本發(fā)明涉及家禽傳染病防疫領(lǐng)域，尤其涉及一種雞傳染性鼻炎亞單位疫苗及其制備方法。

背景技術(shù)：

雞傳染性鼻炎(Avian infectious coryza)是由副雞禽桿菌(Avibacterium paragallinarum，Apg)感染引起的最重要的呼吸疾病之一。患有雞傳染性鼻炎的雞主要呈現(xiàn)流鼻涕、眼瞼腫和溢淚等臨床癥狀。雞傳染性鼻炎可以導(dǎo)致雞產(chǎn)蛋的延遲、產(chǎn)蛋量的下降，從而引起大量的經(jīng)濟(jì)損失。

Apg為巴氏桿菌科的一種短小革蘭氏陰性桿菌，基本特征為無(wú)運(yùn)動(dòng)性、菌體呈多形性、強(qiáng)毒株帶有莢膜。Page等人將Apg分為A、B和C三種血清型，研究表明A、B、C三個(gè)血清型的Apg均有不同程度的致病力，但三者的滅活菌體不存在型間交叉免疫。為了預(yù)防雞傳染性鼻炎，目前已經(jīng)廣泛使用了滅活疫苗，這些疫苗是通過(guò)以福爾馬林、硫柳汞等滅活副雞禽桿菌的細(xì)胞而獲得的。目前國(guó)際上普遍使用的滅活疫苗絕大多數(shù)都包含了A型和C型Apg，隨著國(guó)內(nèi)外陸續(xù)發(fā)現(xiàn)有大量B型Apg的流行和發(fā)生，國(guó)際上影響較大的疫苗公司已經(jīng)開(kāi)始提供包含A、B、C三種血清型的三價(jià)滅活疫苗。由于副雞禽桿菌屬于苛生菌，培養(yǎng)成本較高導(dǎo)致常規(guī)滅活菌苗成本居高不下；另外，副雞禽桿菌含有LPS等毒素物質(zhì)，大量接種所帶來(lái)毒副作用也會(huì)影響雞的產(chǎn)蛋與生長(zhǎng)，在接種的雞中還會(huì)形成局灶性壞死斑。雞傳染性鼻炎滅活疫苗對(duì)野外雞群感染的預(yù)防效果大約為70-80％，在其效力檢驗(yàn)中由于環(huán)境和評(píng)價(jià)方法的差異可能會(huì)有不同的結(jié)果。

為了開(kāi)發(fā)更為安全有效的疫苗，有學(xué)者研究了通過(guò)遺傳重組技術(shù)制備重組疫苗的可行性。例如，Ryuichi Sakamoto等人克隆表達(dá)了A型和C型副雞禽桿菌的外膜蛋白，獲得的重組蛋白可用作分別抵抗A型和C型雞傳染性鼻炎感染的保護(hù)性抗原。然而，在設(shè)計(jì)用于制備疫苗的重組抗原時(shí)，由于篩選A，B，C三種血清型Apg共有的、具有中和活性的抗原表位十分困難，目前還未見(jiàn)到能夠同時(shí)抵抗A，B，C三種血清型的副雞禽桿菌感染的保護(hù)性抗原的相關(guān)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

經(jīng)過(guò)發(fā)明人的深入研究，本發(fā)明提供一種新型副雞禽桿菌免疫保護(hù)性抗原蛋白，免疫原性強(qiáng)，以該抗原蛋白作為活性成分制備的亞單位疫苗能夠同時(shí)有效預(yù)防A型、B型和C型副雞禽桿菌的感染。

本發(fā)明請(qǐng)求保護(hù)的技術(shù)方案如下：

一種副雞禽桿菌免疫保護(hù)性抗原蛋白，其特征在于，包括氨基酸序列如Seq ID No.1～16所示的16個(gè)抗原表位或表位域。

優(yōu)選地，所述副雞禽桿菌免疫保護(hù)性抗原蛋白的氨基酸序列選自Seq ID No.17，18，19，20和21之一。

編碼權(quán)利要求1所述的副雞禽桿菌免疫保護(hù)性抗原蛋白的基因。

優(yōu)選地，所述基因的核苷酸序列選自Seq ID No.22，23，24，25和26之一。

一種構(gòu)建體，其特征在于，包含權(quán)利要求3或4所述的基因。

一種重組細(xì)胞，其特征在于，是由權(quán)利要求5所述的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞而得；任選地，所述受體細(xì)胞選自細(xì)菌、酵母、動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞。

一種雞傳染性鼻炎亞單位疫苗，其特征在于，其免疫活性組分包括權(quán)利要求1或2所述的副雞禽桿菌免疫保護(hù)性抗原蛋白。

優(yōu)選地，所述副雞禽桿菌免疫保護(hù)性抗原蛋白的終濃度為5-100μg/ml。

一種雞傳染性鼻炎亞單位疫苗的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)構(gòu)建權(quán)利要求1或2所述的副雞禽桿菌免疫保護(hù)性抗原蛋白的表達(dá)載體；

(2)用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化與之匹配的蛋白表達(dá)系統(tǒng)，得到重組細(xì)胞；

(3)培養(yǎng)所述重組細(xì)胞，誘導(dǎo)表達(dá)獲得副雞禽桿菌免疫保護(hù)性抗原蛋白并純化蛋白；

(4)將純化后的副雞禽桿菌免疫保護(hù)性抗原蛋白與輔助試劑混合，調(diào)節(jié)所述抗原蛋白的終濃度為5-100μg/ml，得到雞傳染性鼻炎亞單位疫苗。

優(yōu)選地，所述表達(dá)載體選自pET、pQE和pGEX系列的載體；所述蛋白表達(dá)系統(tǒng)選自大腸桿菌BL21、DH5ɑ、Top10和JM109菌株；所述輔助試劑包括免疫增強(qiáng)劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、鹽溶液和/或蒸餾水。

本發(fā)明利用生物信息學(xué)軟件geneious(Biomatters.Ltd，網(wǎng)址http://www.geneious.com/)，通過(guò)對(duì)副雞禽桿菌外膜蛋白HMTp210的基因(GenBank:KJ867498.1，全長(zhǎng)6255bp)及其編碼的蛋白序列(2083個(gè)氨基酸殘基)進(jìn)行抗原表位分析。根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果和實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，選取免疫原性強(qiáng)的若干肽段，經(jīng)過(guò)多次序列優(yōu)化后，確定了16個(gè)核心的抗原表位/表位域，其氨基酸序列如Seq ID No.1～16所示。

一些實(shí)施例中，由上述16個(gè)抗原表位/表位域組合而得到若干種重組抗原蛋白。

一些實(shí)施例中，獲得了包含上述16個(gè)抗原表位多肽，還包括選取的其它氨基酸序列如連接肽或其它抗原表位或表位域，通過(guò)序列拼接而獲得了若干種重組抗原蛋白。

實(shí)施例列出了5種重組抗原蛋白(氨基酸序列如Seq ID No.17，18，19，20和21所示，分別命名為p1，p2，p3，p4，p5)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。其余重組抗原蛋白的數(shù)據(jù)與此類(lèi)似。

對(duì)所得的重組抗原蛋白的抗原特性進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析，Western Blotting實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明所得的重組抗原蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性；使用該抗原蛋白免疫試驗(yàn)雞后能保護(hù)試驗(yàn)雞只不受副雞禽桿菌感染。

免疫實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明所得的重組抗原蛋白能夠?qū)︶槍?duì)多株不同血清型的副雞禽桿菌產(chǎn)生免疫保護(hù)作用，如Hp8、221、0083、BJ、222、668、Modesto等A型、B型和C型Apg菌株，且保護(hù)效果優(yōu)于全菌滅活疫苗。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，攻毒實(shí)驗(yàn)表明，采用本發(fā)明所得的重組抗原蛋白(以p1，p4，p5為例)制備的疫苗免疫的雞群在A、B或C型副雞禽桿菌攻毒后，所有雞只沒(méi)有出現(xiàn)鼻炎癥狀，保護(hù)率為100％；采用p2，p3制備的疫苗免疫的雞群在A型Hp8株攻毒后，所有雞只沒(méi)有出現(xiàn)鼻炎癥狀，保護(hù)率為100％，在用B型BJ株和C型Modesto株攻毒后，只有10％的雞只出現(xiàn)鼻炎癥狀，保護(hù)率為90％；采用全菌滅活疫苗免疫的雞群在攻毒后7天內(nèi)有2-3只雞出現(xiàn)臨床癥狀，保護(hù)率為70-80％；而未進(jìn)行免疫的對(duì)照組雞群在攻毒后全部出現(xiàn)鼻炎癥狀，保護(hù)率為0。免疫組與非免疫組的保護(hù)率有極顯著差異。

因此，本發(fā)明的重組抗原蛋白具有很好的免疫保護(hù)活性，其保護(hù)效果優(yōu)于全菌滅活疫苗，可以作為副雞禽桿菌亞單位疫苗的候選抗原。

所述構(gòu)建體，可以是克隆載體或表達(dá)載體。所述表達(dá)載體可以是具有trp啟動(dòng)子、T7啟動(dòng)子、cspA啟動(dòng)子等多種市售的表達(dá)載體。這類(lèi)表達(dá)載體包括pET系列的載體，如pET-28a；pQE系列的載體，如pQE30；pGEX系列的載體，如pGEX-6-1。

所述重組細(xì)胞，可以是用于克隆和保存質(zhì)粒的細(xì)胞，也可以是用于蛋白表達(dá)的細(xì)胞。表達(dá)系統(tǒng)可以采用原核表達(dá)系統(tǒng)或真核表達(dá)系統(tǒng)，原核表達(dá)系統(tǒng)可以選擇大腸桿菌BL21、DH5ɑ、Top10、JM109等菌株，優(yōu)選大腸埃希氏菌BL21(DE3)；真核表達(dá)系統(tǒng)可以是酵母、動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞。相應(yīng)地，選用與之匹配的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)化條件、表達(dá)條件及蛋白提取方法進(jìn)行抗原蛋白的制備。

利用本發(fā)明的重組抗原蛋白制備的亞單位疫苗，能夠明顯增強(qiáng)雞對(duì)A，B，C三種血清型副雞禽桿菌的抵抗力，有效預(yù)防副雞禽桿菌的感染。在一些實(shí)施例中，所述亞單位疫苗包括本發(fā)明的1種，2種，3種，4種，5種或多種氨基酸序列的副雞禽桿菌重組抗原蛋白。本發(fā)明的亞單位疫苗可以單獨(dú)使用，也可以聯(lián)合一種或多種其他傳染病病原體抗原，制作一針?lè)蓝嗖〉穆?lián)合疫苗。其他抗原包括引起雞只感染的各種傳染性病原體，例如雞傳染性法氏囊病病毒、雞新城疫病毒、雞傳染性支氣管炎病毒等病毒；或者由雞沙門(mén)氏菌、支原體、雞球蟲(chóng)等微生物或寄生蟲(chóng)病。

所述亞單位疫苗中，副雞禽桿菌免疫保護(hù)性抗原蛋白的終濃度優(yōu)選為5-100μg/ml，更優(yōu)選為10-50μg/ml，最優(yōu)選為20μg/ml。

本發(fā)明還提供一種雞傳染性鼻炎亞單位疫苗的制備方法，在一些實(shí)施例中，包括如下步驟：

構(gòu)建表達(dá)載體：全基因合成編碼重組抗原蛋白的DNA，所述DNA編碼SEQ ID No.17～21所示的融合肽或其中刪除、添加或替換了一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸的融合肽突變體；設(shè)計(jì)PCR的引物大量擴(kuò)增該DNA，為方便和表達(dá)載體連接，在上、下游引物的5’末端加上合適的酶切位點(diǎn)。將獲得的編碼重組抗原蛋白的DNA片段連接到合適的表達(dá)載體中，所述表達(dá)載體可以是具有trp啟動(dòng)子、T7啟動(dòng)子、cspA啟動(dòng)子等多種市售的表達(dá)載體。這類(lèi)表達(dá)載體包括pET系列的載體，如pET-28a；pQE系列的載體，如pQE30；pGEX系列的載體，如pGEX-6-1。

導(dǎo)入宿主細(xì)胞：將攜帶有重組抗原蛋白編碼基因的表達(dá)載體導(dǎo)入宿主中以表達(dá)重組抗原蛋白。表達(dá)用的宿主可以是細(xì)菌、昆蟲(chóng)細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞、酵母、植物細(xì)胞等，例如，可以選擇大腸桿菌BL21、DH5ɑ、Top10、JM109菌株進(jìn)行蛋白的大量表達(dá)，操作簡(jiǎn)便易行，且生產(chǎn)成本較低。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞選擇合適的轉(zhuǎn)化方法，可以使用本領(lǐng)域常規(guī)方法，例如電轉(zhuǎn)化，熱激、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染等，將表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞。

誘導(dǎo)蛋白表達(dá)：培養(yǎng)攜帶重組抗原蛋白表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，加入誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)，通過(guò)離心收集誘導(dǎo)表達(dá)的宿主細(xì)胞，將其懸浮于固定體積的蒸餾水或PBS中，通過(guò)超聲裂解將其破碎，并進(jìn)行離心以收沉淀物和上清液。將回收的固定量的上清液和沉淀物進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，以考馬斯亮藍(lán)染色后，通過(guò)目標(biāo)條帶相對(duì)于蛋白Marker的位置大小來(lái)確認(rèn)目標(biāo)蛋白是否表達(dá)。也還可以使用ELISA、Western-blotting等體外抗原-抗體反應(yīng)的試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。

純化蛋白：對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)后的重組大腸桿菌進(jìn)行離心，收集細(xì)菌沉淀。通過(guò)化學(xué)物質(zhì)、表面活性劑、溶菌酶或超聲裂解等方法將收集的大腸桿菌進(jìn)行破碎，從而將重組蛋白釋放到細(xì)胞外。利用鎳瓊脂糖親和層析原理處理經(jīng)超聲波裂解后的菌體上清液，如果目標(biāo)蛋白是包涵體形式存在，則通過(guò)離心濃縮將含有包涵體的溶液以沉淀物的形式回收，經(jīng)變性復(fù)性后再親和層析純化。包涵體蛋白純化時(shí)，將回收的包涵體溶解于含有變性劑的溶液中。涉及到的變性劑可以是4M-8M的脲、或鹽酸胍。溶解變性劑或還原劑的緩沖液可以是pH7-8的磷酸緩沖液、Tris緩沖液、甘氨酸緩沖液等。通過(guò)透析使重組蛋白復(fù)性，恢復(fù)正常的空間結(jié)構(gòu)。透析溶液可以使用與用于溶解包涵體相同種類(lèi)、溫度和pH的緩沖液。用SDS-PAGE法測(cè)定蛋白的純度，并用分光光度計(jì)或?qū)Ｓ迷噭┖袦y(cè)定所獲得的蛋白的含量或濃度。

獲得疫苗：將純化后的抗原蛋白與輔助試劑混合，調(diào)節(jié)所述抗原蛋白的終濃度為20μg/ml。所述輔助試劑包括免疫增強(qiáng)劑，例如氫氧化鋁、礦物油或非礦物油；穩(wěn)定劑，例如聚山梨酯80、乳糖以及蔗糖等；以及防腐劑，如福爾馬林、硫柳汞、苯甲醇等。在一些實(shí)施例中，將重組抗原蛋白與弗氏完全佐劑或不完全佐劑進(jìn)行等體積混合乳化，制備副雞禽桿菌亞單位疫苗。本發(fā)明亞單位疫苗的免疫途徑?jīng)]有特別限制，可以通過(guò)皮下、皮內(nèi)或肌肉注射等方式。

免疫效果驗(yàn)證：使用所述亞單位疫苗免疫雞，采集免疫雞的血清，測(cè)定血清中副雞禽桿菌的抗體效價(jià)；或者用Apg強(qiáng)毒菌株攻擊免疫雞并觀察雞的存活和臨床癥狀。

附圖說(shuō)明

圖1.本發(fā)明典型實(shí)施例中使用的pET28a質(zhì)粒圖譜。

圖2.本發(fā)明重組蛋白SDS-PAGE分析圖，

其中，M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.pET28a-p1誘導(dǎo)后全菌；2.pET28a-p2誘導(dǎo)后全菌；3.pET28a-p3誘導(dǎo)后全菌；4.pET28a-p4誘導(dǎo)后全菌；5.pET28a-p5誘導(dǎo)后全菌。

圖3.本發(fā)明重組蛋白SDS-PAGE分析圖，

其中，M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.pET28a-p1誘導(dǎo)裂解后沉淀；2.pET28a-p2誘導(dǎo)裂解后沉淀；3.pET28a-p3誘導(dǎo)裂解后沉淀；4.pET28a-p4誘導(dǎo)裂解后沉淀；5.pET28a-p5誘導(dǎo)裂解后沉淀。

圖4.本發(fā)明重組蛋白SDS-PAGE分析圖，

其中，M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.pET28a-p1誘導(dǎo)裂解后上清；2.pET28a-p2誘導(dǎo)裂解后上清；3.pET28a-p3誘導(dǎo)裂解后上清；4.pET28a-p4誘導(dǎo)裂解后上清；5.pET28a-p5誘導(dǎo)裂解后上清。

圖5.純化的重組蛋白SDS-PAGE分析圖，

其中，M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.p1蛋白；2.P2蛋白；3.P3蛋白；4.P4蛋白；5.P5蛋白。

圖6.本發(fā)明重組抗原蛋白Western-blotting檢測(cè)結(jié)果，

其中，M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.p1蛋白；2.P2蛋白；3.P4蛋白；4.P5蛋白；5.P3蛋白。

圖7.副雞禽桿菌221株外膜蛋白的抗原分析結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，需要聲明的是，下述實(shí)施例僅作為解釋和說(shuō)明，不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

本發(fā)明實(shí)施例中未特別說(shuō)明的生物化學(xué)試劑，均為本領(lǐng)域常規(guī)試劑，可以商購(gòu)獲得，或通過(guò)本領(lǐng)域常規(guī)方法配制而得，規(guī)格為實(shí)驗(yàn)室純級(jí)即可。

實(shí)施例1、副雞禽桿菌外膜蛋白的抗原表位預(yù)測(cè)

外膜蛋白：其氨基酸序列如Seq ID No.27所示，該序列源自GenBank No.KJ867498.1副雞禽桿菌221株外膜蛋白的編碼基因。

抗原表位預(yù)測(cè)：使用抗原表位預(yù)測(cè)軟件geneious(Biomatters.Ltd，網(wǎng)址http://www.geneious.com/)預(yù)測(cè)外膜蛋白的抗原表位，分析外膜蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、親疏水性、抗原性等信息(圖7)。

序列分析與拼接：綜合軟件分析，根據(jù)蛋白序列抗原性，考慮蛋白表達(dá)、純化的難易性，避開(kāi)信號(hào)肽區(qū)域，從中選取合適抗原表位序列或抗原表位集中區(qū)域用于序列拼接；根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果和積累的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)對(duì)選取的抗原表位序列進(jìn)行多次優(yōu)化，截取部分抗原表位區(qū)域，使拼接所得的抗原蛋白免疫原性強(qiáng)且適合進(jìn)行蛋白表達(dá)和動(dòng)物免疫。最終確定了16個(gè)核心的抗原表位/表位域，其氨基酸序列如Seq ID No.1～16所示。

由上述16個(gè)抗原表位/表位域組合而得到若干種重組抗原蛋白。

還與選取的其它蛋白序列如連接肽或其它抗原表位或表位域，通過(guò)序列拼接而獲得了若干種重組抗原蛋白。

其中5種副雞禽桿菌重組抗原蛋白，分別命名為p1，p2，p3，p4，p5，其氨基酸序列如Seq ID No.17，18，19，20和21所示。

實(shí)施例2、副雞禽桿菌重組抗原蛋白的原核表達(dá)

1.材料

1.1質(zhì)粒與菌株

本實(shí)例采用的pET28a質(zhì)粒(Pharmacia公司產(chǎn)品，購(gòu)自北京百靈克生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；該pET28a質(zhì)粒圖譜如圖1所示。

大腸埃希氏菌BL21(DE3)感受態(tài)購(gòu)自北京天根生物技術(shù)有限公司。

本發(fā)明所用副雞禽桿菌菌株為Hp8、221、0083、BJ、222、Modesto、668菌株，購(gòu)自中國(guó)北京中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，屬于商業(yè)菌株。

1.2副雞禽桿菌抗原蛋白

實(shí)施例1中由生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)、分析和拼接獲得的5種副雞禽桿菌重組抗原蛋白p1，p2，p3，p4，p5。

1.3主要試劑及耗材

氯化鈉、EDTA二鈉鹽、乙醇、甲醇、麗春紅S、三氯乙酸(TCA)是中國(guó)國(guó)藥公司產(chǎn)品。

Tris堿(Tris-HCL)、二硫蘇糖醇(DTT)、甘油、十二烷基磺酸鈉(SDS)、丙烯酰胺、過(guò)硫酸銨、四甲基乙二胺(TEMED)，碳酸鈉、乙酸鈉購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)有限公司。

甘氨酸、考馬斯亮藍(lán)R-250購(gòu)自AMRESCO公司。

牛血清白蛋白(BSA)、胰酶、蛋白酶抑制劑(PMSF)、甲醛均為Sigma公司產(chǎn)品。

蛋白酶K(貯存液濃度為20mg/ml，使用液濃度為1mg/mI)購(gòu)自上海華舜生物工程有限公司。

卡那霉素(kanamycin)、胎牛血清、誘導(dǎo)劑IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)均為Invitrogen公司產(chǎn)品。

吸頭與離心管是AxyGen公司產(chǎn)品。

Taq酶及10xTaq酶緩沖液、NcoI、Xho I等核酸內(nèi)切酶及相關(guān)緩沖液、T4連接酶及10x T4連接酶緩沖液、Rnase、DNA marker(DL-2000、DL-15000)均為寶生物(大連)有限公司產(chǎn)品。

柱式離心式DNA凝膠回收試劑盒、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗雞IgG購(gòu)自Sigma公司。

底物液配制：底物液A：0.006％H₂O₂緩沖液；底物液B：取Na₂HPO₄.12H₂O 14.2g，檸檬酸10.5g，用雙蒸水定容至500mL配成0.1磷酸鹽檸檬酸緩沖液(pH5.0)，然后加上聯(lián)苯二胺(TMB)。使用時(shí)將A液和B液等體積混合，混合后5分鐘內(nèi)使用，現(xiàn)配現(xiàn)用。

大腸桿菌培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)液及固體培養(yǎng)基：每升含酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl 10g，用10mol/L NaOH調(diào)pH至7.5，121℃高壓滅菌20min，4℃保存?zhèn)溆?。在?00毫升LB液體培養(yǎng)基中加入1.5g瓊脂即為固體LB培養(yǎng)基，121℃高壓滅菌20min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

副雞禽桿菌培養(yǎng)基TSB、TSA，及弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑均購(gòu)自Sigma公司。

純化副雞禽桿菌抗原蛋白采用Sepharose 4B純化柱(Amershan pharmacia公司產(chǎn)品)購(gòu)自北京百靈克生物技術(shù)有限公司。

PBS緩沖液：NaCl 8.0g，KCl 0.2g，KH₂PO₄ 0.24g，Na₂HPO₄·12H₂O 3.628g，溶于800ml蒸餾水中，用鹽酸調(diào)pH值為7.4，蒸餾水定容至1000ml，121℃高壓滅菌20min，室溫保存。

Western-blotting緩沖液：

電轉(zhuǎn)緩沖液：39mmol/L甘氨酸，48mmol/L Tris堿，0.037％SDS(電泳級(jí))，20％甲醇。配制1000mL轉(zhuǎn)移緩沖液，需稱(chēng)取2.9g甘氨酸，5.8g Tris堿，0.37g SDS，加200mL甲醇，加ddH₂O至總量為1000mL。

TBS(pH8.0)緩沖液：10mmol/L Tris.HCl，150mmol/L NaCl。

TBST緩沖液：在上述TBS中加入終濃度為0.05％Tween-20即可。

麗春紅S(10×)貯存液：2g麗春紅S，30g三氯乙酸，30g磺基水楊酸，加dd H₂O至100mL。

1.4試驗(yàn)動(dòng)物：6周齡SPF雞，購(gòu)自北京梅里亞維通SPF雞實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

2.序列設(shè)計(jì)與合成

抗原蛋白p1，p2，p3，p4，p5(p1-5)的基因編碼序列如Seq ID No.22，23，24，25，26所示，將基因編碼序列送華大科技(北京)有限公司進(jìn)行全基因合成。

按照各自的堿基序列分別設(shè)計(jì)上、下游引物，并在上、下游引物中分別引入NcoI和XhoI酶切位點(diǎn)，送華大科技(北京)有限公司進(jìn)行引物合成，引物序列如Seq ID No.28～37所示。

3.重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

3.1抗原蛋白p1-5編碼基因的PCR擴(kuò)增

以步驟2得到的合成產(chǎn)物為模板，利用合成的引物進(jìn)行PCR，

PCR反應(yīng)體系：

PCR各個(gè)成分的用量：(其中引物濃度為1OD溶于400μl ddH₂O)

PCR反應(yīng)程序：在98℃反應(yīng)1分鐘后，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的“變性(95℃，10秒)、退火(56℃，15秒)和延伸反應(yīng)(72℃，120秒)”，然后修復(fù)延伸反應(yīng)(72℃，7分鐘)。

3.2PCR產(chǎn)物的酶切及回收

將上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行NcoI和XhoI酶切，

酶切體系：

PCR產(chǎn)物片段酶切體系(50ul)：

以上體系放入37℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)2h。

將全部的酶切產(chǎn)物通過(guò)0.8％的瓊脂糖凝膠電泳分離之后，采用北京天根生化技術(shù)有限公司的普通DNA膠回收試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行DNA片段回收?；厥盏哪康腄NA片段，可立即使用或保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

3.3表達(dá)載體的酶切及回收

對(duì)表達(dá)載體PET28a進(jìn)行Nco I和XhoI酶切和酶切產(chǎn)物的回收，方法及步驟同3.2PCR產(chǎn)物的酶切及回收。

3.4目的片段與載體連接

將步驟3.2回收純化的目的DNA片段和3.3回收純化的表達(dá)載體PET28a進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒。

連接體系為：目的DNA片段，8ul；表達(dá)載體pET28a，4ul；10×T4DNA連接酶緩沖液，2ul；T4DNA連接酶，1ul(5u/ul)；ddH₂O補(bǔ)充至20ul。

連接條件：上述連接體系的混合液放在22℃PCR儀1h即可。

3.5轉(zhuǎn)化并篩選克隆

取大腸桿菌DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞100μl加入到1.5ml EP管中，將步驟3.4獲得的重組質(zhì)粒pET28a-p1，pET28a-p2，pET28a-p3，pET28a-p4，pET28a-p5各5-10μl分別加入各自的EP管中并混勻。置冰上30min后，42℃熱激90秒，冰浴3-5分鐘。加入400μl LB，于37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)45min使其復(fù)蘇。復(fù)蘇后的重組大腸桿菌懸液于4℃，25000rpm離心10min，棄去400μl上清，用剩余的100μl重懸沉淀并涂布于含有25μg/ml卡那霉素的LB瓊脂平板上。37℃增殖1h，再將平板翻過(guò)來(lái)，37℃倒置培養(yǎng)14h-16h至菌落出現(xiàn)。

3.6重組質(zhì)粒的酶切鑒定

挑取步驟3.5中平板上長(zhǎng)出的單菌落，分別接種于含25μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀達(dá)到0.6～1。

收集菌體，使用普通質(zhì)粒提取試劑盒(天根生化技術(shù)有限公司)提取重組質(zhì)粒，具體操作步驟依照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。利用NcoI+XhoI酶切鑒定重組質(zhì)粒，酶切后出現(xiàn)預(yù)期大小的外源片段和載體片斷的，即為正確的重組質(zhì)粒。

4.重組表達(dá)菌株的構(gòu)建

取感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE₃)100μl加入到1.5ml EP管中，將鑒定正確的重組質(zhì)粒pET28a-p1，pET28a-p2，pET28a-p3，pET28a-p4，pET28a-p5各0.5μl加入各自的EP管中并混勻。置冰上30min后，42℃熱激90秒，冰浴3-5分鐘。將其涂布于含有25μg/ml卡那霉素的LB瓊脂平板上。37℃置1h，再將平板翻過(guò)來(lái)，37℃倒置培養(yǎng)14h-16h至菌落出現(xiàn)。挑取單菌落，按照步驟3.1中的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序進(jìn)行菌落PCR并測(cè)序比對(duì)，鑒定陽(yáng)性克隆。

5.目的基因在大腸桿菌中的表達(dá)及純化

5.1目的基因的誘導(dǎo)表達(dá)：將含重組質(zhì)粒pET28a-p1，pET28a-p2，pET28a-p3，pET28a-p4，pET28a-p5的陽(yáng)性克隆分別接種于含有25μg/ml卡那霉素的3mL LB液體培養(yǎng)基，于37℃振蕩培養(yǎng)。從培養(yǎng)好的菌液中取100μl接種于10mL含有25μg/ml卡那霉素的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，于37℃振蕩培養(yǎng)約3h，至OD₆₀₀達(dá)到0.6-1.0時(shí)，加IPTG至終濃度為0.8mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)3h后收集菌體。

5.2表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳分析

(1)制膠：SDS-PAGE凝膠配制方法如表1所示：

表1SDS-PAGE凝膠配制方法

12％的分離膠配制：將各成分加入后迅速混合，加入制膠板中，上面加純化水。然后，再配制5％濃縮膠：將表中相關(guān)各成分加入后迅速混合，加入制膠板的分離膠的上面(先將分離膠上面的純化水倒干凈)，灌滿后插入加樣梳。待濃縮膠凝固后，取下梳子。

(2)PAGE：將凝膠固定于電泳裝置上，加入足夠量的Tris-甘氨酸電泳緩沖液，在加樣孔中分別加入各樣品：電泳電壓200V，電流在20mA-40mA范圍內(nèi)，電泳1h，至溴酚藍(lán)泳出膠底面，終止電泳。

(3)聚丙烯酰胺凝膠染色與脫色：卸下凝膠，用考馬斯亮藍(lán)R250染色液染色30min，再用脫色液進(jìn)行脫色1min，觀察結(jié)果。

結(jié)果如圖2所示，將含有陽(yáng)性重組質(zhì)粒的大腸埃希菌以1mM IPTG誘導(dǎo)37℃誘導(dǎo)表達(dá)后，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，在預(yù)期位置出現(xiàn)蛋白目標(biāo)條帶，預(yù)期蛋白大小相一致，未誘導(dǎo)菌沒(méi)有此蛋白。

5.3重組蛋白的制備及純化

1)挑取步驟4鑒定正確的陽(yáng)性克隆，接種于3mL含25μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃活化過(guò)夜后，1:100稀釋到含25μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃、230r/min振搖培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD₆₀₀ 0.6～1)，加入終濃度為1mmol/L的IPTG，于37℃、230r/min振搖誘導(dǎo)培養(yǎng)6-8h。分別于誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后不同時(shí)間取出1mL,5,000r/min離心10min收集菌體，棄上清后加入2×SDS上樣緩沖液，煮沸10min，用12％的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行檢查，并用Quantity One-4.3.1(BIO-RAD)軟件分析表達(dá)產(chǎn)量。

2)收集500mL經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)6h后的菌液，8000r/min離心10min，沉淀用5mL的10mmol/L PBS溶解，超聲波破碎后，12,000r/min離心10min后，保留上清。包涵體沉淀用8mol/L的尿素溶液溶解，8M尿素在50mM Tris pH7.0-8.5左右，1mM EDTA，10％Triton X-100，二硫鍵還原劑中洗滌。洗滌4～8h，使包涵體變性可溶。包涵體溶解后的上清液，用鎳親和層析柱純化。操作過(guò)程參照Amersham Pharmacia Biotech公司提供的操作指南進(jìn)行。具體過(guò)程如下：轉(zhuǎn)移樹(shù)脂到柱子，待完全沉淀后，用三蒸水洗滌鎳親和層析柱，以除盡基質(zhì)中的乙醇和空氣，并防止下一步Ni²⁺沉淀；5×柱體積的Charge Buffer(50mM NiSO₄)充電；20×柱體積的三蒸水洗滌，去盡游離的Ni²⁺；10×柱體積的Binding Buffer平衡柱子；手工上樣，根據(jù)蛋白的濃度來(lái)確定上樣體積；20×柱體積的Binding Buffer洗滌；6×柱體積的Wash Buffer洗滌，至檢出無(wú)蛋白；Elution Buffer洗脫，每次1ml，收集洗脫流出液，洗脫至檢出無(wú)蛋白；然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。

結(jié)果參見(jiàn)圖3和圖4，兩圖為本發(fā)明構(gòu)建的重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)后超聲裂解后的SDS-PAGE，圖3是裂解后沉淀，可知p1，p2，p4和p5大部分在沉淀中；圖4是裂解后上清，可知p3蛋白大部分存在于裂解后的上清中。

誘導(dǎo)后裂解上清中的蛋白含量若高于沉淀，純化時(shí)可以直接使用裂解上清，省去包涵體變性復(fù)性的步驟,利用鎳瓊脂糖親和層析原理處理經(jīng)超聲波裂解后的菌體上清液，具體操作如下：

①取5mLNi-IDA，用10倍柱床體積的Binding buffer清洗平衡柱子，流速5ml/min。

②樣品(裂解液上清)上柱，流速為2ml/min，收集穿透液。

③10倍柱床體積的Binding buffer清洗柱子,流速10mL/min。

④Wash Buffer洗雜,流速5ml/min，收集洗脫液。

⑤Elution Buffer洗脫,流速2ml/min，收集洗脫液。

⑥將純化后的蛋白置于透析袋中，在PBS，緩沖液(pH＝7.4)中緩慢透析，收集透析后的樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析。

注：Binding Buffer(PBS，0.5％Triton X-100，pH＝7.4)

Wash buffer-10(PBS，10mM咪唑，pH＝7.4)

Elution Buffer-500(PBS，500mM咪唑，pH＝7.4)

結(jié)果參見(jiàn)圖5，經(jīng)純化，獲得了較純的目的蛋白p1，p2，p3，p4和p5。

實(shí)施例3、重組抗原蛋白的特性分析

1.用Western-blot方法分析重組抗原蛋白的抗原性

將上述純化的重組抗原蛋白p1，p2，p3，p4，p5按照常規(guī)方法進(jìn)行SDS-PAGE電泳，其步驟是：

1)轉(zhuǎn)移：切出6張Whatman 3M濾紙和1張硝酸纖維膜(NC膜)，濾紙和膜的大小要和凝膠的大小完全相等或略小于凝膠，用鉛筆在濾膜一角作標(biāo)記，確保轉(zhuǎn)印后膜與凝膠的相對(duì)方向；將硝酸纖維膜在純化水中浸泡5min；在另一淺托盤(pán)中加入少量轉(zhuǎn)移緩沖液，將6張Whatman 3M濾紙浸泡于其中。然后按照如下步驟安裝轉(zhuǎn)移電泳槽：平放石墨電極的底座(陽(yáng)極)，依次放3層3M濾紙、硝酸纖維膜、聚丙烯酰胺凝膠和3層3M濾紙。徹底排除各層間的氣泡：將轉(zhuǎn)移電泳槽的上蓋扣到石墨電極一轉(zhuǎn)移膜膠復(fù)合體上；連接電源，根據(jù)凝膠板面積按照0.65mA/cm²-1.0mA/cm²的參數(shù)接通電流，電泳轉(zhuǎn)移0.5h-2h。

2)麗春紅染色：轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取下NC膜，于去離子水中漂洗2-3次后，轉(zhuǎn)移至麗春紅染色液中染色5min-10min，觀察轉(zhuǎn)印效果，并用鉛筆標(biāo)出蛋白Marker位置；室溫下用去離子水漂洗硝酸纖維膜直至顏色褪去；將NC膜置于5％的脫脂奶粉中，室溫封閉2h；洗膜：棄封閉液，用1×TBST洗NC膜3遍，每次5min。

3)一抗孵育：將NC膜放入用5％的脫脂奶粉稀釋(體積比1:50)的雞抗Apg型菌陽(yáng)性血清，37℃孵育1h。洗膜：取出NC膜，用1×TBST洗膜3次，每次10min。

所述陽(yáng)性血清由本實(shí)驗(yàn)室用Apg Hp8\BJ\668菌株制備的三價(jià)滅活疫苗免疫SPF雞制備而得，可對(duì)外提供用于驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

4)二抗孵育：將膜轉(zhuǎn)入5％的脫脂奶粉稀釋(體積比1：5000)的HRP標(biāo)記的羊抗雞IgG抗體，37℃孵育2h；洗膜：取出NC膜，用1×TBST洗膜3次，每次10min。

5)顯色：將NC膜置于新配制的DAB顯色液中，置暗處顯色，待蛋白帶的顏色深度達(dá)到要求后，用1×TBST、沖洗以終止反應(yīng)。

2.重組蛋白抗血清的制備

1)疫苗的制備及免疫試驗(yàn)

重組抗原蛋白疫苗的制備：將重組抗原蛋白p1，p2，p3，p4，p5分別與弗氏完全佐劑等體積混合乳化，使疫苗中抗原蛋白終濃度為20μg/ml。第二次免疫用疫苗采用弗氏不完全佐劑，其余組分及濃度與首次免疫相同。

免疫方法：給所述的42日齡試驗(yàn)SPF雞胸部肌肉注射弗氏完全佐劑乳化的重組抗原蛋白疫苗(接種量為0.5ml/只)；2周后胸部肌肉注射弗氏不完全佐劑乳化的重組蛋白疫苗(接種量為0.5ml/只)；間隔10天后于翅靜脈采血，收集血清。

血清特異性抗體的檢測(cè)：采用ELISA方法，具體步驟為：

使用純化的重組抗原蛋白p1，p2，p3，p4，p5各1μg/100μl于4℃過(guò)夜包被酶聯(lián)板，1％BSA 37℃封閉1h，洗滌液洗板1次后封裝，于-20℃保存。

將加強(qiáng)免疫一周后的雞采血分離血清，倍比稀釋后取100μl加入酶聯(lián)板，同時(shí)設(shè)佐劑對(duì)照和空白對(duì)照。

37℃反應(yīng)30min。

洗板3次后加入體積比1:5,000稀釋的兔抗雞IgY(H+L)-HRP，37℃反應(yīng)30min。

洗板5次后加100μl底物液，避光顯色10min后加入2％H₂SO₄終止反應(yīng)，于630nm讀數(shù)。

樣品與對(duì)照組OD值之比大于2的血清判為血清ELISA抗體陽(yáng)性。

重組抗原蛋白p1，p2，p3，p4，p5的Western-blotting檢測(cè)結(jié)果如圖6所示，雞傳染性鼻炎陽(yáng)性雞血清與各重組抗原蛋白均發(fā)生了反應(yīng)，與預(yù)期結(jié)果相符。由此表明，本發(fā)明的重組抗原蛋白具有良好的抗體結(jié)合活性。

實(shí)施例4、重組抗原蛋白對(duì)SPF雞免疫效力試驗(yàn)

1.重組抗原蛋白疫苗制備及免疫方法

1.1重組抗原蛋白疫苗的制備

將重組抗原蛋白p1，p2，p3，p4，p5分別與MONTANIDE^TM ISA 71VG佐劑(SEPPIC公司產(chǎn)品)按3:7重量比(30％重量的抗原，70％重量的佐劑)混合乳化(操作方法見(jiàn)SEPPIC公司產(chǎn)品使用方法介紹)，使疫苗中抗原蛋白終濃度為20μg/ml(不同地區(qū)雞傳染性鼻炎流行威脅程度不同，不同雞種對(duì)免疫原的敏感度也有差異，可根據(jù)實(shí)際需要調(diào)整所述抗原蛋白終濃度為5-100μg/ml)。所制備的疫苗依次命名為vp1，vp2，vp3，vp4，vp5。

全菌滅活疫苗制備：分別將A、B、C型副雞禽桿菌Hp8株、BJ株和668株菌經(jīng)純培養(yǎng)后，挑取單個(gè)菌落8～10個(gè)，涂于TSA平板上(含10％滅活牛血清)。37℃培養(yǎng)16h～18h后，用滅菌的0.01mol/L PBS將平板上的菌苔洗下，稀釋至7.5×10⁹cfu/ml，用甲醛滅活(3‰)4h～48h，然后等體積混合?；旌暇号c10號(hào)工業(yè)白油(杭州煉油廠)佐劑按1：1體積混合，膠體磨乳化，所得的三價(jià)滅活疫苗抗原終濃度達(dá)到1.0×10⁹cfu/ml。

1.2免疫方法

42日齡SPF試驗(yàn)雞210只，分為亞單位疫苗組、常規(guī)滅活疫苗組和PBS對(duì)照組。其中疫苗組再分為vp1，vp2，vp3，vp4，vp5五小組，每組30只；常規(guī)三價(jià)滅活疫苗組和PBS對(duì)照組各30只。各組亞單位疫苗組試驗(yàn)雞分別用vp1，vp2，vp3，vp4，vp5進(jìn)行免疫，常規(guī)三價(jià)滅活疫苗組試驗(yàn)雞用常規(guī)滅活疫苗免疫，對(duì)照組試驗(yàn)雞接種PBS。采用胸部肌肉注射，0.5ml/只；4周后相同劑量、相同途徑加強(qiáng)免疫。期間每?jī)芍艹犰o脈取血，用于血清特異性抗體的監(jiān)測(cè)。

血清抗體的檢測(cè)采用ELISA方法，步驟同實(shí)施例3。

1.3免疫雞攻毒試驗(yàn)

對(duì)加強(qiáng)免疫4周后的試驗(yàn)雞全部進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。各試驗(yàn)組內(nèi)再分別用A型(Hp8株)，B型(BJ株)和C型(668株)Apg進(jìn)行攻毒，每組10只，眶下竇接種，劑量依次是A型(Hp8株)1×10⁶CFU，B型(BJ株)5×10⁵CFU，C型(668株)1×10⁶CFU。連續(xù)觀察一周，記錄試驗(yàn)雞的臨床發(fā)病情況，包括流鼻涕，眼瞼腫，溢淚等。評(píng)價(jià)重組亞單位疫苗的免疫保護(hù)力，結(jié)果參見(jiàn)表2。

表2本發(fā)明雞傳染性鼻炎亞單位疫苗免疫雞對(duì)Apg菌株攻毒的保護(hù)效果

注：攻毒劑量A型Hp8株1×10⁶CFU，B型BJ株5×10⁵CFU，C型668株1×10⁶CFU。

*亞單位疫苗免疫組獲得免疫保護(hù)的試驗(yàn)雞數(shù)與PBS對(duì)照組比較，差異顯著。

表2列出了A型Hp8株、B型BJ株和C型668株的攻毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)時(shí)，分別用本發(fā)明優(yōu)選的5個(gè)重組蛋白制備的5種亞單位疫苗免疫試驗(yàn)雞，2次免疫后用A，B，C三個(gè)血清型的Apg強(qiáng)毒攻擊，非免疫對(duì)照組所有試驗(yàn)雞陸續(xù)發(fā)病。亞單位疫苗免疫組攻毒后只有個(gè)別試驗(yàn)雞表現(xiàn)出鼻炎癥狀，保護(hù)率為90％～100％；全菌三價(jià)滅活疫苗免疫組在攻毒后3天內(nèi)有2-3只雞出現(xiàn)臨床癥狀，保護(hù)率為70～80％；而非免疫對(duì)照組所有試驗(yàn)雞都表現(xiàn)出嚴(yán)重的鼻炎癥狀。

利用A型221株、0083株，B型222株和C型Modesto株的Apg進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與Hp8株、BJ株和668株的攻毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，Vp1，Vp4和Vp5實(shí)驗(yàn)組的保護(hù)率為100％，Vp2，Vp3實(shí)驗(yàn)組的保護(hù)率為90％～100％。由此可見(jiàn)，采用本發(fā)明提供的重組抗原蛋白制備的疫苗免疫效果顯著，能夠同時(shí)有效預(yù)防雞感染A，B，C三個(gè)血清型的Apg。

此外，蛋白亞單位疫苗的保護(hù)率優(yōu)于全菌三價(jià)滅活疫苗的保護(hù)效果，與非免疫組相比，有極顯著差異。由于純化蛋白不含全菌體所攜帶的脂多糖等成分，本發(fā)明制備的亞單位疫苗沒(méi)有副反應(yīng)，而全菌滅活疫苗會(huì)有一過(guò)性食欲下降，精神萎靡等副反應(yīng)。從制備成本上說(shuō)，亞單位疫苗由于培養(yǎng)誘導(dǎo)容易，培養(yǎng)基便宜，容易純化等特點(diǎn)，也低于常規(guī)滅活菌苗。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。