發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及嵌合抗原受體(car)，其是能夠重定向?qū)τ趓or1的免疫細(xì)胞特異性和反應(yīng)性的重組嵌合蛋白質(zhì)，ror1是在大多數(shù)骨髓細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)并且被用于在患者中診斷慢性淋巴細(xì)胞白血病(cll)或?qū)嶓w瘤例如乳腺、結(jié)腸、肺和腎臟腫瘤的細(xì)胞表面糖蛋白。當(dāng)其在t細(xì)胞或nk細(xì)胞中被表達(dá)時(shí)，根據(jù)本發(fā)明所述的car特別地可用于治療帶有ror1抗原的惡性細(xì)胞。所產(chǎn)生的工程化的免疫細(xì)胞展示高水平的對(duì)于惡性細(xì)胞的特異性,賦予免疫療法以安全性和效率。發(fā)明背景過繼性免疫療法涉及離體產(chǎn)生的自體抗原特異性的t細(xì)胞的轉(zhuǎn)移,是一種有前途的用來(lái)治療病毒感染和癌癥的策略。用于過繼性免疫療法的t細(xì)胞可以或者通過抗原特異性的t細(xì)胞的擴(kuò)增或者通過遺傳工程重定向t細(xì)胞而產(chǎn)生(park,rosenberg等人2011)。病毒抗原特異性的t細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是一種得到確認(rèn)的用于治療與移植相關(guān)聯(lián)的病毒感染和與稀有病毒有關(guān)的惡性腫瘤的方法。已經(jīng)顯示腫瘤特異性的t細(xì)胞的分離和轉(zhuǎn)移在治療黑素瘤方面是成功的。通過轉(zhuǎn)基因t細(xì)胞受體或嵌合抗原受體(car)的遺傳轉(zhuǎn)移，已經(jīng)成功地在t細(xì)胞中產(chǎn)生了新的特異性(jena,dotti等人2010)。在圖1中呈現(xiàn)了3代的car的略圖。car是合成的受體，其由與單個(gè)融合分子中一個(gè)或更多個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域締合的靶向部分組成。一般而言,car的結(jié)合部分由單鏈抗體(scfv)的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成，包含通過柔性接頭連接的單克隆抗體的輕并且可變的片段。也已經(jīng)成功地使用了基于受體或配體結(jié)構(gòu)域的結(jié)合部分。第一代car的信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域源自于cd3ζ的胞質(zhì)區(qū)或fc受體γ鏈。已經(jīng)顯示第一代car成功地重定向t細(xì)胞的細(xì)胞毒性。然而,它們未能提供持續(xù)的擴(kuò)增和體內(nèi)抗腫瘤活性。已經(jīng)添加了來(lái)自共刺激分子的信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域以及跨膜和鉸鏈結(jié)構(gòu)域來(lái)形成第二和第三代的car,導(dǎo)致在人中某些成功的治療性試驗(yàn),其中可以重定向t細(xì)胞使其對(duì)抗表達(dá)cd19的惡性細(xì)胞(june等人,2011)。然而,針對(duì)cd19scfv使用的信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和共刺激結(jié)構(gòu)域的特定組合是相當(dāng)抗原特異性的并且不能被擴(kuò)展到任何抗原標(biāo)記。慢性淋巴細(xì)胞白血病(cll)是由執(zhí)業(yè)血液學(xué)家管理的一種最通常診斷的白血病。持續(xù)多年，患有cll的患者一直被看作類似的具有長(zhǎng)的自然史并且僅僅邊際有效的治療，其很少產(chǎn)生完全應(yīng)答。最近,與vh突變狀態(tài)和相關(guān)聯(lián)的zap-70過表達(dá)、破壞的p53功能和染色體畸變的生物學(xué)顯著性相關(guān)的幾個(gè)重要的觀察已經(jīng)導(dǎo)致能夠鑒定處于早期疾病發(fā)展和弱生存力的高風(fēng)險(xiǎn)的患者。與這些研究同時(shí),包括核苷類似物、單克隆抗體利妥昔單抗和阿侖單抗在內(nèi)的幾種治療已經(jīng)被引入。當(dāng)被用作有癥狀的cll的初始治療時(shí)，這些治療的組合在臨床試驗(yàn)中已經(jīng)導(dǎo)致高度完全的和總的響應(yīng)速率。因此,cll和治療的初始風(fēng)險(xiǎn)分層化的復(fù)雜性已經(jīng)顯著地增大了。此外,當(dāng)這些初始治療沒有效果時(shí),對(duì)患有氟達(dá)拉濱頑固性疾病的cll患者的方法可能是相當(dāng)具有挑戰(zhàn)性的(byrdj.c等人,2014)。針對(duì)慢性淋巴細(xì)胞白血病(cll)的免疫療法的一種候選抗原是酪氨酸蛋白激酶跨膜受體ror1(也被稱為ntrkr1；uniprotkb/trembl)條目:q01973)。ror1(受體酪氨酸激酶樣孤兒受體1)是一種包含胞外免疫球蛋白(ig)樣、三環(huán)域和卷發(fā)樣半胱氨酸富集域的120-kda糖蛋白(圖2)。被這種基因編碼的蛋白是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中調(diào)節(jié)軸突生長(zhǎng)的受體酪氨酸激酶。它是i型膜蛋白并且屬于ror亞族的細(xì)胞表面受體(reddy等人,1997)。盡管在患有關(guān)于正常白血球的cll的患者中ror1蛋白表達(dá)以及它在cll的病理學(xué)中的作用值得進(jìn)一步研究，ror1可能是用于癌癥免疫療法的合適的靶(daneshmanesh等人；2008)。ror1實(shí)際上是在多種b細(xì)胞惡性腫瘤上被表達(dá)的，而且也在包括乳腺、結(jié)腸、肺和腎臟腫瘤在內(nèi)的某些實(shí)體瘤的亞組上被表達(dá)的。相信ror1在致癌的信號(hào)傳導(dǎo)中起作用以改善腫瘤細(xì)胞在上皮腫瘤中的生存力。重要地,ror1不在除了脂肪和胰腺組織之外的重要器官上被表達(dá),這減小了來(lái)自殺傷正常細(xì)胞的潛在毒性(hudecek等人,2013)。ror1是在胚胎形成期間被表達(dá)的，但是在正常的成熟組織中不存在,除了不成熟的b細(xì)胞前體亞組以及在脂肪細(xì)胞上低水平的表達(dá)以外(hudecek等人,2010；matsuda等人,2001)。通過轉(zhuǎn)錄的剖析首次證明了ror1在b細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病(b-cll)中被表達(dá)(klein等人,2001；rosenwald等人,2001)并且隨后在包括套細(xì)胞淋巴瘤(mcl)、具有t(1；19)染色體易位的急性淋巴母細(xì)胞性白血病(all)和肺、乳腺、結(jié)腸、胰腺、腎和卵巢癌亞組在內(nèi)的許多癌癥的表面上鑒定了ror1(baskar等人,2008；bicocca等人,2012；daneshmanesh等人,2008；dave等人,2012；fukuda等人,2008；yamaguchi等人,2012；zhang等人,2012a,2012b)。在肺腺癌和t(1；19)all這兩者中,ror1在致癌的信號(hào)傳導(dǎo)和ror1的敲減方面與sirna合作暴露了關(guān)于這種分子在保持腫瘤細(xì)胞生存力方面的關(guān)鍵作用(bicocca等人,2012；choudhury等人,2010；gentile等人,2011；yamaguchi等人,2012)。因此,ror1損失不能容易地被腫瘤忍受，使得它成為可能被廣泛地應(yīng)用的car定向的t細(xì)胞療法的有吸引力的候選者。因此本發(fā)明人已經(jīng)考慮到通過利用表達(dá)car的t細(xì)胞，ror1可能是用于治療cll以及實(shí)體瘤例如乳腺、結(jié)腸、肺、卵巢和腎臟腫瘤的有價(jià)值的靶抗原。stanleyriddell博士和laurencecooper博士的實(shí)驗(yàn)室先前已經(jīng)工程化并且確認(rèn)了分別地包含4a5和2a2scfvs的抗ror1sccar(cooper等人2010；hudecek等人,2013)。特別地,hudecek等人公開了抗ror1sccar，其包含不同長(zhǎng)度的igg4鉸鏈和cd28跨膜結(jié)構(gòu)域。仍然存在著對(duì)通過設(shè)計(jì)car結(jié)構(gòu)并且利用合適的組件來(lái)改進(jìn)car功能的需要，因?yàn)檫@些參數(shù)發(fā)揮著重要作用并且精細(xì)調(diào)諧是必需的。因此,作為先前策略的備選,本發(fā)明提供ror1特異性的car,其可以在免疫細(xì)胞中被表達(dá)以靶向ror1惡性細(xì)胞，具有顯著的臨床優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn):通過把car結(jié)構(gòu)與合適組件的選擇結(jié)合,他們可以得到對(duì)于癌性的靶細(xì)胞具有高細(xì)胞毒性的ror1特異性的單鏈car。發(fā)明概述本發(fā)明人已經(jīng)生產(chǎn)了具有不同的結(jié)構(gòu)并且包含來(lái)源于不同的ror1特異性抗體的不同scfv的ror1特異性的car。正如在圖4中闡明的那樣，根據(jù)本發(fā)明的ror1(ntrkr1)特異性的嵌合抗原受體(car)可以具有選自v1至v6的一種多肽結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)包含結(jié)合細(xì)胞外配體的結(jié)構(gòu)域，其包括來(lái)自單克隆抗ror1抗體的vh和vl、鉸鏈、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，包括cd3ζ信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和來(lái)自4-1bb的共刺激結(jié)構(gòu)域在內(nèi)。更特別地,正如在圖4中闡明的那樣，根據(jù)本發(fā)明的ror1(ntrkr1)特異性的嵌合抗原受體(car)可以具有選自v3、v5和v1的多肽結(jié)構(gòu)中的一種結(jié)構(gòu),所述結(jié)構(gòu)包含結(jié)合細(xì)胞外配體的結(jié)構(gòu)域，其包括來(lái)自單克隆抗ror1抗體的vh和vl、鉸鏈、cd8α跨膜結(jié)構(gòu)域、胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，包括cd3ζ信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和來(lái)自4-1bb的共刺激結(jié)構(gòu)域在內(nèi)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這樣的ror1(ntrkr1)特異性的抗原受體在細(xì)胞毒性方面具有意想不到的優(yōu)越的效果。在一個(gè)實(shí)施方式中,ror1特異性的car具有結(jié)構(gòu)v1，其包含fcγriiiα鉸鏈和cd8α跨膜結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中,ror1特異性的car具有結(jié)構(gòu)v3并且包含cd8α鉸鏈和cd8α跨膜結(jié)構(gòu)域。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中,ror1特異性的car具有結(jié)構(gòu)v5，其包含igg1鉸鏈和cd8α跨膜結(jié)構(gòu)域。特別地,所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(scfv)來(lái)源于h10和d10抗ror1抗體，已經(jīng)顯示了顯著的抗癌性質(zhì)。而且,已經(jīng)從鼠h10和d10抗ror1抗體產(chǎn)生了人源化的scfv。本發(fā)明的優(yōu)選的car多肽包含選自seqidno.79至138的氨基酸序列。在體外非特異性的活化(例如采用抗cd3/cd28包被的珠子和重組的il2)以后,采用表達(dá)這些car的多核苷酸利用病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)化了來(lái)自供體的t細(xì)胞。在某些情形中,進(jìn)一步把所述的t細(xì)胞工程化以產(chǎn)生非等位反應(yīng)性t細(xì)胞,更特別地通過破壞tcr的組件(αβ–t細(xì)胞受體)來(lái)預(yù)防移植物抗宿主反應(yīng)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明所述的car在同種異體的t細(xì)胞的背景中是特別地有效的。所產(chǎn)生的工程化t細(xì)胞在體外展示了對(duì)抗ror1陽(yáng)性細(xì)胞的反應(yīng)性達(dá)到各種程度，這顯示本發(fā)明所述的car對(duì)t細(xì)胞的抗原依賴性活化和增殖有貢獻(xiàn),使得它們可用于免疫療法。在本說明書中詳細(xì)地描述了編碼本發(fā)明所述的car的多肽和多核苷酸序列。本發(fā)明所述的工程化的免疫細(xì)胞特別地可用于治療性應(yīng)用,例如用于治療慢性淋巴細(xì)胞白血病(cll)、小的淋巴細(xì)胞性淋巴瘤(sll)、套細(xì)胞淋巴瘤(mcl)、具有t(1；19)染色體易位的急性淋巴母細(xì)胞性白血病(all)。也可以使用它們用于治療實(shí)體瘤例如乳房、結(jié)腸、肺和腎臟腫瘤。附圖簡(jiǎn)述圖1:單鏈嵌合抗原受體(sccar)最通常地是通過把與特異性抗原結(jié)合的單克隆抗體的重和輕鏈可變區(qū)連接到t細(xì)胞信號(hào)分子的胞內(nèi)部分例如與tcr締合的cd3復(fù)合物的組件(ζ鏈)而產(chǎn)生的(圖1b)。第一代sccar僅僅包含傳送活化信號(hào)的t細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(圖1c左邊)。第二代sccar另外摻入了增強(qiáng)t細(xì)胞持久性和體內(nèi)抗腫瘤功能的單個(gè)共刺激分子內(nèi)結(jié)構(gòu)域,例如cd28或41bb的內(nèi)結(jié)構(gòu)域(圖1c中間)。第三代sccar摻入了至少兩個(gè)共刺激分子內(nèi)結(jié)構(gòu)域,例如cd28和41bb的內(nèi)結(jié)構(gòu)域(圖1c右邊)。圖2:ror1蛋白的結(jié)構(gòu)，其由胞外的部分、跨膜部分和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成；正如先前闡明的那樣，胞外和胞內(nèi)的部分包含多個(gè)部件。圖3a、3b、3c和3d:(i)來(lái)自d10和h10vh的序列和vl鼠序列與由編碼免疫球蛋白的可變區(qū)的v和j基因編碼的生殖系人序列的比對(duì),那些序列與鼠的序列具有高的同源性。為了穩(wěn)定性目的(特別地cdr的穩(wěn)定性),在對(duì)應(yīng)于應(yīng)該是來(lái)自鼠來(lái)源的aa的上面的線中，用箭頭顯示aa的“最關(guān)鍵的”位置,并且在下面的線中“不太關(guān)鍵的”位置是可以是人或鼠來(lái)源中的任何一種的那些位置。(ii)mgt/domaingapalign(lefranc等人dev.comp.immunol.,29,185-203(2005))允許對(duì)d10和h10vh的結(jié)構(gòu)域氨基酸序列與vl鼠序列進(jìn)行比對(duì)和“imgt缺口”。展示了輸入序列,將其與imgt結(jié)構(gòu)域目錄的最接近的生殖系v-區(qū)域或最接近的c-結(jié)構(gòu)域比對(duì)以及根據(jù)關(guān)于v-區(qū)域、c-結(jié)構(gòu)域和c樣-結(jié)構(gòu)域的imgt單一編號(hào)與缺口比對(duì)。圖4:不同的car結(jié)構(gòu)(v1至v6)的略圖。圖5:在不同的人細(xì)胞系上的ror1表面分子的編號(hào)。圖6:sccar篩選程序圖7:在人t細(xì)胞中sccar的總的表達(dá)。(a)實(shí)驗(yàn)1，(b)實(shí)驗(yàn)2。圖8:sccar在人t細(xì)胞上的細(xì)胞表面表達(dá)。(a)實(shí)驗(yàn)1，(b)實(shí)驗(yàn)2。圖9:在與靶細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，sccar修飾的t細(xì)胞的脫粒。實(shí)驗(yàn)1，(b)實(shí)驗(yàn)2(細(xì)胞系和/或處理，從左到右:mda-mb-2301、pc-3、mcf-7、沒有活化、pma+離子霉素)。圖10:sccar在人t細(xì)胞上的細(xì)胞表面表達(dá)。以4次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)差形式呈列數(shù)據(jù)。圖11:在與靶細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，sccar修飾的t細(xì)胞的脫粒。以4次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)差形式呈列數(shù)據(jù)。圖12:在與靶細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，經(jīng)由sccar修飾的t細(xì)胞生產(chǎn)ifnγ。以4次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)差形式呈列數(shù)據(jù)(細(xì)胞系和/或處理，從左到右:jeko-1、k562、mda-mb-2301、pc-3、mcf-7、沒有活化)。圖13:在與附著的靶細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，sccar修飾的t細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性。以4次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)差形式呈列數(shù)據(jù)。圖14:在與懸浮的靶細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，sccar修飾的t細(xì)胞的細(xì)胞毒性的活性。以4次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)差形式呈列數(shù)據(jù)。圖15:根據(jù)本發(fā)明的工程化的免疫細(xì)胞的略圖。呈現(xiàn)在這個(gè)圖中的工程化的免疫細(xì)胞是采用編碼逆轉(zhuǎn)錄病毒多肽的car轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細(xì)胞。進(jìn)一步把這種t細(xì)胞工程化以允許更好地并且更安全地植入到患者中，這在本發(fā)明的框架之內(nèi)是任選的。例如x基因可以是表達(dá)tcr的組件(tcrα或tcrβ)的基因,y可以是參與到t細(xì)胞對(duì)免疫抑制性藥物例如cd52(針對(duì)阿侖單抗)或hprt(針對(duì)6-硫代鳥嘌呤)的敏感性中的基因。表1：除scfv以外的不同的car組件的序列表2：來(lái)自鼠來(lái)源的scfv的序列、它們的scfv和來(lái)自d10和h10的人源化scfv的cdr表3：結(jié)構(gòu)v-1的car表4:結(jié)構(gòu)v-2的car表5:結(jié)構(gòu)v-3的car表6：結(jié)構(gòu)v-4的car表7：結(jié)構(gòu)v-5的car表8：結(jié)構(gòu)v-6的car發(fā)明詳述除非在本文中具體地定義,使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與基因療法、生物化學(xué)、遺傳學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域中技術(shù)人員通常理解的相同的意義?？梢园雅c本文中描述的那些方法和物質(zhì)類似的或等同的所有方法和物質(zhì)與本文中描述的合適的方法和物質(zhì)一起用于本發(fā)明的實(shí)踐或測(cè)試中。本文中提到的所有公布、專利申請(qǐng)、專利以及其它參考文獻(xiàn)通過以它們的整體引用并入。在沖突的情況下,包括定義在內(nèi)的本說明書將會(huì)占優(yōu)勢(shì)。進(jìn)一步,除非另外指定，所述的物質(zhì)、方法和實(shí)施例僅僅是闡明性的并且不意圖是限定性的。除非另有指示,本發(fā)明的實(shí)踐將會(huì)利用細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)、轉(zhuǎn)基因生物學(xué)、微生物學(xué)、重組dna和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù),這些都在本領(lǐng)域技術(shù)的范圍之內(nèi)。在文獻(xiàn)中充分地闡明了這樣的技術(shù)。參見例如currentprotocolsinmolecularbiology(frederickm.ausubel,2000,wileyandsoninc,libraryofcongress,美國(guó))；molecularcloning:alaboratorymanual,第三版,(sambrook等人,2001,coldspringharbor,newyork:coldspringharborlaboratorypress)；oligonucleotidesynthesis(m.j.gait編輯,1984)；mullis等人美國(guó)專利號(hào)4,683,195；nucleicacidhybridization(b.d.harries與s.j.higgins編輯1984)；transcriptionandtranslation(b.d.hames與s.j.higgins編輯1984)；cultureofanimalcells(r.i.freshney,alanr.liss,inc.,1987)；immobilizedcellsandenzymes(irlpress,1986)；b.perbal,apracticalguidetoguidetomolecularcloning(1984)；系列,methodsinenzymology(j.abelson和m.simon主要編輯,academicpress,inc.,newyork),具體地,第154和155卷(wu等人編輯.)和第185卷,“geneexpressiontechnology”(d.goeddel編輯.)；genetransfervectorsformammaliancells(j.h.miller和m.p.calos編輯,1987,coldspringharborlaboratory)；immunochemicalmethodsincellandmolecularbiology(mayer和walker編輯,academicpress,london,1987)；handbookofexperimentalimmunology,第i-iv卷(d.m.weir和c.c.blackwell編輯,1986)；和manipulatingthemouseembryo,(coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.,1986)。ror1特異性的嵌合抗原受體本發(fā)明涉及抗ror1嵌合抗原受體(car)的新設(shè)計(jì)，其包含胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和傳導(dǎo)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。正如本文中所用的那樣，術(shù)語(yǔ)“胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域”被定義為能夠結(jié)合配體的寡肽或多肽。優(yōu)選地,所述的結(jié)構(gòu)域?qū)⒛軌蚺c細(xì)胞表面分子相互作用。例如,可以選擇所述的胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域以識(shí)別與特定的疾病狀態(tài)有關(guān)的在靶細(xì)胞上作為細(xì)胞表面標(biāo)志而起作用的配體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中,所述胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含單鏈抗體片段(scfv)，其包括通過柔性接頭連接靶抗原特異性的單克隆抗cd-123抗體的輕(vl)和重(vh)可變片段。所述vl和vh優(yōu)選地選自被稱為2a2、4a5和d10的抗體，正如在表2中所指示的那樣。而且,表2也涉及g6、g3、h10、2a4和1c11的vl和vh,其公開了它們各自的序列seqidno.37、41、45、49、53、58、63、67、71和75,以及涉及d10和h10的人源化的vl和vh，其分別具有序列seqididno.31、36、57和62。圖4顯示根據(jù)本發(fā)明所述的car的6種形式的結(jié)構(gòu)。正如實(shí)施例那樣，表1顯示在進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中使用的組件。根據(jù)本發(fā)明的ror1(ntrkr1)特異性的嵌合抗原受體(car)可以具有選自v1至v6的一種多肽結(jié)構(gòu)，正如在圖4中闡明的那樣,所述結(jié)構(gòu)包含胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其包括來(lái)自單克隆抗ror1抗體的vh和vl、鉸鏈、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，所述胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域包括cd3ζ信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和來(lái)自4-1bb的共刺激結(jié)構(gòu)域在內(nèi)。更具體地,本發(fā)明涉及具有選自v3、v5和v1的一種多肽結(jié)構(gòu)的ror1(ntrkr1)特異性的嵌合抗原受體(car)，正如在圖4中闡明的那樣,所述結(jié)構(gòu)包含胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其包括來(lái)自單克隆抗ror1抗體的vh和vl、鉸鏈、cd8α跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，所述胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域包括cd3ζ信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和來(lái)自4-1bb的共刺激結(jié)構(gòu)域在內(nèi)?？乖Y(jié)合結(jié)構(gòu)域本發(fā)明所述的ror1car的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以是與離開組織(off-tissue)的抗原結(jié)合的任何結(jié)構(gòu)域，該抗原包括但不限于單克隆抗體、重組抗體、人抗體、人源化的抗體以及其功能性片段。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中,所述胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含單鏈抗體片段(scfv)，其包括通過柔性接頭連接的靶抗原特異性的單克隆ror1抗體的輕(vl)和重(vh)可變片段。所述vl和vh優(yōu)選地選自被稱為h10、d10、4a5、g6、g3、2a2、2a4和1c11的抗體，正如在表2中指示的那樣。優(yōu)選地，通過包含例如序列seqidno:10的柔性接頭將它們連接在一起。換句話說,所述car優(yōu)先地包含胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其包括展示與由vh和vl鏈與它們之間的接頭組合產(chǎn)生的多肽序列至少90％、95％、97％或99％同一性的多肽序列，正如在表3至表8中關(guān)于形式v1至v6描繪的那樣。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中,所述vl和vh源自于抗體h10。在其它特定的實(shí)施方式中,所述vl和vh源自于抗體d10。正如本文中所用的那樣,術(shù)語(yǔ)“重組抗體”意指利用重組dna技術(shù)產(chǎn)生的抗體或抗體片段,例如,舉例來(lái)說,由噬菌體、酵母表達(dá)系統(tǒng)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)以及更特別地由采用病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細(xì)胞表達(dá)的抗體或抗體片段，該病毒載體包含編碼抗體的cdr區(qū)域的核酸序列。也應(yīng)該把該術(shù)語(yǔ)解釋成意指通過合成編碼所述的抗體或抗體片段的dna分子(并且該dna分子表達(dá)抗體或抗體片段蛋白)而產(chǎn)生的抗體或抗體片段，或意指限定所述的抗體或抗體片段的氨基酸序列,其中已經(jīng)利用本領(lǐng)域中能夠得到的并且熟知的重組或合成dna或氨基酸序列技術(shù)，得到了所述的dna或氨基酸序列。正如本文中所用的那樣,術(shù)語(yǔ)“人源化的抗體”意指多肽，其包括人源化的重鏈可變區(qū)和人源化的輕鏈可變區(qū)。例如,所述的多肽可以包括人抗體的輕和重鏈可變區(qū)的構(gòu)架(fr)區(qū),同時(shí)實(shí)質(zhì)上保留親本單克隆抗體的抗原結(jié)合特異性。所述的人源化的重鏈可變區(qū)和/或人源化的輕鏈可變區(qū)是至少大約87％人源化的、至少大約90％人源化的、至少大約95％人源化的、至少大約98％人源化的或至少大約100％人源化的,不包括互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)。所述的結(jié)合抗原的多肽分子可以來(lái)源于單克隆抗體供體(例如小鼠單克隆抗體供體)并且可以包括來(lái)自單克隆抗體的cdr(例如小鼠單克隆的cdr)。正如本文中所用的那樣,術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”意指由雜交瘤或病毒轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞中任何一種的實(shí)驗(yàn)室生長(zhǎng)的細(xì)胞克隆生產(chǎn)的抗體，它比天然抗體更豐富和均一并且能夠與ror1抗原上的單個(gè)位點(diǎn)特異性地結(jié)合。它們是由作為單一親本細(xì)胞的全部克隆的相同的免疫細(xì)胞制造的單特異性抗體，和由幾種不同的免疫細(xì)胞制造的多克隆抗體形成對(duì)比。單克隆抗體具有單價(jià)親和性,因?yàn)樗鼈兣c相同的表位結(jié)合。本發(fā)明公開了如上的ror1特異性的嵌合抗原受體(ror1car),其中所述胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含人源化的vh和vl鏈。表2顯示對(duì)應(yīng)于d10和h10抗ror1抗體的人源化scfv(vh和vl鏈)的序列。圖3a至3d呈現(xiàn)在已經(jīng)應(yīng)用了根據(jù)lefrancmp等人的方法(lefranc,mp,ehrenmannf,ginestouxc,giudicelliv,durouxp“使用imgt數(shù)據(jù)庫(kù)和工具用于抗體工程和人源化”,methodsmolbiol.2012；907:3-37)以后，鼠的d10和h10scfv與它們的人源化形式的比對(duì)。在這4種比對(duì)中指示了:-cdr；-具有上面的箭頭的“最關(guān)鍵的”氨基酸(aa)，其意指作為鼠源保持的那些aa；-具有上面的箭頭的“不太關(guān)鍵的”氨基酸，其意指可能是鼠來(lái)源或人來(lái)源的那些aa；應(yīng)該明白，本發(fā)明所述的人源化序列實(shí)際上是一組所有可能通過這樣的來(lái)自人或鼠來(lái)源的“不太關(guān)鍵的”aa的所有組合制造的不同的序列；包含cdr和“最關(guān)鍵的”aa的那些序列如剛好先前呈現(xiàn)的那樣。可以利用本領(lǐng)域中已知的多種技術(shù)來(lái)生產(chǎn)人源化的抗體，這些技術(shù)包括但不限于cdr接枝(參見例如歐洲專利號(hào)ep239,400；國(guó)際公布號(hào)wo91/09967；和美國(guó)專利號(hào)5,225,539、5,530,101和5,585,089,通過引用將其每一篇全文并入本文中)、貼面或表面重建(參見例如歐洲專利號(hào)ep592,106和ep519,596；padlan,1991,molecularimmunology,28(4/5):489-498；studnicka等人,1994,proteinengineering,7(6:805-814；和roguska等人,1994,pnas,91:969-973,通過引用將其每一篇全文并入本文中)、鏈改組(參見例如美國(guó)專利號(hào)5,565,332,通過引用將其全文并入本文中)和在例如下列文獻(xiàn)中公開的技術(shù):美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)us2005/0042664、美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)us2005/0048617、美國(guó)專利號(hào)6,407,213、美國(guó)專利號(hào)5,766,886、國(guó)際公布號(hào)wo9317105、tan等人,j.immunol.,169:1119-25(2002)、caldas等人,proteineng.,13(5):353-60(2000)、morea等人,methods,20(3):267-79(2000)、baca等人,j.biol.chem.,272(16):10678-84(1997)、roguska等人,proteineng.,9(10):895-904(1996)、couto等人,cancerres.,55(23增刊):5973s-5977s(1995)、couto等人,cancerres.,55(8):1717-22(1995)、sandhujs,gene,150(2):409-10(1994)和pedersen等人,j.mol.biol.,235(3):959-73(1994),將其每一篇全文并入本文中。常常,在構(gòu)架區(qū)中的構(gòu)架殘基將會(huì)被來(lái)自cdr供體抗體的相應(yīng)殘基替代，以改變,例如改善抗原結(jié)合。通過本領(lǐng)域中眾所周知的方法，例如通過建立cdr和構(gòu)架殘基相互作用的模型來(lái)鑒定這些構(gòu)架替代，以鑒定對(duì)于抗原結(jié)合和序列比較重要的構(gòu)架殘基而鑒定處于特定位置的不尋常的構(gòu)架殘基(參見例如queen等人,美國(guó)專利號(hào)5,585,089；和riechmann等人,1988,nature,332:323,通過引用將其全文并入本文中)。本發(fā)明的一個(gè)方面特別地涉及具有選自v3、v5和v1的一種多肽結(jié)構(gòu)的ror1(ntrkr1)特異性的嵌合抗原受體(car)，正如在圖4中闡明的那樣,所述結(jié)構(gòu)包含胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其包括來(lái)自單克隆抗ror1抗體的vh和vl、鉸鏈、cd8α跨膜結(jié)構(gòu)域(cd8αtm)和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，其包括cd3ζ信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和來(lái)自4-1bb的共刺激結(jié)構(gòu)域在內(nèi)。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式,所述跨膜結(jié)構(gòu)域是由與seqidno.6(cd8αtm)具有至少80％,優(yōu)選地至少90％,更優(yōu)選地至少95％,以及甚至更優(yōu)選地至少99％序列同一性的多肽編碼的。根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式,所述鉸鏈?zhǔn)怯梢环N多肽編碼的,分別地對(duì)于結(jié)構(gòu)v3、v5和v1,該多肽與seqidno.4(cd8α)、seqidno.5(igg1)和seqidno.3(fcγriiiα)具有至少80％,優(yōu)選地至少90％,更優(yōu)選地至少95％,以及甚至更優(yōu)選地至少99％序列同一性。根據(jù)一種更優(yōu)選的實(shí)施方式,本發(fā)明所述的ror1特異性的car具有多肽結(jié)構(gòu)v3，其包含具有列在seqidno.4中的氨基酸序列的cd8α鉸鏈和具有列在seqidno:6中的氨基酸序列的cd8α跨膜結(jié)構(gòu)域。根據(jù)另一種更優(yōu)選的實(shí)施方式,本發(fā)明所述的ror1特異性的car具有多肽結(jié)構(gòu)v5，其包含具有列在seqidno.5中的氨基酸序列的igg1鉸鏈和具有列在seqidno.6中的氨基酸序列的cd8α跨膜結(jié)構(gòu)域。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式,所述ror1(ntrkr1)特異性的嵌合抗原受體(car)具有選自v3、v5和v1的一種多肽結(jié)構(gòu)，正如在圖4中闡明的那樣,其中所述的胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含:-可變的重鏈vh，其包含seqidno.54(cdr-h1)、seqidno:55(cdr-h2)和seqidno:56(cdr-h3)的來(lái)自小鼠單克隆抗體h10的cdr,和；-可變的輕vl，其包含seqidno.59(cdr-l1)、seqidno:60(cdr-l2)和seqidno:61(cdr-l3)的來(lái)自小鼠單克隆抗體h10的cdr；或:-可變的重vh，其包含seqidno.28(cdr-h1)、seqidno.29(cdr-h2)和seqidno.30(cdr-h3)的來(lái)自小鼠單克隆抗體d10的cdr,和；-可變的輕vl，其包含seqidno.33(cdr-l1)、seqidno:34(cdr-l2)和seqidno:35(cdr-l3)的來(lái)自小鼠單克隆抗體d10的cdr。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中,所述ror1(ntrkr1)特異性的嵌合抗原受體(car)具有選自v3、v5和v1的一種多肽結(jié)構(gòu)，正如在圖4中闡明的那樣,其中所述胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含分別地與-seqidno:53(h10-vh)和seqidno:58(h10-vl)或-seqidno:27(d10-vh)和seqidno:32(d10-vl)具有至少80％,優(yōu)選地至少90％,更優(yōu)選地至少95％,以及甚至更優(yōu)選地至少99％序列同一性的vh和vl鏈,或；在另一個(gè)實(shí)施方式中,所述ror1(ntrkr1)特異性的嵌合抗原受體(car)具有選自v3、v5和v1的一種多肽結(jié)構(gòu)，正如在圖4中闡明的那樣,其中所述胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含來(lái)自已經(jīng)被人源化的h10或d10抗體的vh和vl鏈。特別地,所述結(jié)合細(xì)胞配體的結(jié)構(gòu)域包含人源化的vh和vl鏈,其中-可變的重huh10vh具有由seqidno:57編碼的多肽,并且-可變的輕huh10vh具有由seqidno:62編碼的多肽；或:-可變的重hud10vh具有由seqidno:31編碼的多肽,并且-可變的輕hud10vh具有由seqidno:36編碼的多肽。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式,所述ror1(ntrkr1)特異性的嵌合抗原受體(car)具有選自v3、v5和v1的一種多肽結(jié)構(gòu)，正如在圖4中闡明的那樣,其中所述car多肽與seqidno:117(h10v3-car序列)或與seqidno:93(d10v3-car序列)或與seqidno:95(d10v5-car序列)具有至少80％,優(yōu)選地至少90％,更優(yōu)選地至少95％,以及甚至更優(yōu)選地至少99％序列同一性。car結(jié)構(gòu)根據(jù)本發(fā)明所述的car的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域或胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域?qū)Π馀潴w的結(jié)構(gòu)域與靶結(jié)合以后的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)負(fù)責(zé)，導(dǎo)致免疫細(xì)胞的活化和免疫應(yīng)答。換句話說,所述的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域?qū)ζ渲斜磉_(dá)car的免疫細(xì)胞的至少一種正常效應(yīng)子功能的活化負(fù)責(zé)。例如,t細(xì)胞的效果子功能可以是細(xì)胞溶解活性或輔助活性，包括分泌細(xì)胞因子在內(nèi)。因此,術(shù)語(yǔ)“信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域”是指轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)子信號(hào)并且指導(dǎo)細(xì)胞以執(zhí)行專業(yè)化功能的蛋白質(zhì)的部分。優(yōu)選的用于car中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的實(shí)例可以是t細(xì)胞受體和輔助受體的胞質(zhì)序列，其在抗原受體接合以后協(xié)同行動(dòng)以啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),以及這些序列的任何衍生物或變體和具有相同的功能能力的任何合成序列。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包含兩種不同的類別的胞質(zhì)信號(hào)傳導(dǎo)序列,啟動(dòng)抗原依賴性初級(jí)活化的那些信號(hào)傳導(dǎo)序列和以不依賴于抗原的方式行動(dòng)以提供次級(jí)或共刺激信號(hào)的那些信號(hào)傳導(dǎo)序列。初級(jí)胞質(zhì)信號(hào)傳導(dǎo)序列可以包含信號(hào)傳導(dǎo)基序，其被稱為基于免疫受體酪氨酸的活化基序或itam。itam是在充當(dāng)syk/zap70類酪氨酸激酶的結(jié)合位點(diǎn)的多種受體的胞質(zhì)內(nèi)尾部中發(fā)現(xiàn)的被很好地確定的信號(hào)傳導(dǎo)基序。作為非限定性的實(shí)例，在本發(fā)明中使用的itam的實(shí)例可以包括來(lái)源于tcrζ、fcrγ、fcrβ、fcrε、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd5、cd22、cd79a、cd79b和cd66d的那些。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中,所述的car的傳導(dǎo)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包含cd3ζ信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，其氨基酸序列與氨基酸序列(seqidno:9)具有至少70％,優(yōu)選地至少80％,更優(yōu)選地至少90％、95％、97％或99％的序列同一性。在特別的實(shí)施方式中，本發(fā)明所述的car的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包含共刺激信號(hào)分子或它的一部分。共刺激分子是除有效的免疫應(yīng)答所需要的抗原受體或它們的配體以外的細(xì)胞表面分子?！肮泊碳づ潴w”是指抗原呈遞細(xì)胞上的一種分子，其特異性地結(jié)合t細(xì)胞上的同源共刺激分子,從而提供信號(hào)，除了由例如tcr/cd3復(fù)合物與裝載了肽的mhc分子的結(jié)合提供的初級(jí)信號(hào)之外,所述信號(hào)介導(dǎo)t細(xì)胞應(yīng)答,包括但不限于增殖活化、分化等等。共刺激配體可以包括但是不局限于cd7、b7-1(cd80)、b7-2(cd86)、pd-l1、pd-l2、4-1bbl、ox40l、可誘導(dǎo)的共刺激配體(icos-l)、細(xì)胞間粘著分子(icam、cd30l、cd40、cd70、cd83、hla-g、mica、m1cb、hvem、淋巴毒素β受體、3/tr6、ilt3、ilt4、結(jié)合toll配體受體的激動(dòng)劑或抗體和與b7-h3特異性地結(jié)合的配體。共刺激配體也包括與在t細(xì)胞上存在的共刺激分子(例如但不限于cd27、cd28、4-1bb、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、ltght、nkg2c、b7-h3)特異性地結(jié)合的抗體、與cd83特異性地結(jié)合的配體?！肮泊碳し肿印笔侵冈趖細(xì)胞上的同源結(jié)合配偶體，其與共刺激配體特異性地結(jié)合,從而經(jīng)由所述的細(xì)胞介導(dǎo)共刺激應(yīng)答,例如但不限于增殖。共刺激分子包括但是不限于i類mhc、btla和toll配體受體。共刺激分子的實(shí)例包括cd27、cd28、cd8、4-1bb(cd137)、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3和與cd83特異性地結(jié)合的配體等等。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中,本發(fā)明所述的car的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包含共刺激信號(hào)分子或它的一部分，選自由4-1bb(genbank:aaa53133.)和cd28(np_006130.1)的片段組成的組。特別地，本發(fā)明所述的car的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包含與選自由seqidno:8組成的組的氨基酸序列具有至少70％,優(yōu)選地至少80％,更優(yōu)選地至少90％、95％、97％或99％序列同一性的氨基酸序列。根據(jù)本發(fā)明的car是在細(xì)胞的表面膜上表達(dá)的。因此,這樣的car進(jìn)一步包含跨膜結(jié)構(gòu)域。合適的跨膜結(jié)構(gòu)域的區(qū)別特征包括在細(xì)胞(在本發(fā)明中優(yōu)選免疫細(xì)胞,特別是淋巴細(xì)胞或天然殺傷(nk)細(xì)胞)的表面上表達(dá)以及一起相互作用用于定向免疫細(xì)胞針對(duì)預(yù)先確定的靶細(xì)胞的細(xì)胞應(yīng)答的能力?？缒そY(jié)構(gòu)域可以來(lái)源于天然來(lái)源或者合成來(lái)源?？缒そY(jié)構(gòu)域可以源自于任何膜結(jié)合蛋白或跨膜蛋白。作為非限定性的實(shí)例,跨膜多肽可以是t細(xì)胞受體的亞基例如α、β、γ或δ、構(gòu)成cd3復(fù)合物的多肽、il2受體p55(α鏈)、p75(β鏈)或γ鏈、fc受體的亞基鏈,特別是fcγ受體iii或cd蛋白質(zhì)。備選地，跨膜結(jié)構(gòu)域可以是合成的并且可以包含占優(yōu)勢(shì)的疏水性殘基例如亮氨酸和纈氨酸。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述跨膜結(jié)構(gòu)域源自于人cd8α鏈(例如np_001139345.1)。跨膜結(jié)構(gòu)域可以進(jìn)一步包含在所述胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域和所述跨膜結(jié)構(gòu)域之間的鉸鏈區(qū)。在本文中使用的術(shù)語(yǔ)“鉸鏈區(qū)”一般地意指起著連接跨膜結(jié)構(gòu)域與胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域作用的任何寡肽或多肽。特別地,使用絞鏈區(qū)來(lái)為胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域提供更多的柔性和可接近性。絞鏈區(qū)可以包含至多300個(gè)氨基酸,優(yōu)選地10至100個(gè)氨基酸以及最優(yōu)選地25至50個(gè)氨基酸。絞鏈區(qū)可以來(lái)源于所有或部分天然存在的分子,例如來(lái)源于所有或部分cd8、cd4或cd28的胞外區(qū),或來(lái)源于所有或部分抗體恒定區(qū)。備選地，絞鏈區(qū)可以是對(duì)應(yīng)于天然存在的鉸鏈序列的合成序列,或可以是完全地合成的鉸鏈序列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述鉸鏈結(jié)構(gòu)域包含人cd8α鏈、fcγriiiα受體或igg1的部分，在本說明書中分別地被稱為seqidno.3、seqidno.4和seqidno.5，或鉸鏈多肽的一部分，其優(yōu)選地展示與這些多肽至少80％,更優(yōu)選地至少90％、95％、97％或99％序列同一性。根據(jù)本發(fā)明的car一般地進(jìn)一步包含更特別地選自cd8α和4-1bb的跨膜結(jié)構(gòu)域(tm)，其顯示與seqidno.6或7的多肽的同一性。優(yōu)選seqidno.6的cd8αtm。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式,ror1特異性的car具有選自v3、v5和v1的多肽結(jié)構(gòu)，正如在圖4中的那樣,所述結(jié)構(gòu)包含胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其包括來(lái)自單克隆抗ror1抗體的vh和vl、cd8α鉸鏈、cd8α跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，包括cd3ζ信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和來(lái)自4-1bb的共刺激結(jié)構(gòu)域在內(nèi)。根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式,ror1特異性的car具有選自v3、v5和v1的多肽結(jié)構(gòu)，正如在圖4中闡明的那樣,所述結(jié)構(gòu)包含胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其包括來(lái)自單克隆抗ror1抗體的vh和vl、igg1鉸鏈、cd8α跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，所述胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域包括cd3ζ信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和來(lái)自4-1bb的共刺激結(jié)構(gòu)域在內(nèi)。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式,ror1特異性的car具有選自v3、v5和v1的多肽結(jié)構(gòu)，正如在圖4中闡明的那樣，所述結(jié)構(gòu)包含胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其包括來(lái)自單克隆抗ror1抗體的vh和vl、fcγriiiα鉸鏈、cd8α跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，所述胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域包括cd3ζ信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和來(lái)自4-1bb的共刺激結(jié)構(gòu)域在內(nèi)。表3-8顯示關(guān)于所有的6種形式v1至v6的car結(jié)構(gòu)。通常在癌細(xì)胞中觀察到靶抗原的下調(diào)或突變,產(chǎn)生抗原損失脫逸變體。因此,為了彌補(bǔ)腫瘤脫逸和使免疫細(xì)胞對(duì)靶更有特異性,根據(jù)本發(fā)明所述的ror1特異性的car可以包含另一個(gè)胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,以同時(shí)地結(jié)合靶中的不同元件，從而增大免疫細(xì)胞活化與功能。在一個(gè)實(shí)施方式中,可以在相同的跨膜多肽上串聯(lián)地放置所述的胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,并且任選地可以通過接頭將所述的胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域分開。在另一個(gè)實(shí)施方式中,可以把所述不同的胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域置于組成car的不同的跨膜多肽上。在另一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明涉及每一種包含不同的胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的car群。在一種特定的方面中，本發(fā)明涉及將免疫細(xì)胞工程化的方法，其包括提供免疫細(xì)胞并且在所說細(xì)胞的表面上表達(dá)每一種包含不同的胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的car群。在另一種特定的實(shí)施方式中,本發(fā)明涉及將免疫細(xì)胞工程化的方法，其包括提供免疫細(xì)胞和向所述細(xì)胞中引入編碼多肽的多核苷酸，該多肽組成了car群，其每一種car包含不同的胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。就car群來(lái)說,它意指至少兩種、三種、四種、五種、六種或更多種car，每一種包含不同的胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。根據(jù)本發(fā)明所述的不同的胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以優(yōu)選地同時(shí)地結(jié)合靶中的不同元件，從而增大免疫細(xì)胞活化與功能。本發(fā)明也涉及包含car群的分離的免疫細(xì)胞，其每一種car包含不同的胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。多核苷酸、載體:本發(fā)明也涉及編碼根據(jù)本發(fā)明以上描述的car的多核苷酸、載體。所述的多核苷酸可以存在于表達(dá)盒或表達(dá)載體(例如用于引入到細(xì)菌宿主細(xì)胞中的質(zhì)粒,或病毒載體例如用于轉(zhuǎn)染昆蟲宿主細(xì)胞的桿狀病毒載體,或質(zhì)?；虿《据d體例如用于轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的慢病毒)。在特定的實(shí)施方式中,可以把所述的不同的核酸序列包括在一個(gè)多核苷酸或載體中，所述多核苷酸或載體包含編碼核糖體跳躍序列的核酸序列(例如編碼2a肽的序列)。2a肽是在細(xì)小核糖核酸病毒的口蹄疫病毒亞群中鑒定的，引起核糖體從一個(gè)密碼子"跳躍"到下一個(gè)密碼子，而無(wú)需在由所述的密碼子編碼的兩個(gè)氨基酸之間形成肽鍵(參見(donnellyandelliott2001；atkins,wills等人2007；doronina,wu等人2008))。“密碼子”意指在mrna上(或在dna分子的有義鏈上)的三個(gè)核苷酸，其被核糖體翻譯成一個(gè)氨基酸殘基。因此,當(dāng)所述的多肽被框架中的一種2a寡肽序列分開時(shí)，可以從在mrna之內(nèi)的單個(gè)的毗連的可讀框合成兩條多肽。這樣的核糖體跳躍機(jī)制是本領(lǐng)域中熟知的并且已知被幾種載體被使用，用于由單個(gè)信使rna編碼的幾種蛋白質(zhì)的表達(dá)。為了把跨膜多肽定向到宿主細(xì)胞的分泌途徑中,在多核苷酸序列或載體序列中提供了分泌信號(hào)序列(也被稱為前導(dǎo)序列、前原序列或前序列)。使所述的分泌信號(hào)序列與跨膜核酸序列有效連接,即使所述的兩條序列沿著正確的讀框相連并且定位以把新合成的多肽定向到宿主細(xì)胞的分泌途徑中。分泌信號(hào)序列通常位于編碼目的多肽的核酸序列的5'端,然而某些分泌信號(hào)序列可以位于所述的目的核酸序列中的其它地方(參見例如welch等人,美國(guó)專利號(hào)5,037,743；holland等人,美國(guó)專利號(hào)5,143,830)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的信號(hào)肽包含氨基酸序列seqidno:1或2。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到:鑒于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性,在這些多核苷酸分子之中有相當(dāng)多的序列變化是可能的。優(yōu)選地,為了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，優(yōu)選地為了在人細(xì)胞中表達(dá)，本發(fā)明所述的核酸序列是密碼子優(yōu)化的。密碼子優(yōu)化是指一般地在給定物種的高度表達(dá)的基因中稀有的密碼子的目的序列被一般地在這樣的物種的高表達(dá)的基因中常見的密碼子替換，這樣的密碼子與將要被替換的密碼子編碼相同的氨基酸。將賦予car的免疫細(xì)胞工程化的方法:本發(fā)明包括制備用于免疫療法的免疫細(xì)胞的方法，包括向所述免疫細(xì)胞中離體引入編碼先前描述的一種ror1car的多核苷酸或載體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中,鑒于其在免疫細(xì)胞中被穩(wěn)定地表達(dá)，所述多核苷酸被包括在慢病毒載體中。根據(jù)進(jìn)一步的實(shí)施方式,所述方法進(jìn)一步包括遺傳修飾所述細(xì)胞以使得它們更適用于同種異體移植的步驟。根據(jù)第一個(gè)方面,可以使免疫細(xì)胞成為同種異體的,例如按照wo2013/176915中描述的那樣，通過失活至少一種表達(dá)t細(xì)胞受體(tcr)的一個(gè)或更多個(gè)組件的基因，可以把該失活與編碼或調(diào)節(jié)hla或β2m蛋白表達(dá)的基因的失活組合。相應(yīng)地，移植物抗宿主反應(yīng)綜合征和移植排斥的風(fēng)險(xiǎn)被顯著地減小了。根據(jù)另一個(gè)方面,可以以遺傳方式進(jìn)一步把免疫細(xì)胞工程化以改善它們對(duì)免疫抑制藥物或化學(xué)療法治療的抗性,這些治療被用作治療ror1陽(yáng)性的惡性細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理。例如,作為campath(阿侖單抗)和糖皮質(zhì)激素治療的藥物靶的cd52和糖皮質(zhì)激素受體(gr)可以被失活以使得所述的細(xì)胞對(duì)這些治療有抗性并且給予它們勝過不具有特異性的ror1car的患者自己的t細(xì)胞的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。還可以抑制或減少cd3基因的表達(dá)以賦予對(duì)teplizumab的抗性，teplizumab是另一種免疫抑制性藥物。根據(jù)本發(fā)明，還可以抑制或減小hprt的表達(dá)以賦予對(duì)6-硫代鳥嘌呤的抗性，6-硫代鳥嘌呤是通常被用于化學(xué)療法，尤其是用于治療急性成淋巴細(xì)胞白血病中的一種細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑。根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步方面,通過將編碼充當(dāng)“免疫檢查點(diǎn)”的作為t細(xì)胞活化的調(diào)節(jié)劑的蛋白質(zhì)的基因(例如pdcd1或ctla-4)失活，可以進(jìn)一步操作免疫細(xì)胞，使得它們更有活力或限制消耗。在表9中指示了其表達(dá)可以被減少或抑制的基因的實(shí)例。表9：編碼免疫檢查點(diǎn)蛋白的基因列表在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述進(jìn)一步將免疫細(xì)胞工程化的方法涉及通過dna切割引入編碼特異性的罕見切割的內(nèi)切核酸酶的所述t細(xì)胞多核苷酸,特別是mrna，以選擇性地失活所述的基因,例如上述的那些基因。在一種更優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述罕見切割內(nèi)切核酸酶是tale核酸酶或cas9內(nèi)切核酸酶。迄今為止，tal核酸酶已經(jīng)證明了具有比其它類型的罕見切割內(nèi)切核酸酶更高的特異性和切割效率,使得它們成為用于以恒定的周轉(zhuǎn)率大規(guī)模地生產(chǎn)工程化的免疫細(xì)胞的內(nèi)切核酸酶的選擇。遞送方法上面描述的不同的方法涉及把car引入到細(xì)胞中。作為非限定性的實(shí)例,可以以由一種質(zhì)粒載體編碼的轉(zhuǎn)基因形式引入所述car。所述質(zhì)粒載體還可以包含篩選標(biāo)志，其提供用于鑒定和/或篩選接受所述載體的細(xì)胞。作為把編碼所述多肽的多核苷酸引入到細(xì)胞中的結(jié)果，可以在細(xì)胞中原位合成多肽。備選地,可以在細(xì)胞外面生產(chǎn)所述多肽然后將其引入到細(xì)胞。用于把多核苷酸構(gòu)建體引入到細(xì)胞中的方法是本領(lǐng)域中已知的，并且作為非限定性的實(shí)例，包括穩(wěn)定轉(zhuǎn)化方法，其中把多核苷酸構(gòu)建體整合到細(xì)胞的基因組中，瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法，其中不把多核苷酸構(gòu)建體整合到細(xì)胞的基因組中，和病毒介導(dǎo)的方法?？梢酝ㄟ^例如重組病毒載體(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒屬)、脂質(zhì)體等等把所述多核苷酸引入細(xì)胞中。例如,瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法包括例如顯微注射、電穿孔或粒子轟擊。鑒于在細(xì)胞中被表達(dá)，所述多核苷酸可以被包括在載體中,更特別地包括在質(zhì)?；虿《局小９こ袒拿庖呒?xì)胞本發(fā)明也涉及容易通過所述方法將細(xì)胞工程化而得到的分離的細(xì)胞或細(xì)胞系。特別地，按照上面描述的那樣，所述分離的細(xì)胞包含至少一個(gè)car。在另一個(gè)實(shí)施方式中,所述分離的細(xì)胞包含car群，其每一種包含不同的胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。特別地,所述分離的細(xì)胞包含編碼car的外源性多核苷酸序列。本發(fā)明的遺傳修飾的免疫細(xì)胞是活化的并且獨(dú)立于抗原結(jié)合機(jī)制而增殖。在本發(fā)明的保護(hù)范圍中也包括分離的免疫細(xì)胞,優(yōu)選地根據(jù)先前描述的任意一種方法得到的t細(xì)胞。所述免疫細(xì)胞是指在功能上參與先天的和/或適應(yīng)性的免疫應(yīng)答的啟動(dòng)和/或執(zhí)行的造血來(lái)源的細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明所述免疫細(xì)胞可以源自于干細(xì)胞。所述的干細(xì)胞可以是成熟的干細(xì)胞、非人胚胎干細(xì)胞,更特別地是非人干細(xì)胞、臍帶血干細(xì)胞、祖細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞、誘導(dǎo)的多潛能干細(xì)胞、全能性干細(xì)胞或造血干細(xì)胞。代表性的人細(xì)胞是cd34+細(xì)胞。所述分離的細(xì)胞還可以是樹突狀細(xì)胞、殺傷樹突狀細(xì)胞、肥大細(xì)胞、nk-細(xì)胞、b細(xì)胞或選自由炎性t淋巴細(xì)胞、細(xì)胞毒性的t淋巴細(xì)胞、調(diào)節(jié)性t淋巴細(xì)胞或輔助t淋巴細(xì)胞組成的組的t細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方式中,所述細(xì)胞可以源自于由cd4+t淋巴細(xì)胞和cd8+t淋巴細(xì)胞組成的組。在本發(fā)明所述的細(xì)胞擴(kuò)增和遺傳修飾之前,可以通過多種非限定性的方法從受試者中獲得細(xì)胞來(lái)源?？梢詮脑S多非限定性的來(lái)源獲得細(xì)胞，這些來(lái)源包括外周血單核細(xì)胞、骨髓、淋巴結(jié)組織、臍帶血、胸腺組織、來(lái)自感染部位的組織、腹水、胸腔積液、脾組織和腫瘤。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中,可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員可得到的和已知的許多t細(xì)胞系。在另一個(gè)實(shí)施方式中,所述細(xì)胞可以源自于健康的供體、被診斷患有癌癥的患者或被診斷患有感染的患者。在另一個(gè)實(shí)施方式中,所述細(xì)胞是呈現(xiàn)不同的表型特征的混合細(xì)胞群的一部分。在本發(fā)明所述的保護(hù)范圍中還包括從根據(jù)先前所述方法的轉(zhuǎn)化t細(xì)胞獲得的細(xì)胞系。對(duì)抑制免疫的治療有抗性并且容易通過先前的方法得到的修飾的細(xì)胞被包括在本發(fā)明所述的保護(hù)范圍中。作為優(yōu)選的實(shí)施方式,本發(fā)明提供具有上面描述的ror1car的t細(xì)胞或t細(xì)胞群,其不表達(dá)功能性tcr并且對(duì)于ror1陽(yáng)性細(xì)胞是反應(yīng)性的，用于將它們同種異體移植到患者中。t細(xì)胞的活化和擴(kuò)增無(wú)論在t細(xì)胞的遺傳修飾之前還是之后,即使本發(fā)明所述的遺傳修飾的免疫細(xì)胞是活化的并且獨(dú)立于抗原結(jié)合機(jī)制而增殖,可以一般地使用例如在美國(guó)專利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)20060121005中描述的方法，進(jìn)一步將本發(fā)明所述的免疫細(xì)胞(特別地t細(xì)胞)活化和擴(kuò)增?？梢允箃細(xì)胞在體外或體內(nèi)擴(kuò)增。一般地,通過與刺激cd3tcr復(fù)合物的作用劑和t細(xì)胞表面上的共刺激分子接觸以產(chǎn)生關(guān)于t細(xì)胞的活化信號(hào)，來(lái)使本發(fā)明所述的t細(xì)胞擴(kuò)增。例如,可以使用化學(xué)品例如鈣離子載體a23187、佛波醇12-豆蔻酸13-乙酸酯(pma)或促有絲分裂的凝集素樣植物凝集素(pha)來(lái)產(chǎn)生t細(xì)胞的活化信號(hào)。作為非限定性的實(shí)例,通過與抗cd3抗體或其抗原結(jié)合片段或固定在表面上的抗cd2抗體接觸,或者通過與蛋白激酶c活化劑(例如苔蘚抑素)和鈣離子載體一起接觸，可以在體外刺激t細(xì)胞群。為了共刺激t細(xì)胞表面上的輔助分子,使用結(jié)合所述的輔助分子的配體。例如,可以使t細(xì)胞群與抗cd3抗體和抗cd28抗體在適合于刺激t細(xì)胞增殖的條件下接觸。適合于t細(xì)胞培養(yǎng)的條件包括合適的培養(yǎng)基(例如極限必需培養(yǎng)基或rpmi培養(yǎng)基1640或x-vivo5,(lonza))，其可以包含增殖和生存所必需的因子,包括血清(例如胎牛或人血清)、干擾素-2(il-2)、胰島素、ifn-g、1l-4、1l-7、gm-csf、-10、-2、1l-15、tgfp和tnf-或熟練技術(shù)人員已知用于細(xì)胞生長(zhǎng)的任何其它添加劑。用于細(xì)胞生長(zhǎng)的其它添加劑包括但是不限于表面活性劑、plasmanate和還原劑例如n-乙酰基-半胱氨酸和2-巰基乙醇。培養(yǎng)基可以包括rpmi1640、a1m-v、dmem、mem、a-mem、f-12、x-vivo1和x-vivo20、optimizer,其含有添加的氨基酸、丙酮酸鈉和維生素,是不含血清的或者是補(bǔ)充有合適數(shù)量的血清(或血漿)或確定組的激素和/或足夠t細(xì)胞生長(zhǎng)和擴(kuò)增的數(shù)量的細(xì)胞因子。僅僅在實(shí)驗(yàn)性的培養(yǎng)物中,而不是在將要被輸注到受試者中的細(xì)胞培養(yǎng)物中包含青霉素和鏈霉素。在支持生長(zhǎng)所必需的條件下，例如合適的溫度(例如37℃)和氣氛(例如空氣加5％co2)下保持靶細(xì)胞。已經(jīng)被暴露于變化的刺激時(shí)間的t細(xì)胞可能展示不同的特征。在另一種特定的實(shí)施方式中,通過與組織或細(xì)胞共培養(yǎng)可以使所述細(xì)胞擴(kuò)增。還可以使所述細(xì)胞在體內(nèi)(例如在把所述細(xì)胞施用到受試者中以后，在受試者的血液中)擴(kuò)增。治療性應(yīng)用在另一個(gè)實(shí)施方式中,通過先前描述的不同方法得到的分離的細(xì)胞或來(lái)源于所述分離的細(xì)胞的細(xì)胞系可以用作藥物。在另一個(gè)實(shí)施方式中,可以使用所述藥物用于治療癌癥,特別地用于治療需要治療的患者中的b細(xì)胞淋巴瘤和白血病。在另一個(gè)實(shí)施方式中,可以把根據(jù)本發(fā)明所述分離的分離的細(xì)胞或來(lái)源于所述分離的細(xì)胞的細(xì)胞系用于生產(chǎn)用于治療需要治療的患者中癌癥的藥物中。在另一個(gè)方面中,本發(fā)明依靠用于治療需要治療的患者的方法,所述方法包含至少一個(gè)下列步驟:(a)提供能夠通過任意一種先前描述的方法獲得的免疫細(xì)胞；(b)向所述患者施用所述轉(zhuǎn)化的免疫細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明所述t細(xì)胞可以發(fā)生穩(wěn)健的體內(nèi)t細(xì)胞擴(kuò)增并且可以持續(xù)延長(zhǎng)數(shù)量的時(shí)間。所述治療可以是改善性的、治愈性的或預(yù)防性的。它可以或者是自體免疫療法的一部分，或者是同種異體免疫療法治療的一部分。自體的意指用于治療患者的細(xì)胞、細(xì)胞系或細(xì)胞群來(lái)自于所述患者或來(lái)自于人白細(xì)胞抗原(hla)相容的供體。同種異體的意指用于治療患者的細(xì)胞或細(xì)胞群不來(lái)自于所述患者而是來(lái)自于供體。在先前的部分中描述了可以與所述的公開的方法一起使用的細(xì)胞?？梢允褂盟鲋委焷?lái)治療被診斷的患者，在該患者中前惡性的或惡性的癌癥狀況的特征在于ror1表達(dá)細(xì)胞,特別地特征在于過多的ror1表達(dá)細(xì)胞。在血液學(xué)癌癥,例如白血病或惡性淋巴組織增生病癥中發(fā)現(xiàn)了這樣的狀況。白血病可以是急性髓細(xì)胞性白血病、慢性髓細(xì)胞性白血病、脊髓發(fā)育不良綜合征、急性淋巴細(xì)胞白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病和脊髓發(fā)育不良綜合征。淋巴組織增生性病癥可以是淋巴瘤,特別是慢性淋巴細(xì)胞白血病、非霍奇金氏淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤和濾泡性淋巴瘤(小細(xì)胞和大細(xì)胞)。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式,提供所述工程化的t細(xì)胞，用于治療慢性淋巴細(xì)胞白血病(cll)或小淋巴細(xì)胞性淋巴瘤(sll)。根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式,在輸注ror1-car-t細(xì)胞之前，向淋巴已經(jīng)被消耗的患者施用所述cll或sll治療。通常通過化學(xué)療法,并且優(yōu)選地通過使用藥物如氟達(dá)拉濱(f)、環(huán)磷酰胺(c)、苯達(dá)莫司汀(b)或利妥昔單抗(r)或其組合來(lái)進(jìn)行所述淋巴消耗。典型地,在施用car-t細(xì)胞之前，可以使用εr或fbr的組合用于淋巴消耗。根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式,提供所述工程化的t細(xì)胞用于治療具有t(1；19)染色體易位的套細(xì)胞淋巴瘤(mcl),急性淋巴母細(xì)胞性白血病(all)。可以被治療的癌癥可以包括非實(shí)體腫瘤(例如血液學(xué)腫瘤,包括但不限于前ball(小兒指征)、成年人all、套細(xì)胞淋巴瘤、彌漫性大b細(xì)胞淋巴瘤等等。將要采用本發(fā)明所述的car治療的癌癥類型包括但是不限于白血病或淋巴惡性腫瘤。也包括成年人腫瘤/癌癥和小兒腫瘤/癌癥。也可以通過本發(fā)明所述的car治療實(shí)體瘤例如乳房、結(jié)腸、肺和腎臟腫瘤。還可以使用本發(fā)明的工程化t細(xì)胞作為對(duì)胰腺、腎或卵巢癌癥的治療?？梢园迅鶕?jù)本發(fā)明所述的采用工程化的免疫細(xì)胞的治療與選自抗體療法、化學(xué)療法、細(xì)胞因子療法、樹突狀細(xì)胞療法、基因療法、激素療法、激光療法和放射療法組的一種或更多種抗癌療法組合。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式,可以把所述治療施用到正在進(jìn)行免疫抑制治療的患者中。實(shí)際上,本發(fā)明優(yōu)選地依靠細(xì)胞或細(xì)胞群，由于對(duì)編碼關(guān)于這樣的免疫抑制劑的受體的基因的失活，已經(jīng)使得該細(xì)胞或細(xì)胞群變成對(duì)至少一種免疫抑制劑有抗力。在這個(gè)方面中,免疫抑制的治療將要幫助在所述的患者體內(nèi)對(duì)根據(jù)本發(fā)明所述的t細(xì)胞的挑選和擴(kuò)增?？梢砸匀魏畏奖愕姆绞絹?lái)進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明所述的細(xì)胞或細(xì)胞群的施用,所述方式包括通過氣溶膠吸入、注射、攝入、輸液、植入或移植?？梢砸云は路绞?、以皮內(nèi)方式、以腫瘤內(nèi)方式、以結(jié)內(nèi)方式、以髓內(nèi)方式、以肌內(nèi)內(nèi)方式、通過靜脈內(nèi)或淋巴內(nèi)注射或以腹膜內(nèi)方式，向患者施用本文中描述的組合物。在一個(gè)實(shí)施方式中,優(yōu)選地通過靜脈內(nèi)注射施用本發(fā)明所述的細(xì)胞組合物。施用所述的細(xì)胞或細(xì)胞群可以由施用104-109個(gè)細(xì)胞/kg體重,優(yōu)選地105至106個(gè)細(xì)胞/kg體重(包括在那些范圍之內(nèi)全部整數(shù)值的細(xì)胞數(shù)目)組成。可以以一個(gè)或更多個(gè)劑量施用所述的細(xì)胞或細(xì)胞群。在另一個(gè)實(shí)施方式中,以單劑量施用所述有效量的細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方式中,以在一段時(shí)間上多于一個(gè)劑量的形式施用有效量的所述細(xì)胞。施用的時(shí)間安排在管理醫(yī)師的判斷范圍之內(nèi)并且取決于患者的臨床狀況?？梢詮娜魏蝸?lái)源例如血庫(kù)或供體獲得所述的細(xì)胞或細(xì)胞群。雖然個(gè)人需要變化,但是針對(duì)特定的疾病或狀況確定給定的細(xì)胞類型的最佳的有效量范圍在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍之內(nèi)。有效量意指提供治療性或預(yù)防性益處的數(shù)量。施用的劑量將會(huì)取決于接受者的年齡、健康情況和體重、同時(shí)進(jìn)行的治療的類型(如果有的話)、治療的頻度和想要的效果的本質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方式中,以腸胃外方式施用所述有效量的細(xì)胞或包含那些細(xì)胞的組合物。所述施用可以是靜脈內(nèi)施用?？梢酝ㄟ^在腫瘤之內(nèi)注射來(lái)直接地進(jìn)行所述施用。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中,和許多有關(guān)的治療形式一起(例如在之前、同時(shí)或在以后)向患者施用細(xì)胞，該治療形式包括但是不限于采用作用劑的治療例如針對(duì)ms患者的抗病毒治療、西多福韋(cidofovir)和白介素-2、阿糖胞苷(也被稱為ara-c)或nataliziimab治療或針對(duì)牛皮癬患者的efaliztimab治療或針對(duì)pml患者的其它治療。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，可以與化學(xué)療法、放射、免疫抑制劑例如環(huán)孢菌素、咪唑硫嘌呤、氨甲喋呤、霉酚酸酯和fk506、抗體或其它免疫消除劑例如campath、抗cd3抗體或其它抗體療法、細(xì)胞毒素、氟達(dá)拉濱(fludaribine)、環(huán)孢菌素、fk506、雷帕霉素、霉酚酸、類固醇、fr901228、細(xì)胞因子和輻射組合使用本發(fā)明所述的t細(xì)胞。這些藥物或者抑制鈣依賴性磷酸酶鈣調(diào)磷酸酶(環(huán)孢菌素和fk506)或者抑制對(duì)于生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)重要的p70s6激酶(雷帕霉素)(henderson,naya等人1991；liu,albers等人1992；bierer,hollander等人1993)。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中,和骨髓移植、使用化學(xué)治療劑例如氟達(dá)拉濱的t細(xì)胞消融療法、外部束輻射療法(xrt)、環(huán)磷酰胺或抗體例如okt3或campath一起(例如在之前、同時(shí)地或在之后)，向患者施用本發(fā)明所述的細(xì)胞組合物。在另一個(gè)實(shí)施方式中,在b細(xì)胞消融療法例如與cd20反應(yīng)的作用劑例如rituxan以后，施用本發(fā)明所述的細(xì)胞組合物。例如,在一個(gè)實(shí)施方式中,受試者可以承受采用高劑量化學(xué)療法的標(biāo)準(zhǔn)治療，隨后承受周圍血液干細(xì)胞移植。在某些實(shí)施方式中,在移植以后,受試者接受本發(fā)明所述的擴(kuò)增的免疫細(xì)胞的輸注。在一種另外的實(shí)施方式中，在手術(shù)之前或以后施用擴(kuò)增的細(xì)胞。其它定義-除非另外指定,“一個(gè)”、“一種”、“所述的”和“至少一個(gè)(種)”可被互換地使用并且意指一個(gè)(種)或多于一個(gè)(種)。在本文中根據(jù)單字母密碼命名多肽序列中的氨基酸殘基,其中例如q意指gln或谷氨酰胺殘基,r意指arg或精氨酸殘基以及d意指asp或天冬氨酸殘基。-氨基酸替代意指一個(gè)氨基酸殘基被另一個(gè)替換,例如在一個(gè)肽序列中一個(gè)精氨酸殘基被一個(gè)谷氨酰胺殘基替換是一種氨基酸替代。-按照下列命名核苷酸:使用單字母密碼來(lái)命名核苷的堿基:a是腺嘌呤,t是胸腺嘧啶,c是胞嘧啶,以及g是鳥嘌呤。對(duì)于簡(jiǎn)并的核苷酸,r代表g或a(嘌呤核苷酸),k代表g或t,s代表g或c,w代表a或t,m代表a或c,y代表t或c(嘧啶核苷酸),d代表g、a或t,v代表g、a或c,b代表g、t或c,h代表a、t或c,以及n代表g、a、t或c。-正如在本文中使用的那樣,“核酸”或“多核苷酸”是指核苷酸和/或多核苷酸,例如脫氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)、寡核苷酸、通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)產(chǎn)生的片段以及通過連接、分裂、內(nèi)切核酸酶作用和外切核酸酶作用中的任意一種產(chǎn)生的片段。核酸分子可以由單體組成，該單體是天然地存在的核苷酸(例如dna和rna)或天然地存在的核苷酸的類似物(例如天然地存在的核苷酸的對(duì)映體形式)或兩者的組合。修飾的核苷酸可以在糖部分中和/或在嘧啶或嘌呤堿基部分中具有改變。糖修飾包括例如一個(gè)或更多個(gè)羥基被鹵素、烷基、胺和疊氮基替換,或糖可以被官能化成醚或酯。而且,全部糖部分可以被在空間上和在電子上類似的結(jié)構(gòu)例如氮雜糖和碳環(huán)糖類似物替換。在堿基部分中修飾的實(shí)例包括烷基化的嘌呤和嘧啶、?；泥堰驶蜞奏?或其它眾所周知的雜環(huán)取代?？梢酝ㄟ^磷酸二酯鍵或這樣的鍵的類似物連接核酸單體。核酸可以或者是單鏈的或者是雙鏈的。-嵌合抗原受體(car)意指分子，它把對(duì)抗靶細(xì)胞上存在的組件的結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如基于抗體的對(duì)于所要的抗原(例如腫瘤抗原)的特異性)與t細(xì)胞受體活化的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組合而產(chǎn)生展示特異性的抗靶細(xì)胞免疫活性的嵌合蛋白。一般地,car由與t細(xì)胞抗原受體復(fù)合物ζ鏈的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(scfvfc:ζ)融合的胞外單鏈抗體(scfvfc)組成，并且當(dāng)在t細(xì)胞中被表達(dá)時(shí)，具有基于單克隆抗體的特異性重定向抗原識(shí)別的能力。在本發(fā)明中使用的car的一個(gè)實(shí)例是針對(duì)ror1抗原定向的car并且作為非限定性的實(shí)例，可以包含氨基酸序列:seqidno:79至138。-術(shù)語(yǔ)“內(nèi)切核酸酶”是指能夠催化dna或rna分子,優(yōu)選地dna分子之內(nèi)核酸之間的鍵的水解(切割)的任何野生型或變體酶。內(nèi)切核酸酶不切割無(wú)關(guān)它的序列的dna或rna分子，而是識(shí)別和切割在特異性的多核苷酸序列處(進(jìn)一步被稱為“靶序列”或“靶位點(diǎn)”)的dna或rna分子。當(dāng)其典型地具有長(zhǎng)度大于12個(gè)堿基對(duì)(bp),更優(yōu)選地14-55bp的多核苷酸識(shí)別位點(diǎn)時(shí)，內(nèi)切核酸酶可以被分類為罕見切割的內(nèi)切核酸酶。罕見切割的內(nèi)切核酸酶通過在確定的位點(diǎn)誘導(dǎo)dna雙鏈斷裂(dsb)而顯著地增大了hr(perrin,buckle等人1993；rouet,smih等人1994；choulika,perrin等人1995；pingoud和silva2007)(perrin,buckle等人1993；rouet,smih等人1994；choulika,perrin等人1995；pingoud和silva2007)。罕見切割的內(nèi)切核酸酶例如可以是歸巢內(nèi)切核酸酶(perrin,buckle等人1993；rouet,smih等人1994；choulika,perrin等人1995；pingoud和silva2007)、由工程化的鋅指結(jié)構(gòu)域與限制性內(nèi)切酶(例如foki(paquesandduchateau2007)、來(lái)自crispr系統(tǒng)(porteus和carroll2005)的cas9內(nèi)切核酸酶或化學(xué)內(nèi)切核酸酶(gasiunas,barrangou等人2012；jinek,chylinski等人2012；cong,ran等人2013；mali,yang等人2013))的催化結(jié)構(gòu)域的融合產(chǎn)生的嵌合鋅指核酸酶(zfn)。在化學(xué)內(nèi)切核酸酶中,使化學(xué)或肽切割劑與核酸聚合物綴合，或者與識(shí)別特異性靶序列的另一種dna綴合,從而把切割活性靶到特異性的序列?；瘜W(xué)內(nèi)切核酸酶還包括已知結(jié)合特異性的dna序列的合成的核酸酶像鄰二氮雜菲、dna切割分子和形成三聯(lián)體的寡核苷酸(tfo)的綴合物(kalishandglazer2005)。根據(jù)本發(fā)明，這樣的化學(xué)內(nèi)切核酸酶被包括在術(shù)語(yǔ)“內(nèi)切核酸酶”內(nèi)。-“tale核酸酶”(talen)意指由典型地來(lái)源于轉(zhuǎn)錄活化劑樣效應(yīng)子(tale)的核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個(gè)用來(lái)切割核酸靶序列的核酸酶催化結(jié)構(gòu)域組成的融合蛋白。所述的催化結(jié)構(gòu)域優(yōu)選地是核酸酶結(jié)構(gòu)域以及更優(yōu)選地是具有內(nèi)切核酸酶活性的結(jié)構(gòu)域,如例如i-tevi、cole7、nuca和fok-i。在特定的實(shí)施方式中,可以把tale結(jié)構(gòu)域融合到大范圍核酸酶如例如i-crei和i-onui或其功能性變體。在更加優(yōu)選的實(shí)施方式中,所述核酸酶是單體tale-核酸酶。單體tale核酸酶是一種tale核酸酶，其不需要用于特異性識(shí)別和切割的二聚化,例如在wo2012138927中描述的工程化tal重復(fù)單元與i-tevi的催化結(jié)構(gòu)域的融合體。轉(zhuǎn)錄活化劑樣效應(yīng)子(tale)是來(lái)自細(xì)菌物種黃單胞菌屬的蛋白質(zhì)，其包含許多重復(fù)序列,每一個(gè)重復(fù)序列在第12和13位包含對(duì)所述的核酸靶序列的每一個(gè)核苷酸堿基特異性的二殘基(rvd)。具有相似的模塊堿基/堿基核酸結(jié)合性質(zhì)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域(mbbbd)還可以源自于最近由申請(qǐng)人在不同的細(xì)菌物種中發(fā)現(xiàn)的新的模塊蛋白質(zhì)。所述的新的模塊蛋白質(zhì)具有展示比tal重復(fù)單元更多序列可變性的優(yōu)點(diǎn)。優(yōu)選地,與識(shí)別不同的核苷酸有關(guān)的rvd是用于識(shí)別c的hd、用于識(shí)別t的ng、用于識(shí)別a的ni、用于識(shí)別g或a的nn、用于識(shí)別a、c、g或t的ns、用于識(shí)別t的hg、用于識(shí)別t的ig、用于識(shí)別g的nk、用于識(shí)別c的ha、用于識(shí)別c的nd、用于識(shí)別c的hi、用于識(shí)別g的hn、用于識(shí)別g的na、用于識(shí)別g或a的sn和用于識(shí)別t的yg、用于識(shí)別a的tl、用于識(shí)別a或g的vt和用于識(shí)別a的sw。在另一個(gè)實(shí)施方式中,可以把關(guān)鍵的氨基酸12和13朝向其它氨基酸殘基突變，以便調(diào)節(jié)它們對(duì)于核苷酸a、t、c和g的特異性以及特別地以便增強(qiáng)這種特異性。tale核酸酶已經(jīng)被描述并且被用于刺激基因?qū)ぐ泻突蛐揎?boch,scholze等人2009；moscouandbogdanove2009；christian,cermak等人2010；li,huang等人2011)。根據(jù)商品名talentm(cellectis,8ruedelacroixjarry,75013巴黎,法國(guó))可在市場(chǎng)上買到定制的tal核酸酶。根據(jù)本發(fā)明所述的罕見切割的內(nèi)切核酸酶還可以是cas9內(nèi)切核酸酶。最近,已經(jīng)基于來(lái)自ii型原核crispr(群集的有規(guī)則地間隙的短回文序列重復(fù)單元)適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的rna指導(dǎo)的cas9核酸酶(gasiunas,barrangou等人2012；jinek,chylinski等人2012；cong,ran等人2013；mali,yang等人2013)發(fā)展了新的基因組工程化工具(參見綜述(sorek,lawrence等人2013))。首次在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了所述crispr相關(guān)的(cas)系統(tǒng)并且其發(fā)揮著防御外源dna(病毒或者質(zhì)粒的)的功能。crispr介導(dǎo)的基因組工程化首先通過篩選靶序列來(lái)進(jìn)行，該靶序列常常側(cè)翼有短序列基序,其被稱為原間隔區(qū)相鄰的基序(pam)。在靶序列篩選以后,把與這種靶序列互補(bǔ)的特異性的crrna工程化。在ii型crispr系統(tǒng)中所需要的反式激活的crrna(tracrrna)與crrna配對(duì)并且與所提供的cas9蛋白結(jié)合。cas9起著分子錨的作用，促進(jìn)tracrna與crna的堿基配對(duì)(deltcheva,chylinski等人2011)。在這種三元復(fù)合物中,雙tracrrna:crrna結(jié)構(gòu)起著指導(dǎo)rna的作用，其把內(nèi)切核酸酶cas9定向到同源的靶序列。經(jīng)由cas9-tracrrna:crrna復(fù)合物的靶識(shí)別是通過掃描靶序列和crrna之間靶序列的同源性而啟動(dòng)的。除了所述的靶序列-crrna互補(bǔ)性之外,dna尋靶需要與原間隔區(qū)鄰接的短基序(原間隔區(qū)相鄰基序-pam)的存在。在所述的雙-rna和靶序列之間配對(duì)以后,cas9隨后在pam基序的上游3個(gè)堿基處引入平末端的雙鏈斷裂(garneau,dupuis等人2010)。罕見切割的內(nèi)切核酸酶可以是歸巢內(nèi)切核酸酶,也以大范圍核酸酶的名字被人知曉。這樣的歸巢內(nèi)切核酸酶是本領(lǐng)域中眾所周知的(stoddard2005)。歸巢內(nèi)切核酸酶識(shí)別dna靶序列并且產(chǎn)生單或雙鏈斷裂。歸巢內(nèi)切核酸酶是高度特異性的,識(shí)別長(zhǎng)度范圍從12至45個(gè)堿基對(duì)(bp),通常長(zhǎng)度范圍從14到40個(gè)bp的dna靶位點(diǎn)。根據(jù)本發(fā)明所述的歸巢內(nèi)切核酸酶例如可以對(duì)應(yīng)于laglidadg內(nèi)切核酸酶、hnh內(nèi)切核酸酶、或giy-yig內(nèi)切核酸酶。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的歸巢內(nèi)切核酸酶可以是i-crei變體。-“遞送載體”意指可以被用于本發(fā)明中以使在本發(fā)明中需要的作用劑/化學(xué)試劑和分子(蛋白質(zhì)或核酸)進(jìn)入細(xì)胞接觸(即“接觸”)中或?qū)⑵溥f送到細(xì)胞或亞細(xì)胞區(qū)室(即“引入”)內(nèi)部的任何遞送載體。它包括但是不限于脂質(zhì)體遞送載體、病毒遞送載體、藥物遞送載體、化學(xué)載體、聚合物載體、脂質(zhì)復(fù)合體、多復(fù)合體、樹枝狀聚合物、微泡(超聲造影劑)、納米微粒、乳液或其它合適的轉(zhuǎn)移載體。這些遞送載體允許遞送分子、化學(xué)試劑、大分子(基因、蛋白質(zhì))或其它載體例如質(zhì)粒、經(jīng)由diatos開發(fā)的肽。在這些情形中,遞送載體是分子載體?！斑f送載體”也意指用來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)染的遞送方法。-術(shù)語(yǔ)“載體”是指能夠輸送已經(jīng)與它連接的另一種核酸的一種核酸分子。在本發(fā)明中“載體”包括但是不限于病毒載體、質(zhì)粒、rna載體或線性或環(huán)狀dna或rna分子，其可以由染色體的、非染色體的、半合成的或合成的核酸組成。優(yōu)選的載體是能夠自主復(fù)制(附加型載體)和/或表達(dá)與它們連接的核酸的那些載體(表達(dá)載體)。大量的合適的載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且是市場(chǎng)上可買到的。病毒載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒屬、細(xì)小病毒屬(例如腺伴隨病毒)、冠狀病毒、負(fù)鏈rna病毒例如正黏病毒(例如流感病毒屬)、彈狀病毒(例如狂犬病和水泡性口炎病毒)、副黏病毒(例如麻疹病毒和仙臺(tái)病毒)、正鏈rna病毒例如微小rna病毒和甲病毒屬,以及雙鏈dna病毒，包括腺病毒屬、皰疹病毒(例如i型和ii型單純皰疹病毒、eb病毒、巨細(xì)胞病毒)和痘病毒(例如疫苗、禽痘和金絲雀痘)。其它病毒例如包括諾沃克病毒、披膜病毒、黃熱病病毒、呼腸弧病毒、乳多空病毒、嗜肝dna病毒和肝炎病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒的實(shí)例包括:禽白血病-肉瘤、哺乳動(dòng)物c型、b型病毒、d型病毒、htlv-blv組、慢病毒、泡沫病毒(coffin,j.m.,retroviridae:thevirusesandtheirreplication,infundamentalvirology,第三版,b.n.fields等人編輯,lippincott-ravenpublishers,philadelphia,1996)。-“慢病毒載體”意指基于hiv的慢病毒載體，其是非常有希望用于基因遞送的，因?yàn)樗鼈兊南鄬?duì)大的包裝容量、減小的免疫原性和它們以高效率穩(wěn)定地轉(zhuǎn)導(dǎo)大范圍的不同細(xì)胞類型的能力。慢病毒載體通常是在把三種(包裹、包封和轉(zhuǎn)移)或更多種質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到生產(chǎn)者細(xì)胞中以后產(chǎn)生的。像hiv一樣，慢病毒載體通過病毒表面糖蛋白與細(xì)胞表面上的受體的相互作用進(jìn)入靶細(xì)胞。一旦進(jìn)入,病毒rna發(fā)生由病毒逆轉(zhuǎn)錄酶復(fù)合物介導(dǎo)的反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物是雙鏈線性病毒dna,它是被感染細(xì)胞的dna中病毒整合的底物。作為非限定性的實(shí)例，“整合的慢病毒載體(或lv)”意指這樣的載體，其能夠整合靶細(xì)胞的基因組。處于對(duì)立面，“非整合的慢病毒載體(或nilv)”意指沒有通過病毒整合酶的作用整合靶細(xì)胞基因組的有效的基因遞送載體。-可以把遞送載體和載體與任何細(xì)胞透化技術(shù)例如超聲穿孔或電穿孔或這些技術(shù)的衍生物聯(lián)合或組合。-細(xì)胞意指任何真核的活細(xì)胞、原代細(xì)胞和來(lái)源于這些生物體用于體外培養(yǎng)的細(xì)胞系。-“原代細(xì)胞”意指直接從活組織(活體檢查材料)獲得并且建立用于體外生長(zhǎng)的細(xì)胞,其已經(jīng)經(jīng)歷很少的群加倍并且因此與連續(xù)的發(fā)生腫瘤的或人工地?zé)o限增殖的細(xì)胞系相比，更加代表來(lái)自它們所源自的組織的主要功能性組件和特征。作為非限定性的實(shí)例，細(xì)胞系可以選自由下列組成的組:cho-k1細(xì)胞；hek293細(xì)胞；caco2細(xì)胞；u2-os細(xì)胞；nih3t3細(xì)胞；nso細(xì)胞；sp2細(xì)胞；cho-s細(xì)胞；dg44細(xì)胞；k-562細(xì)胞、u-937細(xì)胞；mrc5細(xì)胞；imr90細(xì)胞；jurkat細(xì)胞；hepg2細(xì)胞；hela細(xì)胞；ht-1080細(xì)胞；hct-116細(xì)胞；hu-h7細(xì)胞；huvec細(xì)胞；molt4細(xì)胞?？梢酝ㄟ^本發(fā)明所述的方法修飾所有這些細(xì)胞系以提供用來(lái)生產(chǎn)、表達(dá)、定量、檢測(cè)、研究目的基因或蛋白的細(xì)胞系模型；還可以使用這些模型來(lái)在研究和生產(chǎn)以及各種領(lǐng)域例如化學(xué)制劑、生物燃料、治療學(xué)和農(nóng)藝學(xué)中篩選生物學(xué)上活性的目的分子，作為非限定性的實(shí)例。-“突變”意指在多核苷酸(cdna,基因)或多肽序列中最多一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)、八個(gè)、九個(gè)、十個(gè)、十一個(gè)、十二個(gè)、十三個(gè)、十四個(gè)、十五個(gè)、二十個(gè)、二十五個(gè)、三十個(gè)、四十個(gè)、五十個(gè)或更多個(gè)核苷酸/氨基酸的替代、缺失、插入。所述的突變可以影響基因的編碼序列或它的調(diào)節(jié)序列。它也可能影響基因組序列的結(jié)構(gòu)或編碼的mrna的結(jié)構(gòu)/穩(wěn)定性。-就“變體”來(lái)說，它意指重復(fù)變體、變體、結(jié)合dna的變體、tale核酸酶變體、通過母體分子的氨基酸序列中至少一個(gè)殘基的突變或替換而得到的多肽變體。-“功能性變體”意指蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的具有催化活性的突變體；與它的親本蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域或附加性能比較，這樣的突變體可以具有相同的活性或較高的或較低的活性。-“同一性”是指在兩個(gè)核酸分子或多肽之間的序列同一性?？梢酝ㄟ^比較為了比較的目的被比對(duì)的每一個(gè)序列中的位置來(lái)測(cè)定同一性。當(dāng)在被比較的序列中的一個(gè)位置被相同的堿基占據(jù)時(shí)，則在該位置處，所述的分子是相同的。在核酸或氨基酸序列之間的相似性或同一性的程度是被所述的核酸序列具有的多個(gè)位置處相同或匹配的核苷酸數(shù)目的函數(shù)?？梢允褂酶鞣N比對(duì)算法和/或程序來(lái)計(jì)算兩個(gè)序列之間的同一性,包括fasta或blast，可以利用其作為gcg序列分析包(universityofwisconsin,madison,wis.)的一部分,并且可以采用例如默認(rèn)設(shè)置來(lái)使用它們。例如,考慮與本文中描述的特異性多肽具有至少70％、85％、90％、95％、98％或99％同一性并且優(yōu)選地實(shí)質(zhì)上展示相同的功能的多肽以及編碼這樣的多肽的多核苷酸。除非另有指示，相似性得分將會(huì)基于使用blosum62。當(dāng)使用blastp時(shí),相似性％基于blastp正的得分并且序列同一性％基于blastp同一性得分。blastp“同一性”顯示在高得分序列對(duì)中相同的總殘基數(shù)目和分?jǐn)?shù)；而blastp“正的”顯示具有正值的比對(duì)得分并且彼此相似的殘基的數(shù)目和分?jǐn)?shù)。本公開考慮和包括與本文中公開的氨基酸序列具有這些同一性或相似性程度或任何中間的同一性或相似性程度的氨基酸序列。利用遺傳密碼推斷了類似多肽的多核苷酸序列，并且可以通過傳統(tǒng)方法,特別地通過利用遺傳密碼逆翻譯它的氨基酸序列得到它們。-“信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域”或“共刺激配體”是指在抗原呈遞細(xì)胞上的分子，其特異性地結(jié)合t細(xì)胞上的同源共刺激分子,從而除了通過例如使tcr/cd3復(fù)合物與負(fù)載肽的mhc分子結(jié)合而提供的初始信號(hào)之外，還提供一種信號(hào),其介導(dǎo)t細(xì)胞應(yīng)答，包括但不限于增殖活化、分化等等。共刺激配體可以包括但是不局限于cd7、b7-1(cd80)、b7-2(cd86)、pd-l1、pd-l2、4-1bbl、ox40l、可誘導(dǎo)的共刺激配體(icos-l)、細(xì)胞間粘著分子(icam、cd30l、cd40、cd70、cd83、hla-g、mica、m1cb、hvem、淋巴毒素β受體、3/tr6、ilt3、ilt4、結(jié)合toll配體受體的激動(dòng)劑或抗體和與b7-h3特異性地結(jié)合的配體。共刺激配體也包括與存在于t細(xì)胞上的共刺激分子(例如但不限于cd27、cd28、4-ibb、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、ltght、nkg2c、b7-h3)特異性地結(jié)合的抗體、與cd83特異性地結(jié)合的配體。“共刺激分子”是指t細(xì)胞上的同源結(jié)合組件，其與共刺激配體特異性地結(jié)合，從而經(jīng)由所述的細(xì)胞介導(dǎo)共刺激應(yīng)答,例如但不限于增殖。共刺激分子包括但是不限于i類mhc分子、btla和toll配體受體。正如本文中所用的那樣，“共刺激信號(hào)”是指一種信號(hào),其與初始信號(hào)例如tcr/cd3連接組合導(dǎo)致t細(xì)胞增殖和/或關(guān)鍵分子的上調(diào)或下調(diào)。正如本文中所用的那樣，術(shù)語(yǔ)“胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域”被定義為能夠結(jié)合配體的寡肽或多肽。優(yōu)選地,所述的結(jié)構(gòu)域?qū)?huì)能夠與細(xì)胞表面分子相互作用。例如,可以選擇胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，使其識(shí)別充當(dāng)在靶細(xì)胞上與特定的疾病狀態(tài)有關(guān)的細(xì)胞表面標(biāo)志的配體。因此，可以充當(dāng)配體的細(xì)胞表面標(biāo)志的實(shí)例包括與病毒、細(xì)菌和寄生蟲感染、自體免疫疾病和癌細(xì)胞有關(guān)的那些標(biāo)志。正如本文中所用的那樣，術(shù)語(yǔ)“受試者”或“患者”包括動(dòng)物界的所有成員，包括非人靈長(zhǎng)類和人在內(nèi)。以上書寫的本發(fā)明的描述提供了制造和使用它的方式和方法，使得本領(lǐng)域任何技術(shù)人員能夠制造和使用它,這確保特別地提供所附的權(quán)利要求書的主題,該權(quán)利要求書構(gòu)成原始說明書的一部分。當(dāng)在本文中聲明數(shù)字邊界或范圍時(shí),邊界點(diǎn)被包括在內(nèi)。還有,在數(shù)字邊界或范圍之內(nèi)的所有的值和子范圍被具體地包括在內(nèi)，好像明確地寫出一樣。提供以上描述以確保本領(lǐng)域技術(shù)人員制造和使用本發(fā)明,并且以上描述是在特定的應(yīng)用以及它的要求的背景中被提供的。對(duì)優(yōu)選的實(shí)施方式的各種修飾將會(huì)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的,并且在不偏離本發(fā)明所述的精髓和保護(hù)范圍的情況下，在本文中定義的一般原理可以被應(yīng)用于其它實(shí)施方式和應(yīng)用。因此,本發(fā)明意圖不局限于所示的實(shí)施方式,而是與最寬的保護(hù)范圍相符合，與本文中公開的原理和特征一致。已經(jīng)一般性地描述了本發(fā)明,通過參考某些具體的實(shí)施例可以獲得進(jìn)一步的理解,在本文中僅僅為了闡明的目的提供這些具體的實(shí)施例,并且除非另外指定，這些具體的實(shí)施例意圖不是限定性的。一般方法原代細(xì)胞通過密度梯度離心從來(lái)自健康的志愿者供體的血沉棕黃層中分離了外周血單核細(xì)胞(etablissementfrancaisdusang)。然后使用easysep人t細(xì)胞富集試劑盒(stemcelltechnologies)純化了t淋巴細(xì)胞,并且采用在補(bǔ)充有20ng/mlil-2(miltenyi)和5％人ab血清(seralab)的x-vivo15培養(yǎng)基(lonza)中的dynabeads人t-活化劑cd3/cd28(lifetechnologies)活化。細(xì)胞系k562、jeko-1、mda-mb-231、pc-3和mcf-7細(xì)胞系是從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心獲得的。在補(bǔ)充有10％熱滅活的fcs、2mmol/ll-谷氨酰胺和100單位/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的imdm中培養(yǎng)k562細(xì)胞。在補(bǔ)充有20％熱滅活的fcs、2mmol/ll-谷氨酰胺和100單位/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的rpmi中培養(yǎng)jeko-1細(xì)胞。在補(bǔ)充有10％熱滅活的fcs、2mmol/ll-谷氨酰胺和100單位/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的dmem中培養(yǎng)mda-mb-231細(xì)胞。在補(bǔ)充有10％熱滅活的fcs、2mmol/ll-谷氨酰胺和100單位/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的f-12k中培養(yǎng)pc-3細(xì)胞。在補(bǔ)充有10％熱滅活的fcs、2mmol/ll-谷氨酰胺和100單位/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素以及0.01mg/ml人胰島素的dmem中培養(yǎng)mcf-7細(xì)胞。ror1細(xì)胞表面表達(dá)的定量按照生產(chǎn)商的說明書使用單克隆抗ror1抗體克隆2a(miltenyi)和dakoqifikit，通過飽和結(jié)合測(cè)定了在不同的人細(xì)胞系上ror1表面分子的數(shù)目。編碼sccar的dna的合成通過genscript合成了編碼sccar的dna。用于sccar的體外轉(zhuǎn)錄mrna載體的構(gòu)建在質(zhì)粒pcls9632中在t7啟動(dòng)子和bghpolya之間克隆了編碼sccar的dna。rna體外轉(zhuǎn)錄使用mmessagemmachinet7ultra試劑盒(lifetechnologies)遵照生產(chǎn)商的說明書，在體外轉(zhuǎn)錄了編碼sccar的mrna并且使其聚腺苷酸化。采用rneasy柱子(qiagen)純化rna,在細(xì)胞穿孔培養(yǎng)基t(harvardapparatus)中洗脫,并且通過使用nanodropnd-1000分光光度計(jì)測(cè)定在260nm處的吸光度來(lái)定量。在變性甲醛/mops瓊脂糖凝膠上證實(shí)了所述的rna的品質(zhì)。t細(xì)胞的rna電穿孔活化后4-5天或11-12天,使用agilepulsemax系統(tǒng)(harvardapparatus)通過電轉(zhuǎn)移信使rna來(lái)轉(zhuǎn)染t淋巴細(xì)胞。使5x106個(gè)細(xì)胞與15μg編碼sccar的mrna混合到0.4cm樣品池中。按照在wo2013176915中提出的實(shí)驗(yàn)規(guī)程進(jìn)行電穿孔。在電穿孔以后,把細(xì)胞稀釋到培養(yǎng)基中并且在37℃/5％co2下培育。sccar的檢測(cè)通過流式細(xì)胞術(shù):采用pe標(biāo)記的多克隆山羊抗小鼠(fab)2抗體(jacksonimmunoresearch)或生物素標(biāo)記的蛋白l(genscript)隨后藻紅蛋白標(biāo)記的鏈霉親和素(bdpharmingen)將t細(xì)胞染色,最后使用macsquant流式細(xì)胞儀(miltenyi)進(jìn)行分析。通過蛋白質(zhì)印跡:在包含1mm原釩酸鹽、3μg/ml蛋白酶抑制劑和2mmpmsf的50μlripa緩沖液中對(duì)1x106個(gè)t細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞溶解。通過sds-page在anykdtm丙烯酰胺凝膠(biorad)上分離細(xì)胞裂解液。在轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜以后,將其與小鼠抗人cd3z(pharmingen)一起培育，然后與山羊抗小鼠igg辣根過氧化酶綴合的抗體(sigma)一起培育。通過使用ecl試劑盒(pierce)顯示了抗體結(jié)合。脫粒試驗(yàn)將5×104個(gè)t細(xì)胞與5×104個(gè)ror1陽(yáng)性的或ror1陰性的細(xì)胞以0.1ml/孔在96-孔板中共培養(yǎng)。在共培養(yǎng)開始時(shí)，除了1μg/ml抗cd49d(bdbiosciences)、1μg/ml抗cd28(miltenyi)和1x莫能菌素溶液(ebioscience)之外，還添加apc標(biāo)記的抗cd107a(bdbiosciences)。在培育6h以后,采用可固定的生存力染料(ebioscience)和vioblue標(biāo)記的抗cd8(miltenyi)染色細(xì)胞并且使用macsquant流式細(xì)胞儀(miltenyi)進(jìn)行分析。脫粒的細(xì)胞毒性t細(xì)胞對(duì)應(yīng)于cd8+cd107a+細(xì)胞。細(xì)胞因子釋放試驗(yàn)將5x104個(gè)t細(xì)胞與5x104個(gè)ror1陽(yáng)性的或ror1陰性的細(xì)胞以0.1ml/孔在96-孔板中共培養(yǎng)。在培育24小時(shí)以后,收集培養(yǎng)上清液并且分析ifnγror1陽(yáng)性的或ror1陰性的細(xì)胞。細(xì)胞毒性試驗(yàn)對(duì)于附著的靶細(xì)胞:把2x104個(gè)ror1陽(yáng)性的或ror1陰性的細(xì)胞以0.1ml/孔接種在96孔板中。在鋪板后的第二天,采用celltracecfse標(biāo)記ror1陽(yáng)性的和ror1陰性的細(xì)胞并且與4x105個(gè)t細(xì)胞共培養(yǎng)4小時(shí)。然后收獲所述的細(xì)胞,采用可固定的生存力染料(ebioscience)染色并且使用macsquant流式細(xì)胞儀(miltenyi)進(jìn)行分析。使用下式計(jì)算特異性裂解的百分比:標(biāo)記ror1陽(yáng)性的和ror1陰性的細(xì)胞。把大約2x104個(gè)ror1陽(yáng)性的細(xì)胞與2x104個(gè)ror1陰性的細(xì)胞與4x105個(gè)t細(xì)胞以0.1ml/孔在96孔板中共培養(yǎng)。在培育4小時(shí)以后,收獲所述的細(xì)胞,采用可固定的生存力染料(ebioscience)染色并且使用macsquant流式細(xì)胞儀(miltenyi)進(jìn)行分析。使用上式計(jì)算特異性裂解的百分比。實(shí)施例car多肽序列的實(shí)施例：此后,呈列了60種ror1sccar的序列seqidno.79至138(含有肽信號(hào))。這些具有v1至v6的car結(jié)構(gòu)和來(lái)自8種不同抗體的scfv:2a2、4a5、d10、g6、g3、h10、2a4和1c11。在下列實(shí)驗(yàn)中分析了形式v1、v3和v5(含有cd8α跨膜結(jié)構(gòu)域的sccar)，含有2a2scfv的sccar除外,對(duì)其僅僅測(cè)試了v1形式(作為基準(zhǔn)用于比較),這個(gè)具有與hudecek等人所描述的(2013)相同的結(jié)構(gòu)?？蚣苄蛄袑?duì)應(yīng)于優(yōu)選的vh和vl序列。然而,可以交換vh和vl以改善根據(jù)本發(fā)明的car效率。2a2v1(seqidno.1+seqidno.79)2a2v2(seqidno.1+seqidno.80)2a2v3(seqidno.1+seqidno.81)2a2v4(seqidno.1+seqidno.82)2a2v5(seqidno.1+seqidno.83)2a2v6(seqidno.1+seqidno.84)4a5v1(seqidno.1+seqidno.85)4a5v2(seqidno.1+seqidno.86)4a5v3(seqidno.1+seqidno.87)4a5v4(seqidno.1+seqidno.88)4a5v5(seqidno.1+seqidno.89)4a5v6(seqidno.1+seqidno.90)d10v1(seqidno.1+seqidno.91)d10v2(seqidno.1+seqidno.92)d10v3(seqidno.1+seqidno.93)d10v4(seqidno.1+seqidno.94)d10v5(seqidno.1+seqidno.95)d10v6(seqidno.1+seqidno.96)人源化的d10-v1(seqidno.1+seqidno.97)人源化的d10-v2(seqidno.1+seqidno.98)人源化的d10-v3(seqidno.1+seqidno.99)人源化的d10-v4(seqidno.1+seqidno.100)人源化的d10-v5(seqidno.1+seqidno.101人源化的d10-v6(seqidno.1+seqidno.102)g6v1(seqidno.1+seqidno.103)g6v2(seqidno.1+seqidno.104)g6v3(seqidno.1+seqidno.105)g6v4(seqidno.1+seqidno.106)g6v5(seqidno.1+seqidno.107)g6v6(seqidno.1+seqidno.108)g3v1(seqidno.1+seqidno.109)g3v2(seqidno.1+seqidno.110)g3v3(seqidno.1+seqidno.111)g3v4(seqidno.1+seqidno.112)g3v5(seqidno.1+seqidno.113)g3v6(seqidno.1+seqidno.114)h10v1(seqidno.1+seqidno.115)h10v2(seqidno.1+seqidno.116)h10v3(seqidno.1+seqidno.117)h10v4(seqidno.1+seqidno.118)h10v5(seqidno.1+seqidno.119)h10v6(seqidno.1+seqidno.120)人源化的h10-v1(seqidno.1+seqidno.121)人源化的h10-v2(seqidno.1+seqidno.122)人源化的h10-v3(seqidno.1+seqidno.123)人源化的h10-v4(seqidno.1+seqidno.124)人源化的h10-v5(seqidno.1+seqidno.125)人源化的h10-v6(seqidno.1+seqidno.126)2a4v1(seqidno.1+seqidno.127)2a4v2(seqidno.1+seqidno.128)2a4v3(seqidno.1+seqidno.129)2a4v4(seqidno.1+seqidno.130)2a4v5(seqidno.1+seqidno.131)2a4v6(seqidno.1+seqidno.132)1c11v1(seqidno.1+seqidno.133)1c11v2(seqidno.1+seqidno.134)1c11v3(seqidno.1+seqidno.135)1c11v4(seqidno.1+seqidno.136)1c11v5(seqidno.1+seqidno.137)1c11v6(seqidno.1+seqidno.138)實(shí)施例1:ror1陽(yáng)性的和陰性的細(xì)胞系的篩選為了鑒定表達(dá)不同的細(xì)胞表面表達(dá)水平的ror1的細(xì)胞系,通過流式細(xì)胞術(shù)，使用qifikit(dako)和抗人ror1mab克隆2a2分析了12種人細(xì)胞系(參見材料和方法)。先前已經(jīng)在文獻(xiàn)中描述了這些細(xì)胞系中的九種在mrna或蛋白質(zhì)水平上對(duì)于ror1是陽(yáng)性的(表10)。表10:在文獻(xiàn)中報(bào)道的對(duì)于ror1是陽(yáng)性的細(xì)胞系細(xì)胞系描述細(xì)胞類型mda-mb-231貼壁的乳腺癌pc-3貼壁的前列腺腺癌mda-mb-468貼壁的乳腺癌hs746t貼壁的胃癌nci-h1993貼壁的非小細(xì)胞肺癌ht-29貼壁的結(jié)腸直腸腺癌a549貼壁的人肺腺癌cal51貼壁的乳癌jeko-1懸浮的套細(xì)胞淋巴癌流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果指示mda-mb-231(htb-26)、mda-mb-468(htb.132)、hs746t(htb-135)和ht-29(htb-38)細(xì)胞表達(dá)最高水平的ror1細(xì)胞表面表達(dá)。在pc-3(crl-1435)、nci-h1993(crl5909)、a549(atccccl-185)和jeko-1(atcccrl-3006)細(xì)胞上檢測(cè)到較低水平的ror1細(xì)胞表面表達(dá),大約是高表達(dá)的細(xì)胞系的ror1細(xì)胞表面表達(dá)的一半(圖5)。從這些結(jié)果中也觀察到:在它們的表面上，mcf-7、k562和t細(xì)胞不表達(dá)ror1并且cal51僅僅表達(dá)很低水平的ror1。從這些細(xì)胞系中挑選了三種貼壁的細(xì)胞系，用來(lái)篩選抗ror1sccar的活性:表達(dá)不同水平的ror1的pc-3和mda-mb-231細(xì)胞以及ror1陰性的mcf-7細(xì)胞。還挑選了兩種懸浮細(xì)胞系，用來(lái)篩選抗ror1sccar的活性:ror1陽(yáng)性的jeko-1細(xì)胞和ror1陰性的k562細(xì)胞。實(shí)施例2：抗ror1sccar的產(chǎn)生在下列實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生和測(cè)試了一組18種第二代ror1特異性的sccar(圖1c)。它們由下列表1-2的構(gòu)件的融合體產(chǎn)生:-來(lái)自鼠來(lái)源的scfv或來(lái)自d10、g6、g3、h10、2a4或1c11的人源化形式；-一個(gè)間隔區(qū):人fcγriiiα、cd8α或igg1鉸鏈；-人cd8α的跨膜結(jié)構(gòu)域和人41bb的共刺激結(jié)構(gòu)域；-人cd3ζ的活化結(jié)構(gòu)域把不同的scfv用在sccar中以產(chǎn)生具有不同的結(jié)合親和性和不同的表位特異性的受體。mabd10和g6靶向3’ig樣區(qū)和ig樣結(jié)構(gòu)域和ror1的crd結(jié)構(gòu)域之間的接頭區(qū)(圖2)mabg3、h10和2a4靶向ror1的igg樣區(qū)(圖2)mab1c11靶向ror1的crd結(jié)構(gòu)域(圖2)。把不同長(zhǎng)度的三種間隔區(qū)(16aa、45aa和231aa)用在sccar中，以試圖經(jīng)由ror1的近端表位和遠(yuǎn)端表位優(yōu)化sccar的接合(guest等人,2005)。實(shí)施例3:抗ror1sccar的體外測(cè)試在人原代t細(xì)胞中，使用在圖6中呈現(xiàn)的兩步篩選法測(cè)試了先前設(shè)計(jì)的抗ror1sccar。在所述的篩選方法的第一步中,采用編碼早些時(shí)候呈現(xiàn)的18種抗ror1sccar的mrna，把預(yù)先采用抗cd28/cd3珠子和il-2活化了4-5天的原代人t細(xì)胞電穿孔。在電穿孔一天后,通過流式細(xì)胞術(shù)和蛋白質(zhì)印跡評(píng)估sccar表達(dá),并且通過測(cè)定t細(xì)胞脫粒來(lái)評(píng)估sccar修飾的t細(xì)胞活性。挑選通過蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)的并且在與至少一種ror1陽(yáng)性的細(xì)胞系共培養(yǎng)時(shí)誘導(dǎo)顯著的特異性的t細(xì)胞脫粒(≥20％)的sccar，使其經(jīng)過所述的篩選方法的第二步。在所述的篩選方法的第二步中,采用在第一篩選步驟以后選擇的編碼抗ror1sccar的mrna，把預(yù)先采用抗cd28/cd3珠子和il-2活化了11-12天的原代人t細(xì)胞電穿孔。在電穿孔一兩天后,通過流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估sccar表達(dá),并且通過測(cè)定t細(xì)胞的效應(yīng)子功能(脫粒、ifng生產(chǎn)和細(xì)胞裂解活性)來(lái)評(píng)估sccar修飾的t細(xì)胞活性。挑選在與至少一種ror1陽(yáng)性的細(xì)胞系共培養(yǎng)時(shí)誘導(dǎo)顯著的特異性的t細(xì)胞脫粒(≥20％)、顯著的特異性的t細(xì)胞的細(xì)胞毒性(≥20％的靶細(xì)胞裂解)和顯著的經(jīng)由t細(xì)胞的ifng生產(chǎn)(≥1500pg/ml)的sccar，作為潛在的sccar候選者。把上述sccar與包含和短鉸鏈(seqidno.79)融合的2a2scfv的基準(zhǔn)sccar進(jìn)行系統(tǒng)性地比較，因?yàn)橄惹霸趆udecek等人,2013中顯示了這種sccar是功能性的。a)sccar的初步篩選:sccar表達(dá)首先,通過蛋白質(zhì)印跡使用抗人cd3ζmab在t細(xì)胞中評(píng)估了抗ror1sccar的總表達(dá)。觀察到在t細(xì)胞裂解物中強(qiáng)烈地檢測(cè)到包含中間區(qū)(cd8α鉸鏈)或長(zhǎng)的間隔區(qū)(igg1鉸鏈)的sccar，無(wú)論它們包含什么scfv。然而,對(duì)于包含短間隔區(qū)(fcγriiiα)的sccar，具有g(shù)6、g3和h10scfv的那些sccar被很好地檢測(cè)到了,而具有d10、2a4和1c11scfv的那些sccar被微弱地檢測(cè)到或沒有被檢測(cè)到(圖7a和7b)。然后,通過流式細(xì)胞術(shù)，使用抗fab或蛋白l評(píng)估了抗ror1sccar在t細(xì)胞上的表面表達(dá)(圖8a和8b)。觀察到-通過蛋白質(zhì)印跡在t細(xì)胞裂解物中很好地檢測(cè)到的sccard10-v3、d10-v5、g6-v3、g6-v5、g3-v3、g3-v5、h10-v3、h10-v5、2a4-v3和2a4-v5也通過流式細(xì)胞術(shù)在t細(xì)胞表面上被很好地檢測(cè)到；-通過蛋白質(zhì)印跡在t細(xì)胞裂解物中沒有或幾乎沒有檢測(cè)到的sccard10-v1、2a4-v1和1c11-v1，通過流式細(xì)胞術(shù)在t細(xì)胞表面上也未被檢測(cè)到。sccar活性為了評(píng)估sccar活性,在與ror1陽(yáng)性的(mda-mb-231和pc-3)或ror1陰性的(mcf-7)細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，分析了sccar修飾的t細(xì)胞的脫粒。觀察到:和在與mcf-7細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)相比較，在與mda-mb-231和pc-3細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，采用sccard10-v1、d10-v3、d10-v5、h10-v1、h10-v3和h10-v5修飾的t細(xì)胞顯著地更多地脫粒(≥20％)(圖9a和9b)。圖9a和圖9b顯示:在與mda-mb-231、pc-3和mcf-7細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，沒有修飾的t細(xì)胞以及采用sccarh10和d10修飾的t細(xì)胞完全脫粒，比采用sccarg6、g3、2a4和1c11的好得多。初步篩選的結(jié)論:總而言之，這些結(jié)果證明:在本發(fā)明之內(nèi)設(shè)計(jì)的18種抗ror1sccar之中,有6種(d10-v1、d10-v3、d10-v5、h10-v1、h10-v3和h10-v5)滿足被挑選的標(biāo)準(zhǔn)，其將經(jīng)過所述的篩選方法的第二步。b)sccar的第二步篩選sccar表達(dá)通過流式細(xì)胞術(shù)使用蛋白l評(píng)估了抗ror1sccar在t細(xì)胞上的表面表達(dá)。觀察到:在活化后4-5天在電穿孔的t細(xì)胞上很好地檢測(cè)到的sccard10-v3、d10-v5、h10-v3和h10-v5(圖8a和8b)，在活化后11-12天在電穿孔的t細(xì)胞上沒有被檢測(cè)到或僅僅被微弱地檢測(cè)到(圖10)。sccar活性首先,為了評(píng)估sccar活性,在與ror1陽(yáng)性的(mda-mb-231、pc-3和jeko-1)或ror1陰性的(mcf-7和k562)細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，分析了sccar修飾的t細(xì)胞的脫粒。觀察到:與采用sccard10-v1、h10-v1和h10-v5修飾的t細(xì)胞相反，和在與mcf-7細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)或在單獨(dú)的培養(yǎng)基中相比較，在與mda-mb-231和pc-3細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，采用sccard10-v1、d10-v3、d10-v3、h10-v1、h10-v3和h10-v3修飾的t細(xì)胞顯著更多地脫粒(≥20％)(圖11)。然后在與ror1陽(yáng)性的(mda-mb-231、pc-3和jeko-1)或ror1陰性的(mcf-7和k562)細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，分析了經(jīng)由sccar修飾的t細(xì)胞的ifnγ生產(chǎn)。觀察到:與采用sccard10-v1、h10-v1、h10-v5修飾的t細(xì)胞相反，在與mcf-7細(xì)胞、k562細(xì)胞或單獨(dú)的培養(yǎng)基共培養(yǎng)時(shí)相比較，在與mda-mb-231、pc-3和jeko-1細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，采用sccard10-v3、d10-v5和h10-v3修飾的t細(xì)胞顯著地生產(chǎn)更多的ifnγ(≥1500pg/ml)(圖12)。最后,在與ror-1陰性的(mcf-7和k562)或ror1陽(yáng)性的(mda-mb-231、pc-3和jeko-1)細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，分析了sccar修飾的t細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性。觀察到:與采用sccard10-v1、h10-v1和h10-v5修飾的t細(xì)胞相反,采用sccard10-v3、d10-v5和h10-v3修飾的t細(xì)胞特異性地殺死超過20％的共培養(yǎng)中的pc-3細(xì)胞(圖13)。盡管采用sccard10-v3和h10-v3修飾的t細(xì)胞也殺死超過20％的共培養(yǎng)中的mda-mb-231和jeko-1細(xì)胞,但是對(duì)于采用sccard10-v5修飾的t細(xì)胞，情況不是這樣的(圖13和圖14)。第二步篩選的結(jié)論:總而言之，這些結(jié)果證明:從所有測(cè)試的sccar中，d10-v3、d10-v5和h10-v3代表最有價(jià)值的sccar。可以注意到在誘導(dǎo)細(xì)胞毒性方面，形式v2的2種car的輕微的優(yōu)勢(shì)(很好地針對(duì)所測(cè)試的不同ror1陽(yáng)性的細(xì)胞系的應(yīng)答)。實(shí)施例4:tcrα失活的表達(dá)ror1car的細(xì)胞的增殖圖15顯示通過使用罕見切割的內(nèi)切核酸酶的tcrα失活的略圖。設(shè)計(jì)和生產(chǎn)了靶向兩個(gè)17-bp長(zhǎng)序列(被稱為半靶)的雜二聚體tale核酸酶，這兩個(gè)17-bp長(zhǎng)序列被t細(xì)胞受體α恒定鏈區(qū)(trac)基因內(nèi)部的15-bp間隔區(qū)分開。每一個(gè)半靶被列在表11中的半tale核酸酶的重復(fù)序列識(shí)別。表11:靶向tcrα基因的tal核酸酶使用限制性內(nèi)切酶消化，在t7啟動(dòng)子的控制下，在哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中亞克隆了每一種tale核酸酶構(gòu)建體。從攜帶t7啟動(dòng)子下游的編碼序列的質(zhì)粒合成編碼切割trac基因組序列的tale核酸酶的mrna。采用編碼兩種半trac_t01tale核酸酶的2種mrna中的每一種，將采用抗cd3/cd28包被的珠子在72小時(shí)期間預(yù)先活化的純化的t細(xì)胞轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染以后48小時(shí),分別地采用編碼先前描述的一種ror1car(seqidno:79至138)的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)自相同供體的不同組的t細(xì)胞。在轉(zhuǎn)導(dǎo)后2天,使用抗cd3磁珠純化cd3neg細(xì)胞，并且在轉(zhuǎn)導(dǎo)后5天，采用可溶性抗cd28(5μg/ml)重新激活細(xì)胞。在重新激活以后，通過每個(gè)星期計(jì)數(shù)細(xì)胞2次來(lái)跟蹤細(xì)胞增殖至多30天。觀察到與沒有轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞比較，在表達(dá)ror1car的tcrα失活的細(xì)胞中增大的增殖,特別是當(dāng)采用抗cd28重新激活時(shí)。為了研究表達(dá)ror1car的人t細(xì)胞是否顯示活化狀態(tài),在轉(zhuǎn)導(dǎo)后7天，通過facs分析了活化標(biāo)志cd25的表達(dá)。為了評(píng)估它們與沒有轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞比較的活化，分析了采用編碼ror1car的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的純化的細(xì)胞在它們的表面處的cd25表達(dá)。增加的cd25表達(dá)指示抗cd28的重新激活或沒有重新激活狀況。參考文獻(xiàn)arimondo,p.b.,c.j.thomas,etal.(2006)."exploringthecellularactivityofcamptothecin-triple-helix-formingoligonucleotideconjugates."molcellbiol26(1):324-33.atkins,j.f.,n.m.wills,etal.(2007)."acasefor"stopgo":reprogrammingtranslationtoaugmentcodonmeaningofggnbypromotingunconventionaltermination(stop)afteradditionofglycineandthenallowingcontinuedtranslation(go)."rna13(6):803-10.baska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