本申請(qǐng)要求保護(hù)2014年10月3日提交的，標(biāo)題為“無熱量甜味劑及合成方法”的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)第62/059,498號(hào)及2014年12月31日提交的，標(biāo)題為“無熱量甜味劑及合成方法”的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)第62/098,929號(hào)的優(yōu)先權(quán)，所述專利申請(qǐng)的公開內(nèi)容據(jù)此通過引用整體并入。

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公開背景

本公開總體上涉及天然甜味劑。更具體地，本公開涉及無熱量甜味劑及合成無熱量甜味劑的方法。

甜菊醇糖苷是從甜葉菊(Stevia rebaudiana)葉片分離的天然產(chǎn)物。甜菊醇糖苷廣泛地用作高強(qiáng)度、低熱量的甜味劑并且明顯比蔗糖更甜。作為天然甜味劑，不同的甜菊醇葡糖苷具有不同的甜度和后味。甜菊醇糖苷的甜度明顯高于蔗糖的甜度。例如，甜菊苷比蔗糖甜100-150倍，具有苦的后味。萊鮑迪苷C(rebaudioside C)比蔗糖甜40-60倍。杜爾可苷A(dulcoside A)比蔗糖甜約30倍。

天然存在的甜菊醇糖苷共有相同的基本甜菊醇結(jié)構(gòu)，但是在C13和C19位置的碳水化合物殘基(例如，葡萄糖、鼠李糖和木糖殘基)的含量上不同。具有已知結(jié)構(gòu)的甜菊醇糖苷包括，甜菊醇、甜菊苷、萊鮑迪苷A、萊鮑迪苷B、萊鮑迪苷C、萊鮑迪苷D、萊鮑迪苷E、萊鮑迪苷F和杜爾可苷A(參見例如，表1)。其它甜菊醇糖苷為萊鮑迪苷M、萊鮑迪苷N和萊鮑迪苷O。

表1.甜菊醇糖苷。

按干重計(jì)，甜菊苷、萊鮑迪苷A、萊鮑迪苷C和杜爾可苷A分別占葉中甜菊醇糖苷總重量的9.1、3.8、0.6和0.3％，而其它甜菊醇糖苷以低得多的量存在。來自甜葉菊植株的提取物可商購，通常含有作為主要化合物的甜菊苷和萊鮑迪苷A。其它甜菊醇糖苷在甜葉菊提取物中作為微量組分存在。例如，商用制劑中萊鮑迪苷A的量可以在總甜菊醇糖苷含量的約20％至大于90％變化，而萊鮑迪苷B的量可為總甜菊醇糖苷的約1-2％，萊鮑迪苷C的量可為總甜菊醇糖苷的約7-15％，且萊鮑迪苷D的量可為總甜菊醇糖苷的約2％。

大多數(shù)甜菊醇糖苷是使用尿苷5’-二磷酸葡萄糖(UDP-葡萄糖)作為糖部分的供體，通過通常由UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶(UGT)催化的甜菊醇的幾個(gè)糖基化反應(yīng)形成的。植物中的UGT構(gòu)成了酶的非常不同的類，所述酶將葡萄糖殘基從UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)移到甜菊醇。例如，甜菊苷的C-13-O-葡萄糖的C-3’的糖基化產(chǎn)生萊鮑迪苷A；且甜菊苷的19-O-葡萄糖的C-2’的糖基化產(chǎn)生萊鮑迪苷E。進(jìn)一步地萊鮑迪苷A(在C-2’-19-O-葡萄糖處)或萊鮑迪苷E(在C-3’-13-O-葡萄糖處)的糖基化生成萊鮑迪苷D。(圖1)。

替代性甜味劑正受到越來越多的關(guān)注，因?yàn)橐庾R(shí)到許多疾病與高糖食品和飲料的消耗相關(guān)。雖然人造甜味劑可用，但許多人造甜味劑如甘素(dulcin)、環(huán)己氨基磺酸鈉和糖精由于對(duì)其安全性的考慮已被一些國家禁止或限制。因此，天然來源的無熱量甜味劑變得越來越受歡迎。廣泛使用甜葉菊甜味劑的主要障礙之一是其不良的口味屬性。因此，需要開發(fā)替代性甜味劑及其生產(chǎn)方法以提供甜味潛能和風(fēng)味性質(zhì)的最佳組合。

發(fā)明概述

本公開總體上涉及天然甜味劑。更具體地，本公開涉及無熱量甜味劑和合成無熱量甜味劑的方法。

合成萊鮑迪苷V。一方面，本公開涉及由以下化學(xué)結(jié)構(gòu)組成的合成萊鮑迪苷(萊鮑迪苷V)：

合成萊鮑迪苷W。一方面，本公開涉及由以下化學(xué)結(jié)構(gòu)組成的合成萊鮑迪苷(萊鮑迪苷W)：

由萊鮑迪苷G生成萊鮑迪苷V的方法。另一方面，本公開涉及一種由萊鮑迪苷G合成萊鮑迪苷V的方法。該方法包括制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含萊鮑迪苷G，選自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)和尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)的底物，和HV1UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶，有或無蔗糖合成酶(SUS)；以及溫育所述反應(yīng)混合物足夠時(shí)間以生成萊鮑迪苷V，其中葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷G以生成萊鮑迪苷V。

由萊鮑迪苷G生成萊鮑迪苷V的方法。另一方面，本公開涉及一種由萊鮑迪苷G合成萊鮑迪苷V的方法。該方法包括制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含萊鮑迪苷G，選自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)和尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)的底物，選自尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶(EUGT11)、UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶-蔗糖合成酶(SUS)融合酶的尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶(UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶)，有或無蔗糖合成酶(SUS)；以及溫育所述反應(yīng)混合物足夠時(shí)間以生成萊鮑迪苷V，其中葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷G以生成萊鮑迪苷V。

由萊鮑迪苷KA生成萊鮑迪苷V的方法。另一方面，本公開涉及一種由萊鮑迪苷KA合成萊鮑迪苷V的方法。該方法包括制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含萊鮑迪苷KA，選自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)和尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)的底物，選自UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶(UGT76G1；SEQ ID NO:1)和UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶-蔗糖合成酶融合酶的尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶(UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶)，有或無蔗糖合成酶(SUS)；以及溫育所述反應(yīng)混合物足夠時(shí)間以生成萊鮑迪苷V，其中葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷KA以生成萊鮑迪苷V。

由甜茶苷生成萊鮑迪苷V的方法。另一方面，本公開涉及一種由甜茶苷合成萊鮑迪苷V的方法。該方法包括制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含甜茶苷，選自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)和尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)的底物，選自UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶(UGT76G1)、HV1和UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶-蔗糖合成酶融合酶的尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶(UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶)，有或無蔗糖合成酶(SUS)；以及溫育所述反應(yīng)混合物足夠時(shí)間以生成萊鮑迪苷V，其中葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至甜茶苷以生成萊鮑迪苷KA。連續(xù)地，葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷KA以生成萊鮑迪苷V。葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至甜茶苷以生成萊鮑迪苷G。連續(xù)地，葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷G以生成萊鮑迪苷V。

由甜茶苷生成萊鮑迪苷V的方法。另一方面，本公開涉及一種由甜茶苷合成萊鮑迪苷V的方法。該方法包括制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含甜茶苷，選自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)和尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)的底物，選自UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶(UGT76G1)、EUGT11和UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶-蔗糖合成酶融合酶的尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶(UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶)，有或無蔗糖合成酶；以及溫育所述反應(yīng)混合物足夠時(shí)間以生成萊鮑迪苷V，其中葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至甜茶苷以生成萊鮑迪苷KA并且葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷KA以生成萊鮑迪苷V。葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至甜茶苷以生成萊鮑迪苷G并且葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷G以生成萊鮑迪苷V。

由萊鮑迪苷V生成萊鮑迪苷W的方法。另一方面，本公開涉及一種由萊鮑迪苷V合成萊鮑迪苷W的方法。該方法包括制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含萊鮑迪苷V，選自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)和尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)的底物，選自UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶(UGT76G1)和UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶-蔗糖合成酶融合酶的尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶(UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶)，有或無蔗糖合成酶；以及溫育所述反應(yīng)混合物足夠時(shí)間以生成萊鮑迪苷W，其中葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷V以生成萊鮑迪苷W。

由萊鮑迪苷G生成萊鮑迪苷W的方法。另一方面，本公開涉及一種由萊鮑迪苷G合成萊鮑迪苷W的方法。該方法包括制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含萊鮑迪苷G，選自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)和尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)的底物，選自UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶(UGT76G1)、UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶-蔗糖合成酶融合酶和HV1的尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶(UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶)；有或無蔗糖合成酶；以及溫育所述反應(yīng)混合物足夠時(shí)間以生成萊鮑迪苷W，其中葡萄糖通過HV1共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷G以生成萊鮑迪苷V。連續(xù)地，葡萄糖通過UGT76G1共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷V以生成萊鮑迪苷W。

由萊鮑迪苷G生成萊鮑迪苷W的方法。另一方面，本公開涉及一種由萊鮑迪苷G合成萊鮑迪苷W的方法。該方法包括制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含萊鮑迪苷G，選自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)和尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)的底物，選自UGT76G1、EUGT11和UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶-蔗糖合成酶融合酶的尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶(UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶)；以及溫育所述反應(yīng)混合物足夠時(shí)間以生成萊鮑迪苷W，其中葡萄糖通過EUGT11共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷G以生成萊鮑迪苷V。連續(xù)地，葡萄糖通過UGT76G1共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷V以生成萊鮑迪苷W。

由萊鮑迪苷KA生成萊鮑迪苷W的方法。另一方面，本公開涉及一種由萊鮑迪苷KA合成萊鮑迪苷W的方法。該方法包括制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含萊鮑迪苷KA；選自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)和尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)的底物；選自UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶(UGT76G1)和UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶-蔗糖合成酶融合酶的尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶(UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶)，有或無蔗糖合成酶；以及溫育所述反應(yīng)混合物足夠時(shí)間以生成萊鮑迪苷W，其中葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷KA以生成萊鮑迪苷V。連續(xù)地，葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷V以生成萊鮑迪苷W。

由甜茶苷生成萊鮑迪苷W的方法。另一方面，本公開涉及一種由甜茶苷合成萊鮑迪苷D的方法。該方法包括制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含甜茶苷，選自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)和尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)的底物，選自UGT76G1、HV1和UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶-蔗糖合成酶融合酶的尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶(UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶)，有或無蔗糖合成酶；以及溫育所述反應(yīng)混合物足夠時(shí)間以生成萊鮑迪苷W。

由甜茶苷生成萊鮑迪苷W的方法。另一方面，本公開涉及一種由甜茶苷合成萊鮑迪苷W的方法。該方法包括制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含甜茶苷，選自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)和尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)的底物，選自UGT76G1、EUGT11和UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶-蔗糖合成酶融合酶的尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶(UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶)，有或無蔗糖合成酶；以及溫育所述反應(yīng)混合物足夠時(shí)間以生成萊鮑迪苷W。

由甜茶苷生成甜茶苷和萊鮑迪苷KA的混合物的方法。另一方面，本公開涉及一種由甜茶苷合成甜菊苷和萊鮑迪苷KA的混合物的方法。該方法包括制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含甜茶苷，選自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)和尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)的底物，選自EUGT11和UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶-蔗糖合成酶融合酶的UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶，有或無蔗糖合成酶；以及溫育所述反應(yīng)混合物足夠時(shí)間以生成甜菊苷和萊鮑迪苷KA的混合物，其中葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至甜茶苷的C2’-19-O-葡萄糖以生成萊鮑迪苷KA；葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至甜茶苷的C2’-13-O-葡萄糖以生成甜菊苷。

由甜茶苷生成萊鮑迪苷KA的方法。另一方面，本公開涉及一種由甜茶苷合成萊鮑迪苷KA的方法。該方法包括制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含甜茶苷，選自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)和尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)的底物和HV1，有或無蔗糖合成酶；以及溫育所述反應(yīng)混合物足夠時(shí)間以生成萊鮑迪苷KA，其中葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至甜茶苷的C2’-19-O-葡萄糖以生成萊鮑迪苷KA。

由甜茶苷生成萊鮑迪苷G的方法。另一方面，本公開涉及一種由甜茶苷合成萊鮑迪苷G的方法。該方法包括制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含甜茶苷，選自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)和尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)的底物，選自UGT76G1和UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶-蔗糖合成酶融合酶的UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶，有或無蔗糖合成酶；以及溫育所述反應(yīng)混合物足夠時(shí)間以生成萊鮑迪苷G，其中葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至甜茶苷的C3’-13-O-葡萄糖以生成萊鮑迪苷G。

由萊鮑迪苷KA生成萊鮑迪苷E的方法。另一方面，本公開涉及一種由萊鮑迪苷KA合成萊鮑迪苷E的方法。該方法包括制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含萊鮑迪苷KA，選自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)和尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)的底物和HV1UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶，有或無蔗糖合成酶；以及溫育所述反應(yīng)混合物足夠時(shí)間以生成萊鮑迪苷E，其中葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷KA的C2’13-O-葡萄糖以生成萊鮑迪苷E。

由萊鮑迪苷KA生成萊鮑迪苷E的方法。另一方面，本公開涉及一種由萊鮑迪苷KA合成萊鮑迪苷E的方法。該方法包括制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含萊鮑迪苷KA，選自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)和尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)的底物，選自EUGT11和UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶-蔗糖合成酶融合酶的UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶，有或無蔗糖合成酶；以及溫育所述反應(yīng)混合物足夠時(shí)間以生成萊鮑迪苷E，其中葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷KA的C2’13-O-葡萄糖以生成萊鮑迪苷E。

由甜茶苷生成萊鮑迪苷E的方法。另一方面，本公開涉及一種由甜茶苷合成萊鮑迪苷E的方法。該方法包括制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含甜茶苷，選自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)和尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)的底物，和選自EUGT11和UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶-蔗糖合成融合酶的UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶，有或無蔗糖合成酶；以及溫育所述反應(yīng)混合物足夠時(shí)間以生成萊鮑迪苷E，其中葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至甜茶苷以生成萊鮑迪苷KA和甜菊苷的混合物。連續(xù)地，葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷KA和甜菊苷以生成萊鮑迪苷E。

由甜茶苷生成萊鮑迪苷E的方法。另一方面，本公開涉及一種由甜茶苷合成萊鮑迪苷E的方法。該方法包括制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含甜茶苷，選自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)和尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)的底物和HV1UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶，有或無蔗糖合成酶；溫育所述反應(yīng)混合物足夠時(shí)間以生成萊鮑迪苷E，其中葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至甜茶苷以生成萊鮑迪苷KA；以及與HV1一起進(jìn)一步溫育萊鮑迪苷KA以生成萊鮑迪苷E。

由甜茶苷生成萊鮑迪苷D2的方法。另一方面，本公開涉及一種由甜茶苷合成萊鮑迪苷D2的方法。該方法包括制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含甜茶苷，選自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)和尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)的底物，選自EUGT11和UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶-蔗糖合成酶融合酶的UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶，有或無蔗糖合成酶；溫育所述反應(yīng)混合物足夠時(shí)間以生成甜菊苷和萊鮑迪苷D2的混合物，其中葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至甜茶苷以生成甜菊苷和萊鮑迪苷KA的混合物；與EUGT11一起進(jìn)一步溫育甜菊苷和萊鮑迪苷KA的混合物以生成萊鮑迪苷E，其中葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至甜菊苷和萊鮑迪苷KA以生成萊鮑迪苷E；以及與EUGT11一起進(jìn)一步溫育萊鮑迪苷E以生成萊鮑迪苷D2，其中葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷E以生成萊鮑迪苷D2。

由萊鮑迪苷KA生成萊鮑迪苷D2的方法。另一方面，本公開涉及一種由萊鮑迪苷KA合成萊鮑迪苷D2的方法。該方法包括制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含萊鮑迪苷KA，選自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)和尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)的底物，選自EUGT11和UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶-蔗糖合成酶融合酶的UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶，有或無蔗糖合成酶；溫育所述反應(yīng)混合物足夠時(shí)間以生成萊鮑迪苷D2，其中葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷KA以生成萊鮑迪苷E；以及進(jìn)一步溫育萊鮑迪苷E與EUGT11的混合物以生成萊鮑迪苷D2，其中葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷E以生成萊鮑迪苷D2。

由萊鮑迪苷E生成萊鮑迪苷Z的方法。另一方面，本公開涉及一種由萊鮑迪苷E合成萊鮑迪苷Z的方法。該方法包括制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含萊鮑迪苷E，選自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)和尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)的底物，HV1和蔗糖合成酶；溫育所述反應(yīng)混合物足夠時(shí)間以生成萊鮑迪苷Z，其中葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷E的C2’-13-O-葡萄糖以生成萊鮑迪苷Z1。葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷E的C2’-19-O-葡萄糖以生成萊鮑迪苷Z2。

由萊鮑迪苷D生成萊鮑迪苷M的方法。另一方面，本公開涉及一種由萊鮑迪苷D合成萊鮑迪苷M的方法。該方法包括制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含萊鮑迪苷D，選自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)、尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)及其組合的底物，及選自UGT76G1、UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶-蔗糖合成酶融合酶及其組合的UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶，有或無蔗糖合成酶；以及溫育所述反應(yīng)混合物足夠時(shí)間以生成萊鮑迪苷M，其中葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷D以生成萊鮑迪苷M。

由甜菊苷生成萊鮑迪苷D和萊鮑迪苷M的方法。另一方面，本公開涉及一種由甜菊苷合成萊鮑迪苷D和萊鮑迪苷M的方法。該方法包括制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含甜菊苷，選自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)、尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)及其組合的底物，及選自HV1、UGT76G1、UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶-蔗糖合成酶融合酶及其組合的UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶，有或無蔗糖合成酶；以及溫育所述反應(yīng)混合物足夠時(shí)間以生成萊鮑迪苷M。在某些實(shí)施方案中，葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至甜菊苷以生成萊鮑迪苷A和/或萊鮑迪苷E。連續(xù)地，葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷A和/或萊鮑迪苷E以生成萊鮑迪苷D，并且葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷D以生成萊鮑迪苷M。

由萊鮑迪苷A生成萊鮑迪苷D和萊鮑迪苷M的方法。另一方面，本公開涉及一種由萊鮑迪苷A合成萊鮑迪苷D和萊鮑迪苷M的方法。該方法包括制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含萊鮑迪苷A，選自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)、尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)及其組合的底物，及選自HV1、UGT76G1、UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶-蔗糖合成酶融合酶及其組合的UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶，有或無蔗糖合成酶；以及溫育所述反應(yīng)混合物足夠時(shí)間以生成萊鮑迪苷M，其中葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷A以生成萊鮑迪苷D，并且葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷D以生成萊鮑迪苷M。

由萊鮑迪苷E生成萊鮑迪苷D和萊鮑迪苷M的方法。另一方面，本公開涉及一種由萊鮑迪苷E合成萊鮑迪苷D和萊鮑迪苷M的方法。該方法包括制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含萊鮑迪苷E，選自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)、尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)及其組合的底物，及選自UGT76G1、UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶-蔗糖合成酶融合酶及其組合的UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶，有或無蔗糖合成酶；以及溫育所述反應(yīng)混合物足夠時(shí)間以生成萊鮑迪苷M，其中葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷E以生成萊鮑迪苷D，并且其中葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷D以生成萊鮑迪苷M。

另一方面，本公開涉及一種可口服消耗產(chǎn)品，其包含增甜量的選自萊鮑迪苷V、萊鮑迪苷W、萊鮑迪苷G、萊鮑迪苷KA、萊鮑迪苷M及其組合的萊鮑迪苷，其中可口服消耗產(chǎn)品選自飲料產(chǎn)品和可消耗產(chǎn)品。

另一方面，本公開涉及一種飲料產(chǎn)品，其包含增甜量的選自萊鮑迪苷V、萊鮑迪苷W、萊鮑迪苷G、萊鮑迪苷KA、萊鮑迪苷M及其組合的萊鮑迪苷。萊鮑迪苷以約5ppm至約100ppm的濃度存在于飲料產(chǎn)品中。在一些實(shí)施方案中，低濃度的萊鮑迪苷，例如低于100ppm，具有與濃度介于10,000和30,000ppm之間的蔗糖溶液相當(dāng)?shù)奶鸲取?/p>

另一方面，本公開涉及一種可消耗產(chǎn)品，其包含增甜量的選自萊鮑迪苷V、萊鮑迪苷W、萊鮑迪苷G、萊鮑迪苷KA、萊鮑迪苷M及其組合的萊鮑迪苷。萊鮑迪苷以約5ppm至約100ppm的濃度存在于可消耗產(chǎn)品中。在一些實(shí)施方案中，低濃度的萊鮑迪苷，例如低于100ppm，具有與濃度介于10,000和30,000ppm之間的蔗糖溶液相當(dāng)?shù)奶鸲取?/p>

另一方面，本公開涉及一種由以下化學(xué)結(jié)構(gòu)組成的甜味劑：

另一方面，本公開涉及一種由以下化學(xué)結(jié)構(gòu)組成的甜味劑：

在可以與任何前述實(shí)施方案組合的某些實(shí)施方案中，萊鮑迪苷V或萊鮑迪苷W或萊鮑迪苷G或萊鮑迪苷KA或萊鮑迪苷M可以是唯一的甜味劑，并且所述產(chǎn)品具有相當(dāng)于約1％至約4％(w/v-％)蔗糖溶液的甜味強(qiáng)度。在可以與任何前述實(shí)施方案組合的某些實(shí)施方案中，可口服消耗產(chǎn)品還可包括附加甜味劑，其中所述產(chǎn)品具有相當(dāng)于約1％至約10％(w/v-％)蔗糖溶液的甜味強(qiáng)度。在可以與任何前述實(shí)施方案組合的某些實(shí)施方案中，產(chǎn)品中的每種增甜成分均可為高強(qiáng)度甜味劑。在可以與任何前述實(shí)施方案組合的某些實(shí)施方案中，產(chǎn)品中的每種增甜成分均可為天然高強(qiáng)度甜味劑。在可以與任何前述實(shí)施方案組合的某些實(shí)施方案中，附加甜味劑可為選自以下的一種或多種甜味劑：甜葉菊提取物、甜菊醇糖苷、甜菊苷、萊鮑迪苷A、萊鮑迪苷B、萊鮑迪苷C、萊鮑迪苷D、萊鮑迪苷D2、萊鮑迪苷E、萊鮑迪苷F、萊鮑迪苷G、萊鮑迪苷KA、萊鮑迪苷M、杜爾可苷A、甜茶苷、甜菊醇二糖苷、蔗糖、高果糖玉米糖漿、果糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、赤蘚糖醇、木糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、AceK、阿斯巴甜(aspartame)、紐甜(neotame)、三氯蔗糖(sucralose)、糖精、柚皮苷二氫查耳酮(NarDHC)、新橙皮苷二氫查耳酮(NDHC)、甜茶苷、羅漢果苷IV(mogroside IV)、賽門苷I(siamenoside I)、羅漢果苷V、莫那甜(monatin)、索馬甜(thaumatin)、莫奈林(monellin)、布拉奇因(brazzein)、L-丙氨酸、甘氨酸、羅漢果、赫南德辛(hernandulcin)、葉甜素(phyllodulcin)、三葉苷(trilobtain)及其組合。在可以與任何前述實(shí)施方案組合的某些實(shí)施方案中，飲料產(chǎn)品和可消耗產(chǎn)品還可包括一種或多種選自以下的添加劑：碳水化合物、多元醇、氨基酸或其鹽、聚氨基酸或其鹽、糖酸或其鹽、核苷酸、有機(jī)酸、無機(jī)酸、有機(jī)鹽、有機(jī)酸式鹽、有機(jī)堿式鹽、無機(jī)鹽、苦味化合物、食用香料、調(diào)味成分、澀味化合物、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)水解物、表面活性劑、乳化劑、類黃酮、醇、聚合物及其組合。在可以與任何前述實(shí)施方案組合的某些實(shí)施方案中，萊鮑迪苷V在將其添加到產(chǎn)品中之前具有按重量計(jì)約50％至約100％的純度。在可以與任何前述實(shí)施方案組合的某些實(shí)施方案中，W在將其添加到產(chǎn)品中之前具有按重量計(jì)約50％至約100％的純度。在可以與任何前述實(shí)施方案組合的某些實(shí)施方案中，產(chǎn)品中的萊鮑迪苷V為萊鮑迪苷V多晶型物或非晶形萊鮑迪苷V。在可以與任何前述實(shí)施方案組合的某些實(shí)施方案中，產(chǎn)品中的萊鮑迪苷V為萊鮑迪苷V立體異構(gòu)體。在可以與任何前述實(shí)施方案組合的某些實(shí)施方案中，產(chǎn)品中的萊鮑迪苷W為萊鮑迪苷W多晶型物或非晶形萊鮑迪苷W。在可以與任何前述實(shí)施方案組合的某些實(shí)施方案中，產(chǎn)品中的萊鮑迪苷W為萊鮑迪苷W立體異構(gòu)體。

本公開的其它方面涉及一種制備飲料產(chǎn)品和可消耗產(chǎn)品的方法，所述方法通過將選自萊鮑迪苷V、萊鮑迪苷W、萊鮑迪苷KA、萊鮑迪苷M和萊鮑迪苷G的合成萊鮑迪苷包括到產(chǎn)品或用于制備飲料產(chǎn)品和可消耗產(chǎn)品的成分中進(jìn)行，其中選自萊鮑迪苷V、萊鮑迪苷W、萊鮑迪苷KA、萊鮑迪苷M和萊鮑迪苷G的萊鮑迪苷以約5ppm至約100ppm的濃度存在于產(chǎn)品中。本公開的其它方面涉及一種提高飲料產(chǎn)品和可消耗產(chǎn)品甜度的方法，所述方法通過將約5ppm至約100ppm的選自萊鮑迪苷V、萊鮑迪苷W、萊鮑迪苷KA、萊鮑迪苷M和萊鮑迪苷G的合成萊鮑迪苷添加到飲料產(chǎn)品和可消耗產(chǎn)品中進(jìn)行，其中與缺少選自萊鮑迪苷V、萊鮑迪苷W、萊鮑迪苷KA、萊鮑迪苷M和萊鮑迪苷G的合成萊鮑迪苷的相應(yīng)飲料產(chǎn)品和可消耗產(chǎn)品相比，添加的選自萊鮑迪苷V、萊鮑迪苷W、萊鮑迪苷KA、萊鮑迪苷M和萊鮑迪苷G的合成萊鮑迪苷提高了飲料產(chǎn)品和可消耗產(chǎn)品的甜度。

在可以與任何前述實(shí)施方案組合的某些實(shí)施方案中，萊鮑迪苷V是唯一的甜味劑，并且產(chǎn)品具有相當(dāng)于約1％至約4％(w/v-％)蔗糖溶液的甜味強(qiáng)度。在可以與任何前述實(shí)施方案組合的某些實(shí)施方案中，萊鮑迪苷KA是唯一的甜味劑，并且產(chǎn)品具有相當(dāng)于約1％至約4％(w/v-％)蔗糖溶液的甜味強(qiáng)度。在可以與任何前述實(shí)施方案組合的某些實(shí)施方案中，萊鮑迪苷G是唯一的甜味劑，并且產(chǎn)品具有相當(dāng)于約1％至約4％(w/v-％)蔗糖溶液的甜味強(qiáng)度。在可以與任何前述實(shí)施方案組合的某些實(shí)施方案中，萊鮑迪苷W是唯一的甜味劑，并且產(chǎn)品具有相當(dāng)于約1％至約4％(w/v-％)蔗糖溶液的甜味強(qiáng)度。在可以與任何前述實(shí)施方案組合的某些實(shí)施方案中，萊鮑迪苷M是唯一的甜味劑，并且產(chǎn)品具有相當(dāng)于約1％至約4％(w/v-％)蔗糖溶液的甜味強(qiáng)度。在可以與任何前述實(shí)施方案組合的某些實(shí)施方案中，所述方法還包括添加附加甜味劑，其中產(chǎn)品具有相當(dāng)于約1％至約10％(w/v-％)蔗糖溶液的甜味強(qiáng)度。

本公開的其它方面涉及一種制備增甜飲料產(chǎn)品或增甜可消耗產(chǎn)品的方法，所述方法通過以下步驟進(jìn)行：a)提供含有一種或多種甜味劑的飲料產(chǎn)品或可消耗產(chǎn)品；以及b)向飲料產(chǎn)品或可消耗產(chǎn)品中添加約5ppm至約100ppm的選自萊鮑迪苷V、萊鮑迪苷W、萊鮑迪苷KA、萊鮑迪苷M和萊鮑迪苷G及其組合的合成萊鮑迪苷。

在可以與任何前述實(shí)施方案組合的某些實(shí)施方案中，所述方法還包括向飲料產(chǎn)品或可消耗產(chǎn)品中添加一種或多種添加劑。在可以與任何前述實(shí)施方案組合的某些實(shí)施方案中，可口服消耗產(chǎn)品還含有一種或多種添加劑。在可以與任何前述實(shí)施方案組合的某些實(shí)施方案中，所述一種或多種添加劑選自碳水化合物、多元醇、氨基酸或其鹽、聚氨基酸或其鹽、糖酸或其鹽、核苷酸、有機(jī)酸、無機(jī)酸、有機(jī)鹽、有機(jī)酸式鹽、有機(jī)堿式鹽、無機(jī)鹽、苦味化合物、食用香料、調(diào)味成分、澀味化合物、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)水解物、表面活性劑、乳化劑、類黃酮、醇、聚合物及其組合。在可以與任何前述實(shí)施方案組合的某些實(shí)施方案中，產(chǎn)品中的每種增甜成分均可為高強(qiáng)度甜味劑。在可以與任何前述實(shí)施方案組合的某些實(shí)施方案中，產(chǎn)品中的每種增甜成分均可為天然高強(qiáng)度甜味劑。在可以與任何前述實(shí)施方案組合的某些實(shí)施方案中，甜味劑選自甜葉菊提取物、甜菊醇糖苷、甜菊苷、萊鮑迪苷A、萊鮑迪苷B、萊鮑迪苷C、萊鮑迪苷D、萊鮑迪苷D2、萊鮑迪苷E、萊鮑迪苷F、萊鮑迪苷G、萊鮑迪苷KA、萊鮑迪苷M、杜爾可苷A、甜茶苷、甜菊醇二糖苷、蔗糖、高果糖玉米糖漿、果糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、赤蘚糖醇、木糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、AceK、阿斯巴甜、紐甜、三氯蔗糖、糖精、柚皮苷二氫查耳酮(NarDHC)、新橙皮苷二氫查耳酮(NDHC)、甜茶苷、羅漢果苷IV、賽門苷I、羅漢果苷V、莫那甜、索馬甜、莫奈林、布拉奇因、L-丙氨酸、甘氨酸、羅漢果、赫南德辛、葉甜素、三葉苷及其組合。在可以與任何前述實(shí)施方案組合的某些實(shí)施方案中，萊鮑迪苷V在將其添加到產(chǎn)品中之前具有按重量計(jì)約50％至約100％的純度。在可以與任何前述實(shí)施方案組合的某些實(shí)施方案中，產(chǎn)品中的萊鮑迪苷V為萊鮑迪苷V多晶型物或非晶形萊鮑迪苷V。在可以與任何前述實(shí)施方案組合的某些實(shí)施方案中，萊鮑迪苷W在將其添加到產(chǎn)品中之前具有按重量計(jì)約50％至約100％的純度。在可以與任何前述實(shí)施方案組合的某些實(shí)施方案中，產(chǎn)品中的萊鮑迪苷W為萊鮑迪苷W多晶型物或非晶形萊鮑迪苷W。

附圖簡述

本公開在考慮到以下對(duì)其的詳述時(shí)將更好理解，并且優(yōu)于以上所提到的那些的特征、方面和優(yōu)勢將變得顯而易見。此詳述參考以下附圖，其中：

圖1描繪自甜菊醇開始的甜菊醇糖苷生物合成途徑。

圖2描繪用箭頭指示的SDS-PAGE分析純化的重組蛋白：A：HV1，B：UGT76G1，C：EUGT11，D：AtSUS1，E：UGT76G1-SUS1(GS)，F(xiàn)：EUGT11-SUS1(EUS)。

圖3描繪由甜茶苷生成萊鮑迪苷KA(“Reb KA”)和萊鮑迪苷E(“Reb E”)的HV1催化反應(yīng)。A-C：示出了甜茶苷(“Rub”)、甜菊苷(“Ste”)和萊鮑迪苷E(“Reb E”)標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC保留時(shí)間。在6小時(shí)(D)、12小時(shí)(F)和24小時(shí)(H)通過單獨(dú)的HV1酶促生成Reb KA；在6小時(shí)(E)、12小時(shí)(G)和24小時(shí)(I)通過UGT-SUS(HV1-AtSUS1)偶聯(lián)體系酶促生成Reb KA和Reb E。

圖4描繪Reb E通過HV1向萊鮑迪苷Z的轉(zhuǎn)化。(A)：示出了萊鮑迪苷E(“Reb E”)的HPLC保留時(shí)間。在3小時(shí)(B)、7小時(shí)(C)、24小時(shí)(D)和44小時(shí)(E)在HV1-AtSUS1偶聯(lián)體系中通過HV1酶促生成萊鮑迪苷Z(“Reb Z”)。

圖5描繪Reb KA通過HV1向Reb E的轉(zhuǎn)化。(A-B)：示出了萊鮑迪苷KA(“Reb KA”)和萊鮑迪苷E(“Reb E”)標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC保留時(shí)間。在12小時(shí)(C)通過單獨(dú)的HV1酶促生成Reb E；在12小時(shí)(D)通過UGT-SUS(HV1-AtSUS1)偶聯(lián)體系酶促生成Reb E。

圖6描繪由甜茶苷生成Reb KA和甜菊苷的EUGT11催化反應(yīng)。(A-F)：示出了甜茶苷(“Rub”)、甜菊苷(“Ste”)、萊鮑迪苷G(“Reb G”)、萊鮑迪苷E(“Reb E”)、萊鮑迪苷D(“Reb D”)和萊鮑迪苷D2(“Reb D2”)標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC保留時(shí)間。在12小時(shí)(G)和48小時(shí)(J)通過單獨(dú)的EUGT11的酶促反應(yīng)；在12小時(shí)(H)和48小時(shí)(K)通過UGT-SUS(EUGT11-AtSUS1)偶聯(lián)體系的酶促反應(yīng)；在12小時(shí)(I)和48小時(shí)(L)通過EUS融合蛋白的酶促反應(yīng)。

圖7描繪Reb KA通過EUGT11和EUS融合蛋白向Reb E和Reb D2的轉(zhuǎn)化。(A-C)：示出了萊鮑迪苷KA(“Reb KA”)、萊鮑迪苷E(“Reb E”)和萊鮑迪苷D2(“Reb D2”)標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC保留時(shí)間。在12小時(shí)(D)和48小時(shí)(G)通過單獨(dú)的EUGT11的酶促反應(yīng)；在12小時(shí)(E)和48小時(shí)(H)通過UGT-SUS(EUGT11-AtSUS1)偶聯(lián)體系的酶促反應(yīng)；在12小時(shí)(F)和48小時(shí)(I)通過EUS融合蛋白的酶促反應(yīng)。

圖8描繪體外萊鮑迪苷G的UGT76G1生成。(A-B)：示出了甜茶苷(“Rub”)和萊鮑迪苷G(“Reb G”)標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC保留時(shí)間。在12小時(shí)(C)和24小時(shí)(F)通過單獨(dú)的UGT76G1的酶促反應(yīng)；在12小時(shí)(D)和24小時(shí)(G)通過UGT-SUS(EUGT11-AtSUS1)偶聯(lián)體系的酶促反應(yīng)；在12小時(shí)(E)和48小時(shí)(H)通過GS融合蛋白的酶促反應(yīng)。

圖9描繪由萊鮑迪苷KA生成甜菊醇糖苷Reb V和Reb W的UGT76G1催化反應(yīng)。(A-D)：示出了甜茶苷(“Rub”)、萊鮑迪苷D(“Reb D”)、萊鮑迪苷E(“Reb E”)和萊鮑迪苷KA(“Reb KA”)標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC保留時(shí)間。在6小時(shí)(E)和12小時(shí)(H)通過單獨(dú)的UGT76G1的酶促反應(yīng)；在6小時(shí)(F)和12小時(shí)(I)通過UGT-SUS(UGT76G1-AtSUS1)偶聯(lián)體系的酶促反應(yīng)；在6小時(shí)(G)和12小時(shí)(J)通過GS融合蛋白的酶促反應(yīng)。

圖10描繪體外Reb V向Reb W的UGT76G1轉(zhuǎn)化。(A-B)：示出了Reb V和Reb W的HPLC保留時(shí)間。(C)：在6小時(shí)通過UGT76G1-AtSUS1偶聯(lián)體系的酶促反應(yīng)。

圖11描繪Reb G向Reb V的HV1轉(zhuǎn)化。(A-C)：示出了萊鮑迪苷G(“Reb G”)、萊鮑迪苷A(“Reb A”)和萊鮑迪苷E(“Reb E”)標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC保留時(shí)間。在12小時(shí)(D)和24小時(shí)(F)通過單獨(dú)的HV1的酶促反應(yīng)；在12小時(shí)(E)和24小時(shí)(G)通過UGT-SUS(HV1-AtSUS1)偶聯(lián)體系的酶促反應(yīng)。

圖12描繪Reb G向Reb V的EUGT11轉(zhuǎn)化。(A-D)：示出了萊鮑迪苷G(“Reb G”)、萊鮑迪苷A(“Reb A”)、萊鮑迪苷E(“Reb E”)和萊鮑迪苷D(“Reb D”)標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC保留時(shí)間。在12小時(shí)(E)和24小時(shí)(H)通過單獨(dú)的EUGT11的酶促反應(yīng)；在12小時(shí)(F)和24小時(shí)(I)通過UGT-SUS(EUGT11-AtSUS1)偶聯(lián)體系的酶促反應(yīng)；在12小時(shí)(G)和24小時(shí)(J)通過EUS融合酶的酶促反應(yīng)。

圖13描繪通過重組HV1多肽、重組UGT76G1、GS融合酶和重組AtSUS1的組合催化由甜茶苷體外生成Reb W。(A-F)：示出了甜茶苷(“Rub”)、甜菊苷(“Ste”)、萊鮑迪苷G(“Reb G”)、萊鮑迪苷A(“Reb A”)、萊鮑迪苷D(“Reb D”)和萊鮑迪苷E(“Reb E”)的標(biāo)準(zhǔn)品。在6小時(shí)(G)、12小時(shí)(I)和24小時(shí)(K)通過HV1、UGT76G1和AtSUS1酶促生成Reb W；在6小時(shí)(H)、12小時(shí)(J)和24小時(shí)(L)通過HV1和GS融合蛋白酶促生成Reb W。

圖14描繪通過重組EUGT11多肽、重組UGT76G1、GS融合酶和重組AtSUS1的組合催化由甜茶苷體外生成Reb W。(A-E)：示出了甜茶苷(“Rub”)、甜菊苷(“Ste”)、萊鮑迪苷G(“Reb G”)、萊鮑迪苷E(“Reb E”)和萊鮑迪苷D(“Reb D”)的標(biāo)準(zhǔn)品。在12小時(shí)(F)和48小時(shí)(H)通過EUGT11、UGT76G1和AtSUS1酶促生成Reb W；在12小時(shí)(G)和48小時(shí)(I)通過EUGT11和GS融合蛋白酶促生成Reb W。

圖15描繪通過重組HV1多肽、重組UGT76G1、GS融合酶和重組AtSUS1的組合催化由Reb G體外生成Reb W。A-D示出了萊鮑迪苷G(“Reb G”)、萊鮑迪苷A(“Reb A”)、萊鮑迪苷D(“Reb D”)、萊鮑迪苷和萊鮑迪苷E(“Reb E”)的標(biāo)準(zhǔn)品。在6小時(shí)(E)、12小時(shí)(G)和36小時(shí)(I)通過HV1、UGT76G1和AtSUS1酶促生成Reb V和Reb W；在6小時(shí)(F)、12小時(shí)(H)和36小時(shí)(J)通過HV1和GS融合蛋白酶促生成Reb V和Reb W。

圖16描繪通過重組EUGT11多肽、重組UGT76G1、GS融合酶和重組AtSUS1的組合催化由Reb G體外生成Reb W。(A-D)：示出了萊鮑迪苷G(“Reb G”)、萊鮑迪苷A(“Reb A”)、萊鮑迪苷E(“Reb E”)和萊鮑迪苷D(“Reb D”)的標(biāo)準(zhǔn)品。在12小時(shí)(E)和48小時(shí)(G)通過EUGT11、UGT76G1和AtSUS1酶促生成Reb W；在12小時(shí)(F)和48小時(shí)(H)通過EUGT11和GS融合蛋白酶促生成Reb W。

圖17描繪Reb V和Reb G的結(jié)構(gòu)。

圖18描繪Reb V的關(guān)鍵TOCSY和HMBC相關(guān)性。

圖19描繪Reb W和Reb V的結(jié)構(gòu)。

圖20描繪Reb W的關(guān)鍵TOCSY和HMBC相關(guān)性。

圖21描繪甜菊醇糖苷的生物合成途徑。

圖22描繪通過UGT76G1和GS融合酶催化由Reb D體外生成Reb M。(A-B)：示出了萊鮑迪苷D(“Reb D”)和萊鮑迪苷M(“Reb M”)標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC保留時(shí)間。在3小時(shí)(C)和6小時(shí)(F)通過單獨(dú)的UGT76G1的酶促反應(yīng)；在3小時(shí)(D)和6小時(shí)(G)通過UGT-SUS(UGT76G1-AtSUS1)偶聯(lián)體系的酶促反應(yīng)；在3小時(shí)(E)和6小時(shí)(H)通過GS融合酶的酶促反應(yīng)。

圖23描繪通過UGT76G1和GS融合酶催化由Reb E體外生成Reb D和Reb M。(A-C)：示出了萊鮑迪苷E(“Reb E”)、萊鮑迪苷D(“Reb D”)和萊鮑迪苷M(“Reb M”)標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC保留時(shí)間。在3小時(shí)(D)、12小時(shí)(G)和24小時(shí)(J)通過單獨(dú)的UGT76G1的酶促反應(yīng)；在3小時(shí)(E)、12小時(shí)(H)和24小時(shí)(K)通過UGT-SUS(UGT76G1-AtSUS1)偶聯(lián)體系的酶促反應(yīng)；在3小時(shí)(F)、12小時(shí)(I)和24小時(shí)(L)通過GS融合酶的酶促反應(yīng)。

圖24描繪通過重組HV1、重組UGT76G1、GS融合酶和/或重組AtSUS1的組合催化由甜菊苷體外生成Reb D和Reb M。(A-D)：示出了甜菊苷(“Ste”)、萊鮑迪苷A(“Reb A”)、萊鮑迪苷D(“Reb D”)和萊鮑迪苷M(“Reb M”)標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC保留時(shí)間。在6小時(shí)(E)、12小時(shí)(H)和24小時(shí)(K)在UGT-SUS偶聯(lián)體系中通過HV1和UGT76G1的酶促反應(yīng)；在6小時(shí)(F)、12小時(shí)(I)和24小時(shí)(L)通過HV1和GS融合酶的酶促反應(yīng)；在6小時(shí)(G)、12小時(shí)(J)和24小時(shí)(M)通過UGT76G1和HV1的酶促反應(yīng).

圖25描繪通過重組HV1、重組UGT76G1、GS融合酶和/或重組AtSUS1催化由萊鮑迪苷A體外生成Reb D和Reb M。(A-C)：示出了萊鮑迪苷A(“Reb A”)、萊鮑迪苷D(“Reb D”)和萊鮑迪苷M(“Reb M”)標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC保留時(shí)間。在6小時(shí)(D)、12小時(shí)(G)和24小時(shí)(J)在UGT-SUS偶聯(lián)體系中通過HV1和UGT76G1的酶促反應(yīng)；在6小時(shí)(E)、12小時(shí)(H)和24小時(shí)(K)通過HV1和GS融合酶的酶促反應(yīng)。在6小時(shí)(F)、12小時(shí)(I)和24小時(shí)(J)通過UGT76G1和HV1的酶促反應(yīng)。

圖26描繪Reb M的結(jié)構(gòu)。

圖27描繪Reb M的關(guān)鍵TOCSY和HMBC相關(guān)性。

雖然本公開易受各種修改和替代性形式影響，但其具體實(shí)施方案已經(jīng)在附圖中以舉例的方式示出并且本文在下面有詳細(xì)描述。然而，應(yīng)理解對(duì)具體實(shí)施方案的描述并非旨在限制本公開而包括屬于所附權(quán)利要求書所定義的本公開的精神和范圍內(nèi)的所有修改、等效方案和替代方案。

詳述

除非另有定義，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本公開所屬領(lǐng)域中普通技術(shù)人員通常所理解的相同含義。雖然在本公開的實(shí)踐或試驗(yàn)中可使用與本文描述的那些類似或等效的任何方法和材料，但下面描述的是優(yōu)選材料和方法。

術(shù)語“互補(bǔ)”根據(jù)本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員所理解的其普通和慣常含義使用，并且不限于用于描述能夠相互雜交的核苷酸堿基之間的關(guān)系。例如，就DNA而言，腺苷與胸腺嘧啶互補(bǔ)且胞嘧啶與鳥嘌呤互補(bǔ)。因此，主題技術(shù)還包括與所附序列表中所報(bào)告的完整序列互補(bǔ)的分離的核酸片段以及那些基本上相似的核酸序列。

術(shù)語“核酸”和“核苷酸”根據(jù)本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員所理解的其各自的普通和慣常含義使用，并且不限于用于指呈單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。除非特別限制，該術(shù)語涵蓋含有天然核苷酸的已知類似物，具有與參考核酸相似的結(jié)合性質(zhì)并且以類似于天然存在的核苷酸的方式代謝的核酸。除非另有說明，否則特定核酸序列還涵蓋其經(jīng)保守性修飾的或簡并性變體(例如簡并密碼子取代)和互補(bǔ)序列，以及明確指示的序列。

術(shù)語“分離的”根據(jù)本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員所理解的其普通和慣常含義使用，并且用于分離的核酸或分離的多肽的上下文中時(shí)，不限于用于指經(jīng)人工，遠(yuǎn)離其天然環(huán)境存在且因此不是天然產(chǎn)物的核酸或多肽。分離的核酸或多肽可以呈純化形式存在或者可以存在于非天然環(huán)境中，例如轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞中。

如本文中所用的術(shù)語“溫育”是指混合兩種或更多種化學(xué)或生物實(shí)體(如化學(xué)化合物和酶)并允許其在利于生成甜菊醇糖苷組合物的條件下相互作用的過程。

術(shù)語“簡并性變體”是指具有與參考核酸序列的不同之處在于一個(gè)或多個(gè)簡并密碼子取代的殘基序列的核酸序列。簡并密碼子取代可通過產(chǎn)生其中一個(gè)或多個(gè)選定(或所有)密碼子的第三位被混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列來實(shí)現(xiàn)。核酸序列及其所有簡并性變體將表達(dá)相同的氨基酸或多肽。

術(shù)語“多肽”、“蛋白質(zhì)”和“肽”根據(jù)本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員所理解的其各自的普通和慣常含義使用；所述三個(gè)術(shù)語有時(shí)可互換使用，并且不限于用于指氨基酸聚合物或氨基酸類似物，而不管其大小或功能如何。雖然“蛋白質(zhì)”常常在提到相對(duì)較大的多肽時(shí)使用，而“肽”常常在提到較小多肽時(shí)使用，但這些術(shù)語在本領(lǐng)域中的使用有重疊和變化。除非另外指出，否則如本文中所用的術(shù)語“多肽”是指肽、多肽和蛋白質(zhì)。術(shù)語“蛋白質(zhì)”、“多肽”和“肽”在提到多核苷酸產(chǎn)物時(shí)可互換使用。因此，示例性多肽包括多核苷酸產(chǎn)物、天然存在的蛋白質(zhì)、同源物、直系同源物、旁系同源物、片段和其它等效物、前述物質(zhì)的變體和類似物。

術(shù)語“多肽片段”和“片段”在提到參考多肽使用時(shí)，根據(jù)本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員所理解的其普通和慣常含義使用，并且不限于用于指與參考多肽本身相比其中有氨基酸殘基缺失，但是其中剩余的氨基酸序列通常與參考多肽中的相應(yīng)位置相同的多肽。此類缺失可以出現(xiàn)在參考多肽的氨基末端或羧基末端，或可選地出現(xiàn)在兩處。

術(shù)語多肽或蛋白質(zhì)的“功能片段”是指為全長多肽或蛋白質(zhì)的一部分，并且具有與全長多肽或蛋白質(zhì)基本上相同的生物活性，或執(zhí)行基本上相同的功能(例如，執(zhí)行相同的酶促反應(yīng))的肽片段。

術(shù)語“變體多肽”、“經(jīng)修飾的氨基酸序列”或“經(jīng)修飾的多肽”，可互換使用，是指與參考多肽的不同之處在于一個(gè)或多個(gè)氨基酸，例如一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失和/或添加的氨基酸序列。一方面，變體是保持參考多肽的一些或所有能力的“功能變體”。

術(shù)語“功能變體”還包括經(jīng)保守性取代的變體。術(shù)語“經(jīng)保守性取代的變體”是指具有與參考肽的不同之處在于一個(gè)或多個(gè)保守性氨基酸取代并且保持參考肽的一些或所有活性的氨基酸序列的肽?！氨Ｊ匦园被崛〈笔前被釟埢还δ芟嗨频臍埢〈?。保守性取代的實(shí)例包括一個(gè)非極性(疏水性)殘基如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸對(duì)另一個(gè)的取代；一個(gè)帶電的或極性(親水性)殘基對(duì)另一個(gè)的取代如精氨酸和賴氨酸之間，谷氨酰胺和天冬酰胺之間，蘇氨酸和絲氨酸之間；一個(gè)堿性殘基如賴氨酸或精氨酸對(duì)另一個(gè)的取代；或一個(gè)酸性殘基如天冬氨酸或谷氨酸對(duì)另一個(gè)的取代；或一個(gè)芳香族殘基，如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸對(duì)另一個(gè)的取代。預(yù)計(jì)此類取代對(duì)蛋白質(zhì)或多肽的表觀分子量或等電點(diǎn)影響很小或沒有影響。短語“經(jīng)保守性取代的變體”還包括其中一個(gè)殘基被化學(xué)衍生化殘基置換的肽，條件是所得肽保持如本文所述的參考肽的一些或所有活性。

與主題技術(shù)的多肽有關(guān)的術(shù)語“變體”，還包括具有與參考多肽的氨基酸序列至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％和甚至100％相同的氨基酸序列的功能活性多肽。

術(shù)語“同源”在其所有語法形式和拼寫變型中是指具有“共同進(jìn)化起源”的多核苷酸或多肽，包括來自超家族的多核苷酸或多肽及來自不同物種的同源多核苷酸或蛋白質(zhì)之間的關(guān)系(Reeck等，Cell 50:667,1987)。此類多核苷酸或多肽，不管是在百分比同一性還是保守性位置的特定氨基酸或基序的存在上，都具有其序列相似性所反映的序列同源性。例如，兩個(gè)同源多肽可具有至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％和甚至100％相同的氨基酸序列。

關(guān)于主題技術(shù)的變體多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”是指在比對(duì)序列并且在必要時(shí)引入空位以實(shí)現(xiàn)最大百分比序列同一性之后，而未將任何保守性取代視為序列同一性的一部分，候選序列中的氨基酸殘基與參考多肽的氨基酸殘基相同的百分比。

為了測定百分比氨基酸序列同一性的比對(duì)可以按本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的各種方式實(shí)現(xiàn)，例如，使用可公用的計(jì)算機(jī)軟件如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)軟件。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以測定適當(dāng)?shù)膮?shù)用于測量比對(duì)，包括在所比較的序列全長上實(shí)現(xiàn)最大限度比對(duì)所需的任何算法。例如，可使用序列比較程序NCBI-BLAST2測定氨基酸序列同一性％。NCBI-BLAST2序列比較程序可從ncbi.nlm.nih.gov下載。NCBI BLAST2使用幾個(gè)搜索參數(shù)，其中那些搜索參數(shù)全部設(shè)為缺省值，包括例如，未遮掩是，鏈＝全部，期望發(fā)生10，最小低復(fù)雜性長度＝15/5，多程e值＝0.01，多程常數(shù)＝25，最終缺口比對(duì)的降低＝25和評(píng)分矩陣＝BLOSUM62。在采用NCBI-BLAST2進(jìn)行氨基酸序列比較的情況下，給定氨基酸序列A對(duì)、與或針對(duì)給定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％(可以可選地表達(dá)為給定氨基酸序列A對(duì)、與或針對(duì)給定氨基酸序列B具有或包含某一％氨基酸序列同一性)計(jì)算如下：100×分?jǐn)?shù)X/Y，其中X是通過序列比對(duì)程序NCBI-BLAST2在該程序?qū)和B的比對(duì)中評(píng)分為相同匹配的氨基酸殘基的數(shù)量，并且其中Y為B中的氨基酸殘基的總數(shù)。將認(rèn)識(shí)到氨基酸序列A的長度不等于氨基酸序列B的長度時(shí)，A對(duì)B的％氨基酸序列同一性將不等于B對(duì)A的％氨基酸序列同一性。

在這個(gè)意義上，測定氨基酸序列“相似性”的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。一般而言，“相似性”是指在氨基酸相同或具有相似化學(xué)和/或物理性質(zhì)如電荷或疏水性的適當(dāng)位置對(duì)兩個(gè)或更多個(gè)多肽的氨基酸與氨基酸的精確比較。然后可測定所比較的多肽序列之間的所謂“百分比相似性”。測定核酸和氨基酸序列同一性的技術(shù)也是本領(lǐng)域公知的并且包括測定對(duì)于該基因而言mRNA的核苷酸序列(通常經(jīng)由cDNA中間體)并測定其中編碼的氨基酸序列，并且將這與第二氨基酸序列進(jìn)行比較。一般而言，“同一性”是指分別兩個(gè)多核苷酸或多肽序列的核苷酸與核苷酸或氨基酸與氨基酸的精確一致性。正如兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸序列一樣，可以通過測定其“百分比同一性”來比較兩個(gè)或更多個(gè)多核苷酸序列。Wisconsin序列分析包第8版(可從Genetics Computer Group,Madison,Wis.獲得)中可用的程序，例如GAP程序，能夠分別計(jì)算兩個(gè)多核苷酸之間的同一性及兩個(gè)多肽序列之間的同一性和相似性。計(jì)算序列之間的同一性或相似性的其它程序?yàn)楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知。

與參考位置“對(duì)應(yīng)”的氨基酸位置是指通過比對(duì)氨基酸序列鑒定，與參考序列匹配的位置。此類比對(duì)可通過人工或通過使用公知的序列比對(duì)程序如ClustalW2、Blast 2等進(jìn)行。

除非另有說明，否則兩個(gè)多肽或多核苷酸序列的百分比同一性是指在兩個(gè)序列中較短序列的整個(gè)長度上相同氨基酸殘基或核苷酸的百分比。

“編碼序列”根據(jù)本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員所理解的其普通和慣常含義使用，并且不限于用于指編碼特定氨基酸序列的DNA序列。

“合適調(diào)控序列”根據(jù)本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員所理解的其普通和慣常含義使用，并且不限于用于指位于編碼序列上游(5’非編碼序列)、內(nèi)部或下游(3’非編碼序列)的核苷酸序列，并且其影響相關(guān)編碼序列的轉(zhuǎn)錄、RNA加工或穩(wěn)定性或翻譯。調(diào)控序列可包括啟動(dòng)子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子和聚腺苷酸化識(shí)別序列。

“啟動(dòng)子”根據(jù)本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員所理解的其普通和慣常含義使用，并且不限于用于指能夠控制編碼序列或功能RNA的表達(dá)的DNA序列。一般而言，編碼序列位于啟動(dòng)子序列的3’。啟動(dòng)子可整個(gè)源自天然基因，或由源自自然界發(fā)現(xiàn)的不同啟動(dòng)子的不同元件組成，或甚至包含合成DNA片段。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解，不同啟動(dòng)子可指導(dǎo)不同細(xì)胞類型中或不同發(fā)育階段或響應(yīng)于不同環(huán)境條件的基因的表達(dá)。使基因大多數(shù)時(shí)間在大多數(shù)細(xì)胞類型中表達(dá)的啟動(dòng)子，通常稱為“組成型啟動(dòng)子”。還進(jìn)一步認(rèn)識(shí)到，因?yàn)樵诖蠖鄶?shù)情況下調(diào)控序列的確切邊界尚未完全定義，所以不同長度的DNA片段可具有相同的啟動(dòng)子活性。

術(shù)語“可操作連接的”是指單個(gè)核酸片段上的核酸序列的締合，使得一個(gè)核酸序列的功能受另一個(gè)影響。例如，啟動(dòng)子在能夠影響編碼序列的表達(dá)(即編碼序列處于啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下)時(shí)，啟動(dòng)子與該編碼序列可操作連接。編碼序列可以在有義或反義方向上與調(diào)控序列可操作連接。

如本文中所用的術(shù)語“表達(dá)”根據(jù)本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員所理解的其普通和慣常含義使用，并且不限于用于指源自主題技術(shù)的核酸片段的有義(mRNA)或反義RNA的轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定積聚?！斑^表達(dá)”是指轉(zhuǎn)基因或重組生物體中基因產(chǎn)物的生成超過正?；蚍寝D(zhuǎn)化生物體中的生成水平。

“轉(zhuǎn)化”根據(jù)本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員所理解的其普通和慣常含義使用，并且不限于用于指多核苷酸向靶細(xì)胞中的轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移的多核苷酸可以并入到靶細(xì)胞的基因組或染色體DNA中，產(chǎn)生基因穩(wěn)定性遺傳，或其可以獨(dú)立于宿主染色體而復(fù)制。含有轉(zhuǎn)化核酸片段的宿主生物體稱為“轉(zhuǎn)基因”或“重組”或“轉(zhuǎn)化”生物體。

術(shù)語“轉(zhuǎn)化”、“轉(zhuǎn)基因”和“重組”，當(dāng)在本文中連同宿主細(xì)胞使用時(shí)，根據(jù)本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員所理解的其普通和慣常含義使用，并且不限于用于指已經(jīng)向其中引入了異源核酸分子的宿主生物體的細(xì)胞，如植物或微生物細(xì)胞。核酸分子可以穩(wěn)定整合到宿主細(xì)胞的基因組中，或核酸分子可以作為染色體外分子存在。此類染色體外分子可以自主復(fù)制。轉(zhuǎn)化細(xì)胞、組織或受試者被理解為不但涵蓋轉(zhuǎn)化過程的最終產(chǎn)物，而且涵蓋其轉(zhuǎn)基因后代。

術(shù)語“重組”、“異源”和“外源”，當(dāng)在本文中連同多核苷酸使用時(shí)，根據(jù)本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員所理解的其普通和慣常含義使用，并且不限于用于指對(duì)特定宿主細(xì)胞來說外來來源的，或者若來自相同來源，則由其原始形式修飾的多核苷酸(例如，DNA序列或基因)。因此，宿主細(xì)胞中的異源基因包括特定宿主細(xì)胞內(nèi)源的但已經(jīng)通過例如使用定點(diǎn)誘變或其它重組技術(shù)修飾的基因。所述術(shù)語還包括天然存在的DNA序列的非天然存在的多個(gè)拷貝。因此，所述術(shù)語是指對(duì)細(xì)胞來說外來的或異源的，或與細(xì)胞同源但處于宿主細(xì)胞內(nèi)一般未發(fā)現(xiàn)該元件的位置或形式的DNA片段。

類似地，術(shù)語“重組”、“異源”和“外源”，當(dāng)在本文中連同多肽或氨基酸序列使用時(shí)，意指來源于對(duì)特定宿主細(xì)胞來說外來來源的或者，若來自相同來源，則由其原始形式修飾的多肽或氨基酸序列。因此，重組DNA片段可以在宿主細(xì)胞中表達(dá)以生成重組多肽。

術(shù)語“質(zhì)粒”、“載體”和“盒”根據(jù)本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員所理解的其普通和慣常含義使用，并且不限于用于指常常攜帶并非細(xì)胞中心代謝的一部分且通常呈環(huán)狀雙鏈DNA分子形式的基因的染色體外元件。此類元件可為源自任何來源的單鏈或雙鏈DNA或RNA的線性或環(huán)狀自主復(fù)制序列、基因組整合序列、噬菌體或核苷酸序列，其中許多核苷酸序列已經(jīng)連接或重組到能夠連同適當(dāng)?shù)?’非翻譯序列一起將選定基因產(chǎn)物的啟動(dòng)子片段和DNA序列引入細(xì)胞中的獨(dú)特構(gòu)造中?！稗D(zhuǎn)化盒”是指含有外來基因且除該外來基因外還具有利于特定宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的元件的特定載體?！氨磉_(dá)盒”是指含有外來基因且除該外來基因外還具有允許該基因在外來宿主中增強(qiáng)表達(dá)的元件的特定載體。

本文中所用的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA和分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域公知的并且，例如，由Sambrook,J.、Fritsch,E.F.和Maniatis,T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第2版；Cold Spring Harbor Laboratory:Cold Spring Harbor,N.Y.,1989(下文稱為“Maniatis”)；和由Silhavy,T.J.、Bennan,M.L.和Enquist,L.W.Experiments with Gene Fusions；Cold Spring Harbor Laboratory:Cold Spring Harbor,N.Y.,1984；和由Ausubel,F.M.等，在1987年由Greene Publishing和Wiley-Interscience出版的Current Protocols in Molecular Biology中有描述，其各自整體據(jù)此通過引用在與之一致的程度上并入本文。

如本文中所用，“合成”或“有機(jī)合成”或“化學(xué)合成”用于指通過一系列化學(xué)反應(yīng)制備化合物；這不包括提取化合物，例如，從天然來源提取。

如本文中所用的術(shù)語“可口服消耗產(chǎn)品”是指與人或動(dòng)物口腔接觸的任何飲料、食物產(chǎn)品、膳食補(bǔ)充劑、營養(yǎng)制劑、藥物組合物、口腔衛(wèi)生組合物和美容產(chǎn)品，包括攝入口腔并隨后由口腔排出的物質(zhì)及飲用、嚼食、吞咽或以其它方式消化的物質(zhì)；及在通?？山邮艿臐舛确秶鷥?nèi)使用時(shí)對(duì)人或動(dòng)物消耗而言是安全的物質(zhì)。

如本文中所用的術(shù)語“食物產(chǎn)品”是指水果、蔬菜、果汁、肉制品如火腿、培根(bacon)、香腸；蛋制品、水果濃縮物、明膠和明膠樣產(chǎn)品如果醬、果凍、蜜餞等；乳制品如冰激凌、酸奶油、酸奶和凍果汁露；糖霜、糖漿，包括糖蜜；玉米、小麥、黑麥、大豆、燕麥、水稻和大麥制品、谷類制品、堅(jiān)果仁和堅(jiān)果制品、蛋糕、曲奇、糖食(如糖果)、樹膠、水果味硬糖(fruit flavored drop)和巧克力、口香糖、薄荷、奶油、糖霜、冰淇淋、餡餅和面包?！笆澄锂a(chǎn)品”還指調(diào)味品如藥草、香料和佐料、增香劑，如谷氨酸一鈉。“食物產(chǎn)品”進(jìn)一步指還包括制備的包裝產(chǎn)品，如飲食甜味劑、液體甜味劑、桌面調(diào)味劑、與水沖調(diào)得到非碳酸飲料的顆粒調(diào)味混合物、速食布丁混合物、速溶咖啡和茶、咖啡伴侶、麥乳精混合物、寵物食品、牲畜飼料、煙草，以及用于烘焙應(yīng)用的材料，例如用于制備面包、曲奇、蛋糕、薄煎餅、甜甜圈等的粉狀烘焙混合物?！笆澄锂a(chǎn)品”還指含有少量或不含蔗糖的減肥或低熱量食品和飲料。

如本文中所用，術(shù)語“立體異構(gòu)體”是僅在其原子在空間中的取向上不同的獨(dú)立分子的所有異構(gòu)體的統(tǒng)稱?！傲Ⅲw異構(gòu)體”包括對(duì)映異構(gòu)體和彼此非鏡像的具有多于一個(gè)手性中心的化合物的異構(gòu)體(非對(duì)映異構(gòu)體)。

如本文中所用，術(shù)語“非晶形萊鮑迪苷V”是指萊鮑迪苷V的非結(jié)晶固體形式。如本文中所用，術(shù)語“非晶形萊鮑迪苷W”是指萊鮑迪苷W的非結(jié)晶固體形式。

如本文中所用，術(shù)語“甜味強(qiáng)度”是指由個(gè)體(例如人)所觀察到的或經(jīng)歷的甜味感覺的相對(duì)強(qiáng)度，或由嘗味者例如基于布里標(biāo)度(Brix scale)檢測的甜味的程度或量。

如本文中所用，術(shù)語“提高甜度”是指與不含萊鮑迪苷V和/或萊鮑迪苷W的相應(yīng)可口服消耗產(chǎn)品相比，萊鮑迪苷V和/或萊鮑迪苷W增加、增大、增強(qiáng)、加重、放大和/或加強(qiáng)本公開的飲料產(chǎn)品或可消耗產(chǎn)品的一種或多種甜度特性的感官知覺而不改變其性質(zhì)或質(zhì)量的作用。

如本文中所用，術(shù)語“異味”是指非典型或不常存在于本公開的飲料產(chǎn)品或可消耗產(chǎn)品中的味道的量或程度。例如，異味是對(duì)于消費(fèi)者來說增甜消耗品不理想的味道，例如，苦味、類甘草味、金屬味、令人反感的味道、澀味、延遲的甜味產(chǎn)生、綿長的甜回味及類似味道，等等。

如本文中所用，術(shù)語“w/v-％”是指對(duì)于每100ml含化合物如糖的本公開的液體可口服消耗產(chǎn)品而言此類化合物的重量(按克計(jì))。如本文中所用，術(shù)語“w/w-％”是指對(duì)于每克含化合物如糖的本公開的可口服消耗產(chǎn)品而言此類化合物的重量(按克計(jì))。

如本文中所用，術(shù)語“ppm”是指按重量計(jì)的百萬分率，例如每千克含化合物的本公開的可口服消耗產(chǎn)品中此類化合物，如萊鮑迪苷V和/或萊鮑迪苷W的重量(按毫克計(jì))(即，mg/kg)或每升含化合物的本公開的可口服消耗產(chǎn)品中此類化合物，如萊鮑迪苷V和/或萊鮑迪苷W的重量(按毫克計(jì))(即，mg/L)；或按體積計(jì)的百萬分率，例如每升含化合物的本公開的可口服消耗產(chǎn)品中此類化合物，如萊鮑迪苷V和/或萊鮑迪苷W的重量(按毫升計(jì))(即，ml/L)。

根據(jù)本公開，公開了無熱量甜味劑和合成無熱量甜味劑的方法。同樣根據(jù)本公開，公開了一種酶和使用該酶制備無熱量甜味劑的方法。

合成的無熱量甜味劑：合成萊鮑迪苷V

一方面，本公開涉及一種合成的無熱量甜味劑。合成的無熱量甜味劑是合成的萊鮑迪苷型甜菊醇糖苷并且已經(jīng)命名為“萊鮑迪苷V”。萊鮑迪苷V(“Reb V”)是在其結(jié)構(gòu)中具有四個(gè)與糖苷配基甜菊醇連接的β-D-葡糖基單元的甜菊醇糖苷，甜菊醇糖苷配基部分在C-13處具有呈醚鍵形式的Glcβ1-3-Glcβ1單元且在C-19位置處具有另一個(gè)呈酯鍵形式的Glcβ1-2-Glcβ1單元。

基于大量的1D和2D NMR以及高分辨率質(zhì)譜數(shù)據(jù)和水解研究，萊鮑迪苷V具有分子式C₄₄H₇₀O₂₃和IUPAC名稱，13-[(3-O-β-D-吡喃葡糖基-β-D-吡喃葡糖基)氧基]對(duì)映-貝殼杉-16-烯-19-烯酸-(2-O-β-D-吡喃葡糖基-β-D-吡喃葡糖基)酯。

合成的無熱量甜味劑：合成萊鮑迪苷W

一方面，本公開涉及一種合成的無熱量甜味劑。合成的無熱量甜味劑是合成的萊鮑迪苷型甜菊醇糖苷并且已經(jīng)命名為“萊鮑迪苷W”。萊鮑迪苷W(“Reb W”)是在其結(jié)構(gòu)中具有五個(gè)與糖苷配基甜菊醇連接的β-D-葡糖基單元的甜菊醇糖苷，甜菊醇糖苷配基部分在C-13處具有呈醚鍵形式的Glcβ1-3-Glcβ1單元且在C-19位置處具有呈酯鍵形式的Glcβ1-2(Glcβ1-3)-Glcβ1單元。

萊鮑迪苷W具有分子式C₅₀H₈₀O₂₈和IUPAC名稱，13-[(3-O-β-D-吡喃葡糖基-β-D-吡喃葡糖基)氧基]對(duì)映-貝殼杉-16-烯-19-烯酸-[(2-O-β-D-吡喃葡糖基-3-O-β-D-吡喃葡糖基-β-D-吡喃葡糖基)酯。

合成的無熱量甜味劑：合成萊鮑迪苷KA

一方面，本公開涉及一種合成的無熱量甜味劑。合成的無熱量甜味劑是合成的萊鮑迪苷型甜菊醇糖苷并且已經(jīng)命名為“萊鮑迪苷KA”。萊鮑迪苷KA(“Reb KA”)是在其結(jié)構(gòu)中具有三個(gè)與糖苷配基甜菊醇連接的β-D-葡糖基單元的甜菊醇糖苷，甜菊醇糖苷配基部分在C-13處具有呈醚鍵形式的Glcβ1單元且在C-19處具有呈醚鍵形式的Glcβ1-2-Glcβ1單元。基于大量的1D和2D NMR以及高分辨率質(zhì)譜數(shù)據(jù)和水解研究，萊鮑迪苷KA具有分子式C₃₈H₆₀O₁₈和IUPAC名稱，13-β-D-吡喃葡糖基氧基]對(duì)映-貝殼杉-16-烯-19-烯酸-(2-O-β-D-吡喃葡糖基-β-D-吡喃葡糖基)酯。

合成的無熱量甜味劑：合成萊鮑迪苷G

一方面，本公開涉及一種合成的無熱量甜味劑。合成的無熱量甜味劑是合成的萊鮑迪苷型甜菊醇糖苷并且已經(jīng)命名為“萊鮑迪苷G”。萊鮑迪苷G(“Reb G”)是在其結(jié)構(gòu)中具有三個(gè)與糖苷配基甜菊醇連接的β-D-葡糖基單元的甜菊醇糖苷，甜菊醇糖苷配基部分在C-13處具有呈醚鍵形式的Glcβ1-3-Glcβ1單元且在C-19處具有呈醚鍵形式的Glcβ1單元。

基于大量的1D和2D NMR以及高分辨率質(zhì)譜數(shù)據(jù)和水解研究，萊鮑迪苷G具有分子式C₃₈H₆₀O₁₈和IUPAC名稱，13-[(3-O-β-D-吡喃葡糖基-β-D-吡喃葡糖基)氧基]對(duì)映-貝殼杉-16-烯-19-烯酸-β-D-吡喃葡糖基)酯。

合成的無熱量甜味劑：合成萊鮑迪苷M

一方面，本公開涉及一種合成的無熱量甜味劑。合成的無熱量甜味劑是合成的萊鮑迪苷型甜菊醇糖苷并且已經(jīng)命名為“萊鮑迪苷M”。萊鮑迪苷M(“Reb M”)是在其結(jié)構(gòu)中具有六個(gè)與糖苷配基甜菊醇連接的β-D-葡糖基單元的甜菊醇糖苷，甜菊醇糖苷配基部分在C-13位置處具有呈醚鍵形式的Glcβ1-2(Glcβ1-3)-Glcβ1單元且在C-19位置處具有呈酯鍵形式的Glcβ1-2(Glcβ1-3)-Glcβ1單元。

基于大量的1D和2D NMR以及高分辨率質(zhì)譜數(shù)據(jù)和水解研究，萊鮑迪苷M具有分子式C₅₆H₉₀O₃₃和IUPAC名稱，13-[(2-O-β-D-吡喃葡糖基-3-O-β-D-吡喃葡糖基-β-D-吡喃葡糖基)氧基]對(duì)映-貝殼杉-16-烯-19-烯酸-[(2-O-β-D-吡喃葡糖基-3-O-β-D-吡喃葡糖基-β-D-吡喃葡糖基)酯。

合成甜菊醇糖苷的方法

由萊鮑迪苷G生成萊鮑迪苷V的方法。另一方面，本公開涉及一種由萊鮑迪苷G合成萊鮑迪苷V的方法。該方法包括制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含萊鮑迪苷G；選自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)和尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)的底物；和HV1UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶；有或無蔗糖合成酶(SUS)以及溫育所述反應(yīng)混合物足夠時(shí)間以生成萊鮑迪苷V，其中葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷G以生成萊鮑迪苷V。

由萊鮑迪苷G生成萊鮑迪苷V的方法。另一方面，本公開涉及一種由萊鮑迪苷G合成萊鮑迪苷V的方法。該方法包括制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含萊鮑迪苷G；選自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)和尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)的底物；選自EUGT11、UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶-蔗糖合成酶(SUS)融合酶的尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶(UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶)；有或無蔗糖合成酶(SUS)以及溫育所述反應(yīng)混合物足夠時(shí)間以生成萊鮑迪苷V，其中葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷G以生成萊鮑迪苷V。

由萊鮑迪苷KA生成萊鮑迪苷V的方法。

另一方面，本公開涉及一種由萊鮑迪苷KA合成萊鮑迪苷V的方法。該方法包括制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含萊鮑迪苷KA；選自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)和尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)的底物；選自UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶(UGT76G1)和UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶-蔗糖合成酶融合酶的尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶(UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶)；有或無蔗糖合成酶(SUS)以及溫育所述反應(yīng)混合物足夠時(shí)間以生成萊鮑迪苷V，其中葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷KA以生成萊鮑迪苷V。

由甜茶苷生成萊鮑迪苷V的方法。另一方面，本公開涉及一種由甜茶苷合成萊鮑迪苷V的方法。該方法包括制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含甜茶苷；選自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)和尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)的底物；選自UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶(UGT76G1)、HV1和UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶-蔗糖合成酶融合酶的尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶(UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶)；有或無蔗糖合成酶(SUS)以及溫育所述反應(yīng)混合物足夠時(shí)間以生成萊鮑迪苷V，其中葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至甜茶苷以生成萊鮑迪苷KA。連續(xù)地，葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷KA以生成萊鮑迪苷V。

由甜茶苷生成萊鮑迪苷V的方法。另一方面，本公開涉及一種由甜茶苷合成萊鮑迪苷A和萊鮑迪苷V的混合物的方法。該方法包括制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含甜茶苷；選自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)和尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)的底物；選自UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶(UGT76G1)、EUGT11和UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶-蔗糖合成酶融合酶的尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶(UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶)；有或無蔗糖合成酶(SUS)；以及溫育所述反應(yīng)混合物足夠時(shí)間以生成萊鮑迪苷V，其中葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至甜茶苷以生成萊鮑迪苷KA并且葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷KA以生成萊鮑迪苷V。葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至甜茶苷以生成萊鮑迪苷G。連續(xù)地，葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷G以生成萊鮑迪苷V。

由萊鮑迪苷V生成萊鮑迪苷W的方法。另一方面，本公開涉及一種由萊鮑迪苷V合成萊鮑迪苷W的方法。該方法包括制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含萊鮑迪苷V；選自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)和尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)的底物；選自UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶(UGT76G1)和UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶-蔗糖合成酶融合酶的尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶(UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶)；有或無蔗糖合成酶(SUS)以及溫育所述反應(yīng)混合物足夠時(shí)間以生成萊鮑迪苷W，其中葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷V以生成萊鮑迪苷W。

由萊鮑迪苷G生成萊鮑迪苷W的方法。另一方面，本公開涉及一種由萊鮑迪苷G合成萊鮑迪苷W的方法。該方法包括制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含萊鮑迪苷G；選自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)和尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)的底物；選自尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶(UGT76G1)、UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶-蔗糖合成酶融合酶和HV1的尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶(UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶)；有或無蔗糖合成酶(SUS)；以及溫育所述反應(yīng)混合物足夠時(shí)間以生成萊鮑迪苷W，其中葡萄糖通過HV1共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷G以生成萊鮑迪苷V。連續(xù)地，葡萄糖通過UGT76G1共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷V以生成萊鮑迪苷W。

由萊鮑迪苷G生成萊鮑迪苷W的方法。另一方面，本公開涉及一種由萊鮑迪苷G合成萊鮑迪苷W的方法。該方法包括制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含萊鮑迪苷G；選自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)和尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)的底物；選自UGT76G1、EUGT11和UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶-蔗糖合成酶融合酶的尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶(UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶)；以及溫育所述反應(yīng)混合物足夠時(shí)間以生成萊鮑迪苷W，其中葡萄糖通過EUGT11共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷G以生成萊鮑迪苷V。連續(xù)地，葡萄糖通過UGT76G1共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷V以生成萊鮑迪苷W。

由萊鮑迪苷KA生成萊鮑迪苷W的方法。另一方面，本公開涉及一種由萊鮑迪苷KA合成萊鮑迪苷W的方法。該方法包括制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含萊鮑迪苷KA；選自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)和尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)的底物；選自尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶(UGT76G1)和UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶-蔗糖合成酶融合酶的尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶(UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶)；有或無蔗糖合成酶；以及溫育所述反應(yīng)混合物足夠時(shí)間以生成萊鮑迪苷W，其中葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷KA以生成萊鮑迪苷V。連續(xù)地，葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷V以生成萊鮑迪苷W。

由甜茶苷生成萊鮑迪苷W的方法。另一方面，本公開涉及一種由甜茶苷合成萊鮑迪苷W的方法。該方法包括制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含甜茶苷；選自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)和尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)的底物；選自UGT76G1、HV1和UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶-蔗糖合成酶融合酶的尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶；有或無蔗糖合成酶；以及溫育所述反應(yīng)混合物足夠時(shí)間以生成萊鮑迪苷W的混合物。

由甜茶苷生成萊鮑迪苷W的方法。另一方面，本公開涉及一種由甜茶苷合成萊鮑迪苷W的方法。該方法包括制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含甜茶苷；選自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)和尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)的底物；選自UGT76G1、EUGT11和UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶-蔗糖合成酶融合酶的尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶；有或無蔗糖合成酶；以及溫育所述反應(yīng)混合物足夠時(shí)間以生成萊鮑迪苷W。

由甜茶苷生成甜菊苷和萊鮑迪苷KA的混合物的方法。另一方面，本公開涉及一種由甜茶苷合成甜菊苷和萊鮑迪苷KA的混合物的方法。該方法包括制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含甜茶苷；選自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)和尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)的底物；選自EUGT11和UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶-蔗糖合成酶融合酶的UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶；有或無蔗糖合成酶；以及溫育所述反應(yīng)混合物足夠時(shí)間以生成甜菊苷和萊鮑迪苷KA的混合物，其中葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至甜茶苷的C2’-19-O-葡萄糖以生成萊鮑迪苷KA；其中葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至甜茶苷的C2’-13-O-葡萄糖以生成甜菊苷。

由甜茶苷生成萊鮑迪苷KA的方法。另一方面，本公開涉及一種由甜茶苷合成萊鮑迪苷KA的方法。該方法包括制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含甜茶苷；選自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)和尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)的底物；和HV1UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶；有或無蔗糖合成酶；以及溫育所述反應(yīng)混合物足夠時(shí)間以生成萊鮑迪苷KA，其中葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至甜茶苷的C2’-19-O-葡萄糖以生成萊鮑迪苷KA。

由甜茶苷生成萊鮑迪苷G的方法。另一方面，本公開涉及一種由甜茶苷合成萊鮑迪苷G的方法。該方法包括制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含甜茶苷；選自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)和尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)的底物；選自UGT76G1和UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶-蔗糖合成酶融合酶的UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶；有或無蔗糖合成酶；以及溫育所述反應(yīng)混合物足夠時(shí)間以生成萊鮑迪苷G，其中葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至甜茶苷的C3’-13-O-葡萄糖以生成萊鮑迪苷G。

由萊鮑迪苷KA生成萊鮑迪苷E的方法。另一方面，本公開涉及一種由萊鮑迪苷KA合成萊鮑迪苷E的方法。該方法包括制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含萊鮑迪苷KA；選自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)和尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)的底物；和HV1UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶；有或無蔗糖合成酶；以及溫育所述反應(yīng)混合物足夠時(shí)間以生成萊鮑迪苷E，其中葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷KA的C2’13-O-葡萄糖以生成萊鮑迪苷E。

由萊鮑迪苷KA生成萊鮑迪苷E的方法。另一方面，本公開涉及一種由萊鮑迪苷KA合成萊鮑迪苷E的方法。該方法包括制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含萊鮑迪苷KA；選自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)和尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)的底物；選自EUGT11和UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶-蔗糖合成酶融合酶的UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶；有或無蔗糖合成酶；以及溫育所述反應(yīng)混合物足夠時(shí)間以生成萊鮑迪苷E，其中葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷KA的C2’13-O-葡萄糖以生成萊鮑迪苷E。

由甜茶苷生成萊鮑迪苷E的方法。另一方面，本公開涉及一種由甜茶苷合成萊鮑迪苷E的方法。該方法包括制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含甜茶苷；選自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)和尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)的底物；和選自EUGT11和UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶-蔗糖合成融合酶的UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶；有或無蔗糖合成酶；以及溫育所述反應(yīng)混合物足夠時(shí)間以生成萊鮑迪苷E，其中葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至甜茶苷以生成萊鮑迪苷KA和甜菊苷的混合物。連續(xù)地，葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷KA和甜菊苷以生成萊鮑迪苷E。

由甜茶苷生成萊鮑迪苷E的方法。另一方面，本公開涉及一種由甜茶苷合成萊鮑迪苷E的方法。該方法包括制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含甜茶苷；選自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)和尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)的底物；和HV1UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶；有或無蔗糖合成酶；溫育所述反應(yīng)混合物足夠時(shí)間以生成萊鮑迪苷E，其中葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至甜茶苷以生成萊鮑迪苷KA；并且與HV1一起進(jìn)一步溫育萊鮑迪苷KA以生成萊鮑迪苷E。

由甜茶苷生成萊鮑迪苷D2的方法。另一方面，本公開涉及一種由甜茶苷合成萊鮑迪苷D2的方法。該方法包括制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含甜茶苷；選自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)和尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)的底物；選自EUGT11和UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶-蔗糖合成融合酶的UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶；有或無蔗糖合成酶；溫育所述反應(yīng)混合物足夠時(shí)間以生成萊鮑迪苷D2，其中葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至甜茶苷以生成甜菊苷和萊鮑迪苷KA的混合物；與EUGT11一起進(jìn)一步溫育甜菊苷和萊鮑迪苷KA的混合物以生成萊鮑迪苷E，其中葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至甜菊苷和萊鮑迪苷KA以生成萊鮑迪苷E；并且與EUGT11一起進(jìn)一步溫育萊鮑迪苷E以生成萊鮑迪苷D2，其中葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷E以生成萊鮑迪苷D2。

由萊鮑迪苷KA生成萊鮑迪苷D2的方法。另一方面，本公開涉及一種由萊鮑迪苷KA合成萊鮑迪苷D2的方法。該方法包括制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含萊鮑迪苷KA，選自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)和尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)的底物，選自EUGT11和UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶-蔗糖合成酶融合酶的UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶，有或無蔗糖合成酶；溫育所述反應(yīng)混合物足夠時(shí)間以生成萊鮑迪苷D2，其中葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷KA以生成萊鮑迪苷E；并且進(jìn)一步溫育萊鮑迪苷E與EUGT11的混合物以生成萊鮑迪苷D2，其中葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷E以生成萊鮑迪苷D2。

由萊鮑迪苷E生成萊鮑迪苷Z的方法。另一方面，本公開涉及一種由萊鮑迪苷E合成萊鮑迪苷Z的方法。該方法包括制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含萊鮑迪苷E；選自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)和尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)的底物；和HV1UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶；及蔗糖合成酶；溫育所述反應(yīng)混合物足夠時(shí)間以生成萊鮑迪苷Z，其中葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷E以生成萊鮑迪苷Z，其中葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷E的C2’-13-O-葡萄糖以生成萊鮑迪苷Z1。葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷E的C2’-19-O-葡萄糖以生成萊鮑迪苷Z2。

由萊鮑迪苷D生成萊鮑迪苷M的方法。另一方面，本公開涉及一種由萊鮑迪苷D合成萊鮑迪苷M的方法。該方法包括制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含萊鮑迪苷D，選自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)、尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)及其組合的底物，及選自UGT76G1、UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶-蔗糖合成酶融合酶及其組合的UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶，有或無蔗糖合成酶；以及溫育所述反應(yīng)混合物足夠時(shí)間以生成萊鮑迪苷M，其中葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷D以生成萊鮑迪苷M。

由甜菊苷生成萊鮑迪苷D和萊鮑迪苷M的方法。另一方面，本公開涉及一種由甜菊苷合成萊鮑迪苷D和萊鮑迪苷M的方法。該方法包括制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含甜菊苷，選自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)、尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)及其組合的底物，及選自HV1、UGT76G1、UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶-蔗糖合成酶融合酶及其組合的UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶，有或無蔗糖合成酶；以及溫育所述反應(yīng)混合物足夠時(shí)間以生成萊鮑迪苷D和/或萊鮑迪苷M。例如，在實(shí)施方案中，可溫育所述反應(yīng)混合物足夠時(shí)間以生成萊鮑迪苷D，并進(jìn)一步溫育包含萊鮑迪苷D的反應(yīng)混合物(例如，與UGT76G1和/或融合酶一起)以生成萊鮑迪苷M。在某些實(shí)施方案中，反應(yīng)混合物將包含HV1和UGT76G1。在其它實(shí)施方案中，反應(yīng)混合物將包含HV1和融合酶。

在某些實(shí)施方案中，葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至甜菊苷以生成萊鮑迪苷A和/或萊鮑迪苷E。例如，葡萄糖可通過UGT76G1或融合酶共價(jià)偶聯(lián)至甜菊苷以生成萊鮑迪苷A和/或葡萄糖可通過HV1共價(jià)偶聯(lián)至甜菊苷以生成萊鮑迪苷E。連續(xù)地，葡萄糖可通過HV1共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷A以生成萊鮑迪苷D和/或葡萄糖可通過UGT76G1或融合酶共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷E以生成萊鮑迪苷D。葡萄糖可進(jìn)一步通過UGT76G1或融合酶共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷D以生成萊鮑迪苷M。

由萊鮑迪苷A生成萊鮑迪苷D和萊鮑迪苷M的方法。另一方面，本公開涉及一種由萊鮑迪苷A合成萊鮑迪苷D和萊鮑迪苷M的方法。該方法包括制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含萊鮑迪苷A，選自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)、尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)及其組合的底物，及選自HV1、UGT76G1、UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶-蔗糖合成酶融合酶及其組合的UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶，有或無蔗糖合成酶；以及溫育所述反應(yīng)混合物足夠時(shí)間以生成萊鮑迪苷D和/或萊鮑迪苷M。例如，在實(shí)施方案中，可溫育反應(yīng)混合物(例如，包含HV1)足夠時(shí)間以生成萊鮑迪苷D，并進(jìn)一步溫育包含萊鮑迪苷D的反應(yīng)混合物(例如，與UGT76G1和/或融合酶一起)以生成萊鮑迪苷M。在某些實(shí)施方案中，反應(yīng)混合物將包含HV1和UGT76G1。在其它實(shí)施方案中，反應(yīng)混合物將包含HV1和融合酶。

葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷A以生成萊鮑迪苷D。例如，葡萄糖可通過HV1共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷A以生成萊鮑迪苷D。連續(xù)地，葡萄糖可通過UGT76G1或融合酶共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷D以生成萊鮑迪苷M。

由萊鮑迪苷E生成萊鮑迪苷D和萊鮑迪苷M的方法。另一方面，本公開涉及一種由萊鮑迪苷E合成萊鮑迪苷D和萊鮑迪苷M的方法。該方法包括制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含萊鮑迪苷E，選自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)、尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)及其組合的底物，及選自UGT76G1、UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶-蔗糖合成酶融合酶及其組合的UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶，有或無蔗糖合成酶；以及溫育所述反應(yīng)混合物足夠時(shí)間以生成萊鮑迪苷D和/或萊鮑迪苷M。例如，在實(shí)施方案中，可溫育所述反應(yīng)混合物(例如，包含UGT76G1和/或融合酶)足夠時(shí)間以生成萊鮑迪苷D，并進(jìn)一步溫育包含萊鮑迪苷D的反應(yīng)混合物以生成萊鮑迪苷M。

葡萄糖共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷E以生成萊鮑迪苷D。例如，葡萄糖可通過UGT76G1或融合酶共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷E以生成萊鮑迪苷D。連續(xù)地，葡萄糖可通過UGT76G1或融合酶共價(jià)偶聯(lián)至萊鮑迪苷D以生成萊鮑迪苷M。

大多數(shù)甜菊醇糖苷是使用尿苷5’-二磷酸葡萄糖(UDP-葡萄糖)作為糖部分的供體，通過通常由UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶(UGT)催化的甜菊醇的幾個(gè)糖基化反應(yīng)形成的。在植物中，UGT是酶的非常不同的類，其將葡萄糖殘基從UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)移到甜菊醇。

尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶(UGT76G1)是具有生成有關(guān)糖苷(萊鮑迪苷A和D)的1,3-13-O-葡萄糖糖基化活性的UGT。令人驚訝且出乎意料的是，發(fā)現(xiàn)UGT76G1也具有由甜茶苷生成萊鮑迪苷G及由萊鮑迪苷D生成萊鮑迪苷M的1,3-19-O-葡萄糖糖基化活性。UGT76G1可以將萊鮑迪苷KA轉(zhuǎn)化為Reb V并繼續(xù)形成Reb W。特別合適的UGT76G1具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

EUGT11(在WO 2013022989中有描述)是具有1,2-19-O-葡萄糖和1,2-13-O-葡萄糖糖基化活性的UGT。已知EUGT11會(huì)催化甜菊苷生成萊鮑迪苷E和萊鮑迪苷A生成萊鮑迪苷D。令人驚訝且出乎意料的是，發(fā)現(xiàn)EUGT11可在體外用于通過新的酶活性(β1,6-13-O-葡萄糖糖基化活性)由萊鮑迪苷E合成萊鮑迪苷D2(轉(zhuǎn)讓給Conagen,Inc.的美國專利申請(qǐng)序列號(hào)14/269,435)。EUGT11具有由甜茶苷生成萊鮑迪苷KA的1,2-19-O-葡萄糖糖基化活性。特別合適的EUGT11具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列。

HV1是具有生成有關(guān)甜菊醇糖苷(萊鮑迪苷E、D和Z)的1,2-19-O-葡萄糖糖基化活性的UGT。令人驚訝且出乎意料的是，發(fā)現(xiàn)HV1也具有由甜茶苷生成萊鮑迪苷KA的1,2-19-O-葡萄糖糖基化活性。HV1也可以將Reb G轉(zhuǎn)化為Reb V和將Reb KA轉(zhuǎn)化為Reb E。特別合適的HV1具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列。

所述方法還可包括向含有尿苷二磷酸(UDP)糖基轉(zhuǎn)移酶的反應(yīng)混合物中添加蔗糖合成酶。蔗糖合成酶催化NDP-葡萄糖和D-果糖之間的化學(xué)反應(yīng)以生成NDP和蔗糖。蔗糖合成酶為糖基轉(zhuǎn)移酶。這種酶類的系統(tǒng)名稱為NDP-葡萄糖:D-果糖2-α-D-葡糖基轉(zhuǎn)移酶。常用的其它名稱包括UDP葡萄糖-果糖葡糖基轉(zhuǎn)移酶、蔗糖合成酶、蔗糖-UDP葡糖基轉(zhuǎn)移酶、蔗糖-尿苷二磷酸葡糖基轉(zhuǎn)移酶和尿苷二磷酸葡萄糖-果糖葡糖基轉(zhuǎn)移酶。向包括尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶的反應(yīng)混合物中添加蔗糖合成酶產(chǎn)生“UGT-SUS偶聯(lián)體系”。在UGT-SUS偶聯(lián)體系中，可由UDP和蔗糖再生UDP-葡萄糖，這允許省略向反應(yīng)混合物中添加額外的UDP-葡萄糖或在反應(yīng)混合物中使用UDP。合適的蔗糖合成酶可以是例如，擬南芥(Arabidopsis)蔗糖合成酶1；擬南芥蔗糖合成酶3；和綠豆(Vigna radiate)蔗糖合成酶。特別合適的蔗糖合成酶可以是，例如，擬南芥蔗糖合成酶1。特別合適的擬南芥蔗糖合成酶1是具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)蔗糖合成酶1(AtSUS1)。

另一方面，尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶融合酶可用于所述方法中。特別合適的尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶融合酶可以是UGT-SUS1融合酶。UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶可以是包括偶聯(lián)至蔗糖合成酶結(jié)構(gòu)域的尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域的UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶融合酶。具體而言，UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶融合酶包括偶聯(lián)至蔗糖合成酶結(jié)構(gòu)域的尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域。另外，UGT-SUS1融合酶具有蔗糖合成酶活性，并且因此，可以由UDP和蔗糖再生UDP-葡萄糖。特別合適的UGT-SUS1融合酶可以是，例如，具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的UGT76G1-AtSUS1融合酶(命名為：“GS”)。另一種特別合適的UGT-SUS1融合酶可以是，例如，具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的EUGT11-SUS1融合酶(命名為：“EUS”)。

合適的蔗糖合成酶結(jié)構(gòu)域可以是例如，擬南芥蔗糖合成酶1；擬南芥蔗糖合成酶3；和綠豆蔗糖合成酶。特別合適的蔗糖合成酶結(jié)構(gòu)域可以是，例如，擬南芥蔗糖合成酶1。特別合適的擬南芥蔗糖合成酶1是具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的阿拉伯芥蔗糖合成酶1(AtSUS1)。

UGT76G1-AtSUS1(“GS”)融合酶可具有與SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％和甚至100％相同的多肽序列。適當(dāng)?shù)?，UGT-AtSUS1融合酶的氨基酸序列與SEQ ID NO:9具有至少80％同一性。更適當(dāng)?shù)?，UGT-AtSUS1融合酶的氨基酸序列與SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％和甚至100％的氨基酸序列同一性。

分離的核酸可包括編碼UGT-AtSUS1融合酶的多肽的核苷酸序列，所述分離的核酸具有與SEQ ID NO:10中列出的核酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％和甚至100％序列同源性的核酸序列。適當(dāng)?shù)?，分離的核酸包括編碼UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶融合酶的多肽的核苷酸序列，所述UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶融合酶具有與SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。更適當(dāng)?shù)?，分離的核酸包括編碼UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶融合酶的多肽的核苷酸序列，所述UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶融合酶具有與SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％和甚至100％序列同一性的氨基酸序列。分離的核酸因此包括編碼SEQ ID NO:10的功能片段、SEQ ID NO:9的功能變體或與SEQ ID NO:9具有(例如)至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％和甚至100％序列同一性的其它同源多肽的那些核苷酸序列。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，編碼UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸序列可以經(jīng)密碼子優(yōu)化以在合適的宿主生物體，例如細(xì)菌和酵母中表達(dá)。

EUGT11-SUS1(“EUS”)融合酶可具有與SEQ ID NO:11中列出的氨基酸序列至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％和甚至100％相同的多肽序列。適當(dāng)?shù)兀珽UGT11-SUS1融合酶的氨基酸序列與SEQ ID NO:11具有至少80％同一性。更適當(dāng)?shù)兀珽UGT11-SUS1融合酶的氨基酸序列與SEQ ID NO:11中列出的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％和甚至100％的氨基酸序列同一性。

分離的核酸可包括編碼EUGT11-SUS1融合酶的多肽的核苷酸序列，所述分離的核酸具有與SEQ ID NO:12中列出的核酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％和甚至100％序列同源性的核酸序列。適當(dāng)?shù)?，分離的核酸包括編碼具有的氨基酸序列與SEQ ID NO:11中列出的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的EUGT11-SUS1融合酶的多肽的核苷酸序列。更適當(dāng)?shù)?，分離的核酸包括編碼EUGT11-SUS1融合酶的多肽的核苷酸序列，所述EUGT11-SUS1融合酶具有與SEQ ID NO:11中列出的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％和甚至100％序列同一性的氨基酸序列。分離的核酸因此包括編碼SEQ ID NO:11的功能片段、SEQ ID NO:11的功能變體或與SEQ ID NO:11具有(例如)至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％和甚至100％序列同一性的其它同源多肽的那些核苷酸序列。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，編碼EUGT11-SUS1的核酸序列可以經(jīng)密碼子優(yōu)化以在合適的宿主生物體，例如細(xì)菌和酵母中表達(dá)。

可口服消耗產(chǎn)品

另一方面，本公開涉及一種選自飲料產(chǎn)品和可消耗產(chǎn)品，具有增甜量的萊鮑迪苷V的可口服消耗產(chǎn)品。另一方面，本公開涉及一種選自飲料產(chǎn)品和可消耗產(chǎn)品，具有增甜量的萊鮑迪苷W的可口服消耗產(chǎn)品。另一方面，本公開涉及一種選自飲料產(chǎn)品和可消耗產(chǎn)品，具有增甜量的萊鮑迪苷KA的可口服消耗產(chǎn)品。另一方面，本公開涉及一種選自飲料產(chǎn)品和可消耗產(chǎn)品，具有增甜量的萊鮑迪苷G的可口服消耗產(chǎn)品。另一方面，本公開涉及一種選自飲料產(chǎn)品和可消耗產(chǎn)品，具有增甜量的萊鮑迪苷M的可口服消耗產(chǎn)品。

可口服消耗產(chǎn)品可具有相當(dāng)于約1％(w/v-％)至約4％(w/v-％)蔗糖溶液的甜味強(qiáng)度。

可口服消耗產(chǎn)品可具有約5ppm至約100ppm萊鮑迪苷V?？煽诜漠a(chǎn)品可具有約5ppm至約100ppm萊鮑迪苷W?？煽诜漠a(chǎn)品可具有約5ppm至約100ppm萊鮑迪苷KA。可口服消耗產(chǎn)品可具有約5ppm至約100ppm萊鮑迪苷G?？煽诜漠a(chǎn)品可具有約5ppm至約100ppm萊鮑迪苷M。

萊鮑迪苷V可以是可口服消耗產(chǎn)品中唯一的甜味劑。萊鮑迪苷W可以是可口服消耗產(chǎn)品中唯一的甜味劑。萊鮑迪苷KA可以是可口服消耗產(chǎn)品中唯一的甜味劑。萊鮑迪苷G可以是可口服消耗產(chǎn)品中唯一的甜味劑。萊鮑迪苷M可以是可口服消耗產(chǎn)品中唯一的甜味劑。

可口服消耗產(chǎn)品也可具有至少一種附加甜味劑。所述至少一種附加甜味劑可為例如，天然高強(qiáng)度甜味劑。附加甜味劑可選自甜葉菊提取物、甜菊醇糖苷、甜菊苷、萊鮑迪苷A、萊鮑迪苷B、萊鮑迪苷C、萊鮑迪苷D、萊鮑迪苷D2、萊鮑迪苷E、萊鮑迪苷F、杜爾可苷A、甜茶苷、甜菊醇二糖苷、蔗糖、高果糖玉米糖漿、果糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、赤蘚糖醇、木糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、AceK、阿斯巴甜、紐甜、三氯蔗糖、糖精、柚皮苷二氫查耳酮(NarDHC)、新橙皮苷二氫查耳酮(NDHC)、甜茶苷、羅漢果苷IV、賽門苷I、羅漢果苷V、莫那甜、索馬甜、莫奈林、布拉奇因、L-丙氨酸、甘氨酸、羅漢果、赫南德辛、葉甜素、三葉苷及其組合。

可口服消耗產(chǎn)品也可具有至少一種添加劑。添加劑可為，例如，碳水化合物、多元醇、氨基酸或其鹽、聚氨基酸或其鹽、糖酸或其鹽、核苷酸、有機(jī)酸、無機(jī)酸、有機(jī)鹽、有機(jī)酸式鹽、有機(jī)堿式鹽、無機(jī)鹽、苦味化合物、食用香料、調(diào)味成分、澀味化合物、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)水解物、表面活性劑、乳化劑、類黃酮、醇、聚合物及其組合。

一方面，本公開涉及一種包含增甜量的萊鮑迪苷V的飲料產(chǎn)品。一方面，本公開涉及一種包含增甜量的萊鮑迪苷W的飲料產(chǎn)品。一方面，本公開涉及一種包含增甜量的萊鮑迪苷KA的飲料產(chǎn)品。一方面，本公開涉及一種包含增甜量的萊鮑迪苷G的飲料產(chǎn)品。一方面，本公開涉及一種包含增甜量的萊鮑迪苷M的飲料產(chǎn)品。

飲料產(chǎn)品可以是，例如，碳酸飲料產(chǎn)品和非碳酸飲料產(chǎn)品。飲料產(chǎn)品也可以是，例如，軟飲料、泉水飲料、冷凍飲料；即飲飲料；冷凍即飲飲料、咖啡、茶、乳品飲料、粉狀軟飲料、液體濃縮物、調(diào)味水、強(qiáng)化水、果汁、果汁味飲料、運(yùn)動(dòng)飲料和能量飲料。

在一些實(shí)施方案中，本公開的飲料產(chǎn)品可以包括一種或多種飲料成分(例如，酸化劑、果汁和/或蔬菜汁、果肉等)、調(diào)味劑、著色劑、防腐劑、維生素、礦物質(zhì)、電解質(zhì)、赤蘚糖醇、塔格糖、甘油和二氧化碳。此類飲料產(chǎn)品可呈任何合適的形式提供，如飲料濃縮物和碳酸、即飲飲料。

在某些實(shí)施方案中，本公開的飲料產(chǎn)品可以具有許多不同的特定配方或組成中的任一種。本公開的飲料產(chǎn)品的配方可以在某種程度上根據(jù)諸如產(chǎn)品的預(yù)期細(xì)分市場、其所需營養(yǎng)特性、風(fēng)味特性等因素改變。例如，在某些實(shí)施方案中，向特定飲料產(chǎn)品的配方中添加另外的成分通?？梢允且环N選擇。例如，可向任何此類配方中添加附加(即，更多和/或其它)甜味劑，通?？商砑诱{(diào)味劑、電解質(zhì)、維生素、果汁或其它水果產(chǎn)品、促味劑、掩蔽劑等、增味劑和/或碳酸化劑，以改變味道、口感、營養(yǎng)特性等。在實(shí)施方案中，飲料產(chǎn)品可以是含有水、約5ppm至約100ppm萊鮑迪苷V、酸化劑和調(diào)味劑的可樂飲料。在實(shí)施方案中，飲料產(chǎn)品可以是含有水、約5ppm至約100ppm萊鮑迪苷W、酸化劑和調(diào)味劑的可樂飲料。在實(shí)施方案中，飲料產(chǎn)品可以是含有水、約5ppm至約100ppm萊鮑迪苷M、酸化劑和調(diào)味劑的可樂飲料。示例性調(diào)味劑可以是，例如，可樂調(diào)味劑、柑橘調(diào)味劑和香料調(diào)味劑。在一些實(shí)施方案中，可添加呈二氧化碳形式的碳酸化劑用于起泡。在其它實(shí)施方案中，根據(jù)其它成分、生產(chǎn)技術(shù)、所需保質(zhì)期等，可添加防腐劑。在某些實(shí)施方案中，可添加咖啡因。在一些實(shí)施方案中，飲料產(chǎn)品可以是可樂味碳酸飲料，典型地含有蘇打水、甜味劑、可樂果提取物和/或其它調(diào)味劑、焦糖色素、一種或多種酸和任選的其它成分。

飲料產(chǎn)品中存在的萊鮑迪苷V、萊鮑迪苷W、萊鮑迪苷KA、萊鮑迪苷M或萊鮑迪苷G的合適量可以為，例如，約5ppm至約100ppm。在一些實(shí)施方案中，低濃度的萊鮑迪苷V、萊鮑迪苷W、萊鮑迪苷KA、萊鮑迪苷M或萊鮑迪苷G，例如，低于100ppm，并且具有相當(dāng)于濃度介于10,000ppm至30,000ppm之間的蔗糖溶液的甜度。最終濃度范圍為約5ppm至約100ppm、約5ppm至約95ppm、約5ppm至約90ppm、約5ppm至約85ppm、約5ppm至約80ppm、約5ppm至約75ppm、約5ppm至約70ppm、約5ppm至約65ppm、約5ppm至約60ppm、約5ppm至約55ppm、約5ppm至約50ppm、約5ppm至約45ppm、約5ppm至約40ppm、約5ppm至約35ppm、約5ppm至約30ppm、約5ppm至約25ppm、約5ppm至約20ppm、約5ppm至約15ppm或約5ppm至約10ppm?？蛇x地，萊鮑迪苷V或萊鮑迪苷W可以按以下范圍的最終濃度存在于本公開的飲料產(chǎn)品中：約5ppm至約100ppm、約10ppm至約100ppm、約15ppm至約100ppm、約20ppm至約100ppm、約25ppm至約100ppm、約30ppm至約100ppm、約35ppm至約100ppm、約40ppm至約100ppm、約45ppm至約100ppm、約50ppm至約100ppm、約55ppm至約100ppm、約60ppm至約100ppm、約65ppm至約100ppm、約70ppm至約100ppm、約75ppm至約100ppm、約80ppm至約100ppm、約85ppm至約100ppm、約90ppm至約100ppm或約95ppm至約100ppm。

另一方面，本公開涉及一種包含增甜量的萊鮑迪苷V的消耗品。另一方面，本公開涉及一種包含增甜量的萊鮑迪苷W的消耗品。另一方面，本公開涉及一種包含增甜量的萊鮑迪苷KA的消耗品。另一方面，本公開涉及一種包含增甜量的萊鮑迪苷G的消耗品。另一方面，本公開涉及一種包含增甜量的萊鮑迪苷M的消耗品。該消耗品可以是，例如，食物產(chǎn)品、營養(yǎng)制劑、藥劑、膳食補(bǔ)充劑、口腔衛(wèi)生組合物、可食用的凝膠組合物、美容產(chǎn)物和桌面調(diào)味劑。

如本文中所用，“膳食補(bǔ)充劑”是指意在補(bǔ)充膳食和提供營養(yǎng)素(如維生素、礦物質(zhì)、纖維、脂肪酸、氨基酸等)的化合物，所述化合物在膳食中可能缺失或不被大量消耗?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的任何合適的膳食補(bǔ)充劑。合適的膳食補(bǔ)充劑的實(shí)例可以是，例如，營養(yǎng)素、維生素、礦物質(zhì)、纖維、脂肪酸、藥草、植物性藥材、氨基酸和代謝物。

如本文中所用，“營養(yǎng)制劑”是指如下化合物，其包括可提供藥用或健康益處的任何食物或食物部分，所述益處包括預(yù)防和/或治療疾病或病癥(例如，疲勞、失眠、老化作用、健忘、情緒障礙、心血管疾病和血液中的高膽固醇水平、糖尿病、骨質(zhì)疏松癥、炎癥、自身免疫性病癥等)?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的任何合適的營養(yǎng)制劑。在一些實(shí)施方案中，營養(yǎng)制劑可用作食品和飲料的補(bǔ)充劑及用作腸內(nèi)或腸胃外應(yīng)用的藥物制劑，其可以是固體制劑，如膠囊或片劑，或液體制劑，如溶液或混懸液。

在一些實(shí)施方案中，膳食補(bǔ)充劑和營養(yǎng)制劑可進(jìn)一步含有保護(hù)性水膠體(如樹膠、蛋白質(zhì)、改性淀粉)、粘合劑、成膜劑、封裝劑/材料、壁/殼材料、基質(zhì)化合物、包衣、乳化劑、表面活性劑、增溶劑(油、脂肪、蠟、卵磷脂等)、吸附劑、載體、填料、共化合物、分散劑、潤濕劑、加工助劑(溶劑)、流化劑、掩味劑、增重劑、成膠劑、膠凝劑、抗氧化劑和抗菌劑。

如本文中所用，“凝膠”是指膠體體系，該體系中顆粒網(wǎng)絡(luò)橫跨液體介質(zhì)的體積。雖然凝膠主要由液體組成，并因此展現(xiàn)出類似液體的密度，但由于橫跨液體介質(zhì)的顆粒網(wǎng)絡(luò)，因而凝膠具有固體的結(jié)構(gòu)連貫性。出于這個(gè)原因，凝膠通常表現(xiàn)為固體、膠狀材料。凝膠可用于許多應(yīng)用。例如，凝膠可用于食物、涂料和粘合劑中?？墒秤玫哪z被稱為“可食用凝膠組合物”?？墒秤媚z組合物通常作為小吃、作為甜品、作為主食的一部分或與主食一起被食用。合適的可食用凝膠組合物的實(shí)例可以是，例如，凝膠甜品、布丁、果醬、果凍、漿糊、松糕、肉凍、棉花糖、橡皮糖等。在一些實(shí)施方案中，可食用凝膠混合物通常是粉狀或顆粒狀固體，可向其中添加流體以形成可食用凝膠組合物。合適的流體實(shí)例可以是，例如，水、乳品流體、乳品類似物流體、果汁、酒精、酒精飲料及其組合。合適的乳品流體的實(shí)例可以是，例如，牛奶、發(fā)酵乳、奶油、液體乳清及其混合物。合適的乳品類似物流體的實(shí)例可以是，例如，豆奶和非乳品咖啡伴侶。

如本文中所用，術(shù)語“膠凝成分”是指可以在液體介質(zhì)中形成膠體體系的任何材料。合適的膠凝成分的實(shí)例可以是，例如，明膠、藻酸鹽、鹿角菜膠、樹膠、果膠、魔芋、瓊脂、食用酸、凝乳酵素(rennet)、淀粉、淀粉衍生物及其組合。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知用于可食用凝膠混合物或可食用凝膠組合物的膠凝成分的量可根據(jù)許多因素而顯著變化，所述因素例如使用的特定膠凝成分、使用的特定液基以及所需的凝膠性質(zhì)。

本公開的凝膠混合物和凝膠組合物可通過本領(lǐng)域已知的任何合適的方法制備。在一些實(shí)施方案中，除膠凝劑外，可使用其它成分制備本公開的可食用凝膠混合物和可食用凝膠組合物。其它合適成分的實(shí)例可以是，例如，食用酸、食用酸的鹽、緩沖體系、膨脹劑、螯合劑、交聯(lián)劑、一種或多種調(diào)料、一種或多種著色劑及其組合。

本領(lǐng)域中已知的任何合適的藥物組合物均可使用。在某些實(shí)施方案中，本公開的藥物組合物可含有約5ppm至約100ppm的萊鮑迪苷V和一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑。在某些實(shí)施方案中，本公開的藥物組合物可含有約5ppm至約100ppm的萊鮑迪苷W和一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑。在某些實(shí)施方案中，本公開的藥物組合物可含有約5ppm至約100ppm的萊鮑迪苷KA和一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑。在某些實(shí)施方案中，本公開的藥物組合物可含有約5ppm至約100ppm的萊鮑迪苷G和一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑。在某些實(shí)施方案中，本公開的藥物組合物可含有約5ppm至約100ppm的萊鮑迪苷M和一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑。在一些實(shí)施方案中，本公開的藥物組合物可用于配制含有一種或多種發(fā)揮生物作用的活性劑的藥物。因此，在一些實(shí)施方案中，本公開的藥物組合物可含有一種或多種發(fā)揮生物作用的活性劑。合適的活性劑是本領(lǐng)域(例如，醫(yī)師案頭參考)中公知的。此類組合物可根據(jù)本領(lǐng)域中公知的程序制備，例如，如Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,USA中所描述那樣。

萊鮑迪苷V、萊鮑迪苷W、萊鮑迪苷KA、萊鮑迪苷M或萊鮑迪苷G可以與本領(lǐng)域中已知的任何合適的牙科和口腔衛(wèi)生組合物一起使用。合適的牙科和口腔衛(wèi)生組合物的實(shí)例可以是，例如，牙膏、牙齒拋光劑(tooth polish)、牙線、漱口水、口腔清洗劑、潔齒劑(dentrifices)、口腔噴霧、口腔清新劑、牙菌斑清洗劑、牙鎮(zhèn)痛藥等。

消耗品中存在的萊鮑迪苷V、萊鮑迪苷W、萊鮑迪苷KA、萊鮑迪苷M或萊鮑迪苷G的合適量可為，例如，約百萬分之5(ppm)至約百萬分之100(ppm)。在一些實(shí)施方案中，低濃度的萊鮑迪苷V、萊鮑迪苷W、萊鮑迪苷KA、萊鮑迪苷M或萊鮑迪苷G，例如，低于100ppm，具有相當(dāng)于濃度介于10,000ppm至30,000ppm之間的蔗糖溶液的甜度。最終濃度范圍為約5ppm至約100ppm、約5ppm至約95ppm、約5ppm至約90ppm、約5ppm至約85ppm、約5ppm至約80ppm、約5ppm至約75ppm、約5ppm至約70ppm、約5ppm至約65ppm、約5ppm至約60ppm、約5ppm至約55ppm、約5ppm至約50ppm、約5ppm至約45ppm、約5ppm至約40ppm、約5ppm至約35ppm、約5ppm至約30ppm、約5ppm至約25ppm、約5ppm至約20ppm、約5ppm至約15ppm或約5ppm至約10ppm?？蛇x地，萊鮑迪苷V或萊鮑迪苷W可按以下范圍的最終濃度存在于本公開的可消耗產(chǎn)品中：約5ppm至約100ppm、約10ppm至約100ppm、約15ppm至約100ppm、約20ppm至約100ppm、約25ppm至約100ppm、約30ppm至約100ppm、約35ppm至約100ppm、約40ppm至約100ppm、約45ppm至約100ppm、約50ppm至約100ppm、約55ppm至約100ppm、約60ppm至約100ppm、約65ppm至約100ppm、約70ppm至約100ppm、約75ppm至約100ppm、約80ppm至約100ppm、約85ppm至約100ppm、約90ppm至約100ppm或約95ppm至約100ppm。

在某些實(shí)施方案中，在食物產(chǎn)品組合物中存在約5ppm至約100ppm萊鮑迪苷V、萊鮑迪苷W、萊鮑迪苷KA、萊鮑迪苷M或萊鮑迪苷G。如本文中所用，“食物產(chǎn)品組合物”是指可以但不必具有營養(yǎng)價(jià)值且旨在用于人和動(dòng)物消耗的任何固體或液體可攝入材料。

合適的食物產(chǎn)品組合物的實(shí)例可以是，例如，糖食組合物，如糖果、薄荷、水果味硬糖、可可制品、巧克力等；調(diào)味品，如番茄醬、芥末、蛋黃醬等；口香糖；谷物組合物；烘焙物，如面包、蛋糕、餡餅、曲奇等；乳制品，例如牛奶、奶酪、奶油、冰淇淋、酸奶油、酸奶、冰凍果子露等；桌面甜味劑組合物；湯；燉菜；方便食品；肉，如火腿、培根、香腸、肉干等；明膠和明膠樣產(chǎn)品如果醬、果凍、蜜餞等；水果；蔬菜；蛋制品；糖霜；糖漿，包括糖蜜；零食；堅(jiān)果仁和堅(jiān)果制品；以及動(dòng)物飼料。

食物產(chǎn)品組合物也可以是藥草、香料和佐料、天然和合成的調(diào)料，以及增香劑，如谷氨酸一鈉。在一些實(shí)施方案中，食物產(chǎn)品組合物可以是，例如，制備的包裝產(chǎn)品，如飲食甜味劑、液體甜味劑、顆粒調(diào)味混合物、寵物食品、牲畜飼料、煙草，以及用于烘焙應(yīng)用的材料，例如用于制備面包、曲奇、蛋糕、薄煎餅、甜甜圈等的粉狀烘焙混合物。在其它實(shí)施方案中，食物產(chǎn)品組合物也可以是含有少量或不含蔗糖的減肥或低熱量食品和飲料。

在可以與任何前述實(shí)施方案組合的某些實(shí)施方案中，萊鮑迪苷V、萊鮑迪苷W、萊鮑迪苷KA、萊鮑迪苷M或萊鮑迪苷G可以是唯一的甜味劑，并且所述產(chǎn)品具有相當(dāng)于約1％至約4％(w/v-％)蔗糖溶液的甜味強(qiáng)度。在可以與任何前述實(shí)施方案組合的某些實(shí)施方案中，可消耗產(chǎn)品和飲料產(chǎn)品還可包括附加甜味劑，其中所述產(chǎn)品具有相當(dāng)于約1％至約10％(w/v-％)蔗糖溶液的甜味強(qiáng)度。在可以與任何前述實(shí)施方案組合的某些實(shí)施方案中，產(chǎn)品中的每種增甜成分均可為高強(qiáng)度甜味劑。在可以與任何前述實(shí)施方案組合的某些實(shí)施方案中，產(chǎn)品中的每種增甜成分均可為天然高強(qiáng)度甜味劑。在可以與任何前述實(shí)施方案組合的某些實(shí)施方案中，附加甜味劑含有選自以下的一種或多種甜味劑：甜葉菊提取物、甜菊醇糖苷、甜菊苷、萊鮑迪苷A、萊鮑迪苷B、萊鮑迪苷C、萊鮑迪苷D、萊鮑迪苷D2、萊鮑迪苷F、杜爾可苷A、甜茶苷、甜菊醇二糖苷、蔗糖、高果糖玉米糖漿、果糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、赤蘚糖醇、木糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、AceK、阿斯巴甜、紐甜、三氯蔗糖、糖精、柚皮苷二氫查耳酮(NarDHC)、新橙皮苷二氫查耳酮(NDHC)、甜茶苷、羅漢果苷IV、賽門苷I、羅漢果苷V、莫那甜、索馬甜、莫奈林、布拉奇因、L-丙氨酸、甘氨酸、羅漢果、赫南德辛、葉甜素、三葉苷及其組合。在可以與任何前述實(shí)施方案組合的某些實(shí)施方案中，可消耗產(chǎn)品和飲料產(chǎn)品還可包括一種或多種選自以下的添加劑：碳水化合物、多元醇、氨基酸或其鹽、聚氨基酸或其鹽、糖酸或其鹽、核苷酸、有機(jī)酸、無機(jī)酸、有機(jī)鹽、有機(jī)酸式鹽、有機(jī)堿式鹽、無機(jī)鹽、苦味化合物、食用香料、調(diào)味成分、澀味化合物、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)水解物、表面活性劑、乳化劑、類黃酮、醇、聚合物及其組合。在可以與任何前述實(shí)施方案組合的某些實(shí)施方案中，萊鮑迪苷D2在將其添加到產(chǎn)品中之前具有按重量計(jì)約50％至約100％的純度。

甜味劑

另一方面，本公開涉及一種由以下化學(xué)結(jié)構(gòu)組成的甜味劑：

另一方面，本公開涉及一種由以下化學(xué)結(jié)構(gòu)組成的甜味劑：

另一方面，本公開涉及一種由以下化學(xué)結(jié)構(gòu)組成的甜味劑：

另一方面，本公開涉及一種由以下化學(xué)結(jié)構(gòu)組成的甜味劑：

另一方面，本公開涉及一種由以下化學(xué)結(jié)構(gòu)組成的甜味劑：

在某些實(shí)施方案中，甜味劑還可包括填料、膨脹劑和抗結(jié)塊劑中的至少一種。合適的填料、膨脹劑和抗結(jié)塊劑是本領(lǐng)域中已知的。

在某些實(shí)施方案中，可按足以使可消耗產(chǎn)品和飲料產(chǎn)品變甜和/或增強(qiáng)其甜度的最終濃度包括和/或添加萊鮑迪苷V、萊鮑迪苷W、萊鮑迪苷KA、萊鮑迪苷M或萊鮑迪苷G甜味劑。萊鮑迪苷V、萊鮑迪苷W、萊鮑迪苷KA、萊鮑迪苷M或萊鮑迪苷G的“最終濃度”是指最終可消耗產(chǎn)品和飲料產(chǎn)品中(即，已經(jīng)添加了所有成分和/或化合物而生產(chǎn)可消耗產(chǎn)品和飲料產(chǎn)品后)存在的萊鮑迪苷V、萊鮑迪苷W、萊鮑迪苷KA、萊鮑迪苷M或萊鮑迪苷G的濃度。因此，在某些實(shí)施方案中，將萊鮑迪苷V、萊鮑迪苷W、萊鮑迪苷KA、萊鮑迪苷M或萊鮑迪苷G包括和/或添加到用于制備可消耗產(chǎn)品和飲料產(chǎn)品的化合物或成分中。萊鮑迪苷V、萊鮑迪苷W、萊鮑迪苷KA、萊鮑迪苷M或萊鮑迪苷G可存在于單一化合物或成分，或多種化合物和成分中。在其它實(shí)施方案中，萊鮑迪苷V、萊鮑迪苷W、萊鮑迪苷KA、萊鮑迪苷M或萊鮑迪苷G可包括和/或添加到可消耗產(chǎn)品和飲料產(chǎn)品中。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，按以下范圍的最終濃度包括和/或添加萊鮑迪苷V、萊鮑迪苷W、萊鮑迪苷KA、萊鮑迪苷M或萊鮑迪苷G：約5ppm至約100ppm、約5ppm至約95ppm、約5ppm至約90ppm、約5ppm至約85ppm、約5ppm至約80ppm、約5ppm至約75ppm、約5ppm至約70ppm、約5ppm至約65ppm、約5ppm至約60ppm、約5ppm至約55ppm、約5ppm至約50ppm、約5ppm至約45ppm、約5ppm至約40ppm、約5ppm至約35ppm、約5ppm至約30ppm、約5ppm至約25ppm、約5ppm至約20ppm、約5ppm至約15ppm或約5ppm至約10ppm。可選地，按以下范圍的最終濃度包括和/或添加萊鮑迪苷V或萊鮑迪苷W：約5ppm至約100ppm、約10ppm至約100ppm、約15ppm至約100ppm、約20ppm至約100ppm、約25ppm至約100ppm、約30ppm至約100ppm、約35ppm至約100ppm、約40ppm至約100ppm、約45ppm至約100ppm、約50ppm至約100ppm、約55ppm至約100ppm、約60ppm至約100ppm、約65ppm至約100ppm、約70ppm至約100ppm、約75ppm至約100ppm、約80ppm至約100ppm、約85ppm至約100ppm、約90ppm至約100ppm或約95ppm至約100ppm。例如，可按以下最終濃度包括和/或添加萊鮑迪苷V或萊鮑迪苷W：約5ppm、約10ppm、約15ppm、約20ppm、約25ppm、約30ppm、約35ppm、約40ppm、約45ppm、約50ppm、約55ppm、約60ppm、約65ppm、約70ppm、約75ppm、約80ppm、約85ppm、約90ppm、約95ppm或約100ppm，包括介于這些值之間的任何范圍。

在某些實(shí)施方案中，萊鮑迪苷V、萊鮑迪苷W、萊鮑迪苷KA、萊鮑迪苷M或萊鮑迪苷G是包括和/或添加到可消耗產(chǎn)品和飲料產(chǎn)品中的唯一甜味劑。在此類實(shí)施方案中，可消耗產(chǎn)品和飲料產(chǎn)品具有相當(dāng)于約1％至約4％(w/v-％)蔗糖溶液、約1％至約3％(w/v-％)蔗糖溶液或約1％至約2％(w/v-％)蔗糖溶液的甜味強(qiáng)度?？蛇x地，可消耗產(chǎn)品和飲料產(chǎn)品具有相當(dāng)于約1％至約4％(w/v-％)蔗糖溶液、約2％至約4％(w/v-％)蔗糖溶液、約3％至約4％(w/v-％)蔗糖溶液或約4％蔗糖溶液的甜味強(qiáng)度。例如，可消耗產(chǎn)品和飲料產(chǎn)品可具有相當(dāng)于約1％、約2％、約3％或約4％(w/v-％)蔗糖溶液，包括介于這些值之間的任何范圍的甜味強(qiáng)度。

本公開的可消耗產(chǎn)品和飲料產(chǎn)品可包括以足以達(dá)到所需甜味強(qiáng)度、營養(yǎng)特性、味道特性、口感或其它感官因素的比率存在的萊鮑迪苷V、萊鮑迪苷W、萊鮑迪苷KA、萊鮑迪苷M或萊鮑迪苷G和一種或多種本公開的甜味劑的混合物。

在考慮了以下非限制性實(shí)施例后本公開將得到更全面的理解。

實(shí)施例

實(shí)施例1

在該實(shí)施例中，合成了所有候選UGT基因的全長DNA片段。

特別地，密碼子優(yōu)化cDNA用于大腸桿菌(E.coli)表達(dá)(Genscript,Piscataway,NJ)。將合成的DNA克隆到細(xì)菌表達(dá)載體pETite N-His SUMO Kan Vector(Lucigen)中。對(duì)于編碼UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶融合酶(UGT76G1-AtSUS1和EUGT11-AtSUS1)的核苷酸序列而言，在介于來自阿拉伯芥(AtSUS1)的編碼尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列和編碼蔗糖合成酶1的核苷酸序列之間的框內(nèi)插入GSG-接頭(由核苷酸序列：ggttctggt編碼)。表2總結(jié)了蛋白質(zhì)和序列標(biāo)識(shí)號(hào)。

表2.序列標(biāo)識(shí)號(hào)。

將每個(gè)表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，隨后使其在37℃下在含有50μg/mL卡那霉素(kanamycin)的LB培養(yǎng)基中生長，直至達(dá)到0.8-1.0的OD₆₀₀。通過添加1mM異丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)并且使培養(yǎng)物在16℃下進(jìn)一步生長22小時(shí)。通過離心(3,000x g；10分鐘；4℃)收獲細(xì)胞。收集細(xì)胞團(tuán)塊并立即使用或儲(chǔ)存在-80℃下。

使細(xì)胞團(tuán)塊重新懸浮在裂解緩沖液(50mM磷酸鉀緩沖液(pH 7.2)、25μg/ml溶菌酶、5μg/ml DNA酶I、20mM咪唑、500mM NaCl、10％甘油和0.4％TRITON X-100)中。在4℃下通過超聲處理破壞細(xì)胞，并且通過離心(18,000x g；30分鐘)使細(xì)胞碎片澄清。將上清液加載至平衡的(平衡緩沖液：50mM磷酸鉀緩沖液(pH 7.2)、20mM咪唑、500mM NaCl、10％甘油)Ni-NTA(Qiagen)親和柱上。加載蛋白質(zhì)樣品之后，用平衡緩沖液洗滌該柱以去除未結(jié)合的污染蛋白質(zhì)。用含有250mM咪唑的平衡緩沖液洗脫His標(biāo)記的UGT重組多肽。圖2中示出了純化HV1(61.4kD)、UGT76G1(65.4kD)、AtSUS1(106.3kD)、EUGT11(62kD)、UGT76G1-SUS1(GS)(157.25kD)和EUGT11-AtSUS1(155kD)融合蛋白。

實(shí)施例2

在該實(shí)施例中，通過使用受試甜菊醇糖苷作為底物測定候選UGT重組多肽的糖基轉(zhuǎn)移酶活性。

通常，以200μl在體外反應(yīng)體系中測試重組多肽(10μg)。該反應(yīng)體系含50mM磷酸鉀緩沖液(pH 7.2)、3mM MgCl₂、1mg/ml甜菊醇糖苷底物、1mM UDP-葡萄糖。反應(yīng)在30℃下進(jìn)行并通過添加200μL 1-丁醇而終止。用200μL 1-丁醇萃取樣品三次。匯合級(jí)分經(jīng)干燥并溶于70μL 80％甲醇中以進(jìn)行高效液相色譜(HPLC)分析。使用甜茶苷(99％，Blue California,CA)、純化的Reb G(98.8％)、Reb KA(98.4％)和Reb V(80％)在體外反應(yīng)中用作底物。

UGT催化的糖基化反應(yīng)與蔗糖合成酶(如AtSUS1)催化的UDP-葡萄糖生成反應(yīng)聯(lián)合。在這種方法中，由蔗糖和UDP生成UDP-葡萄糖，使得可以省略添加額外的UDP-葡萄糖。在所述測定中，在UGT反應(yīng)體系中添加重組AtSUS1并且由UDP再生UDP-葡萄糖。合成AtSUS1序列(Bieniawska等，Plant J.2007,49:810-828)并插入細(xì)菌表達(dá)載體中。表達(dá)重組AtSUS1蛋白并通過親和色譜法純化。

使用Dionex UPLC ultimate 3000系統(tǒng)(Sunnyvale,CA)進(jìn)行HPLC分析，所述系統(tǒng)包括四元泵、溫控柱室、自動(dòng)取樣器和紫外吸光度檢測器。使用Phenomenex Luna NH₂、Luna C18或Synergi Hydro-RP與保護(hù)柱進(jìn)行甜菊醇糖苷表征。于水中或于Na₃PO₄緩沖液中的乙腈用于HPLC分析中的等度洗脫。檢測波長為210nm。

實(shí)施例3

在該實(shí)施例中，分析重組HV1多肽，在有或無AtSUS1的所有反應(yīng)條件下將糖部分轉(zhuǎn)移至甜茶苷以生成萊鮑迪苷KA(“Minor diterpene glycosides from the leaves of Stevia rebaudiana”.Journal of Natural Products(2014),77(5),1231-1235)。

如圖3所示，在有或無AtSUS1的所有反應(yīng)條件下，重組HV1多肽將糖部分轉(zhuǎn)移至甜茶苷以生成Reb KA。在UGT-SUS偶聯(lián)反應(yīng)體系(G、I)中甜茶苷被重組HV1完全轉(zhuǎn)化為Reb KA和Reb E。然而，24小時(shí)后(H)僅部分甜茶苷被未偶聯(lián)至AtSUS1的單獨(dú)的重組HV1多肽轉(zhuǎn)化為Reb KA，表明AtSUS1提高了UGT-SUS偶聯(lián)體系中的轉(zhuǎn)化效率。在HV1-AtSUS1偶聯(lián)反應(yīng)體系中，生成的Reb KA可連續(xù)地轉(zhuǎn)化為Reb E。

實(shí)施例4

在該實(shí)施例中，使用Reb E作為底物分析HV1活性。

Reb E底物(0.5mg/ml)與重組HV1多肽(20μg)和AtSUS1(20μg)一起在UGT-SUS偶聯(lián)反應(yīng)體系(200μL)中在類似于以上實(shí)施例中所用的條件下溫育。如圖4所示，由重組HV1多肽和AtSUS1的組合生成Reb Z。這些結(jié)果表明HV1可以將葡萄糖部分轉(zhuǎn)移至Reb E以形成RZ。圖4顯示可由萊鮑迪苷E(“Reb E”)，經(jīng)重組HV1多肽和重組AtSUS1催化在HV1-AtSUS1偶聯(lián)反應(yīng)體系中生成萊鮑迪苷Z(“Reb Z”)。HV1可以將葡萄糖轉(zhuǎn)移至Reb E以生成Reb Z，比率介于60:40與70:30之間的Reb Z1和Reb Z2的混合物(轉(zhuǎn)讓給Conagen Inc.的美國臨時(shí)申請(qǐng)第61/898,571號(hào))。

實(shí)施例5

在該實(shí)施例中，為確認(rèn)Reb KA轉(zhuǎn)化為Reb E，將純化Reb KA底物與重組HV1一起溫育，有或無AtSUS1。如圖5所示，在兩種反應(yīng)條件下由重組HV1多肽生成Reb E。然而，UGT-SUS偶聯(lián)反應(yīng)體系中的AtSUS1多肽可以提高反應(yīng)效率。在UGT-SUS偶聯(lián)體系(D)中所有Reb KA底物可完全轉(zhuǎn)化為Reb E。

實(shí)施例6

在該實(shí)施例中，使用甜茶苷作為底物分析EUGT11活性。

如圖6所示，在有或無AtSUS1的所有反應(yīng)條件下EUGT11均可以將糖部分轉(zhuǎn)移至甜茶苷以生成Reb KA和甜菊苷。在UGT-SUS偶聯(lián)體系中AtSUS1提高了轉(zhuǎn)化效率。在HV1-AtSUS1偶聯(lián)反應(yīng)體系中，Reb E可以被EUGT11連續(xù)轉(zhuǎn)化。EUS融合蛋白在相同反應(yīng)條件下表現(xiàn)出更高活性。在48小時(shí)所有生成的Reb KA和甜菊苷被EUS完全轉(zhuǎn)化為Reb E。Reb E可以連續(xù)轉(zhuǎn)化為Reb D2。

實(shí)施例7

在該實(shí)施例中，使用Reb KA作為底物分析EUGT11活性。

EUGT11是具有生成有關(guān)甜菊醇糖苷的1,2-19-O-葡萄糖糖基化活性的UGT(轉(zhuǎn)讓給Evolva SA的PCT公布申請(qǐng)WO2013/022989)。例如，EUGT11可以催化由甜菊苷生成Reb E的反應(yīng)。EUGT11還具有可以將葡萄糖分子轉(zhuǎn)移至萊鮑迪苷E以形成萊鮑迪苷D2的1,6-13-O-葡萄糖糖基化活性(轉(zhuǎn)讓給Conagen,Inc.的美國專利申請(qǐng)序列號(hào)14/269,435)。在實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)EUGT11可以將葡萄糖殘基轉(zhuǎn)移至Reb KA以形成Reb E。如圖7所示，在有AtSUS1(E、H)或無AtSUS1(D、G)的所有反應(yīng)條件下，EUGT11可以將糖部分轉(zhuǎn)移至Reb KA以生成Reb E。AtSUS1提高了UGT-SUS偶聯(lián)體系(E、H)中的轉(zhuǎn)化效率。在EUGT11-AtSUS1偶聯(lián)反應(yīng)體系(E、H)和EUS融合反應(yīng)體系(F、I)中，所有Reb KA完全轉(zhuǎn)化并且生成的Reb E可以連續(xù)轉(zhuǎn)化為Reb D2。

實(shí)施例8

在該實(shí)施例中，使用甜茶苷作為底物分析UGT76G1活性。

UGT76G1具有可以將葡萄糖分子轉(zhuǎn)移至甜菊苷以形成萊鮑迪苷A和轉(zhuǎn)移至Reb E以形成萊鮑迪苷D的1,3-13-O-葡萄糖糖基化活性。在該實(shí)施例中，我們發(fā)現(xiàn)UGT76G1可以將葡萄糖殘基轉(zhuǎn)移至甜茶苷以形成萊鮑迪苷G。

如圖8所示，在有AtSUS1(D、G)或無AtSUS1(C、F)的所有反應(yīng)條件下，UGT76G1可以將糖部分轉(zhuǎn)移至甜茶苷以生成Reb G。AtSUS1提高了UGT-SUS偶聯(lián)體系中的轉(zhuǎn)化效率。GS融合蛋白在相同反應(yīng)條件(E、H)下表現(xiàn)出更高活性。在12小時(shí)所有甜茶苷通過GS完全轉(zhuǎn)化為Reb G(E)。

實(shí)施例9

在該實(shí)施例中，使用萊鮑迪苷KA作為底物分析UGT76G1活性。

為進(jìn)一步鑒定UGT76G1的酶活性，使用萊鮑迪苷KA作為底物進(jìn)行體外測定。令人驚訝地，在早期時(shí)間點(diǎn)生成新型甜菊醇糖苷(萊鮑迪苷V“Reb V”)。在以后的時(shí)間點(diǎn)，反應(yīng)中生成的Reb V轉(zhuǎn)化為另一種新型甜菊醇糖苷(萊鮑迪苷W“Reb W”)。

如圖9所示，在有AtSUS1(F、I)或無AtSUS1(E、H)的所有反應(yīng)條件下，UGT76G1可以將糖部分轉(zhuǎn)移至Reb KA以生成Reb V。AtSUS1提高了UGT-SUS偶聯(lián)體系(F、I)中的轉(zhuǎn)化效率。在UGT76G1-AtSUS1偶聯(lián)反應(yīng)體系(I)和GS融合反應(yīng)體系(J)中，在12小時(shí)生成的Reb V完全轉(zhuǎn)化為Reb W。

實(shí)施例10

在該實(shí)施例中，使用Reb V作為底物分析UGT76G1活性。

將作為底物的純化Reb V引入到反應(yīng)體系中。如圖10C所示，在6小時(shí)在UGT-SUS1偶聯(lián)體系中Reb V驚人地被UGT76G1重組多肽完全轉(zhuǎn)化為Reb W。

實(shí)施例11

在該實(shí)施例中，使用Reb G作為底物分析HV1活性。

如圖11所示，在有或無AtSUS1的所有反應(yīng)條件下，重組HV1多肽將糖部分轉(zhuǎn)移至萊鮑迪苷G以生成Reb V。在UGT-SUS偶聯(lián)反應(yīng)體系(E、G)中Reb G被重組HV1完全轉(zhuǎn)化為Reb V。然而，24小時(shí)后(F)僅部分Reb G被未偶聯(lián)至AtSUS1的單獨(dú)的重組HV1多肽轉(zhuǎn)化為Reb V，表明AtSUS1提高了UGT-SUS偶聯(lián)體系中的轉(zhuǎn)化效率。

實(shí)施例12

在該實(shí)施例中，使用Reb G作為底物分析EUGT11活性。

如圖12所示，在有AtSUS1(F、I)或無AtSUS1(E、H)的所有反應(yīng)條件下，重組EUGT11多肽將糖部分轉(zhuǎn)移至萊鮑迪苷G以生成Reb V。在UGT-SUS偶聯(lián)反應(yīng)體系(F、I)中更多的Reb G被重組EUGT11轉(zhuǎn)化為Reb V。然而，僅部分Reb G被未偶聯(lián)至AtSUS1的單獨(dú)的重組EUGT11多肽轉(zhuǎn)化為Reb V(E、H)，表明AtSUS1提高了UGT-SUS偶聯(lián)體系中的轉(zhuǎn)化效率。EUS融合蛋白在相同反應(yīng)條件下表現(xiàn)出更高活性(G、J)。24小時(shí)(J)該反應(yīng)體系中的所有Reb G被EUS完全轉(zhuǎn)化為Reb V。

實(shí)施例13

在該實(shí)施例中，使用甜茶苷作為底物分析HV1與UGT76G1組合的活性。

甜茶苷底物與重組HV1多肽、UGT76G1和AtSUS1一起在UGT-SUS偶聯(lián)反應(yīng)體系中在類似于以上實(shí)施例中所用的條件下溫育。通過HPLC分析產(chǎn)物。如圖13所示，由重組HV1多肽、UGT76G1和AtSUS1的組合生成Reb V和Reb W。因此，顯示出1,2-19-O-葡萄糖和1,2-13-O-葡萄糖糖基化活性的重組HV1多肽，可以與其它UGT酶(如UGT76G1，其顯示出1,3-13-O-葡萄糖和1,3-19-O-葡萄糖糖基化活性)組合使用，用于甜菊醇糖苷的復(fù)雜、多步生物合成。如果HV1重組蛋白與GS融合蛋白在反應(yīng)體系中組合，也由這些UGT酶生成Reb V和Reb W，表明可由GS融合蛋白產(chǎn)生UGT-SUS偶聯(lián)反應(yīng)。

實(shí)施例14

在該實(shí)施例中，使用甜茶苷作為底物分析EUGT11與UGT76G1組合的活性。

甜茶苷底物與重組EUGT11多肽、UGT76G1和AtSUS1一起在UGT-SUS偶聯(lián)反應(yīng)體系中在類似于以上實(shí)施例中所用的條件下溫育。通過HPLC分析產(chǎn)物。如圖14所示，由重組EUGT11多肽、UGT76G1和AtSUS1的組合生成Reb W。因此，顯示出1,2-19-O-葡萄糖和1,2-13-O-葡萄糖糖基化活性的重組EUGT11多肽，可以與其它UGT酶(如UGT76G1，其顯示出1,3-13-O-葡萄糖和1,3-19-O-葡萄糖糖基化活性)組合使用，用于甜菊醇糖苷的復(fù)雜、多步生物合成。如果EUGT11重組蛋白與GS融合蛋白在反應(yīng)體系中組合，也由這些UGT酶生成Reb W，表明可由GS融合蛋白產(chǎn)生UGT-SUS偶聯(lián)反應(yīng)。

實(shí)施例15

在該實(shí)施例中，使用Reb G作為底物分析HV1與UGT76G1組合的活性。

Reb G底物與重組HV1多肽、UGT76G1和AtSUS1一起在UGT-SUS偶聯(lián)反應(yīng)體系中在類似于以上實(shí)施例中所用的條件下溫育。通過HPLC分析產(chǎn)物。如圖15所示，由重組HV1多肽、UGT76G1和AtSUS1的組合生成Reb V和Reb W。在12小時(shí)后，所有甜茶苷底物轉(zhuǎn)化為Reb V，并且在36小時(shí)后，所有生成的Reb V轉(zhuǎn)化為Reb W。因此，顯示出1,2-19-O-葡萄糖和1,2-13-O-葡萄糖糖基化活性的重組HV1多肽，可以與其它UGT酶(如UGT76G1，其顯示出1,3-13-O-葡萄糖和1,3-19-O-葡萄糖糖基化活性)組合使用，用于甜菊醇糖苷的復(fù)雜、多步生物合成。如果HV1重組蛋白與GS融合蛋白在反應(yīng)體系中組合，也由這些UGT酶生成Reb V和Reb W，表明可由GS融合蛋白產(chǎn)生UGT-SUS偶聯(lián)反應(yīng)。

實(shí)施例16

在該實(shí)施例中，使用Reb G作為底物分析EUGT11與UGT76G1組合的活性。

Reb G底物與重組EUGT11多肽、UGT76G1和AtSUS1一起在UGT-SUS偶聯(lián)反應(yīng)體系中在類似于以上實(shí)施例中所用的條件下溫育。通過HPLC分析產(chǎn)物。如圖16所示，由重組EUGT11多肽、UGT76G1和AtSUS1的組合生成和Reb W。因此，顯示出1,2-19-O-葡萄糖和1,2-13-O-葡萄糖糖基化活性的重組EUGT11多肽，可以與其它UGT酶(如UGT76G1，其顯示出1,3-13-O-葡萄糖和1,3-19-O-葡萄糖糖基化活性)組合使用，用于甜菊醇糖苷的復(fù)雜、多步生物合成。如果EUGT11重組蛋白與GS融合蛋白在反應(yīng)體系中組合，也由這些UGT酶生成Reb W，表明可由GS融合蛋白產(chǎn)生UGT-SUS偶聯(lián)反應(yīng)。

實(shí)施例17

在該實(shí)施例中，使用Reb D作為底物分析UGT76G1和GS融合酶活性。

Reb D底物與重組UGT76G1一起在類似于以上實(shí)施例中所用的條件下溫育。通過HPLC分析產(chǎn)物。如圖22所示，在反應(yīng)中由有AtSUS1(圖22D和G)或無AtSUS1(圖22C和F)的UGT76G1生成Reb M。因此，顯示出1,3-19-O-葡萄糖糖基化活性的重組UGT76G1多肽，可用于萊鮑迪苷M的生物合成。在UGT-SUS偶聯(lián)反應(yīng)體系(圖22G)中，Reb D被重組UGT76G1完全轉(zhuǎn)化為Reb M。然而，6小時(shí)后(F)僅部分Reb D被未偶聯(lián)至AtSUS1的單獨(dú)的重組UGT76G1多肽轉(zhuǎn)化為Reb M，表明AtSUS1提高了UGT-SUS偶聯(lián)體系中的轉(zhuǎn)化效率。GS融合蛋白在相同反應(yīng)條件下(E、H)表現(xiàn)出與UGT76G1-AtSUS1偶聯(lián)反應(yīng)相似的活性。在6小時(shí)(H)所有Reb D被GS完全轉(zhuǎn)化為Reb M，表明可由GS融合蛋白產(chǎn)生UGT-SUS偶聯(lián)反應(yīng)。

實(shí)施例18

在該實(shí)施例中，使用Reb E作為底物分析UGT76G1和GS融合酶活性。

Reb E底物與重組UGT76G1或GS融合酶一起在類似于以上實(shí)施例中所用的條件下溫育。通過HPLC分析產(chǎn)物。如圖23所示，在反應(yīng)中由有AtSUS1(圖23E、H和K)或無AtSUS1(圖22D、G和J)的UGT76G1和GS融合酶(圖23F、I和L)生成Reb D。此外，由反應(yīng)中生成的Reb D形成Reb M。因此，顯示出1,3-13-O-葡萄糖和1,3-19-O-葡萄糖糖基化活性的重組UGT76G1多肽，可用于萊鮑迪苷D和萊鮑迪苷M的生物合成。24小時(shí)后在UGT-SUS偶聯(lián)反應(yīng)體系中，Reb E被重組UGT76G1完全轉(zhuǎn)化為Reb M(圖23K)。然而，24小時(shí)后(J)僅Reb D被未偶聯(lián)至AtSUS1的單獨(dú)的重組UGT76G1多肽從Reb E轉(zhuǎn)化，表明AtSUS1通過連續(xù)的UDPG生成而提高了UGT-SUS偶聯(lián)體系中的轉(zhuǎn)化效率。GS融合蛋白在相同反應(yīng)條件下(圖23F、I和L)表現(xiàn)出與UGT76G1-AtSUS1偶聯(lián)反應(yīng)相似的活性，表明可由GS融合蛋白產(chǎn)生UGT-SUS偶聯(lián)反應(yīng)。

實(shí)施例19

在該實(shí)施例中，使用甜菊苷作為底物分析HV1與UGT76G1組合的活性。

甜茶苷底物與重組HV1多肽和UGT76G1或GS融合酶一起在類似于以上實(shí)施例中所用的條件下溫育。通過HPLC分析產(chǎn)物。如圖24所示，在所有反應(yīng)中由重組HV1多肽和UGT76G1的組合生成Reb A。此外，在反應(yīng)中使用重組HV1多肽、UGT76G1多肽和AtSUS1的組合(圖24E、H和K)或重組GS融合酶和HV1多肽的組合(圖24F、I和L)檢測到Reb D和Reb M。顯示出1,2-19-O-葡萄糖糖基化活性的重組HV1多肽，可以與其它UGT酶(如UGT76G1，其顯示出1,3-13-O-葡萄糖和1,3-19-O-葡萄糖糖基化活性)組合使用，用于萊鮑迪苷D和萊鮑迪苷M的復(fù)雜、多步生物合成。結(jié)果還顯示AtSUS1通過連續(xù)的UDPG生成提高了UGT-SUS偶聯(lián)體系中的轉(zhuǎn)化效率(圖24E、H和K)。GS融合蛋白在相同反應(yīng)條件下(圖24F、I和L)表現(xiàn)出與UGT76G1-AtSUS1偶聯(lián)反應(yīng)相似的活性，表明可由GS融合蛋白產(chǎn)生UGT-SUS偶聯(lián)反應(yīng)。

實(shí)施例20

在該實(shí)施例中，使用Reb A作為底物分析HV1與UGT76G1組合的活性。

Reb A底物與重組HV1多肽和UGT76G1或GS融合酶一起在類似于以上實(shí)施例中所用的條件下溫育。通過HPLC分析產(chǎn)物。如圖25所示，在所有反應(yīng)中由重組HV1多肽和UGT76G1的組合生成Reb D。此外，在反應(yīng)中使用重組HV1多肽、UGT76G1多肽和AtSUS1的組合(圖25D、G和J)或重組GS融合酶和HV1多肽的組合(圖25E、H和K)檢測到Reb M。顯示出1,2-19-O-葡萄糖糖基化活性的重組HV1多肽，可以與其它UGT酶(如UGT76G1，其顯示出1,3-19-O-葡萄糖糖基化活性)組合使用，用于萊鮑迪苷D和萊鮑迪苷M的復(fù)雜、多步生物合成。結(jié)果還顯示AtSUS1通過連續(xù)的UDPG生成提高了UGT-SUS偶聯(lián)體系中的轉(zhuǎn)化效率(圖25D、G和J)。GS融合蛋白在相同反應(yīng)條件下(圖25E、H和K)表現(xiàn)出與UGT76G1-AtSUS1偶聯(lián)反應(yīng)相似的活性，表明可由GS融合蛋白產(chǎn)生UGT-SUS偶聯(lián)反應(yīng)。

實(shí)施例21

在該實(shí)施例中，通過NMR分析Reb V的結(jié)構(gòu)。

用于Reb V表征的材料通過使用Reb G的酶促轉(zhuǎn)化生成并通過HPLC純化。用將其分辨率設(shè)為30k的LTQ Orbitrap Discovery HRMS儀器生成HRMS數(shù)據(jù)。在正離子電噴射模式下掃描數(shù)據(jù)從m/z 150至1500。針電壓設(shè)為4kV；其它源條件為鞘氣＝25，輔助氣＝0，吹掃氣＝5(為任意單位的所有氣流)，毛細(xì)管電壓＝30V，毛細(xì)管溫度＝300℃和管透鏡電壓＝75。樣品用2:2:1乙腈:甲醇:水(與輸注洗脫液相同)稀釋并注射50微升。在Bruker Avance DRX 500MHz或Varian INOVA 600MHz儀器上使用標(biāo)準(zhǔn)脈沖序列獲得NMR波譜。1D(¹H和¹³C)和2D(TOCSY、HMQC和HMBC)NMR波譜在C₅D₅N中進(jìn)行。

已基于其在m/z 989.4198處顯示出對(duì)應(yīng)于[M+Na]⁺的加合離子的正電高分辨率(HR)質(zhì)譜將Reb V的分子式推導(dǎo)為C₄₄H₇₀O₂₃；這種組成受¹³C NMR波譜數(shù)據(jù)支持。Reb V的¹H NMR波譜數(shù)據(jù)顯示在δ0.97和1.40存在兩個(gè)甲基單線態(tài)，在環(huán)外雙鍵的δ5.06和5.71存在兩個(gè)為單線態(tài)的烯烴質(zhì)子，在δ0.74-2.72存在九個(gè)sp3亞甲基和兩個(gè)sp3次甲基質(zhì)子，這是早期分離自甜葉菊屬的對(duì)映-貝殼杉烷二萜的特點(diǎn)。對(duì)映-貝殼杉烷二萜的基本骨架受到COSY和TOCSY研究支持，該研究顯示出關(guān)鍵相關(guān)性：H-1/H-2；H-2/H-3；H-5/H-6；H-6/H-7；H-9/H-11；H-11/H-12。Reb V的¹H NMR波譜還顯示存在四個(gè)在δ5.08、5.38、5.57和6.23共振的異頭質(zhì)子；表明在其結(jié)構(gòu)中存在四個(gè)糖單元。用5％H₂SO₄酸水解Reb V提供了通過TLC與真實(shí)樣品直接比較所鑒定的D-葡萄糖。酶水解Reb V供給了通過與標(biāo)準(zhǔn)化合物的¹H NMR和co-TLC的比較鑒定為甜菊醇的糖苷配基。在δ5.08(d,J＝7.8Hz)、5.38(d,J＝8.1Hz)、5.57(d,J＝8.0Hz)和6.23(d,J＝7.8Hz)對(duì)于葡萄糖部分的四個(gè)異頭質(zhì)子所觀察到的大偶聯(lián)常數(shù)，表明其β-取向與對(duì)甜菊醇糖苷所報(bào)告的相同。基于TOCSY、HMQC和HMBC數(shù)據(jù)分配Reb V的¹H和¹³C NMR值并且于表3中給出。

表3.Reb V和Reb G的¹H和¹³C NMR波譜數(shù)據(jù)(化學(xué)位移和偶聯(lián)常數(shù))^a-c

^a基于TOCSY、HMQC和HMBC相關(guān)性進(jìn)行的分配；^b化學(xué)位移值按δ(ppm)計(jì)；^c偶聯(lián)常數(shù)按Hz計(jì)。

基于來自Reb V的NMR波譜數(shù)據(jù)和水解實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，推斷在其結(jié)構(gòu)中存在四個(gè)與糖苷配基甜菊醇連接的β-D-葡糖基單元。對(duì)Reb V與Reb G的¹H和¹³C NMR值的嚴(yán)密比較表明存在在C-13處具有呈醚鍵形式的3-O-β-D-吡喃葡糖基單元且在C-19位置處具有另一個(gè)呈酯鍵形式的β-D-葡糖基單元的甜菊醇糖苷配基，剩下第四個(gè)β-D-葡糖基部分的分配(圖17)。在β-D-葡糖基部分的糖I的2-位的¹H和¹³C化學(xué)位移的低場位移支持在該位置存在β-D-葡糖基單元。該結(jié)構(gòu)還受到如圖18所示的關(guān)鍵TOCSY和HMBC相關(guān)性的支持。基于NMR和質(zhì)譜數(shù)據(jù)以及水解研究的結(jié)果，將通過Reb G的酶促轉(zhuǎn)化生成的Reb V的結(jié)構(gòu)推導(dǎo)為13-[(3-O-β-D-吡喃葡糖基-β-D-吡喃葡糖基)氧基]對(duì)映-貝殼杉-16-烯-19-烯酸-(2-O-β-D-吡喃葡糖基-β-D-吡喃葡糖基)酯。

Reb V的酸水解。向Reb V(5mg)于MeOH(10ml)中的溶液添加3ml的5％H₂SO₄并且使混合物回流24小時(shí)。然后用飽和碳酸鈉中和反應(yīng)混合物并用乙酸乙酯(EtOAc)(2x 25ml)萃取以得到含糖的水性級(jí)分及含糖苷配基部分的EtOAc級(jí)分。濃縮水相并使用TLC體系EtOAc/正丁醇/水(2:7:1)和CH₂Cl₂/MeOH/水(10:6:1)與標(biāo)準(zhǔn)糖進(jìn)行比較；將糖鑒定為D-葡萄糖。

Reb V的酶水解。將Reb V(1mg)溶于10ml的0.1M乙酸鈉緩沖液(pH 4.5)中并添加來自黑曲霉(Aspergillus niger)(50uL，Sigma-Aldrich,P2736)的粗果膠酶。在50℃下攪拌混合物96小時(shí)。反應(yīng)期間由1的水解沉淀出來的產(chǎn)物通過比較其與標(biāo)準(zhǔn)化合物的co-TLC和¹H NMR波譜數(shù)據(jù)被鑒定為甜菊醇?；诖罅康?D和2D NMR以及高分辨率質(zhì)譜數(shù)據(jù)和水解研究，確認(rèn)命名為Reb V的化合物為13-[(3-O-β-D-吡喃葡糖基-β-D-吡喃葡糖基)氧基]對(duì)映-貝殼杉-16-烯-19-烯酸-(2-O-β-D-吡喃葡糖基-β-D-吡喃葡糖基)酯。

實(shí)施例22

在該實(shí)施例中，通過NMR分析Reb W的結(jié)構(gòu)。

用于Reb W表征的材料通過使用Reb V的酶促轉(zhuǎn)化生成并通過HPLC純化。用將其分辨率設(shè)為30k的LTQ Orbitrap Discovery HRMS儀器生成HRMS數(shù)據(jù)。在正離子電噴射模式下掃描數(shù)據(jù)從m/z 150至1500。針電壓設(shè)為4kV；其它源條件為鞘氣＝25，輔助氣＝0，吹掃氣＝5(為任意單位的所有氣流)，毛細(xì)管電壓＝30V，毛細(xì)管溫度＝300C和管透鏡電壓＝75。樣品用2:2:1乙腈:甲醇:水(與輸注洗脫液相同)稀釋并注射50微升。在Bruker Avance DRX 500MHz或Varian INOVA 600MHz儀器上使用標(biāo)準(zhǔn)脈沖序列獲得NMR波譜。1D(¹H和¹³C)和2D(TOCSY、HMQC和HMBC)NMR波譜在C₅D₅N中進(jìn)行。

已基于其在m/z 1151.4708處顯示出對(duì)應(yīng)于[M+Na]⁺的加合離子的正電高分辨率(HR)質(zhì)譜將Reb W的分子式推導(dǎo)為C₅₀H₈₀O₂₈；這種組成受¹³C NMR波譜數(shù)據(jù)支持。Reb W的¹H NMR波譜數(shù)據(jù)顯示在δ0.92和1.39存在兩個(gè)甲基單線態(tài)，在環(huán)外雙鍵的δ5.10和5.73存在兩個(gè)為單線態(tài)的烯烴質(zhì)子，在δ0.72-2.72存在九個(gè)sp3亞甲基和兩個(gè)sp3次甲基質(zhì)子，這是早期分離自甜葉菊屬的對(duì)映-貝殼杉烷二萜的特點(diǎn)。對(duì)映-貝殼杉烷二萜的基本骨架受到TOCSY研究支持，該研究顯示出關(guān)鍵相關(guān)性：H-1/H-2；H-2/H-3；H-5/H-6；H-6/H-7；H-9/H-11；H-11/H-12。Reb W的¹H NMR波譜還顯示存在五個(gè)在δ5.10、5.34、5.41、5.81和6.14共振的異頭質(zhì)子；表明在其結(jié)構(gòu)中存在五個(gè)糖單元。用5％H₂SO₄酸水解Reb W提供了通過TLC與真實(shí)樣品直接比較所鑒定的D-葡萄糖。酶水解Reb W供給了通過與標(biāo)準(zhǔn)化合物的¹H NMR和co-TLC的比較鑒定為甜菊醇的糖苷配基。在δ5.10(d,J＝7.4Hz)、5.34(d,J＝7.9Hz)、5.41(d,J＝7.9Hz)、5.89(d,J＝7.9Hz)和6.14(d,J＝7.9Hz)對(duì)于葡萄糖部分的五個(gè)異頭質(zhì)子所觀察到的大偶聯(lián)常數(shù)，表明其β-取向與對(duì)甜菊醇糖苷所報(bào)告的相同[1-5,9-13]。基于TOCSY、HMQC和HMBC數(shù)據(jù)分配Reb W的¹H和¹³C NMR值并且于表4中給出。

表4.Reb W和Reb V的¹H和¹³C NMR波譜數(shù)據(jù)(化學(xué)位移和偶聯(lián)常數(shù))^a-c

^a基于TOCSY、HMQC和HMBC相關(guān)性進(jìn)行的分配；^b化學(xué)位移值按δ(ppm)計(jì)；^c偶聯(lián)常數(shù)按Hz計(jì)。

基于來自Reb W的NMR波譜數(shù)據(jù)和水解實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，推斷在其結(jié)構(gòu)中存在五個(gè)與糖苷配基甜菊醇連接的β-D-葡糖基單元。對(duì)Reb W與Reb V的¹H和¹³C NMR值的嚴(yán)密比較表明存在在C-13處具有呈醚鍵形式的3-O-β-D-吡喃葡糖基單元且在C-19位置處具有呈酯鍵形式的2-O-β-D-吡喃葡糖基單元的甜菊醇糖苷配基，剩下第五個(gè)β-D-葡糖基部分的分配(圖19)。在β-D-葡糖基部分的糖I的3-位的¹H和¹³C化學(xué)位移的低場位移支持在該位置存在β-D-葡糖基單元。該結(jié)構(gòu)還受到如圖20所示的關(guān)鍵TOCSY和HMBC相關(guān)性的支持?；贜MR和質(zhì)譜數(shù)據(jù)以及水解研究的結(jié)果，將通過Reb V的酶促轉(zhuǎn)化生成的Reb W的結(jié)構(gòu)推導(dǎo)為13-[(3-O-β-D-吡喃葡糖基-β-D-吡喃葡糖基)氧基]對(duì)映-貝殼杉-16-烯-19-烯酸-[(2-O-β-D-吡喃葡糖基-3-O-β-D-吡喃葡糖基-β-D-吡喃葡糖基)酯。

Reb W的酸水解。向Reb W(5mg)于MeOH(10ml)中的溶液添加3ml的5％H₂SO₄并且使混合物回流24小時(shí)。然后用飽和碳酸鈉中和反應(yīng)混合物并用乙酸乙酯(EtOAc)(2x 25ml)萃取以得到含糖的水性級(jí)分及含糖苷配基部分的EtOAc級(jí)分。濃縮水相并使用TLC體系EtOAc/正丁醇/水(2:7:1)和CH₂Cl₂/MeOH/水(10:6:1)與標(biāo)準(zhǔn)糖進(jìn)行比較；將糖鑒定為D-葡萄糖。

Reb W的酶水解。將Reb W(1mg)溶于10ml的0.1M乙酸鈉緩沖液(pH 4.5)中并添加來自黑曲霉(50uL，Sigma-Aldrich,P2736)的粗果膠酶。在50℃下攪拌混合物96小時(shí)。產(chǎn)物在反應(yīng)期間沉淀出來并且經(jīng)過濾，然后結(jié)晶。從Reb W水解獲得的所得產(chǎn)物通過比較其與標(biāo)準(zhǔn)化合物的co-TLC和¹H NMR波譜數(shù)據(jù)被鑒定為甜菊醇。基于大量的1D和2D NMR以及高分辨率質(zhì)譜數(shù)據(jù)和水解研究，確認(rèn)命名為Reb W的化合物為13-[(3-O-β-D-吡喃葡糖基-β-D-吡喃葡糖基)氧基]對(duì)映-貝殼杉-16-烯-19-烯酸-[(2-O-β-D-吡喃葡糖基-3-O-β-D-吡喃葡糖基-β-D-吡喃葡糖基)酯。

NMR分析之后，將Reb V和Reb W的結(jié)構(gòu)鑒定為新型甜菊醇糖苷。以上結(jié)果進(jìn)一步證明，UGT76G1不但具有1,3-13-O-葡萄糖糖基化活性，而且具有1,3-19-O-葡萄糖糖基化活性。

實(shí)施例23

在該實(shí)施例中，通過NMR分析Reb M的結(jié)構(gòu)。

用于Reb M表征的材料通過使用Reb D的酶促轉(zhuǎn)化生成并通過HPLC純化。用將其分辨率設(shè)為30k的LTQ Orbitrap Discovery HRMS儀器生成HRMS數(shù)據(jù)。在正離子電噴射模式下掃描數(shù)據(jù)從m/z 150至1500。針電壓設(shè)為4kV；其它源條件為鞘氣＝25，輔助氣＝0，吹掃氣＝5(為任意單位的所有氣流)，毛細(xì)管電壓＝30V，毛細(xì)管溫度＝300C和管透鏡電壓＝75。樣品用2:2:1乙腈:甲醇:水(與輸注洗脫液相同)稀釋并注射50微升。

在Bruker Avance DRX 500MHz或Varian INOVA 600MHz儀器上使用標(biāo)準(zhǔn)脈沖序列獲得NMR波譜。1D(¹H和¹³C)和2D(COSY、HMQC和HMBC)NMR波譜在C₅D₅N中進(jìn)行。

已基于其在m/z 1349.5964處顯示出[M+NH₄+CH₃CN]⁺離子的正電高分辨率(HR)質(zhì)譜將Reb M的分子式推導(dǎo)為C₅₆H₉₀O₃₃；這種組成受¹³C NMR波譜數(shù)據(jù)支持。Reb M的¹H NMR波譜顯示在δ1.35和1.42存在兩個(gè)甲基單線態(tài)，在環(huán)外雙鍵的δ4.92和5.65存在兩個(gè)為單線態(tài)的烯烴質(zhì)子，在δ0.77-2.77存在九個(gè)亞甲基和兩個(gè)次甲基質(zhì)子，這是早期分離自甜葉菊屬的對(duì)映-貝殼杉烷二萜的特點(diǎn)。對(duì)映-貝殼杉烷二萜的基本骨架受到COSY(H-1/H-2；H-2/H-3；H-5/H-6；H-6/H-7；H-9/H-11；H-11/H-12)和HMBC(H-1/C-2、C-10；H-3/C-1、C-2、C-4、C-5、C-18、C-19；H-5/C-4、C-6、C-7、C-9、C-10、C-18、C-19、C-20；H-9/C-8、C-10、C-11、C-12、C-14、C-15；H-14/C-8、C-9、C-13、C-15、C-16和H-17/C-13、C-15、C-16)相關(guān)性的支持。Reb M的¹H NMR波譜還顯示存在在δ5.33、5.47、5.50、5.52、5.85和6.43共振的異頭質(zhì)子；表明在其結(jié)構(gòu)中存在六個(gè)糖單元。酶水解Reb M供給了通過與標(biāo)準(zhǔn)化合物的co-TLC的比較鑒定為甜菊醇的糖苷配基。用5％H₂SO₄酸水解Reb M提供了通過TLC與真實(shí)樣品直接比較所鑒定的葡萄糖。基于TOCSY、HMQC和HMBC相關(guān)性分配Reb M中選定的質(zhì)子和碳的¹H和¹³C NMR值(表5)。

基于來自Reb M的NMR波譜數(shù)據(jù)的結(jié)果，推斷在其結(jié)構(gòu)中存在六個(gè)葡糖基單元(圖26)。對(duì)Reb M與萊鮑迪苷D的¹H和¹³C NMR波譜的嚴(yán)密比較表明Reb M也是甜菊醇糖苷，其具有三個(gè)附連在C-13羥基處作為2,3-分支吡喃葡糖基取代基的葡萄糖殘基和在C-19處呈酯形式的2-取代的吡喃葡糖基部分，剩下另一個(gè)葡糖基部分的分配。圖27所示的關(guān)鍵TOCSY和HMBC相關(guān)性表明第六個(gè)葡糖基部分置于糖I的C-3位置。在δ5.33(d,J＝8.4Hz)、5.47(d,J＝7.8Hz)、5.50(d,J＝7.4Hz)、5.52(d,J＝7.4Hz)、5.85(d,J＝7.4Hz)和6.43(d,J＝7.8Hz)對(duì)于葡萄糖部分的六個(gè)異頭質(zhì)子所觀察到的大偶聯(lián)常數(shù)，表明其β-取向與對(duì)甜菊醇糖苷所報(bào)告的相同?；贜MR和質(zhì)譜研究的結(jié)果及在與從文獻(xiàn)中報(bào)告的萊鮑迪苷M的波譜值的比較中，將通過酶促反應(yīng)生成的Reb M的結(jié)構(gòu)指定為13-[(2-O-β-D-吡喃葡糖基-3-O-β-D-吡喃葡糖基-β-D-吡喃葡糖基)氧基]對(duì)映-貝殼杉-16-烯-19-烯酸-[(2-O-β-D-吡喃葡糖基-3-O-β-D-吡喃葡糖基-β-D-吡喃葡糖基)酯。

表5.通過酶促反應(yīng)生成的Reb M的¹H和¹³C NMR波譜數(shù)據(jù)(化學(xué)位移和偶聯(lián)常數(shù))^a-c。

^a基于TOCSY、HSQC和HMBC相關(guān)性進(jìn)行的分配；^b化學(xué)位移值按δ(ppm)計(jì)；^c偶聯(lián)常數(shù)按Hz計(jì)。

化合物1的酸水解：向生成的Reb M(5mg)于MeOH(10ml)中的溶液添加3ml的5％H₂SO₄并且使混合物回流24小時(shí)。然后用飽和碳酸鈉中和反應(yīng)混合物并用乙酸乙酯(EtOAc)(2x 25ml)萃取以得到含糖的水性級(jí)分及含糖苷配基部分的EtOAc級(jí)分。濃縮水相并使用TLC體系EtOAc/正丁醇/水(2:7:1)和CH₂Cl₂/MeOH/水(10:6:1)與標(biāo)準(zhǔn)糖進(jìn)行比較；將糖鑒定為D-葡萄糖。

化合物的酶水解：將生成的Reb M(1mg)溶于10ml的0.1M乙酸鈉緩沖液(pH 4.5)中并添加來自黑曲霉(50uL，Sigma-Aldrich,P2736)的粗果膠酶。在50℃下攪拌混合物96小時(shí)。反應(yīng)期間由1的水解沉淀出來的產(chǎn)物通過比較其與標(biāo)準(zhǔn)化合物的co-TLC和¹H NMR波譜數(shù)據(jù)被鑒定為甜菊醇。

獲得的命名為萊鮑迪苷M(Reb M)的化合物通過生物轉(zhuǎn)化而生成。對(duì)萊鮑迪苷M(Reb M)的完全¹H和¹³C NMR波譜分配基于大量的1D和2D NMR以及高分辨率質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行，其表明結(jié)構(gòu)為13-[(2-O-β-D-吡喃葡糖基-3-O-β-D-吡喃葡糖基-β-D-吡喃葡糖基)氧基]對(duì)映-貝殼杉-16-烯-19-烯酸-[(2-O-β-D-吡喃葡糖基-3-O-β-D-吡喃葡糖基-β-D-吡喃葡糖基)酯。

實(shí)施例24

在該實(shí)施例中，討論甜菊醇糖苷的生物合成途徑。

圖21是說明由甜茶苷生物合成甜菊醇糖苷的新型途徑的圖解。如本文所述，重組HV1多肽(“HV1”)含有將第二葡糖苷部分轉(zhuǎn)移至甜茶苷19-O-葡萄糖的C-2’以生成萊鮑迪苷KA(“Reb KA”)的1,2-O-葡萄糖糖基化活性；重組EUGT11多肽(“EUGT11”)含有將第二葡萄糖部分轉(zhuǎn)移至甜茶苷19-O-葡萄糖的C-2’以生成萊鮑迪苷KA；或?qū)⒌诙咸烟遣糠洲D(zhuǎn)移至甜茶苷的13-O-葡萄糖的C-2’以生成甜菊苷的1,2-O-葡萄糖糖基化活性；重組UGT76G1酶(“UGT76G1”)含有將第二葡萄糖部分轉(zhuǎn)移至甜茶苷的13-O-葡萄糖的C-3’以生成萊鮑迪苷G(“Reb G”)的1,3-O-葡萄糖糖基化活性。HV1和EUGT11兩者將第二糖部分轉(zhuǎn)移至萊鮑迪苷G的19-O-葡萄糖的C-2’以生成萊鮑迪苷V(“Reb V”)，或?qū)⒌诙咸烟遣糠洲D(zhuǎn)移至萊鮑迪苷KA的13-O-葡萄糖的C-2’以生成萊鮑迪苷E(“Reb E”)。圖21還顯示，重組UGT76G1酶催化第三糖部分轉(zhuǎn)移至萊鮑迪苷V的C-19-O-葡萄糖的C-3’以生成萊鮑迪苷W(“Reb W”)的反應(yīng)并且EUGT11可以連續(xù)地將第三葡萄糖部分轉(zhuǎn)移至萊鮑迪苷E的C-13-O-葡萄糖的C-6’以生成萊鮑迪苷D2。HV1可以將第三葡萄糖部分轉(zhuǎn)移至萊鮑迪苷E的C-13-O-葡萄糖的C-2’以生成萊鮑迪苷Z1(“Reb Z1”)，并且可以將第三葡萄糖部分轉(zhuǎn)移至萊鮑迪苷E的C-19-O-葡萄糖的C-2’以生成萊鮑迪苷Z2(“Reb Z2”)。HV1和EUGT11兩者可以催化甜菊苷轉(zhuǎn)化為Reb E及萊鮑迪苷A(“Reb A”)轉(zhuǎn)化為萊鮑迪苷D(“Reb D”)。UGT76G1可以將第三葡萄糖部分轉(zhuǎn)移至萊鮑迪苷E(“Reb E”)的C-13-O-葡萄糖的C-3’以形成萊鮑迪苷D(“Reb D”)。UGT76G1也催化甜菊苷轉(zhuǎn)化為萊鮑迪苷(“Reb A”)及萊鮑迪苷D(“Reb D”)轉(zhuǎn)化為萊鮑迪苷M(“Reb M”)。

鑒于以上所述，將會(huì)看到實(shí)現(xiàn)了本公開的幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)并獲得了其它有利結(jié)果。因?yàn)樵诓槐畴x本公開范圍的前提下可以在以上方法和體系上進(jìn)行各種變化，所以意圖是應(yīng)將以上描述中所含的及附圖中所示的所有問題均解釋為說明性而非限制性意義。

在介紹本公開或其型式、實(shí)施方案或方面的要素時(shí)，冠詞“一種”、“一個(gè)”、“該”和“所述”旨在意指存在一個(gè)或多個(gè)要素。術(shù)語“包含”、“包括”和“具有”旨在為包括性且意指可能存在除所列要素之外的附加要素。

序列表

<110> Conagen Inc.

Mao, Guohong

Yu, Xiaodan

Luo, Yang

Lin, Ying

<120> 無熱量甜味劑及合成方法

<130> 32559-49

<160> 12

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 458

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 1

Met Glu Asn Lys Thr Glu Thr Thr Val Arg Arg Arg Arg Arg Ile Ile

1 5 10 15

Leu Phe Pro Val Pro Phe Gln Gly His Ile Asn Pro Ile Leu Gln Leu

20 25 30

Ala Asn Val Leu Tyr Ser Lys Gly Phe Ser Ile Thr Ile Phe His Thr

35 40 45

Asn Phe Asn Lys Pro Lys Thr Ser Asn Tyr Pro His Phe Thr Phe Arg

50 55 60

Phe Ile Leu Asp Asn Asp Pro Gln Asp Glu Arg Ile Ser Asn Leu Pro

65 70 75 80

Thr His Gly Pro Leu Ala Gly Met Arg Ile Pro Ile Ile Asn Glu His

85 90 95

Gly Ala Asp Glu Leu Arg Arg Glu Leu Glu Leu Leu Met Leu Ala Ser

100 105 110

Glu Glu Asp Glu Glu Val Ser Cys Leu Ile Thr Asp Ala Leu Trp Tyr

115 120 125

Phe Ala Gln Ser Val Ala Asp Ser Leu Asn Leu Arg Arg Leu Val Leu

130 135 140

Met Thr Ser Ser Leu Phe Asn Phe His Ala His Val Ser Leu Pro Gln

145 150 155 160

Phe Asp Glu Leu Gly Tyr Leu Asp Pro Asp Asp Lys Thr Arg Leu Glu

165 170 175

Glu Gln Ala Ser Gly Phe Pro Met Leu Lys Val Lys Asp Ile Lys Ser

180 185 190

Ala Tyr Ser Asn Trp Gln Ile Leu Lys Glu Ile Leu Gly Lys Met Ile

195 200 205

Lys Gln Thr Lys Ala Ser Ser Gly Val Ile Trp Asn Ser Phe Lys Glu

210 215 220

Leu Glu Glu Ser Glu Leu Glu Thr Val Ile Arg Glu Ile Pro Ala Pro

225 230 235 240

Ser Phe Leu Ile Pro Leu Pro Lys His Leu Thr Ala Ser Ser Ser Ser

245 250 255

Leu Leu Asp His Asp Arg Thr Val Phe Gln Trp Leu Asp Gln Gln Pro

260 265 270

Pro Ser Ser Val Leu Tyr Val Ser Phe Gly Ser Thr Ser Glu Val Asp

275 280 285

Glu Lys Asp Phe Leu Glu Ile Ala Arg Gly Leu Val Asp Ser Lys Gln

290 295 300

Ser Phe Leu Trp Val Val Arg Pro Gly Phe Val Lys Gly Ser Thr Trp

305 310 315 320

Val Glu Pro Leu Pro Asp Gly Phe Leu Gly Glu Arg Gly Arg Ile Val

325 330 335

Lys Trp Val Pro Gln Gln Glu Val Leu Ala His Gly Ala Ile Gly Ala

340 345 350

Phe Trp Thr His Ser Gly Trp Asn Ser Thr Leu Glu Ser Val Cys Glu

355 360 365

Gly Val Pro Met Ile Phe Ser Asp Phe Gly Leu Asp Gln Pro Leu Asn

370 375 380

Ala Arg Tyr Met Ser Asp Val Leu Lys Val Gly Val Tyr Leu Glu Asn

385 390 395 400

Gly Trp Glu Arg Gly Glu Ile Ala Asn Ala Ile Arg Arg Val Met Val

405 410 415

Asp Glu Glu Gly Glu Tyr Ile Arg Gln Asn Ala Arg Val Leu Lys Gln

420 425 430

Lys Ala Asp Val Ser Leu Met Lys Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Ser Leu

435 440 445

Glu Ser Leu Val Ser Tyr Ile Ser Ser Leu

450 455

<210> 2

<211> 1377

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 2

atggagaata agacagaaac aaccgtaaga cggaggcgga ggattatctt gttccctgta 60

ccatttcagg gccatattaa tccgatcctc caattagcaa acgtcctcta ctccaaggga 120

ttttcaataa caatcttcca tactaacttt aacaagccta aaacgagtaa ttatcctcac 180

tttacattca ggttcattct agacaacgac cctcaggatg agcgtatctc aaatttacct 240

acgcatggcc ccttggcagg tatgcgaata ccaataatca atgagcatgg agccgatgaa 300

ctccgtcgcg agttagagct tctcatgctc gcaagtgagg aagacgagga agtttcgtgc 360

ctaataactg atgcgctttg gtacttcgcc caatcagtcg cagactcact gaatctacgc 420

cgtttggtcc ttatgacaag ttcattattc aactttcacg cacatgtatc actgccgcaa 480

tttgacgagt tgggttacct ggacccggat gacaaaacgc gattggagga acaagcgtcg 540

ggcttcccca tgctgaaagt caaagatatt aagagcgctt atagtaattg gcaaattctg 600

aaagaaattc tcggaaaaat gataaagcaa accaaagcgt cctctggagt aatctggaac 660

tccttcaagg agttagagga atctgaactt gaaacggtca tcagagaaat ccccgctccc 720

tcgttcttaa ttccactacc caagcacctt actgcaagta gcagttccct cctagatcat 780

gaccgaaccg tgtttcagtg gctggatcag caacccccgt cgtcagttct atatgtaagc 840

tttgggagta cttcggaagt ggatgaaaag gacttcttag agattgcgcg agggctcgtg 900

gatagcaaac agagcttcct gtgggtagtg agaccgggat tcgttaaggg ctcgacgtgg 960

gtcgagccgt tgccagatgg ttttctaggg gagagaggga gaatcgtgaa atgggttcca 1020

cagcaagagg ttttggctca cggagctata ggggcctttt ggacccactc tggttggaat 1080

tctactcttg aaagtgtctg tgaaggcgtt ccaatgatat tttctgattt tgggcttgac 1140

cagcctctaa acgctcgcta tatgtctgat gtgttgaagg ttggcgtgta cctggagaat 1200

ggttgggaaa ggggggaaat tgccaacgcc atacgccggg taatggtgga cgaggaaggt 1260

gagtacatac gtcagaacgc tcgggtttta aaacaaaaag cggacgtcag ccttatgaag 1320

ggaggtagct cctatgaatc cctagaatcc ttggtaagct atatatcttc gttataa 1377

<210> 3

<211> 462

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 3

Met Asp Ser Gly Tyr Ser Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Ala Gly Met His

1 5 10 15

Val Val Ile Cys Pro Trp Leu Ala Phe Gly His Leu Leu Pro Cys Leu

20 25 30

Asp Leu Ala Gln Arg Leu Ala Ser Arg Gly His Arg Val Ser Phe Val

35 40 45

Ser Thr Pro Arg Asn Ile Ser Arg Leu Pro Pro Val Arg Pro Ala Leu

50 55 60

Ala Pro Leu Val Ala Phe Val Ala Leu Pro Leu Pro Arg Val Glu Gly

65 70 75 80

Leu Pro Asp Gly Ala Glu Ser Thr Asn Asp Val Pro His Asp Arg Pro

85 90 95

Asp Met Val Glu Leu His Arg Arg Ala Phe Asp Gly Leu Ala Ala Pro

100 105 110

Phe Ser Glu Phe Leu Gly Thr Ala Cys Ala Asp Trp Val Ile Val Asp

115 120 125

Val Phe His His Trp Ala Ala Ala Ala Ala Leu Glu His Lys Val Pro

130 135 140

Cys Ala Met Met Leu Leu Gly Ser Ala His Met Ile Ala Ser Ile Ala

145 150 155 160

Asp Arg Arg Leu Glu Arg Ala Glu Thr Glu Ser Pro Ala Ala Ala Gly

165 170 175

Gln Gly Arg Pro Ala Ala Ala Pro Thr Phe Glu Val Ala Arg Met Lys

180 185 190

Leu Ile Arg Thr Lys Gly Ser Ser Gly Met Ser Leu Ala Glu Arg Phe

195 200 205

Ser Leu Thr Leu Ser Arg Ser Ser Leu Val Val Gly Arg Ser Cys Val

210 215 220

Glu Phe Glu Pro Glu Thr Val Pro Leu Leu Ser Thr Leu Arg Gly Lys

225 230 235 240

Pro Ile Thr Phe Leu Gly Leu Met Pro Pro Leu His Glu Gly Arg Arg

245 250 255

Glu Asp Gly Glu Asp Ala Thr Val Arg Trp Leu Asp Ala Gln Pro Ala

260 265 270

Lys Ser Val Val Tyr Val Ala Leu Gly Ser Glu Val Pro Leu Gly Val

275 280 285

Glu Lys Val His Glu Leu Ala Leu Gly Leu Glu Leu Ala Gly Thr Arg

290 295 300

Phe Leu Trp Ala Leu Arg Lys Pro Thr Gly Val Ser Asp Ala Asp Leu

305 310 315 320

Leu Pro Ala Gly Phe Glu Glu Arg Thr Arg Gly Arg Gly Val Val Ala

325 330 335

Thr Arg Trp Val Pro Gln Met Ser Ile Leu Ala His Ala Ala Val Gly

340 345 350

Ala Phe Leu Thr His Cys Gly Trp Asn Ser Thr Ile Glu Gly Leu Met

355 360 365

Phe Gly His Pro Leu Ile Met Leu Pro Ile Phe Gly Asp Gln Gly Pro

370 375 380

Asn Ala Arg Leu Ile Glu Ala Lys Asn Ala Gly Leu Gln Val Ala Arg

385 390 395 400

Asn Asp Gly Asp Gly Ser Phe Asp Arg Glu Gly Val Ala Ala Ala Ile

405 410 415

Arg Ala Val Ala Val Glu Glu Glu Ser Ser Lys Val Phe Gln Ala Lys

420 425 430

Ala Lys Lys Leu Gln Glu Ile Val Ala Asp Met Ala Cys His Glu Arg

435 440 445

Tyr Ile Asp Gly Phe Ile Gln Gln Leu Arg Ser Tyr Lys Asp

450 455 460

<210> 4

<211> 1389

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 4

atggattcgg gttactcttc ctcctatgcg gcggctgcgg gtatgcacgt tgttatctgt 60

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tgcgccgatt gggtgatcgt tgacgtcttt catcactggg cggcggcggc ggcgctggaa 420

cataaagttc cgtgtgcaat gatgctgctg ggctcagctc acatgattgc gtcgatcgca 480

gaccgtcgcc tggaacgtgc agaaaccgaa agtccggctg cggccggcca gggtcgcccg 540

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ggtatgagcc tggcagaacg ctttagtctg accctgtccc gtagttccct ggtggttggt 660

cgcagttgcg ttgaatttga accggaaacc gtcccgctgc tgtccacgct gcgtggtaaa 720

ccgatcacct ttctgggtct gatgccgccg ctgcatgaag gccgtcgcga agatggtgaa 780

gacgcaacgg tgcgttggct ggatgcacag ccggctaaaa gcgtcgtgta tgtcgccctg 840

ggctctgaag tgccgctggg tgtggaaaaa gttcacgaac tggcactggg cctggaactg 900

gctggcaccc gcttcctgtg ggcactgcgt aaaccgacgg gtgtgagcga tgcggacctg 960

ctgccggccg gttttgaaga acgtacccgc ggccgtggtg ttgtcgcaac gcgttgggtc 1020

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aaagactaa 1389

<210> 5

<211> 459

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 5

Met Asp Gly Asn Ser Ser Ser Ser Pro Leu His Val Val Ile Cys Pro

1 5 10 15

Trp Leu Ala Leu Gly His Leu Leu Pro Cys Leu Asp Ile Ala Glu Arg

20 25 30

Leu Ala Ser Arg Gly His Arg Val Ser Phe Val Ser Thr Pro Arg Asn

35 40 45

Ile Ala Arg Leu Pro Pro Leu Arg Pro Ala Val Ala Pro Leu Val Asp

50 55 60

Phe Val Ala Leu Pro Leu Pro His Val Asp Gly Leu Pro Glu Gly Ala

65 70 75 80

Glu Ser Thr Asn Asp Val Pro Tyr Asp Lys Phe Glu Leu His Arg Lys

85 90 95

Ala Phe Asp Gly Leu Ala Ala Pro Phe Ser Glu Phe Leu Arg Ala Ala

100 105 110

Cys Ala Glu Gly Ala Gly Ser Arg Pro Asp Trp Leu Ile Val Asp Thr

115 120 125

Phe His His Trp Ala Ala Ala Ala Ala Val Glu Asn Lys Val Pro Cys

130 135 140

Val Met Leu Leu Leu Gly Ala Ala Thr Val Ile Ala Gly Phe Ala Arg

145 150 155 160

Gly Val Ser Glu His Ala Ala Ala Ala Val Gly Lys Glu Arg Pro Ala

165 170 175

Ala Glu Ala Pro Ser Phe Glu Thr Glu Arg Arg Lys Leu Met Thr Thr

180 185 190

Gln Asn Ala Ser Gly Met Thr Val Ala Glu Arg Tyr Phe Leu Thr Leu

195 200 205

Met Arg Ser Asp Leu Val Ala Ile Arg Ser Cys Ala Glu Trp Glu Pro

210 215 220

Glu Ser Val Ala Ala Leu Thr Thr Leu Ala Gly Lys Pro Val Val Pro

225 230 235 240

Leu Gly Leu Leu Pro Pro Ser Pro Glu Gly Gly Arg Gly Val Ser Lys

245 250 255

Glu Asp Ala Ala Val Arg Trp Leu Asp Ala Gln Pro Ala Lys Ser Val

260 265 270

Val Tyr Val Ala Leu Gly Ser Glu Val Pro Leu Arg Ala Glu Gln Val

275 280 285

His Glu Leu Ala Leu Gly Leu Glu Leu Ser Gly Ala Arg Phe Leu Trp

290 295 300

Ala Leu Arg Lys Pro Thr Asp Ala Pro Asp Ala Ala Val Leu Pro Pro

305 310 315 320

Gly Phe Glu Glu Arg Thr Arg Gly Arg Gly Leu Val Val Thr Gly Trp

325 330 335

Val Pro Gln Ile Gly Val Leu Ala His Gly Ala Val Ala Ala Phe Leu

340 345 350

Thr His Cys Gly Trp Asn Ser Thr Ile Glu Gly Leu Leu Phe Gly His

355 360 365

Pro Leu Ile Met Leu Pro Ile Ser Ser Asp Gln Gly Pro Asn Ala Arg

370 375 380

Leu Met Glu Gly Arg Lys Val Gly Met Gln Val Pro Arg Asp Glu Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Arg Arg Glu Asp Val Ala Ala Thr Val Arg Ala Val

405 410 415

Ala Val Glu Glu Asp Gly Arg Arg Val Phe Thr Ala Asn Ala Lys Lys

420 425 430

Met Gln Glu Ile Val Ala Asp Gly Ala Cys His Glu Arg Cys Ile Asp

435 440 445

Gly Phe Ile Gln Gln Leu Arg Ser Tyr Lys Ala

450 455

<210> 6

<211> 1380

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 6

atggatggta actcctcctc ctcgccgctg catgtggtca tttgtccgtg gctggctctg 60

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tcgaaagaat tgaatggcaa gcctgacctt atcattggta actacagtga tggaaatctt 2640

gttgcttctt tattggctca caaacttggt gtcactcagt gtaccattgc tcatgctctt 2700

gagaaaacaa agtacccgga ttctgatatc tactggaaga agcttgacga caagtaccat 2760

ttctcatgcc agttcactgc ggatattttc gcaatgaacc acactgattt catcatcact 2820

agtactttcc aagaaattgc tggaagcaaa gaaactgttg ggcagtatga aagccacaca 2880

gcctttactc ttcccggatt gtatcgagtt gttcacggga ttgatgtgtt tgatcccaag 2940

ttcaacattg tctctcctgg tgctgatatg agcatctact tcccttacac agaggagaag 3000

cgtagattga ctaagttcca ctctgagatc gaggagctcc tctacagcga tgttgagaac 3060

aaagagcact tatgtgtgct caaggacaag aagaagccga ttctcttcac aatggctagg 3120

cttgatcgtg tcaagaactt gtcaggtctt gttgagtggt acgggaagaa cacccgcttg 3180

cgtgagctag ctaacttggt tgttgttgga ggagacagga ggaaagagtc aaaggacaat 3240

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gttgtggagg ctatgacttg tggtttaccg actttcgcca cttgcaaagg tggtccagct 3480

gagatcattg tgcacggtaa atcgggtttc cacattgacc cttaccatgg tgatcaggct 3540

gctgatactc ttgctgattt cttcaccaag tgtaaggagg atccatctca ctgggatgag 3600

atctcaaaag gagggcttca gaggattgag gagaaataca cttggcaaat ctattcacag 3660

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<210> 11

<211> 1272

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 11

Met Asp Ser Gly Tyr Ser Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Ala Gly Met His

1 5 10 15

Val Val Ile Cys Pro Trp Leu Ala Phe Gly His Leu Leu Pro Cys Leu

20 25 30

Asp Leu Ala Gln Arg Leu Ala Ser Arg Gly His Arg Val Ser Phe Val

35 40 45

Ser Thr Pro Arg Asn Ile Ser Arg Leu Pro Pro Val Arg Pro Ala Leu

50 55 60

Ala Pro Leu Val Ala Phe Val Ala Leu Pro Leu Pro Arg Val Glu Gly

65 70 75 80

Leu Pro Asp Gly Ala Glu Ser Thr Asn Asp Val Pro His Asp Arg Pro

85 90 95

Asp Met Val Glu Leu His Arg Arg Ala Phe Asp Gly Leu Ala Ala Pro

100 105 110

Phe Ser Glu Phe Leu Gly Thr Ala Cys Ala Asp Trp Val Ile Val Asp

115 120 125

Val Phe His His Trp Ala Ala Ala Ala Ala Leu Glu His Lys Val Pro

130 135 140

Cys Ala Met Met Leu Leu Gly Ser Ala His Met Ile Ala Ser Ile Ala

145 150 155 160

Asp Arg Arg Leu Glu Arg Ala Glu Thr Glu Ser Pro Ala Ala Ala Gly

165 170 175

Gln Gly Arg Pro Ala Ala Ala Pro Thr Phe Glu Val Ala Arg Met Lys

180 185 190

Leu Ile Arg Thr Lys Gly Ser Ser Gly Met Ser Leu Ala Glu Arg Phe

195 200 205

Ser Leu Thr Leu Ser Arg Ser Ser Leu Val Val Gly Arg Ser Cys Val

210 215 220

Glu Phe Glu Pro Glu Thr Val Pro Leu Leu Ser Thr Leu Arg Gly Lys

225 230 235 240

Pro Ile Thr Phe Leu Gly Leu Met Pro Pro Leu His Glu Gly Arg Arg

245 250 255

Glu Asp Gly Glu Asp Ala Thr Val Arg Trp Leu Asp Ala Gln Pro Ala

260 265 270

Lys Ser Val Val Tyr Val Ala Leu Gly Ser Glu Val Pro Leu Gly Val

275 280 285

Glu Lys Val His Glu Leu Ala Leu Gly Leu Glu Leu Ala Gly Thr Arg

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Phe Leu Trp Ala Leu Arg Lys Pro Thr Gly Val Ser Asp Ala Asp Leu

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Leu Pro Ala Gly Phe Glu Glu Arg Thr Arg Gly Arg Gly Val Val Ala

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Thr Arg Trp Val Pro Gln Met Ser Ile Leu Ala His Ala Ala Val Gly

340 345 350

Ala Phe Leu Thr His Cys Gly Trp Asn Ser Thr Ile Glu Gly Leu Met

355 360 365

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Asn Ala Arg Leu Ile Glu Ala Lys Asn Ala Gly Leu Gln Val Ala Arg

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Asn Asp Gly Asp Gly Ser Phe Asp Arg Glu Gly Val Ala Ala Ala Ile

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Arg Ala Val Ala Val Glu Glu Glu Ser Ser Lys Val Phe Gln Ala Lys

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Ala Lys Lys Leu Gln Glu Ile Val Ala Asp Met Ala Cys His Glu Arg

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Arg Leu Asn Glu Thr Leu Val Ser Glu Arg Asn Glu Val Leu Ala Leu

485 490 495

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Ile Ile Ala Glu Phe Glu Ala Leu Pro Glu Gln Thr Arg Lys Lys Leu

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530 535 540

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Trp Glu Tyr Leu Arg Val Asn Leu His Ala Leu Val Val Glu Glu Leu

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Gln Pro Ala Glu Phe Leu His Phe Lys Glu Glu Leu Val Asp Gly Val

580 585 590

Lys Asn Gly Asn Phe Thr Leu Glu Leu Asp Phe Glu Pro Phe Asn Ala

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Leu Asp Leu Leu Glu Ala Pro Asp Pro Cys Thr Leu Glu Thr Phe Leu

725 730 735

Gly Arg Val Pro Met Val Phe Asn Val Val Ile Leu Ser Pro His Gly

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Val Val Tyr Ile Leu Asp Gln Val Arg Ala Leu Glu Ile Glu Met Leu

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835 840 845

Val Trp Pro Tyr Leu Glu Thr Tyr Thr Glu Asp Ala Ala Val Glu Leu

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Ser Lys Glu Leu Asn Gly Lys Pro Asp Leu Ile Ile Gly Asn Tyr Ser

865 870 875 880

Asp Gly Asn Leu Val Ala Ser Leu Leu Ala His Lys Leu Gly Val Thr

885 890 895

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Asp Ile Tyr Trp Lys Lys Leu Asp Asp Lys Tyr His Phe Ser Cys Gln

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Asp Met Ser Ile Tyr Phe Pro Tyr Thr Glu Glu Lys Arg Arg Leu Thr

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Asn Leu Val Val Val Gly Gly Asp Arg Arg Lys Glu Ser Lys Asp

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Asn Glu Glu Lys Ala Glu Met Lys Lys Met Tyr Asp Leu Ile Glu

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Glu Tyr Lys Leu Asn Gly Gln Phe Arg Trp Ile Ser Ser Gln Met

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Asp Arg Val Arg Asn Gly Glu Leu Tyr Arg Tyr Ile Cys Asp Thr

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<210> 12

<211> 3819

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 12

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gaaagccaca cagcctttac tcttcccgga ttgtatcgag ttgttcacgg gattgatgtg 2940

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acagaggaga agcgtagatt gactaagttc cactctgaga tcgaggagct cctctacagc 3060

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acaatggcta ggcttgatcg tgtcaagaac ttgtcaggtc ttgttgagtg gtacgggaag 3180

aacacccgct tgcgtgagct agctaacttg gttgttgttg gaggagacag gaggaaagag 3240

tcaaaggaca atgaagagaa agcagagatg aagaaaatgt atgatctcat tgaggaatac 3300

aagctaaacg gtcagttcag gtggatctcc tctcagatgg accgggtaag gaacggtgag 3360

ctgtaccggt acatctgtga caccaagggt gcttttgtcc aacctgcatt atatgaagcc 3420

tttgggttaa ctgttgtgga ggctatgact tgtggtttac cgactttcgc cacttgcaaa 3480

ggtggtccag ctgagatcat tgtgcacggt aaatcgggtt tccacattga cccttaccat 3540

ggtgatcagg ctgctgatac tcttgctgat ttcttcacca agtgtaagga ggatccatct 3600

cactgggatg agatctcaaa aggagggctt cagaggattg aggagaaata cacttggcaa 3660

atctattcac agaggctctt gacattgact ggtgtgtatg gattctggaa gcatgtctcg 3720

aaccttgacc gtcttgaggc tcgccgttac cttgaaatgt tctatgcatt gaagtatcgc 3780

ccattggctc aggctgttcc tcttgcacaa gatgattga 3819