本發(fā)明涉及融合蛋白、由多個所述融合蛋白的單體組成的納米顆粒、編碼所述融合蛋白的核酸及其診斷性和治療性的應用。

背景技術：

治療劑在患病區(qū)域的選擇性釋放是改善目前療法的最重要挑戰(zhàn)中的一種。在這種環(huán)境下，使用納米顆粒作為治療劑的載體(納米載體)潛在地允許避免可能存在于施用部位和最終靶標之間的生物屏障，以及更具體地，以選擇性方式在患病區(qū)域而不是正常組織處積聚藥物。作為基本的先決條件，納米載體必須能夠以有效的方式結合大量的藥物。

在已知的用于靶向藥物釋放的載體中，由于基于鐵蛋白(fts)的納米顆粒的生物相容性、穿過生物屏障的能力、功能化多樣性以及結合某些類型藥物的性能的優(yōu)異特征，其變得越來越令人關注(vannucci,l.,falvo,e.,ceci,p.multifunctionalprotein-basednanoparticlesforcancertheranosis.2014,a.prokop等人(編輯),intracellulardeliveryii,fundamentalbiomedicaltechnologies7)。fts是高度對稱的由24個組裝成具有基本上球形殼的分子結構的亞基組成的多聚蛋白質結構，其包圍生理學上用于儲存鐵的腔。外徑和內(nèi)徑分別為12和8nm。在下文中這種殼狀分子結構將被稱為“納米顆?！被颉癶ft納米顆粒”。

與其它藥物釋放系統(tǒng)相比，基于人類鐵蛋白重鏈(hft)的納米顆粒顯示出許多優(yōu)點，特別是與體內(nèi)人類應用相關。事實上，hft分子被設計成穿過生物屏障(20nm小直徑)，并且在生理條件下存在于細胞內(nèi)和血液中，盡管以低濃度(約20μg/l)。

作為天然元素，它們不太可能引起強烈的非自身(外來)抗體和/或t細胞免疫應答。

此外，hft是能夠以有效的和選擇性方式由其自身結合腫瘤細胞的少數(shù)天然納米顆粒中的一種。事實上，通過使用用于靶向癌癥治療的最有吸引力的分子中的一種，轉鐵蛋白受體1(tfr1)，已經(jīng)顯示了hft被內(nèi)在化。tfr1確實在許多類型癌癥的表面上上調(diào)(比正常細胞高達100倍)，并且被有效地內(nèi)化。在超過474個臨床組織樣本中，證明了hft而非人類鐵蛋白輕鏈(lft)被tfr1內(nèi)在化，并且與非腫瘤組織相比，特異性識別許多類型的腫瘤(即，肝、肺、胰腺、結腸、子宮頸、卵巢、前列腺、乳腺、肉瘤和胸腺癌)具有98％的敏感性和95％的特異性(fank,caoc,pany,lud,yangd,fengj等人,magnetoferritinnanoparticlesfortargetingandvisualizingtumourtissues.natnanotechnol.2012；7:459-64)。

然而，天然hft表現(xiàn)出一些缺點。首先，其能夠結合某些類型藥物，如例如阿霉素(具有廣泛抗腫瘤譜的抗腫瘤藥物中的一種)的收率較低，并且這可能限制其可能的用途和臨床發(fā)展。其次，當通過全身性途徑注射時，天然hft具有非常短的血漿半衰期，約2-3小時。最后，其天然的鐵氧化酶活性可能抑制人類成骨細胞的發(fā)育和成熟，并導致礦化降低、骨質減少和骨質疏松(zarjoua,jeneyv,arosiop,polim,zavaczkie,ballag,ballaj.ferritinferroxidaseactivity:apotentinhibitorofosteogenesis.jboneminerres.2010,25:164-72)。因此，建議使用不具有抑制作用的通過位點特異性突變(在下文中稱為vhft)獲得的缺乏鐵氧化酶活性的hft變體。

技術實現(xiàn)要素：

為了同時地解決以上列出的關于天然hft的所有缺點，本發(fā)明人決定通過直接作用于蛋白質的外表面來從遺傳學角度修飾人類鐵蛋白重鏈(hft)。在這樣做的過程中，顯著且令人驚奇地提高了將藥物阿霉素封裝在蛋白質腔內(nèi)的能力，并且延長了血漿半衰期，而不影響蛋白質識別腫瘤細胞的能力。

通過如所附權利要求1中所定義的融合蛋白實現(xiàn)了以上和其它目的。其它獨立權利要求和從屬權利要求涉及本發(fā)明的其它方面和具體實施方式，其形成說明書的組成部分。

附圖說明

本發(fā)明的其它特征和優(yōu)勢將出現(xiàn)于以下詳細說明中，參照附圖，提供該詳細說明僅僅用于舉例說明的目的而非以限制的方式，其中：

圖1是制備hft納米顆粒的示意圖，其中將24個單體中的每一個的n末端以遺傳的方式結合至可切割的肽序列以及結合至基本上由脯氨酸、丙氨酸和絲氨酸(pas)組成的序列。為了清楚起見，僅顯示了24個n末端中的5個。

圖2是制備攜帶治療性分子和/或診斷性分子的hft納米顆粒的示意圖?？梢詫⒃摲肿友b載在內(nèi)腔中或結合至蛋白質的外表面。

圖3是描述hft納米顆粒在腫瘤細胞上作用的模式的總體圖。

圖4通過sds-page然后以考馬斯亮藍r-250染色示出了已建立的構建體中的一種，hft-mmp-pas75(pas長度：75個殘基)的蛋白質表達譜。通過使用iptg誘導性質粒pet-11a在大腸桿菌(e.coli)bl21de3中制備重組蛋白，并且如與實施例相關的部分所描述的進行純化。泳道1：非iptg誘導細胞的可溶性成分和不溶性成分(fraction)的sds-page。泳道2：用0.5mmiptg誘導細胞的可溶性成分和不溶性成分的sds-page。hft-mmp-pas條帶由黑色箭頭表示，并以大約40kda遷移，與計算質量28.5kda完全不同。這種現(xiàn)象與其它的對于pas化的(pasylated)蛋白質所報道的一致，并且是由于pas序列的sds結合降低。此外，pas序列與考馬斯亮藍染色微弱，導致低估凝膠中的蛋白質條帶。

圖5示出了天然hft(點線)和融合蛋白構建體hft-mmp-pas75(實線)，hft-mmp-pas40(斷線和點線)或用聚乙二醇(peg)5kda官能化的hft(hft-peg5k，斷線)的尺寸排阻色譜圖。

圖6示出了在體外由蛋白酶mmp-2/9(膠原酶iv)除去pas之前(實線)和之后(點線)的hft-mmp-pas75的典型尺寸排阻色譜圖。

圖7示出了在體外由蛋白酶mmp-2/9(膠原酶iv)除去pas之前和之后的hft-mmp-pas75條帶的遷移譜。用考馬斯亮藍r-250染色sds-page。泳道1：蛋白質標記；泳道2：hft(1mg/ml)；泳道3：用0.2mg/mlmmp-2/9蛋白酶(膠原酶iv)體外消化后的hft-mmp-pas75(2mg/ml)；泳道4：用0.2mg/mlmmp-2/9蛋白酶(膠原酶iv)體外消化后的hft-mmp-pas75(2mg/ml)。

圖8示出了由建立的構建體中的兩個(hft-mmp-pas40和hft-mmp-pas75)與天然hft蛋白質和來自文獻的其它數(shù)據(jù)相比的封裝阿霉素的能力。相對收率以％蛋白質回收率和封裝的阿霉素分子數(shù)量表示。可以看出，與天然hft相比，本專利的構建體主題令人驚訝地和出乎意料地已經(jīng)獲得了至少6倍的封裝藥物阿霉素的改善能力。

圖9示出了在280nm(實線)和485nm(點線)讀數(shù)的hft-mmp-pas40-doxo的典型尺寸排阻色譜圖。

圖10示出了在％藥物釋放隨時間在4℃和37℃下的鐵蛋白-阿霉素復合物(hft-doxo，hft-mmp-pas40-doxo和hft-mmp-pas75-doxo)的穩(wěn)定性。由于在該專利中描述的hft上進行修飾，與相應的天然hft構建體相比，hft-mmp-pas40構建體(用hft-mmp-pas75也獲得相同的結果)在藥物結合形式上更穩(wěn)定(當存儲在4或37℃時，隨時間釋放的藥物％更低)。星號(*)表示在天然hft樣本中，釋放的藥物量不能在超過這段時間測定，由于材料傾向于變得渾濁并沉淀。

圖11示出了doxorubicin、hft-mmp-pas75和hft-mmp-pas75-doxo對肉瘤ht-1080細胞的抗增殖活性。

圖12示出了來自含阿霉素的化合物的藥代動力學實驗的結果。在健康小鼠中靜脈內(nèi)注射裸露藥物阿霉素和inno-206(一種新的和更有活性的阿霉素制劑)或者封裝在基于鐵蛋白的化合物中的阿霉素后在不同時間(10、60、180、360和1440分鐘)時計算阿霉素血漿濃度：天然hft、hft-mmp-pas40和hft-mmp-pas75。

圖13示出了用于評估帶有人類胰腺腫瘤(異種移植物)的小鼠的治療效果的典型實驗。用一次劑量為5mg/kg的阿霉素治療小鼠組(一旦腫瘤大小達到約100mm³)(n＝6)4次(每4天)。測試的化合物是：inno-206、hft-mmp-pas40-doxo和hft-mmp-pas75-doxo。在附圖中，從治療開始大約3周后，報道腫瘤的重量(和代表性圖像)。

具體實施方式

作為本發(fā)明的主題的融合蛋白包含至少三個結構域。

第一結構域包含人類鐵蛋白重鏈的氨基酸序列。這樣的氨基酸序列是天然序列，或是具有至少90％序列同一性的天然序列的變體。由于人類鐵蛋白重鏈具有183個氨基酸的長度(seqidno：1)，與天然序列相比，具有至少90％序列同一性的變體包含多達19個氨基酸取代。該定義尤其包括以上提及的缺乏鐵氧化酶活性的vhft變體的氨基酸序列seqidno：2，其代表可替換的變體。vhft的氨基酸序列以兩個氨基酸取代為特征：賴氨酸代替62位谷氨酸以及甘氨酸代替65位組氨酸。

本發(fā)明的融合蛋白的第二結構域包含至少一種基質金屬蛋白酶(mmp)切割位點，特別是mmp-2、mmp-3、mmp-7或mmp-9的氨基酸序列。作為非限制性的實例，在下文中列出了幾種肽，其模擬膠原鏈的切割序列，并由mmp-2和mmp-9以特別有效的方式切割：

gly-pro-leu-gly-ile-ala-gly-gln(seqidno:3)

gly-pro-gln-gly-ile-trp-gly-gln(seqidno:4)

pro-leu-gly-leu-ala-gly(seqidno:5)

pro-val-gly-leu-ile-gly(seqidno:6)

cys-gly-leu-asp-asp(seqidno:7)

也可以以將切割位點重復數(shù)次的方式構建含有針對預期酶的切割位點的氨基酸序列，如例如以如下所示的順序：

gly-pro-leu-gly-ile-ala-gly-gln-gly-pro-leu-gly-ile-ala-gly-gln(seqidno:8)。

所有先前提及的氨基酸序列是制備根據(jù)本發(fā)明的融合蛋白和納米顆粒的代表性但非限制性的實例。

與n末端連接的本發(fā)明的融合蛋白的第三結構域由富含脯氨酸、絲氨酸和丙氨酸的多肽(為了簡便起見稱為“pas”)的氨基酸序列組成，具有在藥物(特別是用于藥物阿霉素)封裝過程中提高蛋白質的穩(wěn)定性，以及增加蛋白質-藥物復合物的穩(wěn)定性的目的。pas的存在還能夠掩蔽蛋白質表面，從而延長其血漿半衰期。

多肽pas主要由富含pro、ala和ser的氨基酸序列組成，其形成非結構化聚合物，其長度優(yōu)選低于80個氨基酸殘基，更優(yōu)選在20至80個氨基酸殘基之間，更優(yōu)選在40至75個氨基酸殘基之間。在優(yōu)選的實施方式中，上述多肽pas的脯氨酸殘基占多肽pas的總氨基酸殘基的10-40％。

特別適合用于本發(fā)明范圍內(nèi)，因而優(yōu)選的pas多肽的實例是40或75個氨基酸殘基的pas多肽，如例如以下：

aspaapapaspaapapsapaaspaapapaspaapapsapa(seqidno9)

aspaapapaspaapapsapaaspaapapaspaapapsapaaspaapapaspaapapsapaaspaapapaspaapa(seqidno10)

通過如以上先前提及的包含一個以上金屬蛋白酶切割位點的短肽序列，將穩(wěn)定和掩蔽的pas多肽添加至hft的表面，以便提供具有可置換掩蔽的本發(fā)明的融合蛋白質。事實上，通過細胞外基質金屬蛋白酶(mmp)可以在靶組織上將pas多肽選擇性地除去。特別地，mmp-2和mmp-9顯示為在腫瘤微環(huán)境中過表達并參與血管生成、侵襲和腫瘤轉移的關鍵金屬蛋白酶。

在本發(fā)明范圍內(nèi)在鐵蛋白的多聚體表面上使用pas多肽提供了優(yōu)于現(xiàn)有技術的幾個優(yōu)點。為了將藥物或小分子封裝在鐵蛋白的蛋白質腔內(nèi)，迄今為止進行的最明顯的行動是直接地修飾藥物或蛋白質的內(nèi)腔本身。以這種方式，藥物(或小分子)與鐵蛋白內(nèi)腔中的結合位點之間的相互作用是有利的。例如，阿霉素與銅(ii)預復合以增加封裝收率(包封收率，encapsulationyield)(zhenz等人,acsnano.2013jun25；7(6):4830-7)。通過用金結合肽以遺傳的方式修飾鐵蛋白的內(nèi)腔而將金納米顆粒封裝(zhengb等人nanotechnology.2010jan29；21(4):045305)。然而，本發(fā)明人已經(jīng)決定通過使用惰性pas聚合物直接作用在蛋白質外表面上，以便在藥物存在下在通常用于解離(ph2.0)和重新締合(ph7.5)hft的ph突然變化期間穩(wěn)定蛋白質。pas聚合物的存在也可能限制藥物在表面本身上的非特異性結合。

此外，存在pas也可以表示一種延長蛋白質的血漿半衰期的方法，如xl-proteingmbh公司最近已經(jīng)提出了大量蛋白質。事實上，被稱為“pasylation”的技術能夠通過使用天然非結構化氨基酸鏈作為peg的生物替代物來延長生物藥物的血漿半衰期(schlapschym,binderu,c,theobaldi,wachingerk,kislings,hallerd,skerraa.pasylation:abiologicalalternativetopegylationforextendingtheplasmahalf-lifeofpharmaceuticallyactiveproteins.proteinengdessel.2013,26:489-501)。使用該技術，生物活性蛋白質與包含數(shù)百個小氨基酸的殘基的多肽序列(脯氨酸、絲氨酸和丙氨酸(pas))以遺傳的方式融合。通常，pas序列由融合至生物活性蛋白質的100-3000個殘基(優(yōu)選400-600個殘基)組成。在專利wo2008/155134中提及的生物活性蛋白質屬于以下類別：結合蛋白、抗體片段、細胞因子、生長因子、酶、激素。沒有提及的特別是以vhft形式的人類鐵蛋白重鏈，不屬于列出的類別。根據(jù)在下文中將進一步詳細描述的本發(fā)明人進行的測試，對于人類(天然或變體)鐵蛋白重鏈，pas序列可以比wo2008/155134中所描述的短得多，例如低于80個氨基酸殘基。換句話說，通過利用hft形成由24個單體組成的納米顆粒的特定能力，更短的pas序列證明在延長體內(nèi)hft的血漿半衰期上是有效果和有效率的。掩蔽pas多肽的長度的選擇是開發(fā)具備有期望特征的hft的關鍵步驟。事實上，在一方面，體內(nèi)半衰期必須足夠長以使hft在期望位置處積聚。在另一方面，hft必須能夠在富含金屬蛋白酶(mmp)的環(huán)境中從掩蔽聚合物釋放其本身。如果pas序列太短，那么該構建體可能非?？斓貜臋C體被清除。如果pas序列太長，則可能阻礙穿過將構建體與靶組織和細胞(即，血管、緊密連接、腫瘤間質等)分離和/或掩蔽一個以上mmp切割位點的生物屏障。

此外，如在本發(fā)明的融合蛋白的情況下，當?shù)鞍踪|的n末端被修飾時，實現(xiàn)過表達、完全可溶解且適當?shù)卣郫B和組裝的最終蛋白質產(chǎn)物是事先不明顯的。事實上，熟知蛋白質的n-末端修飾可能損害它們的表達、溶解性和/或適當?shù)恼郫B和組裝。

所有這些結果，特別是藥物阿霉素的封裝收率的改善已經(jīng)由本發(fā)明人令人驚訝地和出乎意料地實現(xiàn)，本發(fā)明人通過使用重組蛋白的基因融合技術和生產(chǎn)技術兩者，構建了基于人類鐵蛋白重鏈(hft)的以天然形式或以變體形式(優(yōu)選vhft)的納米顆粒。特別地，如將在與實施例相關的部分中詳細描述的，制備遺傳構建體，其在單個核酸序列(例如dna)中編碼圖1所示的三種序列：i)hft(或vhft)；ii)可由mmp-2/9切割的短肽序列(mmp)；iii)富含pro、ser和ala(pas)的非結構多肽序列，優(yōu)選具有在20至80個殘基之間的長度。將序列ii)和iii)結合至hft的n末端，用于它們的可逆掩蔽。

在一些實施方式中，本發(fā)明的融合蛋白質hft包含分別將第一結構域連接至第二結構域和/或將第二結構域連接至第三結構域的第一和/或第二接頭氨基酸序列。第一和/或第二氨基酸序列可以彼此相同或不同。

如上所述，本發(fā)明人獲得的hft融合蛋白自發(fā)地形成能夠攜帶治療性(化學的化合物、單克隆抗體、肽等)和/或診斷性分子的hft納米顆粒(圖2)。在優(yōu)選的實施方式中，將至少5種治療性和/或診斷性分子封裝在hft納米顆粒的內(nèi)腔中或共價結合至hft納米顆粒的表面。由于pas多肽的存在，與未修飾的蛋白質相比，結合的藥物量和蛋白質-藥物復合物本身的穩(wěn)定性顯著地增加。如在本文中所使用的，術語“蛋白質-藥物復合物的穩(wěn)定性”是指hft融合蛋白將藥物保留在腔中并且在復合物的儲存期間不隨時間釋放藥物的能力。在其最終使用前從hft蛋白質中釋放藥物可以導致不良影響，如沉淀、聚集和最終產(chǎn)品的損失。

用作為用于藥物或診斷劑的靶向結合和釋放系統(tǒng)的本發(fā)明的hft納米顆粒將在循環(huán)中和在不表達mmp或不充分表達mmp的組織中暫時無活性，并且隨后在它們達到富含mmp(mmp-2/9)的靶組織時被活化，在該靶組織中可以釋放其負載(圖3)。治療性分子是例如藥學的活性成分。如在本文中所使用的，表述“藥學的活性成分”或更簡單的“活性成分”是指任何藥學上活性分子(化學的化合物，單克隆抗體，肽等)，例如可用于癌癥治療的分子。用于本發(fā)明的優(yōu)選活性成分是例如但不限于阿霉素、紫杉醇、吉西他濱和鉑類活性成分。也可以使用以上列出的活性成分的前體。

診斷性分子是例如成像劑。如在本文中所使用的，術語“成像劑”涉及允許器官、組織或身體系統(tǒng)的可視化的分子。示例性的成像劑包括順磁劑，光學探針和放射性核素。術語“光學探針”是指可以通過在第一波長處激發(fā)并以第二波長讀取來探測的熒光化合物。示例性的光學探針包括異硫氰酸熒光素和5-(和6)-羧基四甲基羅丹明、琥珀酰亞胺酯。

在診斷性和治療性應用中，作為靶向載體系統(tǒng)的本發(fā)明的hft納米顆?？梢酝ㄟ^任何合適的給藥途徑施用于受試者或患者，例如口服、不經(jīng)腸道、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、作為栓劑、病灶內(nèi)、經(jīng)鼻內(nèi)或皮下、鞘內(nèi)、淋巴內(nèi)、通過吸入微滴，或通過植入緩釋裝置，例如滲透泵。如在本文中所使用的，術語“受試者”涉及動物，如哺乳動物，包括人、牛、綿羊、山羊、馬、狗、貓、兔、大鼠、小鼠等。

如在本文中所使用的，術語“治療(treating)”或“治療(treatment)”是指在治療某種疾病、病變、病癥或癥狀上的成功或改善，或者在某些情況下預防癥狀或病癥發(fā)作的證據(jù)。

在治療性應用中，本發(fā)明的hft納米顆粒用于施用治療有效劑量的藥學活性成分?！爸委熡行┝俊敝荚诒硎緦τ谒┯玫漠a(chǎn)生治療效果的劑量。確切劑量將取決于許多因素，包括治療目標、受試者、待治療的疾病等等，并且可以由本領域普通技術人員通過使用本身已知的方法容易地確定(參見，例如，lieberman，pharmaceuticaldosageforms(第1-3卷，1992)；lloyd，theart，scienceandtechnologyofpharmaceuticalcompounding(1999)；pickar，dosagecalculations(1999)；和remington：thescienceandpracticeofpharmacy，2003年第20版，gennaro編輯，lippincott，williams&wilkins)。

本發(fā)明的hft納米顆?？捎糜谥委熜枰┯盟帉W成分的任何疾病，例如通過在納米顆粒的腔內(nèi)螯合活性成分或者通過將其共價結合至納米顆粒表面。納米顆粒也可以用于診斷，更具體地用于疾病成像，通過在納米顆粒的腔內(nèi)螯合成像劑或者通過將其共價結合至納米顆粒表面。

本發(fā)明的hft納米顆粒可以施用于受試者，用于治療任何疾病，優(yōu)選包括癌癥(cancer)的過度增生性疾病，例如：癌(carcinomas)、神經(jīng)膠質瘤、間皮瘤、黑素瘤、肉瘤、淋巴瘤、白血病(leukaemias)、腺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、成膠質細胞瘤、白血病(leukaemia)、淋巴瘤、前列腺癌、伯基特淋巴瘤(burkitt’slymphoma)、頭頸癌、結腸癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、食管癌、胃癌、胰腺癌、肝膽癌、膀胱癌、小腸癌、直腸癌、腎癌、膽囊癌、陰莖癌、尿道癌、睪丸癌、宮頸癌、陰道癌、子宮癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、內(nèi)分泌胰腺癌、類癌、骨癌、皮膚癌、成視網(wǎng)膜細胞瘤、多發(fā)性骨髓瘤(multiplemielomas)、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(參見cancer:principlesandpractice(devita,v.t.等人，2008版)用于其它類型的癌癥)。

提供以下實施例用于舉例說明的目的，而不是作為對所附權利要求所限定的本發(fā)明范圍的限制。

實施例

實施例1

構建hft-mmp-pas40和hft-mmp-pas75融合蛋白的表達載體

作為設計hft-mmp-pas(或vhft-mmp-pas)構建體的第一步，基于通過x射線晶體學以實驗方式確定的且可以以代碼3ajo在蛋白質數(shù)據(jù)庫(pdb)獲得的hft的三維結構，構建了幾種分子模型。為了以計算的方式修改該結構，使用了insightii分子建模軟件(accelrysinc.)。

i)為了構建vannucci等人(2012)描述的具有合適的流體動力學體積的hft變體的模型，使用含有110個peg單元的結合至在hft表面上顯示的-sh基團的聚合物。將peg聚合物模擬成蛋白質表面上的緊密折疊的構象，以反映針對持續(xù)循環(huán)peg化的(pegylated)hft(peg5kda)的已經(jīng)以實驗的方式測量的流體動力學體積(參見vannucci等人，2012)。

ii)為了構建新的hft的模型，將選擇的mmp切割序列(seqidno：5)結合至每個hft亞基(seqidno：1)的暴露的n末端，并且構建多個不同長度的pas聚合物。通過三個甘氨酸殘基將這些pas聚合物連接至mmp切割序列上，并將其體積與peg化的hft的體積進行比較。最初地，選擇兩種pas長度，因為它們反映了兩種不同的情況，即伸展構象(pas40)和更多折疊的構象(pas75)，考慮到由于存在肽鍵和脯氨酸殘基，因而pas聚合物與高度柔性的peg相比具有顯著降低的自由度。

通過將三種不同序列組合成一個單一序列來獲得hft-mmp-pas40基因：hft(seqidno：1)、mmp(seqidno：5)和pas(seqidno：9)。將由三個甘氨酸殘基組成的接頭插入至hft和mmp之間以及mmp和pas之間。

通過將三種不同的序列組合成一個單一序列：hft(seqidno：1)、mmp(seqidno：5)和pas(seqidno：10)來實現(xiàn)hft-mmp-pas75基因。將由三個甘氨酸殘基組成的接頭插入到hft和mmp之間以及mmp和pas之間。

通過使用geneartag(germania)合成含有hft-mmp-pas40基因或hft-mmp-pas75基因的pet-11a表達載體。考慮到用于在大腸桿菌(escherichiacoli)中高水平表達的密碼子優(yōu)化進行基因合成。

實施例2

hft-mmp-pas40和hft-mmp-pas75融合蛋白的細菌表達和純化

將來自實施例1的含有hft-mmp-pas40或hft-mmp-pas75的pet-11a表達載體插入大腸桿菌bl21(de3)中，并通過雙脫氧測序方法測序以證實存在正確的基因。將含有重組質粒的大腸桿菌bl21(de3)細胞在37℃下在1l的含有氨芐青霉素的terrificbroth(tb)液體培養(yǎng)基(23.6g/l酵母提取物，11.8g/l胰蛋白胨，9.4g/lk2hpo4，2.2g/lkh2po4)中培養(yǎng)直至od600為0.6。通過添加0.5mm的異丙基硫代-β-d-半乳糖苷(iptg)誘導基因表達，并將培養(yǎng)物進一步孵育3小時。通過離心(15000rpm持續(xù)20分鐘)收集細胞，懸浮在50mmtris-hcl(ph7.5)、0.5mm二硫蘇糖醇、1mmedta和300mmnacl中，通過超聲處理破壞。以15000rpm將裂解物離心40分鐘，并且將含有可溶性成分的上清液在37℃下用0.1mg/ml的富含5mmmgcl2的dna酶處理30分鐘，加熱至75℃持續(xù)10分鐘，在冰上冷卻，然后離心除去變性的蛋白質。通過使用濃度為65％的飽和(w/v)硫酸銨將回收的上清液沉淀。將沉淀物重新懸浮并相對30mmtris-hcl、ph7.5、2.5mnacl透析過夜，然后裝載在預先用磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)平衡的superdex200hiload26/600柱(gehealthcare)上。將各成分合并、濃縮、無菌過濾并儲存于4℃。通過利用對在sds存在下跑出的15％page凝膠進行考馬斯亮藍染色評估所有制劑的純度。使用protparam軟件獲得的摩爾消光系數(shù)，在280nm下用分光光度法測定蛋白質濃度(www.expasy.org)。

hft-mmp-pas75構建體的細菌表達譜如圖4所示。

實施例3

制備peg化型(pegylatedversion)的hft蛋白

用peg5kda將天然hftpeg化并用作為尺寸排阻色譜實驗(sec)中的參考。在ph7.0的pbs中并在室溫下，將溶液(2mg/ml)與1.0mm甲氧基聚乙二醇馬來酰亞胺5kda(sigma-aldrich)一起孵育約2小時，伴有攪拌。隨后，用來自amiconultra-15(milliporecorporate)的30kda自旋過濾裝置將樣品過濾并用h2odd進行5次交換，以除去過量的試劑。將peg化的樣品(hft-peg5k)無菌過濾并儲存于4℃。

實施例4

通過尺寸排阻色譜法(sec)評估hft、hft-mmp-pas40、hft-mmp-pas75和hft-peg5k的流體動力學體積

通過使用以ph7.5的磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)平衡的凝膠過濾superose6柱進行sec實驗。以過濾的pbs將所有樣品制備為1mg/ml。

用origin8.0(originlabcorporation，northampton，ma)分析所有sec洗脫曲線。hft及其融合蛋白或官能化型(functionalisedversion)的洗脫曲線如圖5所示。這些結果表明，兩種pas化型都具有比天然蛋白更高的流體動力學體積，并且與hft的peg化型(peg5kda)相當，其中hft-mmp-pas75略高而hft-mmp-pas40略低。此外，與peg化型相比，兩種pas化型都具有更加均勻且單分散的曲線。出于本發(fā)明人的目的，這些流體動力學體積被認為是適當?shù)闹担⑶覍ft-mmp-pas75和hft-mmp-pas40融合蛋白兩者進行進一步地表征，并用于封裝藥物以及用作為癌癥治療的納米載體。

實施例5

在體外蛋白酶mmp2/9存在下從hft-mmp-pas75融合蛋白中除去保護性pas

為了分析mmp-敏感性綴合物的酶切，在mmp-2/9存在下研究了hft-mmp-pas75的切割。將hft-mmp-pas75的溶液與膠原酶iv(含有mmp2和9)混合，并在37℃下孵育2小時。然后，在使用以ph7.5的磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)平衡的凝膠過濾superose6柱的sec實驗中(圖6)以及通過sds凝膠色譜(圖7)測試樣品。

實施例6

制備攜帶化學治療劑的hft-mmp-pas40和hft-mmp-pas75

作為化學治療劑，本發(fā)明人報道了使用藥物阿霉素(doxo)的實例。通過利用作為ph的函數(shù)的蛋白質解偶聯(lián)-偶聯(lián)過程，將doxo封裝在兩種融合蛋白的蛋白質腔內(nèi)。通過使用1.5mmdoxo的優(yōu)選濃度和5μm蛋白質的優(yōu)選濃度進行反應。通過在酸性條件下，在1.8至2.5之間、更優(yōu)選2.0的ph下，在黑暗中溫和地混合doxo和蛋白質，進行封裝反應。反應溫度通常包括在+10℃至+40℃之間(優(yōu)選+25℃)，持續(xù)5至30分鐘(優(yōu)選10分鐘)的時間段。隨后，使用濃縮的naoh以包括在6.5至9.0之間，更優(yōu)選ph7.5的ph快速地調(diào)節(jié)溶液，并且保持攪拌額外的30分鐘。然后，在4℃下以15,000rpm將溶液離心30分鐘，并且在黑暗處在4℃下，在ph7.4的磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)中將上清液透析10至16小時之間的時間段。作為最后一步，用30kda的自旋裝置amiconultra-15(milliporecorporate)將溶液調(diào)節(jié)至期望濃度。將含有doxo(hft-mmp-pas40-doxo和hft-mmp-pas75-doxo)的hft納米顆粒(np)無菌過濾并在黑暗中儲存于4℃。

實施例7

測試藥物阿霉素的封裝收率

測試了兩種建立的構建體(hft-mmp-pas40和hft-mmp-pas75)封裝阿霉素的能力，并將其與天然hft蛋白質封裝阿霉素的能力以及文獻中的其它數(shù)據(jù)進行比較。樣品與酸性異丙醇(2nhcl)在25℃下孵育30分鐘的時間段后測定阿霉素的量。通過使用uv-可見的分光光度計進行評估，在485nm處讀數(shù)，并且doxo的消光系數(shù)為9250m^-1cm^-1。

然后以％蛋白質回收率和封裝的阿霉素分子數(shù)量報道了相對產(chǎn)率(圖8)?？梢钥闯?，與天然hft相比，本專利的構建體主題已經(jīng)令人驚訝地和出人意料地獲得了至少6倍的更佳的封裝藥物阿霉素的能力。

實施例8

測試鐵蛋白-阿霉素復合物的穩(wěn)定性

在4℃和37℃下以隨時間的％藥物釋放測試了鐵蛋白-阿霉素復合物的穩(wěn)定性。通過使用以ph7.5的磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)平衡的凝膠過濾superose6柱由尺寸排阻色譜法(sec)評估釋放的阿霉素的百分比。按照在280和485nm處的吸光度，以過濾的pbs將所有樣品制備為1mg/ml。hft-mmp-pas40-doxo的典型洗脫曲線如圖9所示。

如圖10所示，由于在該專利中描述的hft上進行修飾，與相應的天然hft構建體相比，hft-mmp-pas40構建體(用hft-mmp-pas75也獲得相同的結果)在其藥物結合形式上是更穩(wěn)定的。

實施例9

hft-mmp-pas75-doxo在體外的抗增殖作用

為了測試增殖，將人類肉瘤細胞(ht-1080)在37℃下以約5×10³/孔接種在96孔板上的200μl完全培養(yǎng)基中。第二天，該孔接收pbs、hft-mmp-pas75、阿霉素或hft-mmp-pas75-doxo，以阿霉素的不同濃度一式三份，將細胞培養(yǎng)72小時。在培養(yǎng)的最后4小時內(nèi)，加入[3h]-胸苷(1μci/孔；1mci＝37mbq)，并且通過裂解洗滌的細胞并計數(shù)tca可沉淀的放射性來評估這種摻入。

hft-mmp-pas75-doxo對培養(yǎng)的癌細胞的抗增殖作用如圖11所示。結果表明，hft-mmp-pas75-doxo以濃度依賴的方式有效地抑制肉瘤細胞體外生長，與裸露(nude)阿霉素相比，ic50值相同或甚至更低。鑒于潛在的治療性應用，這些結果是非常重要的。

實施例10

含阿霉素的化合物的藥代動力學實驗

為了評估血漿穩(wěn)定性和藥代動力學，將含阿霉素的化合物靜脈內(nèi)注射到健康小鼠中。然后，在不同時間(10、60、180、360和1440分鐘)抽取血樣，用酸性異丙醇(0.75nhcl)1:10稀釋，且-20℃冷凍。第二天，使用多模式掃描板讀數(shù)器，通過測量在485nm激發(fā)和在590nm發(fā)射下的熒光來量化提取的阿霉素。評估以下樣品：阿霉素、inno-206(新的和更有活性的阿霉素制劑)、hft-doxo、hft-mmp-pas40-doxo和hft-mmp-pas75-doxo。結果示于圖12中。

實施例11

評估含阿霉素的化合物在動物模型中的治療效果

在帶有人類胰腺腫瘤(異種移植物)的小鼠中進行用于評估含阿霉素的化合物的治療效果的典型實驗。以一次劑量為5mg/kg的阿霉素治療小鼠組(一旦腫瘤大小達到約100mm³)(n＝6)4次(每4天)。測試的化合物是：inno-206、hft-mmp-pas40-doxo和hft-mmp-pas75-doxo。在圖13中報道了從治療開始約3周后的腫瘤重量(和代表性圖像)的典型實驗的結果。如圖所示，由本發(fā)明人建立的含阿霉素的構建體與藥物阿霉素的新制劑(inno-206)相比在所測試的劑量下具有更高的治療活性。