，k251s、d、q、e、n，n261d，l262d、e和s265h；c)回收該變體。這些氨基酸變化可以具有微小性質(zhì)，即，不會顯著地影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30個氨基酸的小缺失；小氨基或羧基-末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸殘基；高達(dá)20-25個殘基的小接頭肽；或通過改變凈電荷或另一功能有利于純化的小的延伸，例如聚組氨酸段、抗原表位或結(jié)合結(jié)構(gòu)域。保守取代的實例是在下組的范圍內(nèi)：堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸及組氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸及纈氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸及甲硫氨酸)。一般不會改變比活性的氨基酸取代是本領(lǐng)域已知的并且例如由h.諾伊拉特(neurath)和r.l.希爾(hill)，1979，在蛋白質(zhì)(theproteins)，學(xué)術(shù)出版社(academicpress)，紐約中描述。常見取代是ala/ser、val/ile、asp/glu、thr/ser、ala/gly、ala/thr、ser/asn、ala/val、ser/gly、tyr/phe、ala/pro、lys/arg、asp/asn、leu/ile、leu/val、ala/glu、以及asp/gly?？商娲?，這些氨基酸改變具有這樣一種性質(zhì)：改變多肽的物理化學(xué)特性。例如，氨基酸改變可以改進(jìn)多肽的熱穩(wěn)定性、改變底物特異性、改變最適ph，等?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域中已知的程序，如定點誘變或丙氨酸掃描誘變來鑒定多肽中的必需氨基酸。在后一項技術(shù)中，在該分子中的每個殘基處引入單個丙氨酸突變，并且對所得突變體分子的蛋白酶活性進(jìn)行測試以鑒定對于該分子的活性至關(guān)重要的氨基酸殘基。酶或其他生物學(xué)相互作用的活性部位還可通過對結(jié)構(gòu)的物理分析來確定，如由下述技術(shù)確定：核磁共振、晶體學(xué)(crystallography)、電子衍射、或光親和標(biāo)記，連同對推定的接觸位點(contractsite)氨基酸進(jìn)行突變。對于bpn’(seqidno:1)，包含氨基酸s221、h64以及d32的催化三聯(lián)體對于酶的蛋白酶活性是必需的。這些枯草桿菌酶變體可以由150至350，例如175至330、200至310、220至300、240至290、260至280，或269、270、271、272、273、274或275個氨基酸組成。在一個實施例中，枯草桿菌酶變體具有改進(jìn)的洗滌性能。在另一個實施例中，枯草桿菌酶變體具有改進(jìn)的穩(wěn)定性，優(yōu)選在洗滌期間改進(jìn)的穩(wěn)定性。在一個實施例中，與親本酶相比，枯草桿菌酶變體具有在液體洗滌劑中改進(jìn)的穩(wěn)定性，其中使用如本文的材料和方法部分中實施例4中所述的‘穩(wěn)定性測定’來測量穩(wěn)定性。在一個實施例中，與seqidno:2的多肽相比，枯草桿菌酶變體具有改進(jìn)的穩(wěn)定性，其中使用如本文的材料和方法部分中實施例4中所述的‘穩(wěn)定性測定’來測量穩(wěn)定性。在一個實施例中，與seqidno:3的多肽相比，枯草桿菌酶變體具有改進(jìn)的穩(wěn)定性，其中使用如本文的材料和方法部分中實施例4中所述的‘穩(wěn)定性測定’來測量穩(wěn)定性。在一個實施例中，與親本酶相比，枯草桿菌酶具有改進(jìn)的洗滌性能，其中使用如本文的材料和方法部分中的實施例7中所述的自動機械應(yīng)力測定(amsa)來測量洗滌性能。在一個實施例中，與seqidno:2的多肽相比，枯草桿菌酶變體具有改進(jìn)的洗滌性能，其中使用如本文的材料和方法部分中的實施例7中所述的自動機械應(yīng)力測定(amsa)來測量洗滌性能。在一個實施例中，與seqidno:3的多肽相比，枯草桿菌酶變體具有改進(jìn)的洗滌性能，其中使用如本文的材料和方法部分中的實施例7中所述的自動機械應(yīng)力測定(amsa)來測量洗滌性能。親本蛋白酶在蛋白質(zhì)底物中切割酰胺鍵的酶被分類為蛋白酶，或(互換地)肽酶。絲氨酸蛋白酶絲氨酸蛋白酶是一種酶，其催化肽鍵的水解，并且其中在活性位點存在必需的絲氨酸殘基。細(xì)菌絲氨酸蛋白酶的分子量范圍是20,000至45,000道爾頓。它們受到二異丙基氟磷酸的抑制。它們水解簡單末端酯并且在活性上與同樣是絲氨酸蛋白酶的真核糜蛋白酶相似。更狹義的術(shù)語，堿性蛋白酶，包括一個亞組，反映了一些絲氨酸蛋白酶從ph9.0-11.0的高最適ph?？莶輻U菌酶斯艾森(siezen)等人(1991)，蛋白質(zhì)工程(proteineng.)4:719-737以及斯艾森等人(1997)，蛋白質(zhì)科學(xué)(proteinscience)6:501-523提出了被暫時命名為枯草桿菌酶(subtilase)的一個絲氨酸蛋白酶亞組。它們是通過對先前稱為枯草桿菌蛋白酶樣蛋白酶的絲氨酸蛋白酶的170多個氨基酸序列進(jìn)行同源性分析而定義的?？莶輻U菌蛋白酶先前通常被定義為由革蘭氏陽性細(xì)菌或真菌產(chǎn)生的絲氨酸蛋白酶，而現(xiàn)在根據(jù)斯艾森(siezen)等人則為枯草桿菌酶的一個亞組。已鑒定多種多樣的枯草桿菌酶，并且已確定很多枯草桿菌酶的氨基酸序列。對于此類枯草桿菌酶及其氨基酸序列的更詳細(xì)描述，參見斯艾森(siezen)等人(1997)。枯草桿菌蛋白酶枯草桿菌酶的一個亞組是枯草桿菌蛋白酶，它們?yōu)閬碜詓8家族，特別是來自s8a子族的絲氨酸蛋白酶，如由merops數(shù)據(jù)庫(http://merops.sanger.ac.uk/cgi-bin/famsum？family＝s8)所定義的。bpn’和賽威蛋白酶(savinase)分別具有merops編號s08.034和s08.003。親本枯草桿菌酶術(shù)語“親本枯草桿菌酶”描述一種根據(jù)斯艾森(siezen)等人(1997)，蛋白質(zhì)科學(xué)(proteinscience)6:501-523定義的枯草桿菌酶。更詳細(xì)的信息參見以上“枯草桿菌酶”的描述。親本枯草桿菌酶也可以是從自然來源中分離的枯草桿菌酶，其中在保留枯草桿菌酶特征的同時，已對其進(jìn)行后續(xù)修飾(例如一條或多條氨基酸側(cè)鏈的一個或多個置換，一個或多個取代、一個或多個缺失和/或一個或多個插入)。此外，親本枯草桿菌酶可以是已經(jīng)通過dna改組技術(shù)制備的枯草桿菌酶?？商娲?，術(shù)語“親本枯草桿菌酶”可被稱為“野生型枯草桿菌酶”。該親本枯草桿菌酶優(yōu)選屬于枯草桿菌蛋白酶亞組?？莶輻U菌酶的一個亞組，i-s1或“真”枯草桿菌蛋白酶，包括“標(biāo)準(zhǔn)的”枯草桿菌蛋白酶，如枯草桿菌蛋白酶168(bss168)、枯草桿菌蛋白酶bpn’、嘉士伯枯草桿菌蛋白酶(subtilisincarlsberg)(諾維信公司)、以及枯草桿菌蛋白酶dy(bssdy)。斯艾森(siezen)等人(見上文)識別了枯草桿菌酶的另一亞組，i-s2或強堿性枯草桿菌蛋白酶。亞組i-s2蛋白酶被描述為強堿性枯草桿菌蛋白酶，并且包括多種酶，如枯草桿菌蛋白酶pb92(baalkp)(杰能科國際(genencorinternational，inc.))、枯草桿菌蛋白酶309(賽威蛋白酶(賽威蛋白酶(savinase))諾維信公司(novozymesa/s))、枯草桿菌蛋白酶147(bls147)(益瑞蛋白酶(esperase)諾維信公司(novozymesa/s))、以及堿性彈性蛋白酶yab(bseyab)。bpn’是來自解淀粉芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶bpn’，bpn’具有氨基酸序列seqidno:1。供參照，下表1給出以上所提及的不同枯草桿菌酶的一些首字母縮略詞的清單。關(guān)于另外的首字母縮略詞，參見斯艾森(siezen)等人(1991和1997)。表1：不同枯草桿菌酶的首字母縮略詞同源枯草桿菌酶序列兩個氨基酸序列之間的同源性是在出于本發(fā)明的目的由參數(shù)“一致性”描述的背景下，兩個氨基酸序列之間的一致性程度是使用如上所述的尼德曼-翁施算法來確定的。來自程序的結(jié)果除了氨基酸比對之外還計算兩個序列之間的“百分比一致性”?；诒久枋?，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，鑒別可以根據(jù)本發(fā)明來修飾的適當(dāng)同源枯草桿菌酶是常規(guī)的。基本上同源的親本枯草桿菌蛋白酶變體可以具有一個或多個(若干個)氨基酸取代、缺失和/或插入，在此背景下，術(shù)語“一個或多個”與術(shù)語“若干個”是互換使用的。這些改變優(yōu)選地具有微小性質(zhì)，即，不會顯著地影響蛋白或多肽的三維折疊或活性的如上所述的保守氨基酸取代以及其他取代；小缺失，典型地為1至約30個氨基酸；以及較小的氨基-或羧基-末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸殘基，高達(dá)約20-25個殘基的小連接肽，或有利于純化的小的延伸(親和標(biāo)簽)，如聚組氨酸段，或蛋白。盡管上述變化優(yōu)選具有較不重要的性質(zhì)，但此類變化還可以具有實質(zhì)性性質(zhì)，例如高達(dá)300個氨基酸或更多的更大多肽作為氨基或羧基末端延伸的融合?？梢允褂胹eqidno:3的多肽或其片段來設(shè)計核酸探針以根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法來鑒別并克隆對來自不同屬或種的菌株的親本進(jìn)行編碼的dna。具體地，可以遵循標(biāo)準(zhǔn)dna印跡程序，使用此類探針與感興趣的細(xì)胞的基因組dna或cdna雜交，以便鑒定和分離其中的對應(yīng)基因。此類探針可以明顯短于完整序列，但是長度應(yīng)為至少15，例如至少25、至少35、或至少70個核苷酸。優(yōu)選地，該核酸探針具有至少100個核苷酸長度，例如至少200個核苷酸長度、至少300個核苷酸長度、至少400個核苷酸長度、至少500個核苷酸長度、至少600個核苷酸長度、至少700個核苷酸長度、至少800個核苷酸長度、或至少900個核苷酸長度。dna和rna探針兩者都可使用。典型地將探針進(jìn)行標(biāo)記(例如，用32p、3h、35s、生物素、或抗生物素蛋白)，以檢測相應(yīng)的基因。本發(fā)明涵蓋此類探針?？梢葬槍εc上文所述的探針雜交并編碼親本的dna來篩選由這類其他菌株制備的基因組dna或cdna文庫。來自這類其他菌株的基因組dna或其他dna可以通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，或其他分離技術(shù)來分離?？梢詫碜晕膸斓膁na或分離的dna轉(zhuǎn)移至硝化纖維素(nitrocellulose)或其他適合的載體材料并且固定于其上。該多肽可以是雜合多肽，其中一種多肽的區(qū)域在另一種多肽的區(qū)域的n-末端或c-末端處融合。該親本可以是融合多肽或可切割融合多肽，其中另一種多肽在本發(fā)明多肽的n-末端或c-末端處融合。通過將編碼另一種多肽的多核苷酸與本發(fā)明多核苷酸融合而產(chǎn)生融合多肽。用于產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并且包括連接編碼多肽的編碼序列，使得它們在框內(nèi)，并且融合多肽的表達(dá)處于相同的啟動子和終止子的控制之下。融合多肽還可以使用內(nèi)含肽技術(shù)來構(gòu)建，其中融合多肽在翻譯后產(chǎn)生。融合多肽可以進(jìn)一步包括兩種多肽之間的切割位點。在融合蛋白分泌之時，該位點被切割，從而釋放出這兩種多肽。該親本可以從任何屬類的微生物中獲得。出于本發(fā)明的目的，如在此結(jié)合一種給定的來源所用的術(shù)語“從...中獲得”應(yīng)意指由多核苷酸編碼的親本是由該來源或由其中已經(jīng)插入來自該來源的多核苷酸的一種菌株產(chǎn)生的。在一方面，該親本是胞外分泌的。該親本可以是細(xì)菌蛋白酶。例如，該親本可以是一種革蘭氏陽性細(xì)菌多肽，如芽孢桿菌屬(bacillus)、梭菌屬(clostridium)、腸球菌屬(enterococcus)、土芽孢桿菌屬(geobacillus)、乳桿菌屬(lactobacillus)、乳球菌屬(lactococcus)、海洋芽孢桿菌屬(oceanobacillus)、葡萄球菌屬(staphylococcus)、鏈球菌屬(streptococcus)、或鏈霉菌屬(streptomyces)蛋白酶；或一種革蘭氏陰性細(xì)菌多肽，如彎曲桿菌屬(campylobacter)、大腸桿菌(e.coli)、黃桿菌屬(flavobacterium)、梭桿菌屬(fusobacterium)、螺桿菌屬(helicobacter)、泥桿菌屬(ilyobacter)、奈瑟氏菌屬(neisseria)、假單胞菌屬(pseudomonas)、沙門菌屬(salmonella)或脲原體屬(ureaplasma)蛋白酶。在一方面，該親本是嗜堿芽孢桿菌(bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)、短芽孢桿菌(bacillusbrevis)、環(huán)狀芽孢桿菌(bacilluscirculans)、克勞氏芽孢桿菌(bacillusclausii)、凝結(jié)芽孢桿菌(bacilluscoagulans)、堅強芽孢桿菌(bacillusfirmus)、燦爛芽孢桿菌(bacilluslautus)、遲緩芽孢桿菌(bacilluslentus)、地衣芽孢桿菌(bacilluslicheniformis)、巨大芽孢桿菌(bacillusmegaterium)、短小芽孢桿菌(bacilluspumilus)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)、或蘇云金芽孢桿菌(bacillusthuringiensis)蛋白酶。在一個方面，該親本是解淀粉芽孢桿菌蛋白酶，例如seqidno:1的蛋白酶或其成熟多肽。在另一方面，該親本是遲緩芽孢桿菌蛋白酶，例如seqidno:2的蛋白酶或其成熟多肽。這些物種的菌株可以容易地在許多培養(yǎng)物保藏中心為公眾所獲得，如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(atcc)、德國微生物菌種保藏中心(deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturengmbh，dsmz)、荷蘭菌種保藏中心(centraalbureauvoorschimmelcultures，cbs)以及美國農(nóng)業(yè)研究菌種保藏中心北方地區(qū)研究中心(nrrl)。可以使用以上提到的探針從其他來源，包括從自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分離的微生物或直接從自然材料(例如，土壤、堆肥、水等)獲得的dna樣品鑒定和獲得該親本。用于從自然生活環(huán)境中直接分離微生物和dna的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。然后可通過在另一種微生物或混合dna樣品的基因組dna或cdna文庫中類似地進(jìn)行篩選來獲得編碼親本的多核苷酸。一旦已經(jīng)用一個或多個探針檢測到編碼親本的多核苷酸，則可以通過利用對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說已知的多種技術(shù)來分離或克隆該多核苷酸。變體的制備本發(fā)明還涉及用于獲得具有蛋白酶活性的枯草桿菌酶變體的方法?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的任何誘變程序來制備這些變體，如定點誘變、合成基因構(gòu)建、半合成基因構(gòu)建、隨機誘變、改組等。定點誘變是在編碼該親本的多核苷酸中的一個或多個限定位點處引入一個或多個(例如，若干個)突變的技術(shù)。通過使用涉及包含所希望的突變的寡核苷酸引物的pcr可以體外實現(xiàn)定點誘變。也可以通過盒式誘變進(jìn)行體外定點誘變，所述盒式誘變涉及由限制酶在包括編碼親本的多核苷酸的質(zhì)粒中的位點處切割并且隨后將包含突變的寡核苷酸連接在多核苷酸中。通常，消化該質(zhì)粒與該寡核苷酸的限制酶是相同的，以允許該質(zhì)粒的粘性末端以及插入片段彼此連接。還可以通過本領(lǐng)域已知的方法體內(nèi)實現(xiàn)定點誘變。在本發(fā)明中可以使用任何定點誘變程序。存在可以用于制備變體的很多可商購的試劑盒。合成基因構(gòu)建需要體外合成設(shè)計的多核苷酸分子以編碼感興趣的多肽?；蚝铣煽梢岳枚喾N技術(shù)來進(jìn)行，如基于多路微芯片的技術(shù)、以及其中在光可編程的微流芯片上合成并組裝寡核苷酸的類似技術(shù)?？梢宰龀鰡蝹€或多個氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用誘變、重組和/或改組的已知方法進(jìn)行測試，隨后進(jìn)行相關(guān)篩選程序?？梢允褂玫钠渌椒òㄒ族epcr、噬菌體展示和區(qū)域定向的誘變。誘變/改組方法可以與高通量、自動化的篩選方法組合以檢測由宿主細(xì)胞表達(dá)的克隆的、誘變的多肽的活性?？梢詮乃拗骷?xì)胞回收編碼活性多肽的誘變的dna分子，并且使用本領(lǐng)域內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)方法快速測序。這些方法允許迅速確定多肽中單個氨基酸殘基的重要性。通過組合合成基因構(gòu)建、和/或定點誘變、和/或隨機誘變、和/或改組的多個方面來實現(xiàn)半合成基因構(gòu)建。半合成構(gòu)建典型地是利用合成的多核苷酸片段的過程結(jié)合pcr技術(shù)。因此，基因的限定的區(qū)域可以從頭合成，而其他區(qū)域可以使用位點特異性誘變引物來擴(kuò)增，而還有其他區(qū)域可以經(jīng)受易錯pcr或非易錯pcr擴(kuò)增。然后可以對多核苷酸子序列進(jìn)行改組。多核苷酸本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明的變體的多核苷酸。核酸構(gòu)建體本發(fā)明還涉及包括編碼本發(fā)明的變體的、可操作地連接至一個或多個控制序列上的多核苷酸的核酸構(gòu)建體，該一個或多個控制序列在與控制序列相容的條件下指導(dǎo)編碼序列在適合的宿主細(xì)胞中的表達(dá)?？梢园炊喾N方式來操縱該多核苷酸以提供變體的表達(dá)。取決于表達(dá)載體，在多核苷酸插入載體之前對其進(jìn)行操縱可以是令人希望的或必需的。用于利用重組dna方法修飾多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。控制序列可以是啟動子，即由宿主細(xì)胞識別用于表達(dá)該多核苷酸的多核苷酸。啟動子包含介導(dǎo)該變體的表達(dá)的轉(zhuǎn)錄控制序列。啟動子可以是在宿主細(xì)胞中顯示出轉(zhuǎn)錄活性的任何多核苷酸，包括突變型、截短型及雜合型啟動子，并且可以是由編碼與該宿主細(xì)胞同源或異源的細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)多肽的基因獲得。指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體在細(xì)菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的適合的啟動子的實例是從以下項獲得的啟動子：解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyq)、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyl)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penp)、嗜熱脂肪芽孢桿菌麥芽糖淀粉酶基因(amym)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacb)、枯草芽孢桿菌xyla和xylb基因、蘇云金芽孢桿菌cryiiia基因、大腸桿菌lac操縱子、大腸桿菌trc啟動子、天藍(lán)色鏈霉菌瓊脂糖酶基因(daga)和原核β-內(nèi)酰胺酶基因，連同tac啟動子控制序列也可以是由宿主細(xì)胞識別以終止轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄終止子。該終止子序列被可操作地連接至編碼該變體的多核苷酸的3’末端?？梢允褂迷谒拗骷?xì)胞中具有功能的任何終止子。細(xì)菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子從針對以下各項的基因獲得：克勞氏芽孢桿菌堿性蛋白酶(aprh)、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶(amyl)、和大腸桿菌核糖體rna(rrnb)?？刂菩蛄羞€可以是啟動子下游和基因的編碼序列上游的mrna穩(wěn)定子區(qū)，其增加該基因的表達(dá)。從蘇云金芽孢桿菌cryiiia基因和枯草芽孢桿菌sp82基因獲得適合的mrna穩(wěn)定區(qū)的實例。該控制序列還可以是信號肽編碼區(qū)，編碼與變體的n-端連接的信號肽，并且引導(dǎo)該變體進(jìn)入細(xì)胞的分泌通路。多核苷酸的編碼序列的5’-末端可以固有地包含信號肽編碼序列，該信號肽編碼序列在翻譯閱讀框中與編碼該變體的編碼序列的區(qū)段天然地連接在一起?？商娲兀幋a序列的5’-末端可以包含對編碼序列是外源的信號肽編碼序列。在編碼序列不天然地包含信號肽編碼序列的情況下，可能需要外源信號肽編碼序列。可替代地，外源信號肽編碼序列可以簡單地置換天然信號肽編碼序列，以便增強變體的分泌。然而，可以使用指導(dǎo)表達(dá)的變體進(jìn)入宿主細(xì)胞的分泌通路的任何信號肽編碼序列。用于細(xì)菌宿主細(xì)胞的有效信號肽編碼序列是從芽孢桿菌ncib11837生麥芽糖淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶、地衣芽孢桿菌鈣-內(nèi)酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌醹-淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(nprt、nprs、nprm)和枯草芽孢桿菌prsa的基因獲得的信號肽編碼序列。該控制序列還可以是編碼位于變體的n-末端處的前肽的一個前肽編碼序列。生成的多肽被稱為前體酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情況下被稱為酶原(zymogen))。多肽原通常是無活性的并且可以通過催化切割或自身催化切割來自多肽原的前肽而轉(zhuǎn)化為活性多肽。可以從枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶(apre)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprt)、嗜熱毀絲霉漆酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶和釀酒酵母醹-因子的基因獲得前肽編碼序列。在信號肽序列和前肽序列二者都存在的情況下，該前肽序列定位成緊鄰該變體的n-末端并且該信號肽序列定位成緊鄰該前肽序列的n-末端。還令人希望的可以是添加相對于宿主細(xì)胞的生長來調(diào)節(jié)該變體的表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的實例是響應(yīng)于化學(xué)或物理刺激而引起基因的表達(dá)開啟或關(guān)閉的那些，包括調(diào)控化合物的存在。原核系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括lac、tac、以及trp操縱子系統(tǒng)。表達(dá)載體本發(fā)明還涉及包括編碼本發(fā)明的變體的多核苷酸、啟動子、以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號的重組表達(dá)載體。不同的核苷酸和控制序列可以連接在一起以產(chǎn)生重組表達(dá)載體，這一重組表達(dá)載體可以包括一個或多個便利的限制酶切位點以允許在這些位點處插入或取代編碼該變體的多核苷酸?？商娲?，可以通過將多核苷酸或包含該多核苷酸的核酸構(gòu)建體插入用于表達(dá)的適當(dāng)載體中而表達(dá)該多核苷酸。在產(chǎn)生該表達(dá)載體時，該編碼序列位于該載體中，這樣使得該編碼序列與該供表達(dá)的適當(dāng)控制序列可操作地連接。重組表達(dá)載體可以是可便利地經(jīng)受重組dna程序并且可引起多核苷酸表達(dá)的任何載體(例如，質(zhì)?；虿《?。載體的選擇將典型地取決于該載體與有待引入該載體的宿主細(xì)胞的相容性。該載體可以是一種線性的或閉合的環(huán)狀質(zhì)粒。載體可以是自主復(fù)制載體，即，作為染色體外實體存在的載體，其復(fù)制獨立于染色體復(fù)制，例如，質(zhì)粒、染色體外元件、微染色體或人工染色體。該載體可包含任何用以保證自我復(fù)制的要素。可替代地，該載體可以是這樣載體，當(dāng)它被引入該宿主細(xì)胞中時，被整合到基因組中并且與其中已整合了它的一個或多個染色體一起復(fù)制。此外，可以使用單一載體或質(zhì)?；騼蓚€或更多個載體或質(zhì)粒(這些載體或質(zhì)粒共同包含待引入到宿主細(xì)胞的基因組中的總dna)或轉(zhuǎn)座子。該載體優(yōu)選包含一個或多個允許方便地選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞、轉(zhuǎn)染細(xì)胞、轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞等細(xì)胞的選擇性標(biāo)記。選擇性標(biāo)記是這樣一種基因，該基因的產(chǎn)物提供了殺生物劑抗性或病毒抗性、重金屬抗性、營養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)型等。細(xì)菌性選擇性標(biāo)記的實例是地衣芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌dal基因，或賦予抗生素抗性(例如氨芐青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大觀霉素或四環(huán)素抗性)的標(biāo)記。載體優(yōu)選包含允許載體整合到宿主細(xì)胞的基因組中或載體在細(xì)胞中獨立于基因組自主復(fù)制的一個或多個元件。對于整合到該宿主細(xì)胞基因組中，該載體可以依靠編碼該變體的多核苷酸序列或用于通過同源或非同源重組整合到該基因組中的該載體的任何其他元件?？商娲?，該載體可以包含用于指導(dǎo)通過同源重組而整合到宿主細(xì)胞基因組中的一個或多個染色體中的一個或多個精確位置的另外的多核苷酸。為了增加在精確位置整合的可能性，這些整合的元件應(yīng)包含足夠數(shù)量的核酸，例如100至10,000個堿基對、400至10,000個堿基對、以及800至10,000個堿基對，這些堿基對與對應(yīng)的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重組的可能性。這些整合元件可以是與宿主細(xì)胞的基因組內(nèi)的靶序列同源的任何序列。此外，這些整合元件可以是非編碼多核苷酸或編碼多核苷酸。在另一方面，該載體可以通過非同源重組整合到宿主細(xì)胞的基因組中。對于自主復(fù)制，該載體可以進(jìn)一步包括使該載體能夠在所討論的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的復(fù)制起點。復(fù)制起點可以是在細(xì)胞中起作用的介導(dǎo)自主復(fù)制的任何質(zhì)粒復(fù)制子。術(shù)語“復(fù)制起點”或“質(zhì)粒復(fù)制子”意指使質(zhì)?；蜉d體能夠在體內(nèi)復(fù)制的多核苷酸。細(xì)菌復(fù)制起點的實例是允許在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pbr322、puc19、pacyc177、以及pacyc184的復(fù)制起點，以及允許在芽孢桿菌屬中復(fù)制的質(zhì)粒pub110、pe194、pta1060、以及pamβ1的復(fù)制起點?？梢詫⒈景l(fā)明的多核苷酸的多于一個的拷貝插入到宿主細(xì)胞中以增加變體的產(chǎn)生。通過將序列的至少一個另外的拷貝整合到宿主細(xì)胞基因組中或通過包括一個與該多核苷酸一起的可擴(kuò)增的選擇性標(biāo)記基因可以獲得多核苷酸的增加的拷貝數(shù)目，其中通過在適當(dāng)?shù)倪x擇性試劑的存在下培養(yǎng)細(xì)胞可以選擇包含選擇性標(biāo)記基因的經(jīng)擴(kuò)增的拷貝的細(xì)胞、以及由此該多核苷酸的另外的拷貝。用于連接上述元件以構(gòu)建本發(fā)明的重組表達(dá)載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。宿主細(xì)胞本發(fā)明還涉及重組宿主細(xì)胞，這些重組宿主細(xì)胞包括編碼本發(fā)明的變體的、可操作地連接至一個或多個控制序列的多核苷酸，該一個或多個控制序列指導(dǎo)本發(fā)明的變體的產(chǎn)生。將包括多核苷酸的構(gòu)建體或載體引入宿主細(xì)胞中，這樣使得該構(gòu)建體或載體被維持作為染色體整合體或作為自主復(fù)制的染色體外載體，如早前所述。術(shù)語“宿主細(xì)胞”涵蓋由于復(fù)制過程中發(fā)生的突變與親本細(xì)胞不同的親本細(xì)胞的任何后代。宿主細(xì)胞的選擇在很大程度上將取決于編碼該變體的基因及其來源。宿主細(xì)胞可以是在重組產(chǎn)生變體中有用的任何細(xì)胞，例如原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。原核宿主細(xì)胞可以是任何革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細(xì)菌。革蘭氏陽性細(xì)菌包括但不限于：芽孢桿菌屬、梭菌屬、腸球菌屬、土芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、海洋芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、以及鏈霉菌屬。革蘭氏陰性細(xì)菌包括但不限于彎曲桿菌屬、大腸桿菌、黃桿菌屬、梭桿菌屬、螺桿菌屬、泥桿菌屬、奈瑟氏菌屬、假單胞菌屬、沙門氏菌屬、以及脲原體屬。細(xì)菌宿主細(xì)胞可以是任何芽孢桿菌屬細(xì)胞，包括但不限于：嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅硬芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌以及蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞。細(xì)菌宿主細(xì)胞還可以是任何鏈球菌屬細(xì)胞，包括但不限于：似馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌以及馬鏈球菌獸瘟亞種細(xì)胞。細(xì)菌宿主細(xì)胞還可以是任何鏈霉菌屬細(xì)胞，包括但不限于：不產(chǎn)色鏈霉菌、除蟲鏈霉菌、天藍(lán)鏈霉菌、灰色鏈霉菌、以及淺青紫鏈霉菌細(xì)胞。可通過以下方法實現(xiàn)將dna引入到芽孢桿菌屬細(xì)胞：原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，電穿孔或接合?？赏ㄟ^以下方法實現(xiàn)將dna引入到大腸桿菌細(xì)胞：原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化或電穿孔。可通過以下方法實現(xiàn)將dna引入到鏈霉菌屬細(xì)胞：原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、電穿孔、接合、或轉(zhuǎn)導(dǎo)?？赏ㄟ^以下方法實現(xiàn)將dna引入到假單胞菌屬細(xì)胞：電穿孔、或接合?？赏ㄟ^以下方法實現(xiàn)將dna引入到鏈球菌屬細(xì)胞：天然感受態(tài)(naturalcompetence)，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，電穿孔或接合。然而，可以使用本領(lǐng)域已知的將dna引入宿主細(xì)胞的任何方法。產(chǎn)生方法本發(fā)明還涉及產(chǎn)生變體的方法，這些方法包括：(a)在適于表達(dá)該變體的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞；并且(b)回收該變體。這些宿主細(xì)胞使用本領(lǐng)域已知的方法在適合于產(chǎn)生變體的營養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。例如，可以通過搖瓶培養(yǎng)，或者在適合的培養(yǎng)基中并在允許該變體表達(dá)和/或分離的條件下在實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中進(jìn)行小規(guī)模或大規(guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)發(fā)酵、分批發(fā)酵、分批給料發(fā)酵或固態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)該細(xì)胞。該培養(yǎng)是使用本領(lǐng)域中已知的程序，在一種適合營養(yǎng)培養(yǎng)基中發(fā)生，該培養(yǎng)基包含碳和氮來源及無機鹽。適合的培養(yǎng)基可從商業(yè)供應(yīng)商獲得或可以根據(jù)公開的組成(例如，在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)制備。如果該變體被分泌到該營養(yǎng)培養(yǎng)基中，則該變體可直接從該培養(yǎng)基中回收。如果該變體沒有分泌，則它可從細(xì)胞裂解液中回收。使用本領(lǐng)域已知的對具有蛋白酶活性的變體特異的方法可以檢測該變體。這些檢測方法包括但不限于，特異性抗體的使用、酶產(chǎn)物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶測定來確定該變體的活性。可以使用本領(lǐng)域已知的方法來回收該變體。例如，可以通過多種常規(guī)程序從該營養(yǎng)培養(yǎng)基中回收該變體，這些常規(guī)程序包括但不局限于收集、離心、過濾、萃取、噴霧干燥、蒸發(fā)、或沉淀。可以通過本領(lǐng)域中已知的多種程序來純化變體以獲得基本上純的變體，這些程序包括但不限于色譜法(例如，離子交換色譜、親和色譜、疏水作用色譜、色譜聚焦、以及尺寸排阻色譜)、電泳程序(例如，制備型等電點聚焦)、差別溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、sds-page、或萃取。在可替代的方面，沒有回收該變體，而是將表達(dá)該變體的本發(fā)明的宿主細(xì)胞用作該變體的來源。組合物在某一方面中，根據(jù)本發(fā)明的枯草桿菌酶變體相比于親本酶或者相比于具有與所述變體一致的氨基酸序列但是在一個或多個所述指定位置處不具有改變的蛋白酶或者相比于seqidno:2的多肽或相比于seqidno3的多肽具有改進(jìn)的洗滌性能，其中使用自動機械應(yīng)力測定(amsa)測量洗滌性能。在某另一個方面，根據(jù)本發(fā)明的枯草桿菌酶變體相比于親本酶或者相比于具有與所述變體一致的氨基酸序列但是在一個或多個所述指定位置處不具有改變的蛋白酶或者相比于seqidno:2的多肽或相比于seqidno3的多肽具有改進(jìn)的穩(wěn)定性，優(yōu)選在洗滌期間改進(jìn)的穩(wěn)定性，其中如在本文的材料和方法部分中實例4中所述‘穩(wěn)定性測定’來測量穩(wěn)定性。組合物可以是洗滌劑組合物，其包括根據(jù)本發(fā)明的可以用于清潔過程如衣物洗滌或硬表面清潔的枯草桿菌酶變體。另外的組分的選擇處于本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍內(nèi)并且包含常規(guī)的成分，包括下文所述的示例性非限制性組分。對于織物護(hù)理，組分的選擇可以包括以下考慮：有待清潔的織物的類型、污漬的類型和/或程度、進(jìn)行清潔時的溫度、以及洗滌劑產(chǎn)品的配制。盡管根據(jù)具體的功能性對以下提及的組分由通用標(biāo)題進(jìn)行分類，但是這并不被解釋為限制，因為如將被普通技術(shù)人員所理解，一種組分可以包括另外的功能性。本發(fā)明的酶在本發(fā)明的一個實施例中，可以將本發(fā)明的多肽以對應(yīng)于以下的量添加至洗滌劑組合物中：0.01-200mg酶蛋白/升洗滌液，優(yōu)選0.05-50mg酶蛋白/升洗滌液，特別是0.1-10mg酶蛋白/升洗滌液。用于在自動洗碗機(adw)中使用的組合物例如可以包括按該組合物的重量計0.0001％-50％，例如0.001％-30％，例如0.01％-20％，例如0.5％-15％的酶蛋白。用于在衣物洗滌造粒(laundrygranulation)中使用的組合物例如可以包含按該組合物的重量計0.0001％-50％，例如0.001％-20％，例如0.01％-10％，例如0.05％-5％的酶蛋白。用于在衣物洗滌液中使用的組合物例如可以包括按該組合物的重量計0.0001％-10％，例如0.001％-7％，例如0.1％-5％的酶蛋白。可以使用常規(guī)穩(wěn)定劑來穩(wěn)定洗滌劑組合物中的一種或多種酶，這些穩(wěn)定劑例如是多元醇(如丙二醇或甘油)、糖或糖醇、乳酸、硼酸、或硼酸衍生物(例如，芳族硼酸酯、或苯基硼酸衍生物(如4-甲酰苯基硼酸))，并且該組合物可以如例如wo92/19709和wo92/19708中所述進(jìn)行配制，或者可以使用如wo2005/105826和wo2009/118375所述的肽醛或酮來穩(wěn)定根據(jù)本發(fā)明的枯草桿菌酶變體。本發(fā)明的變體還可以摻入到wo97/07202(通過引用結(jié)合在此)中所披露的洗滌劑配制品中。表面活性劑洗滌劑組合物可以包括一種或多種表面活性劑，它們可以是陰離子的和/或陽離子的和/或非離子的和/或半極性的和/或兼性離子的或其混合物。在一個具體實施例中，洗滌劑組合物包括一種或多種非離子型表面活性劑和一種或多種陰離子表面活性劑的混合物。典型地，表面活性劑按重量計以從大約0.1％至60％，如大約1％至大約40％、或大約3％至大約20％、或大約3％至大約10％的水平存在?；谒Ｍ那鍧崙?yīng)用來選擇這種或這些表面活性劑，并且這種或這些表面活性劑包括本領(lǐng)域中已知的任何一種或多種常規(guī)表面活性劑?？梢岳帽绢I(lǐng)域中已知的用于在洗滌劑中使用的任何表面活性劑。當(dāng)包含在其中時，所述去污劑通常將會包含按重量計約1％至約40％，例如約5％至約30％，包括約5％至約15％，或約20％至約25％的陰離子型表面活性劑。陰離子表面活性劑的非限制性實例包括硫酸鹽和磺酸鹽，具體地，直鏈烷基苯磺酸鹽(las)、las的異構(gòu)體、支鏈烷基苯磺酸鹽(babs)、苯基鏈烷磺酸鹽、α-烯烴磺酸鹽(aos)、烯烴磺酸鹽、鏈烯烴磺酸鹽、鏈烷-2,3-二基雙(硫酸鹽)、羥基鏈烷磺酸鹽以及二磺酸鹽、烷基硫酸鹽(as)(例如十二烷基硫酸鈉(sds))、脂肪醇硫酸鹽(fas)、伯醇硫酸鹽(pas)、醇醚硫酸鹽(aes或aeos或fes、也被稱為醇乙氧基硫酸鹽或脂肪醇醚硫酸鹽)、仲鏈烷磺酸鹽(sas)、石蠟烴磺酸鹽(ps)、酯磺酸鹽、磺化的脂肪酸甘油酯、α-磺酸基脂肪酸甲酯(α-sfme或ses)(包括甲酯磺酸鹽(mes))、烷基琥珀酸或烯基琥珀酸、十二烯基/十四烯基琥珀酸(dtsa)、氨基酸的脂肪酸衍生物、磺酸基琥珀酸或皂的二酯和單酯、及其組合。當(dāng)被包括在其中時，洗滌劑將通常包含按重量計從約0％至約10％的陽離子表面活性劑。陽離子表面活性劑的非限制性實例包括烷基二甲基乙醇季胺(admeaq)、十六烷基三甲基溴化銨(ctab)、二甲基二硬脂酰氯化銨(dsdmac)、以及烷基芐基二甲基銨、烷基季銨化合物、烷氧基化季銨(aqa)化合物及其組合。當(dāng)被包括在其中時，洗滌劑將通常包含按重量計從約0.2％至約40％的非離子型表面活性劑，例如從約0.5％至約30％，特別是從約1％至約20％、從約3％至約10％，例如從約3％至約5％、或從約8％至約12％。非離子型表面活性劑的非限制性實例包括醇乙氧基化物(ae或aeo)、醇丙氧基化物、丙氧基化的脂肪醇(pfa)，烷氧基化的脂肪酸烷基酯(例如乙氧基化的和/或丙氧基化的脂肪酸烷基酯)，烷基酚乙氧基化物(ape)，壬基酚乙氧基化物(npe)，烷基多糖苷(apg)，烷氧基化胺，脂肪酸單乙醇酰胺(fam)，脂肪酸二乙醇酰胺(fada)，乙氧基化的脂肪酸單乙醇酰胺(efam)，丙氧基化的脂肪酸單乙醇酰胺(pfam)，多羥基烷基脂肪酸酰胺，或葡萄糖胺的n-?；鵱-烷基衍生物(葡糖酰胺(ga)，或脂肪酸葡糖酰胺(faga))，連同在span和tween商品名下可獲得的產(chǎn)品，及其組合。當(dāng)被包括在其中時，洗滌劑將通常包含按重量計從約0％至約10％的半極性表面活性劑。半極性表面活性劑的非限制性實例包括氧化胺(ao)，例如烷基二甲基氧化胺、n-(椰油基烷基)-n,n-二甲基氧化胺和n-(牛油-烷基)-n,n-雙(2-羥乙基)氧化胺、脂肪酸鏈烷醇酰胺和乙氧基化的脂肪酸鏈烷醇酰胺及其組合。當(dāng)被包括在其中時，洗滌劑將通常包含按重量計從約0％至約10％的兼性離子表面活性劑。兼性離子表面活性劑的非限制性實例包括甜菜堿、烷基二甲基甜菜堿、磺基甜菜堿及其組合。助水溶劑助水溶劑是如下化合物，該化合物在水性溶液中溶解疏水化合物(或相反地，在非極性環(huán)境中的極性物質(zhì))。典型地，助水溶劑同時具有親水的和疏水的特征(如從表面活性劑已知的所謂兩親特性)；然而助水溶劑的分子結(jié)構(gòu)一般并不有利于自發(fā)自聚集。助水溶劑并不顯示一個臨界濃度，高于該濃度就會發(fā)生如對表面活性劑而言所發(fā)現(xiàn)的自聚集并且脂質(zhì)形成膠束、薄層或其他很好地定義的中間相。相反，許多助水溶劑顯示連續(xù)類型的聚集過程，其中聚集物的大小隨著濃度增加而增長。然而，很多助水溶劑改變了包含極性和非極性特征的物質(zhì)的系統(tǒng)(包括水、油、表面活性劑、和聚合物的混合物)的相行為、穩(wěn)定性、和膠體特性。經(jīng)典地從制藥、個人護(hù)理、食品跨行業(yè)至技術(shù)應(yīng)用使用助水溶劑。助水溶劑在洗滌劑組合物中的使用允許例如更濃的表面活性劑配制品(如在通過去除水而壓縮液體洗滌劑的過程中)而不引起不希望的現(xiàn)象，例如相分離或高粘度。洗滌劑可以包含按重量計0-5％，例如約0.5％至約5％、或約3％至約5％的助水溶劑?？梢岳帽绢I(lǐng)域中已知的用于在洗滌劑中使用的任何助水溶劑。助水溶劑的非限制性實例包括苯磺酸鈉、對甲苯磺酸鈉(sts)、二甲苯磺酸鈉(sxs)、枯烯磺酸鈉(scs)、傘花烴磺酸鈉、氧化胺、醇和聚乙二醇醚、羥基萘甲酸鈉、羥基萘磺酸鈉、乙基己基磺酸鈉及其組合。助洗劑和共助洗劑洗滌劑組合物可以包含按重量計大約0-65％，如大約5％至大約45％的洗滌劑助洗劑或共助洗劑，或其混合物。在洗滌餐具洗滌劑中，助洗劑的水平典型地是40％-65％，特別是50％-65％。助洗劑和/或共助洗劑可以具體是形成具有ca和mg的水溶性絡(luò)合物的螫合劑?？梢岳帽绢I(lǐng)域中已知的用于在衣物洗滌劑中使用的任何助洗劑和/或共-助洗劑。助洗劑的非限制性實例包括沸石、二磷酸鹽(焦磷酸鹽)、三磷酸鹽例如三磷酸鈉(stp或stpp)、碳酸鹽例如碳酸鈉、可溶性硅酸鹽例如硅酸鈉、層狀硅酸鹽(例如來自赫斯特公司(hoechst)的sks-6)、乙醇胺例如2-氨基乙-1-醇(mea)、二乙醇胺(dea，也稱為亞氨基二乙醇)、三乙醇胺(tea，也稱為2,2’,2”-次氨基三乙醇)、以及羧甲基菊粉(cmi)及其組合。洗滌劑組合物還可以包含按重量計0-20％，例如約5％至約10％的洗滌劑共助洗劑或其混合物。洗滌劑組合物可以單獨地包括一種共助洗劑，或與一種助洗劑，例如沸石助洗劑組合。共助洗劑的非限制性實例包括聚丙烯酸酯的均聚物或其共聚物，例如聚(丙烯酸)(paa)或共聚(丙烯酸/馬來酸)(paa/pma)。另外的非限制性實例包括檸檬酸鹽，螯合劑，例如氨基羧酸鹽、氨基多羧酸鹽和磷酸鹽，以及烷基-或烯基琥珀酸。另外的具體實例包括2,2’,2”-次氨基三乙酸(nta)、乙二胺四乙酸(edta)、二亞乙基三胺五乙酸(dtpa)、亞氨基二丁二酸(iminodisuccinicacid)(ids)、乙二胺-n,n’-二丁二酸(edds)、甲基甘氨酸二乙酸(mgda)、谷氨酸-n,n-二乙酸(glda)、1-羥基乙烷-1,1-二膦酸(hedp)、乙二胺四-(亞甲基膦酸)(edtmpa)、二亞乙基三胺五(亞甲基膦酸)(dtpmpa或dtmpa)、n-(2-羥乙基)亞氨基二乙酸(edg)、天冬氨酸-n-單乙酸(asma)、天冬氨酸-n,n-二乙酸(asda)、天冬氨酸-n-單丙酸(asmp)、亞氨基二丁二酸(iminodisuccinicacid)(ida)、n-(2-磺甲基)-天冬氨酸(smas)、n-(2-磺乙基)-天冬氨酸(seas)、n-(2-磺甲基)-谷氨酸(smgl)、n-(2-磺乙基)-谷氨酸(segl)、n-甲基亞氨基二乙酸(mida)、α-丙氨酸-n,n-二乙酸(α-alda)、絲氨酸-n,n-二乙酸(seda)、異絲氨酸-n,n-二乙酸(isda)、苯丙氨酸-n,n-二乙酸(phda)、鄰氨基苯甲酸-n,n-二乙酸(anda)、磺胺酸-n,n-二乙酸(slda)、牛磺酸-n,n-二乙酸(tuda)以及磺甲基-n,n-二乙酸(smda)、n-(2-羥乙基)-亞乙基二胺-n,n’,n’-三乙酸鹽(hedta)、二乙醇甘氨酸(deg)、二亞乙基三胺五(亞甲基膦酸)(dtpmp)、氨基三(亞甲基膦酸)(atmp)及其組合和鹽。其他示例性助洗劑和/或共助洗劑描述于例如wo09/102854、us5977053中漂白系統(tǒng)所述洗滌劑可以包含按重量計0-50％，如約0.1％至約25％的漂白系統(tǒng)?？梢岳帽绢I(lǐng)域中已知的用于在衣物洗滌劑中使用的任何漂白系統(tǒng)。適合的漂白系統(tǒng)組分包括漂白催化劑、光漂白劑、漂白活化劑、過氧化氫源如過碳酸鈉和過硼酸鈉、預(yù)成型過酸及其混合物。適合的預(yù)成型過酸包括但不限于：過氧羧酸及鹽、過碳酸及鹽、過亞氨酸(perimidicacid)及鹽、過氧單硫酸及鹽(例如過硫酸氫鉀(oxone(r))、及其混合物。漂白系統(tǒng)的非限制性實例包括基于過氧化物的漂白系統(tǒng)，這些系統(tǒng)可以包括例如與過酸形成漂白活化劑組合的無機鹽，包括堿金屬鹽，如過硼酸鹽(通常是單水合物或四水合物)、過碳酸鹽、過硫酸鹽、過磷酸鹽、過硅酸鹽的鈉鹽。術(shù)語漂白活化劑在此意指一種與過氧化物漂白劑(像過氧化氫)反應(yīng)以形成過酸的化合物。因此形成的過酸構(gòu)成活化的漂白劑。有待在此使用的適合漂白活化劑包括屬于酯酰胺、酰亞胺或酸酐類別的那些。適合的實例是四乙?；叶?taed)、4-[(3,5,5-三甲基己酰)氧基]苯磺酸鈉(isonobs)、二過氧月桂酸、4-(十二?；趸?苯磺酸鹽(lobs)、4-(癸?；趸?苯磺酸鹽、4-(癸?；趸?苯甲酸鹽(dobs)、4-(壬?；趸?-苯磺酸鹽(nobs)、和/或披露于wo98/17767中的那些。感興趣的漂白活化劑的具體家族披露于ep624154中并且在那個家族中特別優(yōu)選的是乙酰檸檬酸三乙酯(atc)。atc或短鏈甘油三酸酯(像三醋汀)具有以下優(yōu)點，它是環(huán)境友好的，因為它最終降解為檸檬酸和醇。此外，乙酰檸檬酸三乙酯和三醋汀在儲存時在產(chǎn)品中具有良好的水解穩(wěn)定性，并且它是一種有效的漂白活化劑。最后，atc為衣物洗滌添加劑提供一種良好的助洗能力?？商娲?，漂白系統(tǒng)可以包括例如酰胺、酰亞胺、或砜型的過氧酸。該漂白系統(tǒng)還可以包括過酸，例如6-(苯二甲酰亞氨基)過己酸(pap)。該漂白系統(tǒng)還可以包括漂白催化劑。在一些實施例中，漂白組分可以是選自下組的有機催化劑，該組由以下各項組成：具有下式的有機催化劑：(iii)及其混合物；其中每個r1獨立地是包含從9至24個碳的支鏈烷基基團(tuán)或包含從11至24個碳的直鏈烷基基團(tuán)，優(yōu)選地，每個r1獨立地是包含從9至18個碳的支鏈烷基基團(tuán)或包含從11至18個碳的直鏈烷基基團(tuán)，更優(yōu)選地，每個r1獨立地選自下組，該組由以下各項組成：2-丙基庚基、2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、正-十二烷基、正-十四烷基、正-十六烷基、正-十八烷基、異-壬基、異-癸基、異-十三基和異-十五烷基。其他示例性漂白系統(tǒng)描述于例如wo2007/087258、wo2007/087244、wo2007/087259以及wo2007/087242中。適合的光漂白劑可以例如是磺化的酞菁鋅。聚合物洗滌劑可以包含按重量計0-10％，如0.5％-5％、2％-5％、0.5％-2％或0.2％-1％的聚合物?？梢岳帽绢I(lǐng)域中已知的用于在洗滌劑中使用的任何聚合物。該聚合物可以作為如以上提到的共助洗劑起作用，或可以提供抗再沉積、纖維保護(hù)、污物釋放、染料轉(zhuǎn)移抑制、油污清潔和/或防沫特性。一些聚合物可以具有多于一種的以上提到的特性和/或多于一種的以下提到的基序。示例性聚合物包括(羧甲基)纖維素(cmc)、聚(乙烯醇)(pva)、聚(乙烯吡咯烷酮)(pvp)、聚(乙二醇)或聚(環(huán)氧乙烷)(peg)、乙氧基化的聚(亞乙基亞胺)、羧甲基菊粉(cmi)、和聚羧化物，例如paa、paa/pma、聚-天冬氨酸、和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物、疏水修飾cmc(hm-cmc)和硅酮、對苯二甲酸和低聚乙二醇的共聚物、聚(對苯二甲酸乙二酯)和聚(氧乙烯對苯二甲酸乙二酯)的共聚物(pet-poet)、pvp、聚(乙烯基咪唑)(pvi)、聚(乙烯吡啶-n-氧化物)(pvpo或pvpno)以及聚乙烯吡咯烷酮-乙烯基咪唑(pvpvi)。另外的示例性聚合物包括磺化的聚羧酸酯、聚環(huán)氧乙烷和聚環(huán)氧丙烷(peo-ppo)以及乙氧基硫酸二季銨鹽。其他示例性聚合物披露于例如wo2006/130575中。也考慮了以上提到的聚合物的鹽?？椢镎{(diào)色劑本發(fā)明的洗滌劑組合物還可以包括織物調(diào)色劑，例如染料或色素，當(dāng)配制在洗滌劑組合物中時，當(dāng)所述織物與一種洗滌液接觸時織物調(diào)色劑可以沉積在織物上，該洗滌液包括所述洗滌劑組合物，并且因此通過可見光的吸收/反射改變所述織物的色彩。熒光增白劑發(fā)射至少一些可見光。相比之下，因為它們吸收至少一部分可見光光譜，所以織物調(diào)色劑改變表面的色彩。適合的織物調(diào)色劑包括染料和染料-粘土軛合物，并且還可以包括色素。適合的染料包括小分子染料和聚合物染料。適合的小分子染料包括選自下組的小分子染料，該組由落入顏色索引(colourindex)(c.i.)分類的以下染料組成：直接藍(lán)、直接紅、直接紫、酸性藍(lán)、酸性紅、酸性紫、堿性藍(lán)、堿性紫和堿性紅或其混合物，例如如描述于wo2005/03274、wo2005/03275、wo2005/03276以及ep1876226(通過引用而特此結(jié)合)中。洗滌劑組合物優(yōu)選包括從約0.00003wt％至約0.2wt％、從約0.00008wt％至約0.05wt％、或甚至從約0.0001wt％至約0.04wt％的織物調(diào)色劑。該組合物可以包括從0.0001wt％至0.2wt％的織物調(diào)色劑，當(dāng)該組合物處于單位劑量袋的形式時，這可以是特別優(yōu)選的。適合的調(diào)色劑還披露于例如wo2007/087257和wo2007/087243中。另外的酶洗滌劑添加劑連同洗滌劑組合物可以包括一種或多種另外的酶，例如蛋白酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、淀粉酶、糖酶、纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如漆酶、和/或過氧化物酶。一般而言，一種或多種所選酶的特性應(yīng)與選定的洗滌劑相容(即，最適ph，與其他酶和非酶成分的相容性，等)，并且該一種或多種酶應(yīng)以有效量存在。纖維素酶適合的纖維素酶包括細(xì)菌或真菌來源的那些。包括化學(xué)修飾的突變體或蛋白質(zhì)工程化的突變體。適合的纖維素酶包括來自芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、腐質(zhì)霉屬、鐮刀菌屬、梭孢殼菌屬、支頂孢屬的纖維素酶，例如披露于us4,435,307、us5,648,263、us5,691,178、us5,776,757以及wo89/09259中的由特異腐質(zhì)霉、嗜熱毀絲霉和尖孢鐮刀菌產(chǎn)生的真菌纖維素酶。尤其適合的纖維素酶是具有顏色護(hù)理益處的堿性或中性纖維素酶。這類纖維素酶的實例是在ep0495257、ep0531372、wo96/11262、wo96/29397、wo98/08940中描述的纖維素酶。其他實例為纖維素酶變體，例如在wo94/07998、ep0531315、us5,457,046、us5,686,593、us5,763,254、wo95/24471、wo98/12307以及pct/dk98/00299中描述的那些。表現(xiàn)出內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶活性的纖維素酶(ec3.2.1.4)的實例是已經(jīng)描述于wo02/099091中的那些。纖維素酶的其他實例包括描述于wo96/29397中的家族45纖維素酶，并且特別是在對應(yīng)于wo02/099091的seqidno:8中的以下位置的一個或多個位置處具有取代、插入和/或缺失的其變體：2、4、7、8、10、13、15、19、20、21、25、26、29、32、33、34、35、37、40、42、42a、43、44、48、53、54、55、58、59、63、64、65、66、67、70、72、76、79、80、82、84、86、88、90、91、93、95、95d、95h、95j、97、100、101、102、103、113、114、117、119、121、133、136、137、138、139、140a、141、143a、145、146、147、150e、150j、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160c、160e、160k、161、162、164、165、168、170、171、172、173、175、176、178、181、183、184、185、186、188、191、192、195、196、200、和/或20，優(yōu)選選自p19a、g20k、q44k、n48e、q119h或q146r。可商購的纖維素酶包括celluzymetm、和carezymetm(諾維信公司(novozymesa/s))、clazinasetm、和puradaxhatm(杰能科國際有限公司(genencorinternationalinc.))、以及kac-500(b)tm(花王株式會社(kaocorporation))。蛋白酶適合的另外的蛋白酶包括細(xì)菌、真菌、植物、病毒或動物來源的那些，例如植物或微生物來源。優(yōu)選微生物來源。包括化學(xué)修飾的突變體或蛋白質(zhì)工程化的突變體。它可以是堿性蛋白酶，例如絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶。絲氨酸蛋白酶可以例如是s1家族(如胰蛋白酶)或s8家族(如枯草桿菌蛋白酶)。金屬蛋白酶可以例如是來自例如家族m4的嗜熱菌蛋白酶或其他金屬蛋白酶，例如來自m5、m7或m8家族的那些。術(shù)語“枯草桿菌酶”是指根據(jù)斯艾森(siezen)等人，蛋白質(zhì)工程(proteinengng.)4(1991)719-737和斯艾森等人，蛋白質(zhì)科學(xué)(proteinscience)6(1997)501-523的絲氨酸蛋白酶亞組。絲氨酸蛋白酶是特征為在活性位點具有與底物形成共價加合物的絲氨酸的蛋白酶的一個亞組?？莶輻U菌酶(subtilase)可以劃分為6個亞部，即，枯草桿菌蛋白酶家族、嗜熱蛋白酶(thermitase)家族、蛋白酶k家族、羊毛硫氨酸抗生素肽酶(lantibioticpeptidase)家族、kexin家族和pyrolysin家族。枯草桿菌酶的實例是來源于芽孢桿菌屬的那些，例如描述于us7262042和wo09/021867中的遲緩芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短小芽孢桿菌和吉氏芽孢桿菌；和描述于wo89/06279中的枯草桿菌蛋白酶lentus、枯草桿菌蛋白酶novo、枯草桿菌蛋白酶carlsberg、地衣芽孢桿菌、枯草桿菌蛋白酶bpn’、枯草桿菌蛋白酶309、枯草桿菌蛋白酶147和枯草桿菌蛋白酶168以及描述于(wo93/18140)中的蛋白酶pd138。其他有用的蛋白酶可以是描述于wo92/175177、wo01/016285、wo02/026024以及wo02/016547中的那些。胰蛋白酶樣蛋白酶的實例是胰蛋白酶(例如豬或牛來源的)和鐮孢屬蛋白酶(描述于wo89/06270、wo94/25583和wo05/040372中)，以及來源于纖維單胞菌(cellumonas)的糜蛋白酶(描述于wo05/052161和wo05/052146中)。另外的優(yōu)選的蛋白酶是來自遲緩芽孢桿菌dsm5483的堿性蛋白酶(如在(例如)wo95/23221中所述)、以及其變體(在wo92/21760、wo95/23221、ep1921147以及ep1921148中描述的)。金屬蛋白酶的實例是如描述于wo07/044993(杰能科國際公司(genencorint.))中的中性金屬蛋白酶，例如來源于解淀粉芽孢桿菌的那些。有用的蛋白酶的實例是于以下各項中的變體：wo92/19729、wo96/034946、wo98/20115、wo98/20116、wo99/011768、wo01/44452、wo03/006602、wo04/03186、wo04/041979、wo07/006305、wo11/036263、wo11/036264，尤其是在以下位置的一個或多個中具有取代的變體：3、4、9、15、27、36、57、68、76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、118、120、123、128、129、130、160、167、170、194、195、199、205、206、217、218、222、224、232、235、236、245、248、252以及274，使用bpn’進(jìn)行編號。更優(yōu)選地，這些枯草桿菌酶變體可以包含以下突變：s3t、v4i、s9r、a15t、k27r、*36d、v68a、n76d、n87s,r、*97e、a98s、s99g,d,a、s99ad、s101g,m,r、s103a、v104i,y,n、s106a、g118v,r、h120d,n、n123s、s128l、p129q、s130a、g160d、y167a、r170s、a194p、g195e、v199m、v205i、l217d、n218d、m222s、a232v、k235l、q236h、q245r、n252k、t274a(使用bpn’進(jìn)行編號)。適合的可商購蛋白酶包括以下列商品名出售的那些：duralasetm、durazymtm、賽威蛋白酶賽威蛋白酶以及(諾維信公司)，以下列商品名出售的那些：以及(丹尼斯克/杜邦公司(danisco/dupont))、axapemtm(吉斯特布羅卡德斯公司(gist-brocasesn.v.))、blap(序列示于us5352604的圖29中)及其變體(漢高股份(henkelag))以及來自花王株式會社(kao)的kap(嗜堿芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶)。脂肪酶和角質(zhì)酶適合的脂肪酶和角質(zhì)酶包括細(xì)菌來源或真菌來源的那些。包括化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程化的突變酶。實例包括來自嗜熱真菌屬的脂肪酶，例如，如描述于ep258068和ep305216中的來自疏綿狀嗜熱絲孢菌(早先命名為疏棉狀腐質(zhì)霉)；來自腐質(zhì)霉屬的角質(zhì)酶，例如特異腐質(zhì)霉(wo96/13580)；來自假單胞菌屬的菌株的脂肪酶(這些中的一些現(xiàn)在改名為伯克霍爾氏菌屬)，例如產(chǎn)堿假單胞菌或類產(chǎn)堿假單胞菌(ep218272)、洋蔥假單胞菌(ep331376)、假單胞菌屬菌株sd705(wo95/06720和wo96/27002)、威斯康星假單胞菌(p.wisconsinensis)(wo96/12012)；gdsl-型鏈霉菌屬脂肪酶(wo10/065455)；來自稻瘟病菌的角質(zhì)酶(wo10/107560)；來自門多薩假單胞菌的角質(zhì)酶(美國5,389,536)；來自褐色嗜熱裂孢菌(thermobifidafusca)的脂肪酶(wo11/084412)；嗜熱脂肪土芽孢桿菌脂肪酶(wo11/084417)；來自枯草芽孢桿菌的脂肪酶(wo11/084599)；以及來自灰色鏈霉菌(wo11/150157)和始旋鏈霉菌(s.pristinaespiralis)的脂肪酶(wo12/137147)。其他實例是例如ep407225、wo92/05249、wo94/01541、wo94/25578、wo95/14783、wo95/30744、wo95/35381、wo95/22615、wo96/00292、wo97/04079、wo97/07202、wo00/34450、wo00/60063、wo01/92502、wo07/87508以及wo09/109500中所描述的那些脂肪酶變體。優(yōu)選的商業(yè)化脂肪酶產(chǎn)品包括lipolasetm、lipextm；lipolextm和lipocleantm(諾維信公司)，lumafast(來自杰能科公司(genencor))以及l(fā)ipomax(來自吉斯特布羅卡德斯公司(gist-brocades))。再其他實例是有時稱為?；D(zhuǎn)移酶或過水解酶的脂肪酶，例如與南極假絲酵母(candidaantarctica)脂肪酶a具有同源性的?；D(zhuǎn)移酶(wo10/111143)、來自恥垢分枝桿菌(mycobacteriumsmegmatis)的?；D(zhuǎn)移酶(wo05/56782)、來自ce7家族的過水解酶(wo09/67279)以及恥垢分枝桿菌過水解酶的變體(特別是來自亨斯邁紡織品染化有限公司(huntsmantextileeffectspteltd)的商業(yè)產(chǎn)品gentlepowerbleach中所用的s54v變體)(wo10/100028)。淀粉酶可以與本發(fā)明的枯草桿菌酶變體一起使用的適合的淀粉酶可以是α-淀粉酶或葡糖淀粉酶并且可以具有細(xì)菌或真菌來源。包括化學(xué)修飾的突變體或蛋白質(zhì)工程化的突變體。淀粉酶包括例如從芽孢桿菌屬、例如從在gb1,296,839中更詳細(xì)描述的地衣芽孢桿菌的特定菌株獲得的α淀粉酶。適合的淀粉酶包括具有在wo95/10603中的seqidno:3的淀粉酶或與seqidno:3具有90％序列一致性的其變體。優(yōu)選的變體描述于wo94/02597、wo94/18314、wo97/43424以及wo99/019467的seqidno:4中，例如在一個或多個以下位置中具有取代的變體：15、23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、209、211、243、264、304、305、391、408以及444。不同的適合的淀粉酶包括具有wo02/010355中的seqidno:6的淀粉酶或與其具有90％序列一致性的變體。優(yōu)選變體是在位置181和182中具有一個缺失并且在位置193中具有一個取代的那些。其他適合的淀粉酶是包括示于wo2006/066594的seqidno:6中的來源于解淀粉芽孢桿菌的α-淀粉酶的殘基1-33和示于wo2006/066594的seqidno:4中的地衣芽孢桿菌α-淀粉酶的殘基36-483的雜合α-淀粉酶或其具有90％序列一致性的變體。這一雜合α-淀粉酶的優(yōu)選變體是在以下位置中的一個或多個中具有取代、缺失或插入的那些：g48、t49、g107、h156、a181、n190、m197、i201、a209以及q264。包括示于wo2006/066594的seqidno:6中的來源于解淀粉芽孢桿菌的α-淀粉酶的殘基1-33和示于wo2006/066594的seqidno:4的殘基36-483的雜合α-淀粉酶的最優(yōu)選變體是具有以下取代的那些：m197t；h156y+a181t+n190f+a209v+q264s；或g48a+t49i+g107a+h156y+a181t+n190f+i201f+a209v+q264s。另外的適合的淀粉酶是具有在wo99/019467中的seqidno:6的淀粉酶或與seqidno:6具有90％序列一致性的其變體。seqidno:6的優(yōu)選變體是那些在以下一個或多個位置具有取代、缺失或插入的變體：r181、g182、h183、g184、n195、i206、e212、e216和k269。特別優(yōu)選的淀粉酶是在位置r181和g182或位置h183和g184中具有缺失的那些。能被使用的另外的淀粉酶是那些具有wo96/023873的seqidno:1、seqidno:3、seqidno:2或seqidno:7的淀粉酶或與seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3或seqidno:7具有90％序列一致性的其變體。seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3或seqidno:7的優(yōu)選變體是在以下位置中的一個或多個中具有取代、缺失或插入的那些：140、181、182、183、184、195、206、212、243、260、269、304以及476。更優(yōu)選的變體是在位置181和182或位置183和184中具有缺失的那些。seqidno:1、seqidno:2或seqidno:7的最優(yōu)選的淀粉酶變體是在位置183和184中具有缺失并且在位置140、195、206、243、260、304以及476中的一個或多個中具有取代的那些?？梢允褂玫钠渌矸勖甘蔷哂衱o08/153815中的seqidno:2、wo01/66712中的seqidno:10的淀粉酶或其與wo08/153815的seqidno:2具有90％序列一致性或與wo01/66712中的seqidno:10具有90％序列一致性的變體。wo01/66712中的seqidno:10的優(yōu)選變體是在以下位置中的一個或多個中具有取代、缺失或插入的那些：176、177、178、179、190、201、207、211以及264。另外的適合的淀粉酶是具有wo09/061380中的seqidno:2的淀粉酶或其與seqidno:2具有90％序列一致性的變體。seqidno:2的優(yōu)選變體是在以下位置中的一個或多個中具有c-末端的截短和/或取代、缺失或插入的那些：q87、q98、s125、n128、t131、t165、k178、r180、s181、t182、g183、m201、f202、n225、s243、n272、n282、y305、r309、d319、q320、q359、k444以及g475。seqidno:2的更優(yōu)選變體是在一個或多個以下位置中具有取代的那些：q87e,r、q98r、s125a、n128c、t131i、t165i、k178l、t182g、m201l、f202y、n225e,r、n272e,r、s243q,a,e,d、y305r、r309a、q320r、q359e、k444e以及g475k和/或位置r180和/或s181或t182和/或g183的缺失。seqidno:2的最優(yōu)選的淀粉酶變體是具有以下取代的那些：n128c+k178l+t182g+y305r+g475k；n128c+k178l+t182g+f202y+y305r+d319t+g475k；s125a+n128c+k178l+t182g+y305r+g475k；或s125a+n128c+t131i+t165i+k178l+t182g+y305r+g475k，其中這些變體是c-末端截短的并且任選地進(jìn)一步在位置243處包括取代和/或在位置180和/或位置181處包括缺失。其他的適合的淀粉酶是具有在wo01/66712中的seqidno:12的淀粉酶或與seqidno:12具有90％序列一致性的其變體。優(yōu)選的淀粉酶變體是在wo01/66712中的seqidno:12的以下位置中的一個或多個處具有取代、缺失或插入的那些：r28，r118，n174；r181，g182，d183，g184，g186，w189，n195，m202，y298，n299，k302，s303，n306，r310，n314；r320，h324，e345，y396，r400，w439，r444，n445，k446，q449，r458，n471，n484。特別優(yōu)選的淀粉酶包括具有d183和g184的缺失并且具有取代r118k、n195f、r320k及r458k的變體，以及一種在選自下組的一個或多個位置中另外具有取代的變體：m9、g149、g182、g186、m202、t257、y295、n299、m323、e345及a339，最優(yōu)選的是在所有這些位置中另外具有取代的變體。其他實例是例如描述于wo2011/098531、wo2013/001078及wo2013/001087中的那些淀粉酶變體。可商購的淀粉酶是duramyltm、termamyltm、fungamyltm、stainzymetm、stainzymeplustm、natalasetm、liquozymex及bantm(來自諾維信公司)，以及rapidasetm、purastartm/effectenztm、powerase及preferenzs100(來自杰能科國際有限公司/杜邦公司(genencorinternationalinc./dupont))。過氧化物酶/氧化酶適合的過氧化物酶/氧化酶包括植物、細(xì)菌或真菌來源的那些。包括化學(xué)修飾的突變體或蛋白質(zhì)工程化的突變體。有用的過氧化物酶的實例包括來自鬼傘屬，例如來自灰蓋鬼傘的過氧化物酶，及其變體，如在wo93/24618、wo95/10602、以及wo98/15257中描述的那些?？缮藤彽倪^氧化物酶包括guardzymetm(諾維信公司)。可以通過添加包含一種或多種酶的單獨添加劑、或通過添加包含所有這些酶的組合添加劑而將洗滌劑酶包含在洗滌劑組合物中。洗滌劑添加劑，即單獨的或組合的添加劑，可以配制成例如顆粒、液體、漿液等，優(yōu)選的洗滌劑添加劑劑型為顆粒，特別是無粉塵顆粒；液體，特別是穩(wěn)定化液體；或者漿液。非塵顆粒可以例如如在us4,106,991和4,661,452中所披露而產(chǎn)生，并且可以任選地通過本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行包衣。蠟狀包衣材料的實例是平均分子量為1000至20000的聚(環(huán)氧乙烷)產(chǎn)品(聚乙二醇，peg)；具有16個到50個環(huán)氧乙烷單位的乙氧基化壬基酚(ethoxylatednonylphenol)；具有15個至80個環(huán)氧乙烷單位的乙氧基化脂肪族醇，其中醇包含12個至20個碳原子；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的單-和雙-和三甘油酯。適用于通過流化床技術(shù)應(yīng)用的成膜包衣材料的實例在gb1483591中給出。液體酶制品可以例如通過根據(jù)已確立的方法添加多元醇(如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸而穩(wěn)定化。受保護(hù)的酶可以根據(jù)ep238,216中披露的方法來制備。輔料還可以利用本領(lǐng)域中已知的用于在衣物洗滌劑中使用的任何洗滌劑組分。其他任選的洗滌劑組分包括防腐劑、防縮劑、抗污垢再沉積劑、抗皺劑、殺細(xì)菌劑、粘合劑、腐蝕抑制劑、崩解劑(disintegrant)/崩解試劑(disintegrationagent)、染料、酶穩(wěn)定劑(包括硼酸、硼酸鹽、cmc和/或多元醇如丙二醇)、織物整理劑(包括粘土)、填充劑/加工助劑、熒光增白劑/光學(xué)增亮劑、增泡劑、泡沫(泡)調(diào)節(jié)劑、香料、污垢助懸劑、軟化劑、抑泡劑、晦暗抑制劑以及芯吸劑，單獨或組合使用。可以利用本領(lǐng)域中已知的用于在衣物洗滌劑中使用的任何成分。此類成分的選擇完全在普通技術(shù)人員的技術(shù)范圍內(nèi)。分散劑：本發(fā)明的洗滌劑組合物還可以包含分散劑。具體地說，粉狀洗滌劑可以包括分散劑。適合的水溶性有機材料包括均聚合或共聚合的酸或其鹽，其中聚羧酸包括至少兩個羧基，這兩個羧基被不超過兩個碳原子彼此分開。適合的分散劑例如描述于粉末洗滌劑，表面活性劑科學(xué)系列(surfactantscienceseries)，第71卷中，馬塞爾·德克爾公司(marceldekker)。染料轉(zhuǎn)移抑制劑：本發(fā)明的洗滌劑組合物還可以包括一種或多種染料轉(zhuǎn)移抑制劑。適合的聚合物染料轉(zhuǎn)移抑制劑包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺n-氧化物聚合物、n-乙烯吡咯烷酮與n-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮以及聚乙烯咪唑或其混合物。當(dāng)在受試組合物中存在時，染料轉(zhuǎn)移抑制劑可以按該組合物的重量計以從大約0.0001％至大約10％、從大約0.01％至大約5％或甚至從大約0.1％至大約3％的水平存在。熒光增白劑：本發(fā)明的洗滌劑組合物還將優(yōu)選地包含另外的組分，這些組分可以給正清潔的物品著色，例如熒光增白劑或光學(xué)增亮劑。其中增亮劑優(yōu)選以約0.01％至約0.5％的水平存在。在本發(fā)明的組合物中可以使用適合用于在衣物洗滌劑組合物中使用的任何熒光增白劑。最常用的熒光增白劑是屬于以下類別的那些：二氨芪-磺酸衍生物、二芳基吡唑啉衍生物和二苯基-聯(lián)苯乙烯基衍生物。熒光增白劑的二氨芪-磺酸衍生物型的實例包括以下各項的鈉鹽：4,4'-雙-(2-二乙醇氨基-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸鹽；4,4'-雙-(2,4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2.2'-二磺酸鹽；4,4'-雙-(2-苯胺基-4(n-甲基-n-2-羥基-乙氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸鹽，4,4'-雙-(4-苯基-2,1,3-三唑-2-基)芪-2,2'-二磺酸鹽；4,4'-雙-(2-苯胺基-4(1-甲基-2-羥基-乙氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸鹽和2-(二苯乙烯基-4"-萘-1.,2':4,5)-1,2,3-三唑-2"-磺酸鹽。優(yōu)選的熒光增白劑是可從汽巴-嘉基股份有限公司(ciba-geigyag)(巴塞爾，瑞士)獲得的天來寶(tinopal)dms和天來寶cbs。天來寶dms是4,4'-雙-(2-嗎啉基-4苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪二磺酸鹽的二鈉鹽。天來寶cbs是2,2'-雙-(苯基-苯乙烯基)二磺酸鹽的二鈉鹽。還優(yōu)選熒光增白劑，是可商購的parawhitekx，由派拉蒙礦物與化學(xué)(paramountmineralsandchemicals)，孟買，印度供應(yīng)。適合在本發(fā)明中使用的其他熒光劑包括1-3-二芳基吡唑啉和7-烷氨基香豆素。適當(dāng)?shù)臒晒庠霭讋┧桨◤拇蠹s0.01wt％，從0.05wt％，從大約0.1wt％或甚至從大約0.2wt％至上限水平0.5wt％或甚至0.75wt％的較低水平。污垢釋放聚合物：本發(fā)明的洗滌劑組合物還可以包括一種或多種污垢釋放聚合物，這些污垢釋放聚合物幫助從織物，例如棉或聚酯基織物上去除污垢，特別是從聚酯基織物上去除疏水污垢。污垢釋放聚合物可以例如是基于非離子型或陰離子型對苯二甲酸的聚合物、聚乙烯基己內(nèi)酰胺和相關(guān)共聚物、乙烯基接枝共聚物、聚酯聚酰胺，參見例如粉末洗滌劑(powdereddetergents)，表面活性劑科學(xué)系列(surfactantscienceseries)第71卷第7章，馬塞爾·德克爾公司(marceldekker，inc.)。另一種類型的污垢釋放聚合物是包括核心結(jié)構(gòu)和連接至該核心結(jié)構(gòu)的多個烷氧基化基團(tuán)的兩親性烷氧基化油污清潔聚合物。核心結(jié)構(gòu)可以包括聚烷基亞胺結(jié)構(gòu)或聚烷醇胺結(jié)構(gòu)，如wo2009/087523中詳細(xì)描述的(將其通過引用而特此結(jié)合)。此外，任意接枝共聚物是適合的污物釋放聚合物。適合的接枝共聚物更詳細(xì)地描述于wo2007/138054、wo2006/108856以及wo2006/113314中(將其通過引用而特此結(jié)合)。其他污垢釋放聚合物是取代的多糖結(jié)構(gòu)，尤其是取代的纖維素結(jié)構(gòu)，例如改性纖維素衍生物，例如ep1867808或wo2003/040279中描述的那些(將二者都通過引用而特此結(jié)合)。適合的纖維素聚合物包括纖維素、纖維素醚、纖維素酯、纖維素酰胺及其混合物。適合的纖維素聚合物包括陰離子修飾的纖維素、非離子修飾的纖維素、陽離子修飾的纖維素、兼性離子修飾的纖維素及其混合物。適合的纖維素聚合物包括甲基纖維素、羧甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、酯羧甲基纖維素及其混合物?？乖俪练e劑：本發(fā)明的洗滌劑組合物還可以包括一種或多種抗再沉積劑，例如羧甲基纖維素(cmc)、聚乙烯醇(pva)、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、聚環(huán)氧乙烷和/或聚乙二醇(peg)、丙烯酸的均聚物、丙烯酸與馬來酸的共聚物以及乙氧基化聚乙亞胺。以上在污垢釋放聚合物下描述的纖維素基聚合物還可以用作抗再沉積劑。其他適合的輔料包括但不限于防縮劑、抗皺劑、殺細(xì)菌劑、粘合劑、載體、染料、酶穩(wěn)定劑、織物柔軟劑、填充劑、泡沫調(diào)節(jié)劑、助水溶劑、香料、色素、抑泡劑、溶劑以及用于液體洗滌劑的結(jié)構(gòu)劑和/或結(jié)構(gòu)彈性劑。洗滌劑產(chǎn)品的配制該洗滌劑組合物可以處于任何常規(guī)形式，例如條、均勻的片劑、具有兩個或更多個層的片劑、具有一個或多個室的袋、規(guī)則的或壓縮的粉末、顆粒、膏、凝膠、或規(guī)則的、壓縮的或濃縮的液體。存在多種洗滌劑配制品形式，例如層(相同或不同相)、袋以及用于機械給料裝置的形式。袋可以被配置為單個或多個的室。它可以具有適合保存該組合物的任何形式、形狀和材料，例如在與水接觸之前，不允許該組合物從袋中釋放出來。袋由封裝內(nèi)體積的水溶性膜制成。可以將所述內(nèi)體積分為袋的室。優(yōu)選的膜是形成膜或片的聚合材料，優(yōu)選是聚合物。優(yōu)選的聚合物、共聚物或其衍生物選自聚丙烯酸酯、和水溶性丙烯酸酯共聚物、甲基纖維素、羧甲基纖維素、糊精鈉、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、麥芽糊精、聚甲基丙烯酸酯，最優(yōu)選的是聚乙烯醇共聚物以及羥丙基甲基纖維素(hpmc)。優(yōu)選地，在膜中的聚合物(例如pva)的水平是至少約60％。優(yōu)選的平均分子量將典型地是約20,000至約150,000。膜還可以是共混物組合物，該共混物組合物包括可水解降解并且水可溶的聚合物共混物，例如聚乳酸和聚乙烯醇(已知在貿(mào)易參照m8630下，如由美國印第安納州蓋里(gary,ind.，us)的克里斯克拉夫特工業(yè)產(chǎn)品公司(chriscraftin.prod.)銷售)加增塑劑，像甘油、乙二醇、丙二醇、山梨醇及其混合物。這些袋可以包括固體衣物洗滌洗滌劑組合物或部分組分和/或液體清潔組合物或由水溶性膜分開的部分組分。用于液體組分的室在構(gòu)成上可以與包含固體的室不同。參考文獻(xiàn)：(us2009/0011970a1)?？梢杂伤扇艿拇谢蚱瑒┑牟煌瑢又械氖襾韺⑾礈靹┏煞治锢淼乇舜朔珠_。由此可以避免組分之間的負(fù)面的存儲相互作用。在洗滌溶液中，每個室的不同溶解曲線還可以引起選擇的組分的延遲溶解。非單位劑量的液體或凝膠洗滌劑可以是水性的，典型地包含按重量計至少20％并且最高達(dá)95％的水，例如高達(dá)約70％的水、高達(dá)約65％的水、高達(dá)約55％的水、高達(dá)約45％的水、高達(dá)約35％的水。包括但不限于鏈烷醇、胺、二醇、醚以及多元醇的其他類型的液體可以被包括在水性液體或凝膠中。含水液體或凝膠洗滌劑可以包含從0-30％的有機溶劑。液體或凝膠洗滌劑可以是非水性的。衣物洗滌皂條本發(fā)明的枯草桿菌酶變體可以被添加至衣物洗滌皂條中并且用于手洗衣物洗滌、織物和/或紡織品。術(shù)語洗滌皂條包括洗滌條、皂條、組合條(combobar)、合成洗滌劑條以及洗滌劑條。條的類型通常區(qū)別在于它們包含的表面活性劑的類型，并且術(shù)語洗滌皂條包括包含來自脂肪酸的皂和/或合成皂的那些。洗滌皂條具有在室溫下為固體而非液體、凝膠或粉末的物理形式。術(shù)語固體被定義為不隨時間推移顯著改變的實體形式，即如果將一個固體物件(例如洗滌皂條)放置在一種容器內(nèi)，那么該固體物件不會改變以填充放置該固體物件的容器。該條是典型地呈條形式但是可以呈其他固體形狀，如圓形或卵形的一種固體。該衣物肥皂棒可以包含一個或多個另外的酶、蛋白酶抑制劑例如肽醛類(或次硫酸鹽加合物或半縮醛加合物)、硼酸、硼酸鹽、硼砂和/或苯基硼酸衍生物例如4-甲酸基本硼酸、一個或多個肥皂或合成的表面活性劑、多元醇例如甘油、ph控制化合物例如脂肪酸、檸檬酸、乙酸和/或甲酸、和/或一價陽離子和有機陰離子的鹽，其中該一價陽離子可以是例如na+、k+或nh4+并且該有機陰離子可以是例如甲酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽或乳酸鹽，因此該一價陽離子和有機陰離子的鹽可以是例如甲酸鈉。洗滌皂條還可以包含絡(luò)合劑像edta和hedp，香料和/或不同類型的填充劑，表面活性劑例如陰離子型合成表面活性劑，助洗劑，聚合的污物釋放劑，洗滌劑螯合劑，穩(wěn)定劑，填充劑，染料，著色劑，染料轉(zhuǎn)移抑制劑，烷氧基化的聚碳酸酯，抑泡劑，結(jié)構(gòu)劑，粘合劑，浸出劑，漂白活化劑，粘土去污劑，抗再沉積劑，聚合分散劑，增白劑，織物柔軟劑，香料和/或本領(lǐng)域已知的其他化合物。衣物洗滌皂條可以在常規(guī)的衣物洗滌皂條制造設(shè)備中進(jìn)行加工，例如但不限制于：混合器、壓條機例如雙級真空壓條機、擠出機、切割機、標(biāo)識壓模機(logo-stamper)、冷卻隧道以及包裝機。本發(fā)明不局限于通過任何單一方法制備衣物洗滌皂條?？梢栽诠に嚨牟煌A段向肥皂中添加預(yù)混料。例如，可以制備包含肥皂、酶、任選地一種或多種另外的酶、蛋白酶抑制劑以及一價陽離子和有機陰離子的鹽的預(yù)混料并且然后將該混合物壓條?？梢酝瑫r添加作為例如處于液態(tài)的蛋白酶抑制劑的酶以及任選的另外的酶。除了混合步驟和壓條步驟以外，該工藝還可以進(jìn)一步包括研磨、擠出、切割、壓模、冷卻和/或包裝的步驟。顆粒洗滌劑配制品如描述于wo09/092699、ep1705241、ep1382668、wo07/001262、us6472364、wo04/074419或wo09/102854中的，可以配制顆粒洗滌劑。其他有用的洗滌劑配制品描述于以下各項中：wo09/124162、wo09/124163、wo09/117340、wo09/117341、wo09/117342、wo09/072069、wo09/063355、wo09/132870、wo09/121757、wo09/112296、wo09/112298、wo09/103822、wo09/087033、wo09/050026、wo09/047125、wo09/047126、wo09/047127、wo09/047128、wo09/021784、wo09/010375、wo09/000605、wo09/122125、wo09/095645、wo09/040544、wo09/040545、wo09/024780、wo09/004295、wo09/004294、wo09/121725、wo09/115391、wo09/115392、wo09/074398、wo09/074403、wo09/068501、wo09/065770、wo09/021813、wo09/030632以及wo09/015951。wo2011025615、wo2011016958、wo2011005803、wo2011005623、wo2011005730、wo2011005844、wo2011005904、wo2011005630、wo2011005830、wo2011005912、wo2011005905、wo2011005910、wo2011005813、wo2010135238、wo2010120863、wo2010108002、wo2010111365、wo2010108000、wo2010107635、wo2010090915、wo2010033976、wo2010033746、wo2010033747、wo2010033897、wo2010033979、wo2010030540、wo2010030541、wo2010030539、wo2010024467、wo2010024469、wo2010024470、wo2010025161、wo2010014395、wo2010044905、wo2010145887、wo2010142503、wo2010122051、wo2010102861、wo2010099997、wo2010084039、wo2010076292、wo2010069742、wo2010069718、wo2010069957、wo2010057784、wo2010054986、wo2010018043、wo2010003783、wo2010003792、wo2011023716、wo2010142539、wo2010118959、wo2010115813、wo2010105942、wo2010105961、wo2010105962、wo2010094356、wo2010084203、wo2010078979、wo2010072456、wo2010069905、wo2010076165、wo2010072603、wo2010066486、wo2010066631、wo2010066632、wo2010063689、wo2010060821、wo2010049187、wo2010031607、wo2010000636。用途可以在紡織品和織物的洗滌(例如家用衣物洗滌和工業(yè)衣物洗滌)中使用根據(jù)本發(fā)明的枯草桿菌酶變體或其組合物。還可以在用于清潔硬表面例如地板、桌子、墻壁、屋頂?shù)?，連同清潔硬物體，例如汽車(汽車洗滌)和餐具(餐具洗滌)的表面的方法中使用根據(jù)本發(fā)明的枯草桿菌酶變體或其組合物。洗滌劑組合物可以配制為(例如)手洗或機洗衣物洗滌洗滌劑組合物，包括適用于預(yù)處理有污跡的織物的衣物洗滌添加劑組合物，和漂洗添加的織物軟化劑組合物，或配制為用于一般家用硬表面清潔操作的洗滌劑組合物，或配制用于手洗或機洗餐具洗滌操作?？梢詫⒈景l(fā)明的多肽添加至洗滌添加劑中。清潔過程或者紡織品護(hù)理過程可以例如是衣物洗滌過程、餐具洗滌過程或硬表面(如浴室瓷磚、地板、桌面、排水管、水槽以及臉盆)清潔。衣物洗滌過程可以例如是家用衣物洗滌，但是它也可以是工業(yè)衣物洗滌。用于洗滌織物和/或服裝的方法，其中該方法包括用包含洗滌劑組合物可以添加本發(fā)明的至少一種枯草桿菌酶變體的洗滌溶液處理織物。例如，可以在機器洗滌過程中或者在手動洗滌過程中進(jìn)行清潔過程或紡織品護(hù)理過程。洗滌溶液可以例如是包含洗滌劑組合物的水性洗滌溶液。最近幾年，人們對替換洗滌劑中的組分的興趣逐漸增加，這源于用可再生生物組分如酶和多肽替換石油化學(xué)產(chǎn)品而不損害洗滌性能。當(dāng)洗滌劑組合物的組分改變新酶活性或者相比于常用洗滌劑酶(如蛋白酶)具有替代和/或改進(jìn)的特性的新酶時，需要脂肪酶和淀粉酶來實現(xiàn)與傳統(tǒng)洗滌劑組合物比較時類似或改進(jìn)的洗滌性能。本發(fā)明進(jìn)一步涉及本發(fā)明的枯草桿菌酶變體在蛋白質(zhì)污漬去除過程中的用途。蛋白質(zhì)污漬可能是如食品污漬等污漬，如嬰兒食品、皮脂、可可、雞蛋、血、牛奶、墨水、草、或其組合。典型的洗滌劑組合物包括除酶之外的各種組分，這些組分具有不同的作用，一些組分像表面活性劑降低洗滌劑的表面張力，這允許正清潔的污漬被提起和分散并隨后被洗滌出來，其他組分像漂白系統(tǒng)通常通過氧化去除顏色并且很多漂白劑還具有強殺菌特性，并且用于消毒和滅菌。再其他組分像助洗劑和螯合劑例如通過從液體中去除金屬離子來軟化洗滌水。包括本發(fā)明的枯草桿菌酶變體的組合物可以包括一種或多種洗滌劑組分，例如表面活性劑、助水溶劑、助洗劑、共助洗劑、螯合劑(chelator)或螯合試劑(chelatingagent)、漂白系統(tǒng)或漂白組分、聚合物、織物調(diào)色劑、織物調(diào)理劑、增泡劑、抑泡劑、分散劑、染料轉(zhuǎn)移抑制劑、熒光增白劑、香料、光學(xué)增亮劑、殺細(xì)菌劑、殺真菌劑、污物懸浮劑、污物釋放聚合物、抗再沉積劑、酶抑制劑或穩(wěn)定劑、酶激活劑、抗氧化劑、以及增溶劑。組合物可以包括本發(fā)明的枯草桿菌酶變體以及一種或多種選自下組的另外的酶，該組包括：蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、纖維素酶、內(nèi)切葡聚糖酶、木葡聚糖酶、果膠酶、果膠裂解酶、黃原膠酶、過氧化物酶、鹵代過氧合酶、過氧化氫酶以及甘露聚糖酶，或其任何混合物。組合物可以包括本發(fā)明的枯草桿菌酶變體，選自下組的一種或多種另外的酶，該組包括蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、纖維素酶、內(nèi)切葡聚糖酶、木葡聚糖酶、果膠酶、果膠裂解酶、黃原膠酶、過氧化物酶、鹵代過氧合酶、過氧化氫酶以及甘露聚糖酶或其任何混合物，以及一種或多種洗滌劑組分，例如表面活性劑、助水溶劑、助洗劑、共助洗劑、螯合劑(chelator)或螯合試劑(chelatingagent)、漂白系統(tǒng)或漂白組分、聚合物、織物調(diào)色劑、織物調(diào)理劑、增泡劑、抑泡劑、分散劑、染料轉(zhuǎn)移抑制劑、熒光增白劑、香料、光學(xué)增亮劑、殺細(xì)菌劑、殺真菌劑、污物懸浮劑、污物釋放聚合物、抗再沉積劑、酶抑制劑或穩(wěn)定劑、酶激活劑、抗氧化劑、以及增溶劑。洗滌方法一種清潔方法包括以下步驟：在適合于清潔物體的條件下將所述物體與包括本發(fā)明的枯草桿菌酶變體的洗滌劑組合物接觸。一種用于從織物或餐具上去除污漬的方法可以包括在適合于清潔所述物體的條件下將所述織物或餐具與包括本發(fā)明的枯草桿菌酶變體的組合物接觸。處理織物(例如使紡織品退漿)的組合物和方法可以使用一種或多種本發(fā)明的枯草桿菌酶變體。該變體可以用于任何織物處理方法，這些方法在本領(lǐng)域是熟知的(參見，例如，us6,077,316)。例如，在一方面，通過如下方法改進(jìn)織物的觸感和外觀，該方法包括將該織物與溶液中的蛋白酶接觸。在一方面，在壓力下用該溶液處理該織物。洗滌劑組合物適合用于在衣物洗滌和硬表面應(yīng)用(包括餐具洗滌)中使用。此類方法包括使有待清潔的織物/餐具與包括洗滌劑組合物的溶液接觸的步驟。織物可以包括能夠在常規(guī)消費者使用條件下被洗滌的任何織物。餐具可以包括任何餐具，例如陶器、用餐工具、陶瓷、塑料(例如三聚氰胺)、金屬、瓷器、玻璃及丙烯酸酯。該溶液優(yōu)選具有從約5.5至約11.5的ph?？稍谌芤褐邪匆韵聺舛仁褂媒M合物：從約100ppm，優(yōu)選500ppm至約15,000ppm。水溫的范圍典型地是從約5℃至約95℃，包括約10℃、約15℃、約20℃、約25℃、約30℃、約35℃、約40℃、約45℃、約50℃、約55℃、約60℃、約65℃、約70℃、約75℃、約80℃、約85℃以及約90℃。水與織物之比典型地是從約1:1至約30:1?？梢允褂贸Ｒ?guī)穩(wěn)定劑和蛋白酶抑制劑來穩(wěn)定洗滌劑組合物的一種或多種酶，例如多元醇(如丙二醇或甘油)、糖或糖醇、不同的鹽(例如nacl、kcl)、乳酸、甲酸、硼酸、或硼酸衍生物(例如，芳族硼酸酯、或苯基硼酸衍生物(如4-甲酰苯基硼酸))、或肽醛(如二肽醛、三肽醛或四肽醛或醛類似物)(或者具有形式b1-b0-r，其中r是h、ch3、cx3、chx2、或ch2x(x＝鹵素)，b0是單個氨基酸殘基(優(yōu)選地具有一個任選取代的脂肪族或芳香族側(cè)鏈)；并且b1由一個或多個氨基酸殘基組成(優(yōu)選一個、兩個或三個)，任選地包括一個n-末端保護(hù)基團(tuán)，或者如描述于wo09118375、wo98/13459中的)或者蛋白類型的蛋白酶抑制劑，例如rasi、basi、wasi(水稻、大麥和小麥的雙功能α-淀粉酶/枯草桿菌蛋白酶抑制劑)或ci2或ssi?？梢匀缭诶鐆o92/19709、wo92/19708和us6,472,364中描述的配制該組合物。在一些實施例中，在此利用的這些酶由存在于為這些酶提供此類離子的成品組合物中的鋅(ii)、鈣(ii)和/或鎂(ii)離子的水溶性來源，連同其他金屬離子(例如，鋇(ii)、鈧(ii)、鐵(ii)、錳(ii)、鋁(iii)、錫(ii)、鈷(ii)、銅(ii)、鎳(ii)以及氧釩(iv))穩(wěn)定化。這些洗滌劑組合物被典型地這樣配制，使得在用于水性清潔操作過程中，洗滌水具有以下ph：從約5.0至約11.5，或在替代實施例中，甚至從約6.0至約10.5。在一些優(yōu)選實施例中，顆粒或液體衣物洗滌產(chǎn)品被配制成具有從約6至約8的ph。用于將ph控制在推薦的使用水平的技術(shù)包括使用緩沖劑、堿、酸等，并且是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟知的。通過以下實例進(jìn)一步描述本發(fā)明，這些實例不應(yīng)當(dāng)解釋為限制本發(fā)明的范圍。實例材料與方法用于衣物洗滌的自動機械應(yīng)力測定(amsa)為了評定在衣物中的洗滌性能，使用自動機械應(yīng)力測定(amsa)進(jìn)行洗滌實驗。使用amsa，可以檢査大量小體積酶洗滌劑溶液的洗滌性能。amsa平板具有許多用于測試溶液的縫和蓋子，蓋子針對所有縫開口強力擠壓洗滌樣品(有待洗滌的紡織品)。在洗滌時間期間，板、測試溶液、紡織品和蓋子劇烈振動從而使測試溶液與紡織品接觸并以規(guī)則、周期性擺動方式施加機械應(yīng)力。關(guān)于進(jìn)一步描述，參見wo02/42740，尤其是第23-24頁的“特定方法實施例(specialmethodembodiments)”段落。將洗滌性能作為所洗滌紡織品顏色的亮度進(jìn)行測量。亮度也可以表達(dá)為當(dāng)用白光照亮?xí)r從樣品反射的光的強度。當(dāng)樣品受到污染時，反射光的強度低于干凈樣品的反射光的強度。因此，反射光的強度可以用來衡量洗滌性能。使用專業(yè)平板掃描儀(kodakiqsmart(柯達(dá)(kodak))，midtager29，dk-2605(丹麥)進(jìn)行顏色測量，該掃描儀用于捕獲所洗滌紡織品的圖像。為了從掃描的圖像中提取光強度值，將來自圖像的24-位像素值轉(zhuǎn)化為紅、綠以及藍(lán)(rgb)的值。通過將rgb值作為向量相加在一起并然后考慮所得向量的長度可以計算強度值(int)：表1：標(biāo)準(zhǔn)洗滌劑和測試材料的組成標(biāo)準(zhǔn)洗滌劑和測試材料如下：tergo-o-tometer(tom)tergo-o-tometer(tom)是一種中等規(guī)模標(biāo)準(zhǔn)洗滌系統(tǒng)，它可以用于同時測試12種不同的洗滌條件。tom基本上是大型的具有多達(dá)12個開放金屬燒杯淹沒至其中的溫度受控的水浴。每個燒杯構(gòu)成一個小的頂部加載型洗滌機器并且在實驗期間，它們中的每一者將包含特定洗滌劑/酶系統(tǒng)的溶液并且對弄臟的和未弄臟的織物測試其性能。通過旋轉(zhuǎn)攪拌臂獲得機械應(yīng)力，該旋轉(zhuǎn)攪拌臂攪拌在每個燒杯內(nèi)的液體(1l)。因為tom杯子不含蓋子，所以有可能在tom實驗期間收回樣品并且在洗滌期間在線分析信息。在一個tom實驗中，如壓載物與污物的比率和織物與洗滌液的比率的因素可以變化。因此，tom提供了在小規(guī)模實驗(如amsa和微型洗滌)與在全規(guī)模洗滌機中的更費時的全規(guī)模實驗之間的聯(lián)系。洗滌并沖洗之后，將小塊布樣攤開鋪平并且允許在室溫下風(fēng)干過夜。在洗滌的次日評估所有洗滌。使用具有大孔徑的macbethcoloreye7000反射分光光度計進(jìn)行小塊布樣的光反射評估。在入射光中沒有uv的條件下進(jìn)行測量，并提取460nm的反射率。在未洗滌的和洗滌的小塊布樣上進(jìn)行測量。將有待測量的測試小塊布樣放置在相同類型和顏色的另一個小塊布樣的頂部(成對小塊布樣)。通過從一起用酶洗滌的小塊布樣的反射值中減去未用酶(空白)洗滌的小塊布樣的反射值來計算單個小塊布樣的反射值。通過取得來自用酶洗滌的小塊布樣的測量值并且減去來自未用酶洗滌的小塊布樣的測量值來計算針對每種污漬的蛋白酶變體效果。通過如下計算相對性能(rp)，將新蛋白酶變體的性能與參照性能(ref)＝seqidno:3進(jìn)行比較：rp＝(r蛋白酶變體-r空白)/(rref-r空白)常規(guī)分子生物學(xué)方法：除非另外提及，使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法(薩姆布魯克(sambrook)等人(1989)；奧蘇貝爾(ausubel)等人(1995)；哈伍德(harwood)和卡廷(cutting)(1990))進(jìn)行dna操縱和轉(zhuǎn)化。蛋白酶活性測定：1)suc-aapf-pna活性測定：蛋白水解活性可以通過采用suc-aapf-pna底物的方法來確定。suc-aapf-pna是n-琥珀?；?丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-對硝基苯胺的縮寫，并且它是可以通過內(nèi)切蛋白酶切割的一種封閉肽。在切割后，一個游離pna分子被釋放出來，并且它具有黃色顏色并且因此可以通過可見光分光光度法在波長405nm進(jìn)行測量。suc-aapf-pna底物是通過巴亨(bachem)(目錄號l1400，溶解在dmso中)制造。待分析的蛋白酶樣品被稀釋在殘余活性緩沖液中(100mmtrisph8.6)。通過轉(zhuǎn)移60μl的稀釋的酶樣品至96孔微量滴定板并添加140μl底物工作溶液(0.72mg/ml于100mmtrisph8.6中)進(jìn)行該測定。將該溶液在室溫混合并且在od405nm經(jīng)5分鐘每20秒測量吸收。在一組給定條件下，時間相關(guān)吸收曲線的斜率(每分鐘的吸光度)與所討論的蛋白酶的比活性(活性/mg酶)成正比例。應(yīng)該將蛋白酶樣品稀釋至其中斜率為線性的水平。加速儲存穩(wěn)定性測定在升高的溫度下孵育長達(dá)24小時的情況下，使用加速測定評估蛋白酶變體在液體洗滌劑中的儲存穩(wěn)定性?；?80nm處的吸光度和理論消光系數(shù)，使用0.01％tritonx-100將所有純化的蛋白酶樣品稀釋至0.2和0.1mg/ml的濃度。針對每個變體，包括具有高蛋白酶濃度的2個孔和具有低濃度的2個孔。作為參照，在每個微量滴定板上包括seqidno:3。使用磁棒(在zephyr移液臺(caliperlifesciences公司)上持續(xù)30min)，將30μl蛋白酶樣品與270μl洗滌劑(cnsedtaph9)在微量滴定板(nuncu96pp0.5ml)的孔中混合。然后將20μl的這種混合物轉(zhuǎn)移至另一個微量滴定板(加有磁棒的nuncu96pp0.5ml)中，并且與150μl100mmtris(ph8.6)混合(在zephyr上至少5min)。將30μl的這種稀釋液轉(zhuǎn)移至nuncf96-mtp中，并且在添加70μl底物溶液后，通過每20sec在405nm下測量吸光度持續(xù)5min來確定非應(yīng)激樣品的初始活性(在spectramaxplus上)。密封后，將洗滌劑板在eppendorf恒溫混合器(無搖動)中在適當(dāng)溫度(針對cns為47℃，edtaph9)下孵育。在1-4和20-25小時孵育后，抽取20μl樣品，并且像初始非應(yīng)激活性一樣，測量應(yīng)激樣品的殘余活性。在用洗滌劑孵育過程中的活性下降被假定為指數(shù)式的。從log(活性)對孵育時間(0、1-4和20-25小時)的線性回歸發(fā)現(xiàn)半衰期(t1/2)，并且將半衰期改進(jìn)系數(shù)(t1/2if)計算為相對于seqidno:3參照的半衰期的蛋白酶變體的半衰期。洗滌劑實例1：變體的制備和表達(dá)通過利用生物的天然感受態(tài)轉(zhuǎn)化適合的表達(dá)盒來將表達(dá)盒引入枯草芽孢桿菌。通過pcr(例如桑布魯克(sambrook)等人，分子克隆(molecularcloning)，冷泉港實驗室出版社(coldspringharborlaboratorypress))進(jìn)行dna操作，例如引入突變并將表達(dá)盒構(gòu)建到枯草芽孢桿菌中，并且所有dna操作可以由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員重復(fù)。使用編碼枯草桿菌酶變體的重組枯草桿菌構(gòu)建體來接種包含富營養(yǎng)培養(yǎng)基(例如，ps-1：100g/l蔗糖(丹尼斯克目錄號109-0429)、40g/l大豆殼(大豆粉)、10g/lna2hpo4.12h2o(默克(merck)目錄號6579)、0.1ml/l替換-dowfax63n10(陶氏化學(xué)(dow))的搖瓶。典型地在30℃下在220rpm的振搖下進(jìn)行4天的培養(yǎng)。實例2：變體的發(fā)酵可以通過本領(lǐng)域熟知的或如以下的方法進(jìn)行發(fā)酵。將具有相關(guān)表達(dá)質(zhì)粒的枯草桿菌菌株在lb-瓊脂板上劃線，并在37℃下生長過夜。將菌落轉(zhuǎn)移到在500ml搖瓶中的100mlps-1培養(yǎng)基上。通過在4500rpm下離心20-25分鐘從發(fā)酵液中去除細(xì)胞和其他未溶解的材料。然后，過濾出上清液以獲得澄清溶液。實例3：變體的純化將培養(yǎng)液離心(26000xg，20min)并且將上清液小心地與沉淀物潷析分開。將上清液通過nalgene0.2μm過濾單元進(jìn)行過濾，以便去除其余的芽孢桿菌宿主細(xì)胞。用3mtris堿將0.2μm濾液中的ph調(diào)節(jié)至ph8，并將經(jīng)ph調(diào)節(jié)的濾液施加至在20mmtris/hcl、1mmcacl2(ph8.0)中平衡的mephypercel柱(來自頗爾公司(pallcorporatio))上。將柱用平衡緩沖液洗滌后，將該柱用20mmch3cooh/naoh、1mmcacl2(ph4.5)逐步洗脫。將來自柱的級分針對蛋白酶活性進(jìn)行分析(使用在ph9下的suc-aapf-pna測定法)，并且合并峰級分。將來自該mephypercel柱的合并物的ph用20％(v/v)ch3cooh或3mtris堿調(diào)節(jié)至ph6，并且將經(jīng)ph調(diào)節(jié)的合并物用去離子水稀釋至與20mmmes/naoh、2mmcacl2(ph6.0)相同的電導(dǎo)率。將經(jīng)稀釋的合并物施加至在20mmmes/naoh、2mmcacl2(ph6.0)中平衡的sp-瓊脂糖ff柱(來自ge醫(yī)療公司(gehealthcare))上。在將柱用平衡緩沖液洗滌之后，將蛋白酶用在相同的緩沖液中的線性nacl梯度(0-->0.5m)經(jīng)五個柱體積進(jìn)行洗脫。將來自柱的級分針對蛋白酶活性進(jìn)行分析(使用在ph9下的suc-aapf-pna測定法)，并且通過sds-page對活性級分進(jìn)行分析。將級分(在考馬斯染色的sds-page凝膠上的僅見到一條帶)合并為純化的制劑并且用于另外的實驗。實例4：本發(fā)明變體的穩(wěn)定性如實例1-3所述產(chǎn)生和純化本發(fā)明的變體，并使用上述披露的穩(wěn)定性測試在47℃的溫度下測試在液體洗滌劑中的穩(wěn)定性并計算半衰期。參照多肽是具有seqidno:3的枯草桿菌酶。表2：seqidno:3的變體的穩(wěn)定性。第一列表示seqidno:3中的取代。第二列表示實驗中發(fā)現(xiàn)的半衰期，并且在第三列中，相對于seqidno:3表示數(shù)據(jù)，最后一列表示標(biāo)準(zhǔn)差：在這些條件下，所有變體具有在液體洗滌劑中的同等的穩(wěn)定性，改進(jìn)的穩(wěn)定性或顯著改進(jìn)的穩(wěn)定性。實例5殘留活性使用上述披露的穩(wěn)定性測試在45℃的溫度下測試本發(fā)明的變體在液體洗滌劑中的穩(wěn)定性，并且計算19小時后的半衰期和殘留活性。親本多肽是具有seqidno:3的枯草桿菌酶。表3：seqidno:3的變體的穩(wěn)定性。第一列表示與seqidno:3相比的取代。第二列表示計算的19小時后的殘留活性，并且最后一列表示具有標(biāo)準(zhǔn)差的殘留活性的：數(shù)據(jù)示出這些變體在測試條件下具有增加的穩(wěn)定性，并且與具有seqidno:3的親本枯草桿菌酶相比，還具有19小時后的增加的殘留活性。實例6通過使用以下標(biāo)準(zhǔn)污物確定變體在洗滌劑中的洗滌性能：a：棉布上的蛋黃：產(chǎn)品號10eg，從如下可獲得：w-測試織物有限公司(w-testgewebegmbh)，christenfeld10,41379，布呂根(brüggen)，德國b：棉布上的血：產(chǎn)品號cs01，從如下可獲得：cft(測試材料中心)b.v.，弗拉爾丁恩(vlaardingen)，荷蘭，c：棉布上的蛋：產(chǎn)品號c37，從如下可獲得：cft(測試材料中心)b.v.，弗拉爾丁恩，荷蘭，d：棉布上的血：產(chǎn)品號111，從如下可獲得：material-undprüfanstalt(empa)testmaterialienag[聯(lián)邦材料與測試機構(gòu)，測試材料(federalmaterialsandtestingagency,testmaterials)]，圣加侖州(st.gallen)，瑞士(switzerland)。以下污漬e-r均從cft(測試材料中心)b.v.，弗拉爾丁恩，荷蘭可獲得：e：棉布上的可可：產(chǎn)品號ch-09f：棉布上的蛋：產(chǎn)品號c38g：棉布上的巧克力-牛奶：產(chǎn)品號c03h：可可-燕麥：產(chǎn)品號c-s-54i：聚酯/棉布上的巧克力-牛奶：產(chǎn)品號pc-3-009j：棉布上與牛奶一起熬制的可可：產(chǎn)品號c-h019k：棉布上的代餐混合飲料：產(chǎn)品號c-h165l：棉布上的巧克力布?。寒a(chǎn)品號c-h118m：棉布上的巧克力布?。寒a(chǎn)品號c-h172n：肉干瓦萊特(meatpatevallette)：產(chǎn)品號kc-h171o：棉布上的巧克力布丁：產(chǎn)品號kc-h172p：棉布上的老化的巧克力冰淇淋：產(chǎn)品號cs-68q：棉布上的巧克力布丁：產(chǎn)品號cs-69r：老化的蛋黃碳黑：產(chǎn)品號cs-38s：棉布上的蛋：產(chǎn)品號wfk10n從w-測試織物有限公司可獲得，christenfeld10，41379布呂根(brüggen)，德國t：棉布上的可可：產(chǎn)品號empa112，從material-undprüfanstalt(empa)testmaterialienag[國家材料與測試機構(gòu)，測試材料(federalmaterialsandtestingagency,testmaterials)]，圣加侖州(st.gallen)，瑞士(switzerland)可獲得。u：棉布上的血-牛奶/墨水：產(chǎn)品號c05v棉布上的花生油色素/墨水：產(chǎn)品號c10w：棉布上的草屑：產(chǎn)品號164，從material-undprüfanstalt(empa)testmaterialienag[國家材料與測試機構(gòu)，測試材料(federalmaterialsandtestingagency,testmaterials)]，圣加侖州(st.gallen)，瑞士(switzerland)可獲得。x：與牛奶一起熬制的可可：產(chǎn)品號c-h010y：血/牛奶/墨水，產(chǎn)品號empa117，從material-undprüfanstalt(empa)testmaterialienag[國家材料與測試機構(gòu)，測試材料(federalmaterialsandtestingagency,testmaterials)]，圣加侖州(st.gallen)，瑞士(switzerland)可獲得。z：巧克力牛奶和煙灰，產(chǎn)品號cftc03，從cft(測試材料中心)b.v.，弗拉爾丁恩，荷蘭可獲得：將具有以下組成的液體洗滌劑用作基本配制品(所有的值都以重量百分比計)：0％至0.5％黃原膠、0.2％至0.4％消泡劑、0.2％至8％三乙醇胺、1％至7％甘油、0.3％至3％乙醇、0至12％faeos(脂肪醇醚硫酸酯)、1％至28％非離子型表面活性劑、0.5％-4％硼酸、0.5％至6％檸檬酸鈉(二水合物)、1％至6％蘇打、0至16％椰子脂肪酸、0.5％至6％hedp(1-羥基乙烷-(1,1-二磷酸))、0至0.4％pvp(聚乙烯吡咯烷酮)、0至0.05％光學(xué)增亮劑、0至0.001％顏料、剩余部分為去離子水?；谶@種基本配制品，通過添加如表4中所指示的對應(yīng)的蛋白酶來制備不同洗滌劑。參照是具有seqidno.3中的氨基酸序列的蛋白酶，該參照蛋白酶已經(jīng)示出良好的洗滌性能(尤其在液體洗滌劑中)。以基于總蛋白質(zhì)含量(5mg/l洗滌液體)的相同量添加蛋白酶。液體洗滌劑的劑量之比是4,7克/升洗滌液體，并且在20℃和40℃的溫度下進(jìn)行60分鐘洗滌程序，水具有15.5°與16.5°(德國硬度)之間的水硬度。白度(即污物的增白)被光度測定地確定為洗滌性能的指示。使用美能達(dá)(minolta)cm508d分光儀裝置，該裝置事先使用提供有單位的白標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行校準(zhǔn)。獲得的結(jié)果是使用洗滌劑獲得的反射單位(remissionunit)與使用包含參照蛋白酶的洗滌劑獲得的反射單位之間的差值。因此，正值指示洗滌劑中變體的改進(jìn)的洗滌性能。從表4a(在40℃的結(jié)果)和表4b(在20℃的結(jié)果)明顯看出，根據(jù)本發(fā)明的變體顯示改進(jìn)的洗滌性能。表4a和b：按照下表，具有與seqidno:3相同的氨基酸序列(除了取代以外)的蛋白酶變體對如所示的污漬在40℃的洗滌性能；參照是根據(jù)seqidno:3的蛋白酶。a)b)蛋白酶變體ugvtws163g0,91,51,8nd0,9g61d1,51,7ndndnds156d1,62,10,5ndndh120d0,81,62,4ndndg195ev199m1,50,71,1ndnda228vn261d0,51,31,6ndndv244t1,31,12,7ndndt58lnd2,01,10,90,4s3tv4in261d1,51,70,4ndnda194pg195ev199mv205i0,8ndnd1,1ndh120da228v2,11,9ndndndh120dn261dndnd0,81,2ndn76da228vn261dnd0,5nd1,8nd表4c-e：按照下表，具有與seqidno:3相同的氨基酸序列(除了取代以外)的蛋白酶變體對如所示的污漬在20℃的洗滌性能；參照是根據(jù)seqidno:3的蛋白酶。c)d)e)f)實例7：脂肪酶變體的洗滌性能按照下表，具有與seqidno:3相同的氨基酸序列(除了取代以外)的蛋白酶變體對如所示的污漬的洗滌性能；參照是根據(jù)seqidno:3的蛋白酶。在衣物洗滌中使用自動機械應(yīng)力測定(amsa)評估，其中可以檢查許多小體積酶洗滌劑溶液的洗滌性能。amsa板具有許多用于測試溶液的槽，以及蓋子，該蓋子將待洗滌的紡織品對槽開口強力擠壓。在洗滌期間，將平板、測試溶液、紡織品和蓋子劇烈振動從而使測試溶液與紡織品接觸并以規(guī)則、周期性振蕩方式施加機械應(yīng)力。關(guān)于進(jìn)一步描述，參見wo02/42740，尤其是第23-24頁的“具體方法實施例”段落。在表5中指定的實驗條件下進(jìn)行衣物洗滌實驗。表5洗滌劑劑量2.0g/l測試溶液體積160μl(20μl酶+140μl洗滌劑)ph8.4洗滌時間20分鐘溫度20℃水硬度12°dh標(biāo)準(zhǔn)洗滌劑和測試材料如表1所述：表6：標(biāo)準(zhǔn)洗滌劑和測試材料的組成測試材料獲得自測試材料bv中心(centerfortestmaterialsbv)，3133kt弗拉爾丁恩，荷蘭。通過將cacl2、mgcl2和nahco3(ca2+:mg2+＝2:1:4.5)添加到測試系統(tǒng)中將水硬度調(diào)節(jié)至12°dh。在洗滌之后，將紡織品用自來水沖洗并干燥。將洗滌性能作為所洗滌紡織品顏色的亮度進(jìn)行測量。亮度也可以表達(dá)為當(dāng)用白光照亮?xí)r從樣品反射的光的強度。當(dāng)樣品被沾污時，反射光的強度低于干凈樣品。因此，反射光的強度可以用于測量洗滌性能。使用柯達(dá)iqsmart平板掃描儀(kodakmidtager29、dk-2605丹麥)進(jìn)行顏色測量，該掃描儀用于捕獲所洗滌紡織品的圖像。為了從掃描的圖像中提取光強度值，將來自圖像的24位像素值轉(zhuǎn)化為紅色、綠色和藍(lán)色(rgb)值?？梢酝ㄟ^將rgb值作為向量相加并隨后考慮所得向量的長度計算強度值(int)：結(jié)果示于表7中。結(jié)果作為與seqidno:3相比在三種不同的小塊布樣上的酶濃度為30nm的相對性能給出。表7：與seqidno:3相比，變體的amsa相對性能。表8與seqidno:3相比在兩種不同的小塊布樣上的酶濃度為30nm的相對性能。結(jié)果示出，與seqidno3的洗滌性能相比，seqidno3的穩(wěn)定化變體示出同等或改進(jìn)的洗滌性能。實例8：terg-o-tometer(tom)洗滌測定的結(jié)果在以下指定的實驗條件下進(jìn)行tom洗滌實驗：表10與具有與seqidno:3相比的所示突變的枯草桿菌酶變體的seqidno:3相比的相對性能。實例9：蛋白酶變體的洗滌性能在不同條件下，洗滌具有如表15所示的與seqidno:3相比的突變的變體，這些條件是具有低濃度蛋白酶(30nm)的amsa洗滌，具有高濃度蛋白酶(300nm)的amsa洗滌，tom洗滌和全規(guī)模洗滌(fsw)。使用表1中披露的洗滌劑和pc-03(棉布/聚酯上的巧克力-牛奶/墨水)測試材料用于洗滌。將結(jié)果與具有seqidno:3的參照蛋白酶的性能和下表11中所示的性能進(jìn)行比較，其中參照蛋白酶的結(jié)果設(shè)定為1.00。表11序列表<110>弗里斯(friis),艾斯本彼得（esbenpeter）<120>枯草桿菌酶變體<130>12755-wo-pct<160>3<170>patentin版本3.5<210>1<211>275<212>prt<213>解淀粉芽孢桿菌<400>1alaglnservalprotyrglyvalserglnilelysalaproalaleu151015hisserglnglytyrthrglyserasnvallysvalalavalileasp202530serglyileaspserserhisproaspleulysvalalaglyglyala354045sermetvalprosergluthrasnpropheglnaspasnasnserhis505560glythrhisvalalaglythrvalalaalaleuasnasnserilegly65707580valleuglyvalalaproseralaserleutyralavallysvalleu859095glyalaaspglyserglyglntyrsertrpileileasnglyileglu100105110trpalailealaasnasnmetaspvalileasnmetserleuglygly115120125proserglyseralaalaleulysalaalavalasplysalavalala130135140serglyvalvalvalvalalaalaalaglyasngluglythrsergly145150155160serserserthrvalglytyrproglylystyrproservalileala165170175valglyalavalaspserserasnglnargalaserpheserserval180185190glyprogluleuaspvalmetalaproglyvalserileglnserthr195200205leuproglyasnlystyrglyalatyrasnglythrsermetalaser210215220prohisvalalaglyalaalaalaleuileleuserlyshisproasn225230235240trpthrasnthrglnvalargserserleugluasnthrthrthrlys245250255leuglyaspserphetyrtyrglylysglyleuileasnvalglnala260265270alaalagln275<210>2<211>269<212>prt<213>遲緩芽孢桿菌<400>2alaglnservalprotrpglyileserargvalglnalaproalaala151015hisasnargglyleuthrglyserglyvallysvalalavalleuasp202530thrglyileserthrhisproaspleuasnileargglyglyalaser354045phevalproglygluproserthrglnaspglyasnglyhisglythr505560hisvalalaglythrilealaalaleuasnasnserileglyvalleu65707580glyvalalaproseralagluleutyralavallysvalleuglyala859095aspglyargglyalaileserserilealaglnglyleuglutrpala100105110glyasnasnglymethisvalalaasnleuserleuglyserproser115120125proseralathrleugluglnalavalasnseralathrserarggly130135140valleuvalvalalaalaserglyasnserglyalaserserileser145150155160tyrproalaargtyralaasnalametalavalglyalathraspgln165170175asnasnasnargalaserpheserglntyrglyalaglyleuaspile180185190valalaproglyvalasnvalglnserthrtyrproglyserthrtyr195200205alaserleuasnglythrsermetalathrprohisvalalaglyala210215220alaalaleuvallysglnlysasnprosertrpserasnvalglnile225230235240argasnhisleulysasnthralathrserleuglyserthrasnleu245250255tyrglyserglyleuvalasnalaglualaalathrarg260265<210>3<211>269<212>prt<213>人工的<220><223>blapr101e(根據(jù)seqidno.1編號)<400>3alaglnservalprotrpglyileserargvalglnalaproalaala151015hisasnargglyleuthrglyserglyvallysvalalavalleuasp202530thrglyileserthrhisproaspleuasnileargglyglyalaser354045phevalproglygluproserthrglnaspglyasnglyhisglythr505560hisvalalaglythrilealaalaleuasnasnserileglyvalleu65707580glyvalalaproseralagluleutyralavallysvalleuglyala859095aspglygluglyalaileserserilealaglnglyleuglutrpala100105110glyasnasnglymethisvalalaasnleuserleuglyserproser115120125proseralathrleugluglnalavalasnseralathrserarggly130135140valleuvalvalalaalaserglyasnserglyalaserserileser145150155160tyrproalaargtyralaasnalametalavalglyalathraspgln165170175asnasnasnargalaserpheserglntyrglyalaglyleuaspile180185190valalaproglyvalasnvalglnserthrtyrproglyserthrtyr195200205alaserleuasnglythrsermetalathrprohisvalalaglyala210215220alaalaleuvallysglnlysasnprosertrpserasnvalglnile225230235240argasnhisleulysasnthralathrserleuglyserthrasnleu245250255tyrglyserglyleuvalasnalaglualaalathrarg260265當(dāng)前第1頁12