一種增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)能力的預(yù)處理培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)能力的預(yù)處理方法，通過(guò)不同蛋白因子組合體外預(yù)處理間充質(zhì)干細(xì)胞，找到最佳因子配比從而快速增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)能力。經(jīng)過(guò)本發(fā)明所述的短時(shí)間預(yù)處理方法，間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)外周血淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)能力得到明顯增強(qiáng)，從而有助于強(qiáng)化其對(duì)于自身免疫性疾病和免疫紊亂相關(guān)疾病的臨床治療效果。
【專利說(shuō)明】
一種増強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)能力的預(yù)處理培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及干細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)能力的預(yù)處理培養(yǎng)方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stemcells，MSCs)是來(lái)源于發(fā)育早期中胚層的一類重要的成體干細(xì)胞，具有多種組織修復(fù)能力，已廣泛用于臨床治療研究。MSCs最初是由骨髓基質(zhì)中分離獲得的非造血多能干細(xì)胞，現(xiàn)已證實(shí)MSCs也存在于脂肪組織、臍帶等多種組織內(nèi)。研究表明間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs) —個(gè)重要應(yīng)用是免疫調(diào)節(jié)領(lǐng)域。大量研究證實(shí)，MSCs在體內(nèi)可誘導(dǎo)免疫抑制，減少造血干細(xì)胞移植治療過(guò)程中的GVHD及排斥反應(yīng)，以及抗炎調(diào)節(jié)能力。MSCs的免疫抑制能力在大量的動(dòng)物試驗(yàn)和臨床研究中得到證實(shí)。Jarvinen 等[Giles JT, Bartlett SJ，Gelber AC，et al.Tumor necrosis factor inhibitor therapy and risk of ser1us postoperative orthopedic infect1n in Rheumatoid Arthritis.Arthritis Care Res 2006, 55:333 - 337.]發(fā)現(xiàn)肺細(xì)胞來(lái)源的MSCs在體外培養(yǎng)時(shí)不表達(dá)免疫刺激分子⑶80、⑶86,將MSCs加入非特異性絲裂原刺激的T細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞增殖顯著受抑制。Corc1ne等[Corc1ne A, Benvenuto F, Ferretti E.Human mesenchymal stem cells modulate B—cell funct1ns.Blood 2006, 107 (1): 367-372]將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與B細(xì)胞體外共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞的增殖被抑制在細(xì)胞周期的G0/G1期，不能誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生。Sotiropoulou等[Sotiropoulou PA, Perez SA, Gritzapis AD.1nteract1ns between human mesenchymal stem cells and natural killer cells.Stem Cells 2006, 24(1):74-85]研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞作用的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在NK/骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞比例較低時(shí)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSCs)改變了 NK細(xì)胞的表型，抑制了 NK細(xì)胞的增殖、細(xì)胞因子的分泌以及對(duì)HLA-1表達(dá)靶物的細(xì)胞毒性作用。
[0003]然而，MSCs在免疫調(diào)節(jié)領(lǐng)域的應(yīng)用仍存在一些問(wèn)題亟需解決。首先，由于來(lái)源不同、細(xì)胞分離擴(kuò)增的方法存在差異，MSCs的質(zhì)量也存在很大差異，因此導(dǎo)致不同實(shí)驗(yàn)室的 MSCs其調(diào)節(jié)免疫效果差異較大。另外，由于細(xì)胞治療本身的特點(diǎn)，MSCs在治療某些自身免疫性疾病方面的效果仍存在不確定性。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，克服現(xiàn)有間充質(zhì)干細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)能力的不確定性，建立一套有效的增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)能力的預(yù)處理培養(yǎng)方法。
[0005]為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)能力的預(yù)處理方法，將達(dá)到質(zhì)量要求的P2代間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)3-4天，換成預(yù)處理培養(yǎng)液，并向培養(yǎng)液中添加重組炎性細(xì)胞因子，預(yù)處理48-72小時(shí)后，獲得處理后的間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0006]所述重組炎性細(xì)胞因子為胞因子為素_2、腫瘤壞死因子-a和干擾素_y中的兩種或三種組合，向預(yù)處理培養(yǎng)液中添加量為:
[0007]白細(xì)胞介素 _2:500-2000IU/ml
[0008]腫瘤壞死因子-a:10-20ng/ml
[0009]干擾素:10-20ng/ml〇
[0010]所述預(yù)處理培養(yǎng)液為DMEM/F12,并按體積比加入2%胎牛血清，培養(yǎng)條件為37°C， 飽和濕度，5% C02培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)。
[0011]優(yōu)選，P2代間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)3-4天，向預(yù)處理培養(yǎng)液添加下述重組炎性細(xì)胞因子，預(yù)處理48小時(shí)，獲得處理后的間充質(zhì)干細(xì)胞；
[0012]白細(xì)胞介素 _2:1000IU/ml
[0013]腫瘤壞死因子-a:20ng/ml
[0014]干擾素:15ng/ml〇
[0015]本發(fā)明的有益效果是:通過(guò)本發(fā)明的方法，經(jīng)IL-2、TNF_a或IFN-y等多種因子組合預(yù)處理的MSCs，可顯著抑制經(jīng)植物血凝素-P(PHA-P)激活的外周血淋巴細(xì)胞。多種因子組合的預(yù)處理可顯著增強(qiáng)MSCs的免疫抑制能力。通過(guò)檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)預(yù)處理的間充質(zhì)干細(xì)胞分泌PGE-2的能力顯著增強(qiáng)?！靖綀D說(shuō)明】
[0016]圖1是體外培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)、分化能力分析。A為BM-MSCs細(xì)胞形態(tài)，B 為BM-MSCs成脂及成骨誘導(dǎo)分化結(jié)果。
[0017]圖2是BrdU吸收法檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞體外抑制淋巴細(xì)胞反應(yīng)。
[0018]圖3是經(jīng)IL-2、TNF-a或IFN-y等蛋白因子處理的MSCs免疫調(diào)節(jié)能力分析。
[0019]圖4是ELISA分析經(jīng)預(yù)處理的MSCs表達(dá)TGF- 0 1、HGF、HLA-G5及PGE-2水平?！揪唧w實(shí)施方式】
[0020]下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明:
[0021]本發(fā)明的增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)能力的預(yù)處理方法，將達(dá)到質(zhì)量要求的P2 代間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)3-4天，換成預(yù)處理培養(yǎng)液，并向預(yù)處理培養(yǎng)液中添加重組炎性細(xì)胞因子，預(yù)處理48-72小時(shí)后，獲得處理后的間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0022]所述重組炎性細(xì)胞因子為白細(xì)胞介素-2、腫瘤壞死因子-a和干擾素-y中的兩種或三種組合，向預(yù)處理培養(yǎng)液中添加量為:
[0023]白細(xì)胞介素 _2:500-2000IU/ml
[0024]腫瘤壞死因子-a:10-20ng/ml
[0025]干擾素:10-20ng/ml〇
[0026]所述預(yù)處理培養(yǎng)液為DMEM/F12,并按體積比加入2%胎牛血清，培養(yǎng)條件為37°C， 飽和濕度，5% C02培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)。
[0027]優(yōu)選，P2代間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)3-4天，向培養(yǎng)液添加下述重組炎性細(xì)胞因子， 預(yù)處理48小時(shí)，獲得處理后的間充質(zhì)干細(xì)胞；
[0028]白細(xì)胞介素 _2:1000IU/ml
[0029]腫瘤壞死因子-a:20ng/ml
[0030]干擾素:15ng/ml〇
[0031]實(shí)施例1間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)、分化能力及免疫表型
[0032]第2代骨髓來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞體外正常傳代培養(yǎng)至P2代，基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)液為 DMEM/F12,培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清(體積比)。培養(yǎng)條件為37°C，飽和濕度，5% C02培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)。待細(xì)胞克隆長(zhǎng)至80%融合時(shí)，0.05%胰酶消化傳代至新培養(yǎng)瓶中。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)、分化能力、免疫表型等分析，確定細(xì)胞是否達(dá)到質(zhì)量要求。
[0033]結(jié)果發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形細(xì)胞貼壁，并可形成細(xì)胞克隆，如圖1A所示。經(jīng)免疫表型分析發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞高表達(dá)黏附分子，如整合素(CD29);受體分子，如玻璃質(zhì)酸(⑶44)，表面酶(⑶73);血管黏附分子(⑶106)和I類主要組織相容性抗原(HLA-ABC)， 而不表達(dá)內(nèi)皮標(biāo)志(⑶31);造血標(biāo)志(⑶34,⑶45)和II類主要組織相容性抗原(數(shù)據(jù)未顯示)。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行成脂及成骨誘導(dǎo)分化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MSCs顯示了良好的成脂、成骨分化能力 (圖1B)。以上結(jié)果顯示體外傳代培養(yǎng)的MSCs達(dá)到了質(zhì)量要求。
[0034]實(shí)施例2BrdU吸收法檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞體外抑制淋巴細(xì)胞反應(yīng)
[0035]將3個(gè)不同批次的間充質(zhì)干細(xì)胞按照0、1X 104、2X 104、4X 104及8X 10 4/孔密度接種于24孔板，相同細(xì)胞各做3個(gè)平行孔，待細(xì)胞貼壁后向每孔中加入8 X 104個(gè)外周血淋巴細(xì)胞(PBLC)，同時(shí)給予PHA刺激，共培養(yǎng)48小時(shí)。BrdU法檢測(cè)經(jīng)上述各組MSCs共培養(yǎng)后PBMC的增殖作用，增殖量以0D值(A450nm-A690nm)表示。
[0036]如圖2所示，外周血淋巴細(xì)胞經(jīng)PHA-P刺激后可顯著增殖(未加MSC組)，然而與 MSC共培養(yǎng)后，淋巴細(xì)胞增殖明顯被抑制。且淋巴細(xì)胞增殖抑制率與MSCs濃度呈正比，即 MSC:PBLC(細(xì)胞濃度比)為1:1時(shí)，MSC免疫調(diào)節(jié)能力最強(qiáng)，而MSC:PBLC濃度比降低時(shí)，其免疫調(diào)節(jié)能力隨之降低。
[0037]實(shí)施例3蛋白因子預(yù)處理MSCs免疫調(diào)節(jié)能力檢測(cè)
[0038]體外培養(yǎng)3個(gè)不同批次的MSCs，基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，吸棄培養(yǎng)液并換成預(yù)處理培養(yǎng)液(含2%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)液)，選擇1000IU/ml IL-2、20ng/ml TNF-a、 15ng/ml IFN-y三種細(xì)胞因子，分別單一加入或者三種因子兩兩組合加入或者三種因子同時(shí)加入預(yù)處理培養(yǎng)液中，并對(duì)MSC預(yù)處理48小時(shí)后，將上述各組預(yù)處理或未處理BM-MSCs 按1 X 104/孔密度接種于24孔板，相同細(xì)胞各做3個(gè)平行孔，待細(xì)胞貼壁后向每孔中加入 8 X 104個(gè)外周血淋巴細(xì)胞(MSC:PBLC為1:8)，同時(shí)給予PHA刺激，共培養(yǎng)48小時(shí)。BrdU法檢測(cè)經(jīng)上述各組MSC共培養(yǎng)后PBMC的增殖作用，增殖量以0D值(A450nm-A690nm)表示。
[0039]如圖3所示，經(jīng)PHA-P刺激后外周血淋巴細(xì)胞與經(jīng)IL-2、TNF- a或IFN- y單一預(yù)處理的MSC共培養(yǎng)后，淋巴細(xì)胞增殖抑制率沒(méi)有明顯提高。而MSCs經(jīng)三種因子兩兩組合及三種因子同時(shí)加入培養(yǎng)液的預(yù)處理，與未處理MSCs相比，其抑制淋巴細(xì)胞增殖的能力明顯增強(qiáng)，且三種因子同時(shí)預(yù)處理的MSCs免疫調(diào)節(jié)能力最強(qiáng)，其對(duì)外周血淋巴細(xì)胞的抑制能力為 46.3%。
[0040]實(shí)施例4ELISA檢測(cè)預(yù)處理后MSCs抗炎因子表達(dá)
[0041]將實(shí)施例3中三種因子同時(shí)加入預(yù)處理培養(yǎng)液中處理MSCs48h，收集細(xì)胞上清液， 通過(guò)ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清中TGF- 1、HGF、HLA-G5及PGE-2等因子變化。結(jié)果如圖4所示，經(jīng)因子處理后的MSCs，其表達(dá)TGF-0 1、HLA-G5及HGF的水平?jīng)]有顯著變化，而其表達(dá)PGE-2的能力增強(qiáng)，且三種因子組合預(yù)處理的MSCs其分泌PGE-2的水平顯著高于其他組。
[0042]以上結(jié)果說(shuō)明，IL-2、TNF-a或IFN-y三種因子組合后可顯著提高M(jìn)SCs的免疫調(diào)節(jié)能力，且MSCs免疫調(diào)節(jié)的提高可能與其分泌的PGE2的水平有關(guān)。
[0043]我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，經(jīng)多種因子組合預(yù)處理的MSCs免疫調(diào)節(jié)能力明顯的高于單一因子或不經(jīng)預(yù)處理的MSCs，并且預(yù)處理后的MSCs其分泌PGE2的能力顯著增強(qiáng)。
[0044]以上所述的實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)思想及特點(diǎn)，其目的在于使本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員能夠理解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，不能僅以本實(shí)施例來(lái)限定本發(fā)明的專利范圍，即凡本發(fā)明所揭示的精神所作的同等變化或修飾，仍落在本發(fā)明的專利范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)能力的預(yù)處理方法，其特征在于，將達(dá)到質(zhì)量要求的P2代間充質(zhì)干細(xì)胞體外正常培養(yǎng)3-4天，換成預(yù)處理培養(yǎng)液，并添加重組炎性細(xì)胞因子，預(yù)處理48-72小時(shí)后，獲得處理后的間充質(zhì)干細(xì)胞。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)能力的預(yù)處理方法，其特征在于，所述重組炎性細(xì)胞因子為白細(xì)胞介素-2、腫瘤壞死因子-α和干擾素-γ中的兩種或三種組合，向預(yù)處理培養(yǎng)液中添加量為: 白細(xì)胞介素-2:500-2000IU/ml 腫瘤壞死因子-α:10-20ng/ml 干擾素-γ:10-20ng/mlo3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)能力的預(yù)處理方法，其特征在于，所述預(yù)處理培養(yǎng)液為DMEM/F12，并按體積比加入2%胎牛血清，培養(yǎng)條件為37°C，飽和濕度，5% CO2培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)能力的預(yù)處理方法，其特征在于，將P2代間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)3-4天，換成預(yù)處理培養(yǎng)液，并添加下述重組炎性細(xì)胞因子，預(yù)處理48小時(shí)，獲得處理后的間充質(zhì)干細(xì)胞； 白細(xì)胞介素-2:1000IU/ml 腫瘤壞死因子-α:20ng/ml 干擾素-γ:15ng/mlo
【文檔編號(hào)】C12N5/0775GK105985928SQ201510069303
【公開日】2016年10月5日
【申請(qǐng)日】2015年2月10日
【發(fā)明人】劉廣洋
【申請(qǐng)人】睿爾（天津）生物科技有限公司