本發(fā)明涉及產(chǎn)生手性β硝基醇化合物的方法，其中醛或酮化合物在硝基烷烴化合物和cupin-硝基醛縮酶的存在下轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的β硝基醇化合物。本發(fā)明特別涉及對映選擇性催化亨利反應(yīng)的(R)-選擇性cupin-硝基醛縮酶。

背景技術(shù)：

生物催化過程對于化工行業(yè)已經(jīng)變得非常重要。當(dāng)生物催化劑的性質(zhì)使兩種對映體中的任一種能夠與手性或前手性化合物的化學(xué)反應(yīng)中優(yōu)先反應(yīng)或形成時，具有特別重要性的是酶的使用。

利用酶的這些有利性質(zhì)的基本要求是如在工業(yè)加工中所需的其足量的低成本的可用性、足夠高的反應(yīng)性、選擇性和在工業(yè)加工的實際條件下的高穩(wěn)定性。

β硝基醇為β氨基醇的前體，其是用于生物活性化合物——如用作藥物成分的麻黃堿、苯丁抑制素和鞘氨醇——合成的重要的手性結(jié)構(gòu)單元。硝基醛醇(nitroaldol)或亨利反應(yīng)是用于C-C鍵形成的有機合成中經(jīng)典命名反應(yīng)之一。由于創(chuàng)建達(dá)兩個新的手性中心的潛力，其能夠?qū)τ尺x擇性和立體選擇性地進行硝基醛醇加成對于合成應(yīng)用是至關(guān)重要的。盡管該反應(yīng)已經(jīng)被熟知一個多世紀(jì)(Henry，1895)，但是利用非酶有機催化劑或手性金屬催化劑的立體特異的方案最近才被開發(fā)。這些方法的發(fā)展是令人印象深刻，但它們?nèi)匀挥性S多缺點，包括長的反應(yīng)時間、并在金屬催化劑的情況下有時極端的反應(yīng)條件、或者在有機催化劑的情況下選擇性不足。

在過去十年中，第一個不對稱的生物催化硝基醛醇反應(yīng)被發(fā)現(xiàn)針對來自熱帶橡膠樹巴西三葉膠(Hevea brasiliensis)(HbHNL)羥基腈裂解酶(hydroxynitrile lyase)(Purkarthofer et al.,Angew Chem Int Ed Engl.2006 45(21):3454-6,Gruber-Khadjawi et al.,Adv.Synth.Catal.2007,349,1445–1450,Yuryev,R.；et al.,Biocatal.Biotransform.,(2010)28,348；Yuryev,R.；et al.；Chemcatchem,(2010)2,981))。

屬于α/β水解酶超家族的類似HbHNL的來自木薯(Manihot esculenta)的(S)-選擇性MeHNL，也能夠催化(S)-選擇性硝基醛醇反應(yīng)，雖然具有較低的活性和選擇性。

催化(R)-選擇性HNL催化的亨利反應(yīng)的第一(R)-選擇性HNL是來自Arabidobsis thaliana的AtHNL(Fuhshuku et al.J.Biotechnol.2011,153,153-159)，其也屬于類似(S)-選擇性硝基醛縮酶的α/β水解酶超家族。

相比之下，硝基醛醇反應(yīng)中的活性到目前為止尚未針對來自屬于不同蛋白質(zhì)折疊的Prunus amygdalus(PaHNL)的(S)-選擇性羥基腈裂解酶而顯示。

然而，不幸的是，在報告的反應(yīng)條件下在延長的反應(yīng)時間(2小時至4小時)內(nèi)AtHNL的反應(yīng)產(chǎn)物的對映體過量顯著減少，而產(chǎn)率沒有增加(Fuhshuku et al.2011)。

施用每mmol苯甲醛40mg AtHNL，Asano和同事實現(xiàn)了具有50％乙酸正丁酯(30％產(chǎn)率和91％ee)的pH為7的兩相系統(tǒng)中苯甲醛和MeNO₂的最高對映體選擇性。通過施用較大量的酶(100mg每mmol底物)進一步略微改善了產(chǎn)率和對映體過量。根據(jù)底物和反應(yīng)系統(tǒng)，產(chǎn)率達(dá)60％或?qū)τ丑w過量達(dá)96％可以通過施用每mmol底物40mg AtHNL和2小時的反應(yīng)時間實現(xiàn)。然而，其在相同的反應(yīng)條件下不能共存。

然而，在報告的反應(yīng)條件下在延長的反應(yīng)時間(2小時至4小時)內(nèi)AtHNL反應(yīng)產(chǎn)物的對映體過量顯著減少，而產(chǎn)率沒有增加。沒有使用硝基乙烷。

Gotor和同事報道了通過水中載體蛋白牛血清白蛋白(BSA)的硝基醛醇反應(yīng)的蛋白質(zhì)介導(dǎo)的催化，其可以被歸類為有機催化，因為科學(xué)家的觀察導(dǎo)致非特異性蛋白催化的結(jié)論。(Busto,E.；Gotor-Fernandez,V.；Gotor,V.,Org.Process Res.Dev.,(2011)15,236)。生物催化的硝基醛醇反應(yīng)也報道于酶(有關(guān)綜述，參見Milner,S.E.；et al.,Eur.J.Org.Chem,(2012),3059)，諸如轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(Tang,R.C.；et al.,J.Mol.Catal.B:Enzym.,(2010)63,62)、水解酶(Wang,J.L.；et al.,J.Biotechnol.,(2010)145,240)、蛋白酶(Lopez-Iglesias,M.；et al.,Adv.Synth.Catal.,(2011)353,2345)、脂肪酶(Le,Z.-G.；et al.,Green Chem.Lett.Rev.,(2013)6,277；Xia,W.-J.；et al.,Molecules,(2013)18,13910)、酰基轉(zhuǎn)移酶(Xia,W.-J.；et al.,Molecules,(2013)18,13910)和葡糖淀粉酶(Gao,N.；et al.,RSC Adv.,(2013)3,16850)，但在所有情況下，反應(yīng)不是對映選擇性或均沒有提供關(guān)于對映體選擇性的數(shù)據(jù)。

因此，到目前為止，只有具有α/β水解酶折疊的植物HNL能夠催化對映選擇性的硝基醛醇反應(yīng)。

另一種方法是化學(xué)-酶促方法，其中立體異構(gòu)體的化學(xué)合成的混合物通過酶動力學(xué)拆分，例如使用水解酶來分離。然而，動力學(xué)拆分的主要缺點一般是產(chǎn)率被限制為50％最大值。

因此，仍然需要新的硝基醛縮酶，其可以對映選擇性催化亨利反應(yīng)。

最近，具有cupin折疊的新細(xì)菌HNL的發(fā)現(xiàn)已經(jīng)被報道(Hajnal,I.；et al.,Febs J.,(2013)280,5815；Hussain,Z.；et al.,Appl.Environ.Biotechnol.,(2012)78,2053)，但只顯示非常低的特異性活性。新的酶之一，GtHNL，被詳細(xì)表征，其結(jié)構(gòu)被分析(Hajnal,I.；et al.,Febs J.,(2013)280,5815；A.；et al.,Acta Crystallogr.F,(2012)68,451)。它是具有約15kDa分子量的小的金屬依賴性的單cupin，其形成四聚體。

發(fā)明概要

本發(fā)明的目的是提供用于產(chǎn)生β硝基醇化合物的改善的方法。該方法包括提供醛或酮化合物和在硝基烷烴化合物和cupin-硝基醛縮酶的存在下將化合物轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的β-硝基醇化合物的步驟。本發(fā)明特別涉及(R)-選擇性cupin-硝基醛縮酶，其可以對映選擇性催化亨利反應(yīng)。

附圖說明

圖1A：GtHNL(PDB-代碼:4BIF)的結(jié)構(gòu)的一個cupin單體的卡通表示。

1B：SEQ ID NO:1、NO:3和NO:5-10的多序列比對。

圖2：AcHNL和GtHNL以及GtHNL的三重變體(GtHNL-A40H/V42T/Q110H,簡短:GtHNLmut)和AcHNL(AcHNL-A40H/V42T/Q110H,簡短:AcHNLmut)與苯甲醛(20μmol)和硝基甲烷(1mmol)在具有50％TBME的雙相系統(tǒng)中的硝基醛醇反應(yīng)。使用澄清的裂解物(酶/mmol BA的量是指酶本身，假設(shè)總裂解物蛋白的約50％是HNL)或者純化的酶。轉(zhuǎn)化率和ee值在6小時的反應(yīng)時間后測量。

圖3：三重變體GtHNL-A40H/V42T/Q110H(簡短:GtHNLmut)與苯甲醛(20μmol)和硝基甲烷(1mmol)在具有50％TBME和不同的蛋白質(zhì)與底物比率的雙相系統(tǒng)中的硝基醛醇反應(yīng)。AtHNL用作參考。轉(zhuǎn)化率和ee值在2小時和24小時的反應(yīng)時間后測量。

圖4：幾種cupin-硝基醛縮酶與苯甲醛(20μmol)和硝基甲烷(1mmol)在具有50％TBME的雙相系統(tǒng)中的硝基醛醇反應(yīng)。轉(zhuǎn)化率和ee值在2小時、4小時和24小時的反應(yīng)時間后測定。

圖5：cupin-硝基醛縮酶的蛋白質(zhì)序列

SEQ ID NO:1GtHNL(Granulicella tundricola MP5ACTX9,Uniprot E8WYN5)

SEQ ID NO:2GtHNL三重變體(A40H、V42T、Q110H)的蛋白質(zhì)序列

SEQ ID NO:3AcHNL(莢膜乳桿菌(Acidobacterium capsulatum)ATCC 51196；Uniprot C1F951)的蛋白質(zhì)序列

SEQ ID NO:4AcHNL三重變體(A40H、V42T、Q110H)的蛋白質(zhì)序列

SEQ ID NO:5cupin 2保守桶結(jié)構(gòu)域蛋白(conserved barrel domain protein)(Uniprot B8ENI4)的蛋白質(zhì)序列

SEQ ID NO:6cupin 2保守桶結(jié)構(gòu)域蛋白(Uniprot A5G162)的蛋白質(zhì)序列

SEQ ID NO:7cupin 2保守桶結(jié)構(gòu)域蛋白(Uniprot C6D499)的蛋白質(zhì)序列

SEQ ID NO:8未表征蛋白質(zhì)(Uniprot C1D3E9)的蛋白質(zhì)序列

SEQ ID NO:9cupin 2保守桶結(jié)構(gòu)域蛋白(Uniprot A6U7V5)的蛋白質(zhì)序列

SEQ ID NO:10cupin 2保守桶結(jié)構(gòu)域蛋白(Uniprot F8IF03)的蛋白質(zhì)序列

實施方式的描述

在第一方面中，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生β硝基醇化合物的方法，其中醛或酮化合物在硝基烷烴化合物和cupin-硝基醛縮酶的存在下轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的β硝基醇化合物。

在另一個方面中，本發(fā)明涉及如上所述的方法，其中cupin-硝基醛縮酶包含根據(jù)圖1A的保守桶結(jié)構(gòu)域。

在另一個方面中，本發(fā)明涉及如上所述的方法，其中cupin-硝基醛縮酶包含具有PFAM登錄CL0029的cupin超家族的保守桶結(jié)構(gòu)域。

在另一個方面中，本發(fā)明涉及如上所述的方法，其中cupin-硝基醛縮酶包含具有PFAM登錄PF07883的cupin 2家族的保守桶結(jié)構(gòu)域。

在另一個方面中，本發(fā)明涉及如上所述的方法，其中cupin-硝基醛縮酶屬于具有SCOP登錄51182的RmlC樣cupin超家族。

在另一個方面中，本發(fā)明涉及如上所述的方法，其中cupin-硝基醛縮酶包含根據(jù)InterPro蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫的RmlC樣凍輥折疊(IPR014710)。

在另一個方面中，本發(fā)明涉及如上所述的方法，其中cupin-硝基醛縮酶包含根據(jù)InterPro蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫的RmlC樣cupin結(jié)構(gòu)域(IPR011051)。

在另一個方面中，本發(fā)明涉及如上所述的方法，其中cupin-硝基醛縮酶包含根據(jù)InterPro蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫的cupin 2保守桶結(jié)構(gòu)域(IPR013096)。

在另一個方面中，本發(fā)明涉及如上所述的方法，其中式I的化合物與式II的化合物在cupin-硝基醛縮酶的存在下反應(yīng)，得到式III的β硝基醇化合物

其中，

R¹和R²彼此獨立地來自H、C_1-20烷基、C_2-20烯基、或C_2-20炔基、C_3-10環(huán)烷基、C_4-20環(huán)烷基烷基、C_6-14芳基、C_7-20芳基烷基、3-14元雜環(huán)烷基、4-20元雜環(huán)烷基烷基、5-20元雜芳基或6-20元雜芳基烷基，任選被一個或多個R^a取代；

R³和R⁴彼此獨立地來自H或C_1-20烷基，任選被一個或多個R^a取代；和

每個R^a獨立地是H、鹵素、-CF₃、-OR^b、-NR^bR^b、-(CH₂)_nCOOR^b、-(CH₂)_nC(＝O)R^b、-(CH₂)_nCONR^bR^b、C_1-20烷基、C_2-20烯基、或C_2-20炔基；和

每個R^b獨立地為H或任選地取代的C_1-20烷基、C_2-20烯基、或C_2-20炔基；和

n為0、1、2或3。

烷基，如果沒有另外說明，指的是線性的或分支的C_1-20烷基，優(yōu)選為一至二十個碳原子的直鏈或支鏈，任選被取代。烷基可以被一個或多個R^a取代。

烯基，如果沒有另外說明，指的是部分不飽和的線性的或分支的C_2-20烯基，優(yōu)選為含有至少一個雙鍵的二至二十個碳原子的直鏈或支鏈，任選被取代。烯基可以被一個或多個R^a取代。

炔基，如果沒有另外說明，指的是部分不飽和的線性的或分支的C_2-20炔基，優(yōu)選為含有至少一個三鍵的二至二十個碳原子的直鏈或支鏈，任選被取代。炔基可以被一個或多個R^a取代。

環(huán)烷基指的是含有三至十個碳原子、優(yōu)選四至六個碳原子的單環(huán)的非芳香烴環(huán)，或含有七至十個碳原子、優(yōu)選七個碳原子的雙環(huán)的非芳香烴環(huán)系統(tǒng)，其中環(huán)烷基任選地包含一個或多個雙鍵或三鍵，任選被取代。環(huán)烷基可以被一個或多個R^a取代。

雜環(huán)烷基指的是含有三至十四個碳原子、優(yōu)選四至八個碳原子的單環(huán)的非芳香烴環(huán)，或含有七至十四個碳原子、優(yōu)選八至十個碳原子的雙環(huán)的非芳香烴環(huán)系統(tǒng)，其中在雜環(huán)烷基中，烴環(huán)或環(huán)系統(tǒng)中的一個或多個碳原子被選自–N–、–O–、–S–、–S(O)–、–S(O)₂–、–Si–和–P–的基團取代；其中雜環(huán)烷基任選包含一個或多個雙鍵，任選被取代。雜環(huán)烷基可以被一個或多個R^a取代。

芳基優(yōu)選指的是單、雙、三或四環(huán)的芳香族烴基團，優(yōu)選具有六至十四個碳原子的單環(huán)芳香族烴基團；芳基優(yōu)選地為苯基，任選被取代，任選被取代。芳基可以被一個或多個R^a取代。

雜芳基指的是芳香族5或6元單環(huán)的烴基團，其中至少一個碳原子由雜原子如O、N、和/或S替換，并且其中芳香族單環(huán)的5或6元環(huán)烴基團任選稠合到另外的單環(huán)的5至7元、優(yōu)選5或6元芳香族或非芳香族烴環(huán)，其中在另外的單環(huán)的芳香族或非芳香族烴環(huán)中，一個或多個、優(yōu)選一個或兩個碳原子可以被雜原子如O、N、和/或S替換，任選被取代。雜芳基可以被一個或多個R^a取代。

鹵素基團為氯、溴、氟或碘。

本文所用的任選被取代，是指選自緊挨著取代的和未取代的C_6-14芳基或C_5-14雜芳基殘基的鹵素、-OH、-OCH₃、-CN、羰基和羧基、C_1-20烷基、C_2-20烯基、和C_2-20炔基的取代基。

該方法可以在單或雙相系統(tǒng)或乳液中進行。

單相反應(yīng)溶液包含水或有機溶劑。

合適的水溶液是例如水、含cupin-硝基醛縮酶溶液、或緩沖溶液。緩沖溶液的實例是磷酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、醋酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液、MES、HEPES、Tris緩沖液、或它們的混合物。這些溶液的pH可以在pH 2和9之間，優(yōu)選為4至7。

合適的有機溶液可以是稍微水混溶的或水不混溶的脂肪族或芳香族烴，其是任選鹵代的醇、醚或酯或它們的混合物或底物本身。合適的是，例如，但不限于乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲基叔丁基醚、二異丙醚、二丁醚、四氯化碳、苯、甲苯、環(huán)己烷、十六烷、己烷、庚烷、氯仿、二甲苯、戊醇、己醇、辛醇和十二烷醇、DMF、DMSO、乙腈、硝基甲烷、硝基乙烷、或它們的混合物。新的溶劑也是適用的，其指的是離子液體和超臨界流體。

水-有機溶劑兩液相系統(tǒng)中的導(dǎo)電生物轉(zhuǎn)化的優(yōu)點在本領(lǐng)域中是公知的。雙相系統(tǒng)由互不混溶的兩相組成，例如水相和有機。

在進一步的方面，本發(fā)明涉及如上所述的方法，其中反應(yīng)在單或雙相系統(tǒng)或在乳液中進行。

在進一步的方面，本發(fā)明涉及如上所述的方法，其中雙相系統(tǒng)包含如本文所述的水溶液和有機溶液。

本發(fā)明的cupin-硝基醛縮酶可以作為純化的酶或作為整個細(xì)胞懸浮液或包含于無細(xì)胞裂解物內(nèi)或以固定化的形式，例如在諸如Avicel等載體上，或作為交聯(lián)酶聚合體(CLEA)而存在。

此外轉(zhuǎn)化發(fā)生在-10℃至+50℃，優(yōu)選在0℃至35℃的溫度下。

適用的親電體選擇在芳香族至雜芳香族和脂族醛范圍內(nèi)。根據(jù)底物和反應(yīng)系統(tǒng)，產(chǎn)率達(dá)97.3％或?qū)τ丑w過量>99％可以通過本發(fā)明的方法得到。

在進一步的方面，本發(fā)明涉及如上所述的方法，其中β硝基醇化合物在至少55％，優(yōu)選至少60％，更優(yōu)選至少75％對映體過量(e.e.)下獲得。

在進一步的方面，本發(fā)明涉及如上所述的方法，其中β-硝基醇化合物在至少10％，優(yōu)選至少20％，更優(yōu)選至少50％的轉(zhuǎn)化率下獲得。

蛋白質(zhì)cupin超家族的蛋白質(zhì)(PFAM：CL0029)含有由10至12個反平行β鏈構(gòu)成的保守β桶結(jié)構(gòu)域(圖1A)。Cupa是桶的拉丁術(shù)語。在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的結(jié)構(gòu)分類(SCOP)中，它們被分類為雙鏈β螺旋折疊內(nèi)的RmlC樣cupins超家族[51182]。cupin折疊在多種酶，但也在非酶蛋白中被發(fā)現(xiàn)。Cupin結(jié)構(gòu)域可以單獨地或與其它結(jié)構(gòu)域組合地在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中被一次、兩次或更多次發(fā)現(xiàn)。雖然cupin超家族中的蛋白質(zhì)顯示出非常低的總序列相似性，但是它們都包含由在長度和氨基酸序列兩者中有變化的較不保守的基序間(intermotif)區(qū)域分開的兩個短的但部分保守的cupin序列基序(圖1)。cupin超家族的蛋白質(zhì)在古細(xì)菌、細(xì)菌和真核生物中具有廣泛的生物學(xué)功能。

Cupin在結(jié)構(gòu)上是保守的，并且通常含有兩個保守基序，G-(X)₅-H-X-H-(X)_3,4-E-(X)₆-G(基序1)和G-(X)₅-P-X-G-(X)₂-H-(X)₃-N(基序2)，總體序列同一性是在該超家族的成員中是低的。這兩個基序還包括用于金屬結(jié)合的殘基。大多數(shù)cupin是金屬結(jié)合蛋白，其結(jié)合二價陽離子，如鐵、鋅、錳、銅、鎳或鎘。該金屬通常直接在反應(yīng)機理中或至少經(jīng)由與底物的相互作用來參與酶促反應(yīng)。

在進一步的方面中，本發(fā)明涉及cupin-硝基醛縮酶，其能夠催化非對稱β硝基醇反應(yīng)，其中轉(zhuǎn)化率為至少10％，優(yōu)選至少20％，更優(yōu)選至少50％。

在進一步的方面中，本發(fā)明涉及cupin-硝基醛縮酶，其中cupin-硝基醛縮酶包含根據(jù)圖1A的保守桶結(jié)構(gòu)域。

在進一步的方面中，本發(fā)明涉及cupin-硝基醛縮酶，其中cupin-硝基醛縮酶包含具有PFAM登錄CL0029的cupin超家族的保守桶結(jié)構(gòu)域。

在進一步的方面中，本發(fā)明涉及cupin-硝基醛縮酶，其中cupin-硝基醛縮酶包含具有PFAM登錄PF07883的cupin 2家族的保守桶結(jié)構(gòu)域。

在進一步的方面中，本發(fā)明涉及cupin-硝基醛縮酶，其中cupin-硝基醛縮酶屬于具有SCOP登錄51182的RmlC樣cupin超家族。

在另一個方面中，本發(fā)明涉及cupin-硝基醛縮酶，其中cupin-硝基醛縮酶包含根據(jù)InterPro蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫的RmlC樣凍輥折疊(IPR014710)。

在另一個方面中，本發(fā)明涉及cupin-硝基醛縮酶，其中cupin-硝基醛縮酶包含根據(jù)InterPro蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫的RmlC樣cupin結(jié)構(gòu)域(IPR011051)。

在另一個方面中，本發(fā)明涉及cupin-硝基醛縮酶，其中cupin-硝基醛縮酶包含根據(jù)InterPro蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫的cupin 2保守桶結(jié)構(gòu)域(IPR013096)。

本發(fā)明的進一步的方面是如上所述的cupin-硝基醛縮酶，其是重組cupin-硝基醛縮酶。

本發(fā)明的進一步的方面是如上所述的cupin-硝基醛縮酶，其包含至少一個、具體地至少兩個、具體地至少三個、具體地至少四個、具體地至少五個或更多個氨基酸修飾。

根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“修飾”指的是至少一個氨基酸的缺失或取代或插入。具體地，修飾是一個氨基酸的取代。

在本發(fā)明的具體實施方式中，cupin-硝基醛縮酶包含一個、兩個或三個氨基酸取代。

根據(jù)本發(fā)明的實施方式，任何氨基酸可以被選擇用以取代野生型序列的氨基酸。

被取代的氨基酸選自精氨酸、賴氨酸、組氨酸和蘇氨酸。具體地，所述被取代的氨基酸是精氨酸、組氨酸或蘇氨酸。

在進一步的方面中，本發(fā)明涉及如上所述的cupin-硝基醛縮酶，其中cupin-硝基醛縮酶的氨基酸序列與各自的野生型酶至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、或至少98％相同。

在進一步的方面中，本發(fā)明涉及如上所述的cupin-硝基醛縮酶，其在根據(jù)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3的編號的位置40、42和/或110中的任一處進行修飾(圖1B)。

在進一步的方面中，本發(fā)明涉及如上所述的cupin-硝基醛縮酶，其在根據(jù)SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的編號的位置40、42和/或110中的任一處進行修飾(圖1B)。

根據(jù)本發(fā)明的實施方式，位置40、42和/或110中的任一處的修飾是氨基酸取代。

根據(jù)進一步的實施方式，本發(fā)明的cupin-硝基醛縮酶變體含有保守桶結(jié)構(gòu)域的位置40、42和110中的任一處的一個、兩個或三個取代。

在進一步的方面中，本發(fā)明涉及如上所述的cupin-硝基醛縮酶，其具有SEQ ID NO:2(GtHNLmut)或(SEQ ID NO:4(AcHNLmut)。

根據(jù)進一步的實施方式，cupin-硝基醛縮酶變體是根據(jù)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5至10的編號的A40H或A40R。

根據(jù)進一步的實施方式，cupin-硝基醛縮酶變體是根據(jù)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5至10的編號的V42T或Q110H。

根據(jù)進一步的實施方式，cupin-硝基醛縮酶變體是根據(jù)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5至10的編號的A40H V42T。

根據(jù)具體的實施方式，cupin-硝基醛縮酶變體是根據(jù)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5至10的編號的A40H V42T Q110H。

在進一步的方面中，本發(fā)明涉及如上所述的cupin-硝基醛縮酶，其特征在于其包括通式：(X1)(X2)(X3)(X4)F(X5)PGAR(X6)(X7)WH(X8)HP(X9)G的氨基酸序列，其中，

X1為A、V、L、F、Y、M、S、T、G、H、N、K或R殘基，優(yōu)選地其是A、或N；

X2是任意氨基酸，優(yōu)選地其是S、H、A、或T；

X3為V、A、I、C、M、H、或T殘基，優(yōu)選地其是V；

X4是任意氨基酸，優(yōu)選地其是T或R；

X5是任意氨基酸，優(yōu)選地其是E；

X6是T、S或N殘基，優(yōu)選地其是T；

X7是任意氨基酸，優(yōu)選地其是A；

X8是T、S、或者I殘基，優(yōu)選地其是T；

X9是任意氨基酸，優(yōu)選地其是L；

并且其中位置X1或X3中的至少一個被H、K、R或T殘基取代。

在進一步的方面中，本發(fā)明涉及如上所述的cupin-硝基醛縮酶，其特征在于其包括通式：(X1)(X2)(X3)(X4)F(X5)PGAR(X6)(X7)WH(X8)HP(X9)G的氨基酸序列，其中，

X1為A、V、L、F、Y、M、S、H、G、N、K或R殘基，優(yōu)選地其是A、或N；

X2是任意氨基酸，優(yōu)選地其是S、H、A、或T；

X3為V、A、I、C、M、或T殘基，優(yōu)選地其是V；

X4是任意氨基酸，優(yōu)選地其是T或R；

X5是任意氨基酸，優(yōu)選地其是E；

X6是T、S或N殘基，優(yōu)選地其是T；

X7是任意氨基酸，優(yōu)選地其是A；

X8是T、S、或者I殘基，優(yōu)選地其是T；

X9是任意氨基酸，優(yōu)選地其是L；

并且其中位置X1或X3中的至少一個被H、K、R或T殘基取代。

在進一步的方面中，本發(fā)明涉及如上所述的cupin-硝基醛縮酶，其特征在于其包括通式：(X1)(X2)(X3)(X4)F(X5)PGAR(X6)(X7)WH(X8)HP(X9)G的氨基酸序列，其中，

X1為A、V、L、F、Y、M、S、T、G、N、K或R殘基，優(yōu)選地其是A、或N；

X2是任意氨基酸，優(yōu)選地其是S、H、A、或T；

X3為V、A、I、C、M、或H殘基，優(yōu)選地其是V；

X4是任意氨基酸，優(yōu)選地其是T或R；

X5是任意氨基酸，優(yōu)選地其是E；

X6是T、S或N殘基，優(yōu)選地其是T；

X7是任意氨基酸，優(yōu)選地其是A；

X8是T、S、或者I殘基，優(yōu)選地其是T；

X9是任意氨基酸，優(yōu)選地其是L；

并且其中位置X1或X3中的至少一個被H、K、R或T殘基取代。

在進一步的方面，本發(fā)明涉及如上所述的cupin-硝基醛縮酶，其特征在于其包括通式：(X1)(X2)(X3)(X4)F(X5)PGAR(X6)(X7)WH(X8)HP(X9)G的氨基酸序列，其中

X1為A、V、L、F、Y、M、S、G、N、K或R殘基，優(yōu)選地其是A、或N；

X2是任意氨基酸，優(yōu)選地其是S、H、A、或T；

X3為V、A、I、C、或M殘基，優(yōu)選地其是V；

X4是任意氨基酸，優(yōu)選地其是T或R；

X5是任意氨基酸，優(yōu)選地其是E；

X6是T、S或N殘基，優(yōu)選地其是T；

X7是任意氨基酸，優(yōu)選地其是A；

X8是T、S、或I殘基，優(yōu)選地其是T；

X9是任意氨基酸，優(yōu)選地其是L；

并且其中位置X1或X3中的至少一個被H、K、R或T殘基取代。

在進一步的方面中，本發(fā)明涉及如上所述的cupin-硝基醛縮酶，其特征在于其包括通式：(X1)(X2)(X3)(X4)FEPGARTAWHTHPLG的氨基酸序列，其中

X1為A、V、L、F、Y、M、S、T、G、H、K、N或R殘基，優(yōu)選地其是A、或N；

X2是任意氨基酸，優(yōu)選地其是S、H、A、或T；

X3為V、A、I、C、M、H、或T殘基，優(yōu)選地其是V；

X4是任意氨基酸，優(yōu)選地其是T或R；

并且其中位置X1或X3中的至少一個被H、K、R或T殘基取代。

在進一步的方面中，本發(fā)明涉及如上所述的cupin-硝基醛縮酶，其特征在于其包括通式：(X1)(X2)(X3)(X4)FEPGARTAWHTHPLG的氨基酸序列，其中

X1為A、V、L、F、Y、M、S、T、G、H、或N殘基，優(yōu)選地其是A、或N；

X2是任意氨基酸，優(yōu)選地其是S、H、A、或T；

X3為V、A、I、C、M、H、或T殘基，優(yōu)選地其是V；

X4是任意氨基酸，優(yōu)選地其是T或R；

并且其中位置X1或X3中的至少一個被H、K、R或T殘基取代。

在進一步的方面中，本發(fā)明涉及如上所述的cupin-硝基醛縮酶，其特征在于其包括通式：(X1)(X2)(X3)(X4)FEPGARTAWHTHPLG的氨基酸序列，其中

X1為A、V、L、F、Y、M、S、T、G、H、K、N或R殘基，優(yōu)選地其是A、或N；

X2是任意氨基酸，優(yōu)選地其是S、H、A、或T；

X3為V；

X4是任意氨基酸，優(yōu)選地其是T或R；

并且其中位置X1或X3中的至少一個被H、K、R或T殘基取代。

在進一步的方面中，本發(fā)明涉及如上所述的cupin-硝基醛縮酶，其特征在于其包括通式：(X1)(X2)(X3)(X4)FEPGARTAWHTHPLG的氨基酸序列，其中

X1為A、V、L、F、Y、M、S、G、N、K或R殘基，優(yōu)選地其是A、或N；

X2是任意氨基酸，優(yōu)選地其是S、H、A、或T；

X3為V、A、I、C、或M殘基，優(yōu)選地其是V；

X4是任意氨基酸，優(yōu)選地其是T或R；

并且其中位置X1或X3中的至少一個被H、K、R或T殘基取代。

在進一步的方面中，本發(fā)明涉及如上所述的cupin-硝基醛縮酶，其特征在于其包括通式：(X1)(X2)(X3)(X4)FEPGARTAWHTHPLG的氨基酸序列，其中

X1為A、或N殘基，優(yōu)選地其是A；

X2是任意氨基酸，優(yōu)選地其是S、H、A、或T；

X3為V、A、I、C、或M殘基，優(yōu)選地其是V；

X4是任意氨基酸，優(yōu)選地其是T或R；

并且其中位置X1或X3中的至少一個被H、K、R或T殘基取代。

在進一步的方面中，本發(fā)明涉及如上所述的cupin-硝基醛縮酶，其特征在于其包括通式：(X1)(X2)(X3)(X4)FEPGARTAWHTHPLG的氨基酸序列，其中

X1為A、或N殘基，優(yōu)選地其是A；

X2是任意氨基酸，優(yōu)選地其是S、H、A、或T；

X3為V；

X4是任意氨基酸，優(yōu)選地其是T或R；

并且其中位置X1或X3中的至少一個被H、K、R或T殘基取代。

在進一步的方面中，本發(fā)明涉及cupin-硝基醛縮酶，其具有根據(jù)SEQ ID NO：1或3或SEQ ID NO：5至10的編號的以下突變A40H、A40R、V42T和/或Q110H中的一個或多個。

在進一步的方面中，本發(fā)明涉及編碼如上所述的cupin-硝基醛縮酶的分離的多核酸分子。

在本發(fā)明的進一步的方面中，提供編碼如上所述的cupin-硝基醛縮酶的分離的多核酸分子。該多核酸可以是DNA或RNA。由此而導(dǎo)致編碼如上所述的本發(fā)明的cupin-硝基醛縮酶的修飾在DNA或RNA水平上進行。該分離的多核酸分子適用于如上所述的本發(fā)明的cupin-硝基醛縮酶的大規(guī)模生產(chǎn)。

在進一步的方面中，本發(fā)明涉及包含如上所述的分離的DNA分子的載體。

載體包含有效轉(zhuǎn)染以及蛋白質(zhì)有效表達(dá)必需的所有調(diào)控元件。這樣的載體是本領(lǐng)域公知的，并且任何合適的載體可以被選擇用于此目的。

本發(fā)明的另一方面涉及用如上所述的本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)染的重組非人類細(xì)胞。在本領(lǐng)域中公知的，可以進行細(xì)胞的轉(zhuǎn)染和重組細(xì)胞的培養(yǎng)。這樣的重組細(xì)胞以及任何來自其的后代細(xì)胞包含載體。從而提供連續(xù)地或依賴于載體活化后表達(dá)本發(fā)明cupin-硝基醛縮酶蛋白的細(xì)胞系。

在進一步的方面中，本發(fā)明涉及通過培養(yǎng)如上所述的重組細(xì)胞而獲得的培養(yǎng)物。

重組細(xì)胞可以在金屬離子的存在下，優(yōu)選在鐵或錳的存在下進行培養(yǎng)。

在進一步的方面中，本發(fā)明涉及從如上所述的培養(yǎng)物中回收的cupin-硝基醛縮酶。具體而言，該蛋白質(zhì)可以通過破壞細(xì)胞并從上清液中回收蛋白質(zhì)來進行分離。

在進一步的方面中，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生cupin-硝基醛縮酶的方法，其包括從如上所述的培養(yǎng)物中回收cupin-硝基醛縮酶。從細(xì)胞培養(yǎng)物進行的所述分離或純化可以通過本領(lǐng)域中已知的方法進行。具體地，親和層析、陰離子交換層析和大小排阻層析可以用于分離所述蛋白質(zhì)。

在進一步的方面中，本發(fā)明涉及如上所述產(chǎn)生的cupin-硝基醛縮酶，其用緩沖液中金屬鹽——例如FeCl₂、MnCl₂、CoCl₂、NiCl₂、CuCl₂或ZnCl₂——的溶液通過本領(lǐng)域中已知的方法進行溫育。

在進一步的方面中，本發(fā)明涉及如上所述產(chǎn)生的cupin-硝基醛縮酶，其中金屬通過本領(lǐng)域已知的方法在體外交換成錳、鐵、鎳、鈷、銅或鋅。

實施例

以下實施例被闡述以用于幫助理解本發(fā)明，但并不意圖并且不應(yīng)當(dāng)被解釋為以任何方式限制本發(fā)明的范圍。該實施例不包括常規(guī)方法，例如克隆、轉(zhuǎn)染、和用于過度表達(dá)微生物宿主細(xì)胞中蛋白質(zhì)的方法的基本方面的詳細(xì)說明。這樣的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。

實施例1.蛋白質(zhì)產(chǎn)生

編碼來自莢膜乳桿菌ATCC 51196(Uniprot C1F951,Ward et al.,Appl.Environ.Microbiol(2009)75,2046)的假定蛋白的基因(基因ID:NC_012483)針對大腸桿菌進行密碼子優(yōu)化(GeneArt,Life Technologies,Carlsbad,CA,USA)(以下稱為AcHNL)。編碼區(qū)兩側(cè)具有NdeI和HindIII限制位點，所述限制位點用于將基因克隆進表達(dá)載體pET26b(+)(Novagen,Merck KGaA,Darmstadt,Germany)。

對大腸桿菌進行密碼子優(yōu)化的編碼對應(yīng)于來自Granulicella tundricula的GtHNL的AciX9_0562(基因ID:322434201)的序列之前被克隆進表達(dá)載體pET26b(+)(Hajnal et al.,FEBS J.2013 280(22):5815-28)。GtHNL用作模板以用于半理性蛋白質(zhì)設(shè)計(semi-rational protein design)，更詳細(xì)地為位點飽和突變。突變A40H、V42T和Q110H導(dǎo)致改善的變體。在位置A40、V42和Q110處的最好的氨基酸交換通過定點突變進行組合。在位置A40、V42和Q110處的相同的氨基酸交換隨后也通過定點突變引入到AcHNL序列中。

大腸桿菌BL21-Gold(DE3)用作表達(dá)宿主(Stratagene,La Jolla,CA,USA)。細(xì)胞生長在補充硫酸卡那霉素(40mg/L的最終濃度)的LB(溶菌肉湯，Lennox)培養(yǎng)基(Carl Roth GmbH,Karlsruhe,Germany)中。通過向OD600～0.8培養(yǎng)物加入0.5mM的IPTG(異丙β-D-1-半乳糖硫吡喃糖苷)啟動重組蛋白的表達(dá)，并在25℃下繼續(xù)培養(yǎng)20小時。所有的酶通過表達(dá)培養(yǎng)基中存在的錳來產(chǎn)生。常規(guī)地，100μΜ的MnCl₂伴隨誘導(dǎo)加入。收獲細(xì)胞，將其重新懸浮于冷緩沖液(50mM磷酸鉀緩沖液pH 6.0)并通過超聲處理(Branson Sonifier S-250，設(shè)定為80％工作循環(huán)，和輸出控制7)兩次持續(xù)3分鐘而破壞，將其在冰上冷卻。將細(xì)胞裂解物以50,000g離心一小時，以除去未破壞的細(xì)胞和不溶物質(zhì)。無細(xì)胞裂解物通過0.45μm注射過濾器進行過濾，并且如果有需要，使用Vivaspin 20離心過濾裝置(10,000道爾頓截留分子量；Sartorius)將其濃縮至所需的濃度。將裂解物等分并冷凍直至進一步使用。蛋白質(zhì)表達(dá)通過標(biāo)準(zhǔn)SDS-PAGE監(jiān)測。AcHNL和GtHNL以及含有氨基酸取代A40H、A40R、V42T和Q110H的GtHNL和AcHNL變體在大腸桿菌BL21-Gold(DE3)中作為可溶性蛋白高產(chǎn)率表達(dá)，達(dá)到>總可溶性蛋白的50％的產(chǎn)率。

純化步驟改編自針對施用陰離子交換層析法和大小排阻層析法的GtHNL發(fā)表的方案(Hajnal et al.,2013)。簡言之，在緩沖液A(50mM Bis-Tris/HCl,pH 6.8或6.9,50mM NaCl)中將細(xì)胞通過超聲處理裂解，并將澄清的裂解物裝載在QSepharose陰離子交換柱(HiTrapTM Q FF 5mL,GE Healthcare,Uppsala,Sweden)上。蛋白質(zhì)用10％緩沖液B(50mM Bis-Tris/HCl,pH 6.6,1M NaCl)洗脫。在利用50mM NAPi，pH7.0，100mM NaCl預(yù)平衡的Superdex 75HiLoad 16/600柱(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)上進行大小排阻層析。含有目的蛋白的組分被匯集，且緩沖液交換至PD-10柱(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)上的50mM KPi，pH 6.0。常規(guī)地使用Bradford測定法(Biorad,Hercules,CA,USA)測定無細(xì)胞裂解物的蛋白質(zhì)濃度。施用基于使用Protparam的氨基酸序列計算的消光系數(shù)利用NanoDrop分光光度計(型號2000c,Peqlab,Erlangen,Germany)在280nm測定純化的蛋白質(zhì)的濃度。將蛋白質(zhì)保存在-80℃或-20℃直到進一步使用。成功摻入通過電感耦合等離子體/發(fā)射光譜(ICP-OES)證實。

實施例2.兩相系統(tǒng)中硝基醛醇反應(yīng)

使用由溶解在MTBE中的苯甲醛和硝基甲烷作為有機相和包含pH 6的磷酸鹽緩沖液中的無細(xì)胞裂解物或純化的酶的水相組成的兩相系統(tǒng)檢測這些酶催化β硝基醇合成的能力。

含有內(nèi)標(biāo)(0.2％1,3,5-三異丙苯，IS)、苯甲醛(20μmol，BA)和硝基甲烷(1mmol，NM)的有機溶劑(500μL MTBE)與500μL含有無細(xì)胞裂解物(約0.5-3mg含約50％cupin硝基醛縮酶的總蛋白)或純化的酶(約0.3-1.5mg)的pH為6的50mM磷酸鉀緩沖液進行混合。不含酶、在MnCl₂不存在下表達(dá)的AcHNL的無細(xì)胞裂解物、或者只是具有和沒有MnCl₂的緩沖液被用作陰性對照。使用如Asano的組描述的被作為合成基因并克隆到質(zhì)粒pET28a(+)-載體、表達(dá)和純化的陽性對照AtHNL(2-3mg)(Fuhshuku et al.,2011)。需要注意的是由于在較低的pH值下AtHNL的穩(wěn)定性問題，將其在pH 6.5下施用。將混合物在Eppendorf Thermomixer裝置中在30℃和1200rpm下溫育2-24小時。在13,000rpm下離心5分鐘停止反應(yīng)。五十μL有機相用450μL HPLC溶劑混合物進行稀釋并通過手性HPLC分析。

利用苯甲醛和硝基甲烷進行的第一cupin-硝基醛縮酶催化的亨利反應(yīng)的結(jié)果顯示在圖2和表1中。

表1.與圖2相關(guān)的轉(zhuǎn)化率和ee值。

n.d.:由于過低的轉(zhuǎn)化率而沒有測定

在溫育6小時后，AcHNL顯示出19％的轉(zhuǎn)化率和88％的ee。GtHNL-A40H/V42T/Q110H實現(xiàn)了近70％的轉(zhuǎn)化率和97％ee。如果施用澄清的裂解物或純化的酶，沒有觀察到區(qū)別。因此，純化的酶在所施加的反應(yīng)條件下是穩(wěn)定的，但在另一方面不需要進行純化以獲得良好至優(yōu)異的ee值。所有的陰性對照、在MnCl₂不存在下表達(dá)的AcHNL、以及在緩沖液或不含酶的大腸桿菌裂解物中施加的MnCl₂無活性。因此，cupin蛋白質(zhì)和錳二者組合對于硝基醛醇酶活性是必要的。

為了進一步探討較低量的酶是否也可以達(dá)到良好的轉(zhuǎn)化率，該ee是否可通過施用較短的反應(yīng)時間來進一步提高，和該ee在較長的溫育時間是否穩(wěn)定，重復(fù)GtHNL-A40H/V42T/Q110H的反應(yīng)(圖3和表2)。

表2.與圖3相關(guān)的轉(zhuǎn)化率和ee值。

n.d.:由于過低的轉(zhuǎn)化率而沒有測定

相比有關(guān)AtHNL文獻(xiàn)(Fuhshuku et al.,2011)中報道的值和還由我們測定的值，以上提到的新發(fā)現(xiàn)的GtHNL三重變體比AtHNL更具活性，并且其顯示更高的對映選擇性。

重要的是，相比AtHNL，通過較長的溫育時間可實現(xiàn)GtHNL-A40H/V42T/Q110H的更高產(chǎn)率，幾乎沒有失去對映選擇性。

測試單變體AcHNL和GtHNL催化硝基醛醇反應(yīng)的能力。

表3.轉(zhuǎn)化率和ee值

實施例3.硝基乙烷添加至苯甲醛

測試純化的AcHNL、AcHNL-A40H、AcHNL-A40R、AcHNL-A40H/V42T/Q110H、GtHNL-A40R和GtHNL-A40H/V42T/Q110H在硝基醛醇反應(yīng)中使用硝基乙烷代替硝基甲烷的能力。如實施例2中所述進行反應(yīng)，區(qū)別在于使用1mmol硝基乙烷代替硝基甲烷。

使用純化的酶，利用苯甲醛和硝基乙烷進行的第一cupin-硝基醛縮酶催化的亨利反應(yīng)的結(jié)果顯示在圖4和表4中。

表4.與圖4相關(guān)的轉(zhuǎn)化率和ee值

硝基乙烷添加至苯甲醛同時產(chǎn)生了兩個新的立體中心并且得到2-硝基-1-苯基丙醇的非對映混合物。在2小時反應(yīng)時間后，AcHNL的反/順比為2:1和反式異構(gòu)體的對映體過量是85％。因此，該產(chǎn)物混合物包含約60％的預(yù)期的主要產(chǎn)物(1R,2S)-2-硝基-1-苯基丙醇。用單變體AcHNL-A40H，(1R,2S)-2-硝基-1-苯基丙醇的比例進一步提高到70％。

實施例4.硝基甲烷添加至各種醛

如實施例2中所述，用2-Cl-苯甲醛、己醛或環(huán)己烷甲醛代替苯甲醛的修飾進行反應(yīng)。

表5.轉(zhuǎn)化率和ee值。

反應(yīng)條件：由1:1的TBME和pH 6.0的50mM KPi組成的兩相系統(tǒng)中的醛(20mM)和硝基甲烷(1M)，反應(yīng)體積1mL，30℃，1200rpm，24小時。使用純化的酶(2.5mg)。

實施例5.硝基醛醇反應(yīng)的金屬-依賴性

為了從GtHNL-A40H/V42T/Q110H除去金屬離子，純化的蛋白質(zhì)(如實施例1中所述)針對在100mM醋酸鈉和150mM NaCl中的20mM 2,4-吡啶二羧酸一水合物(PDCA)在pH 5.5下進行透析50小時，并隨后針對20mM Tris/HCl在pH7.5下透析20小時。所得脫輔基蛋白用10倍摩爾過量的FeCl₂、MnCl₂、CoCl₂、NiCl₂或ZnCl₂在室溫下溫育2.5小時。除去未結(jié)合的金屬且用PD-10柱將緩沖液交換至pH 6.0的50mM KPi。用ICP-OES進行金屬分析。

如實施例2中所述進行反應(yīng)。

表6.轉(zhuǎn)化率和ee值。

^a在表達(dá)培養(yǎng)基中在MnCl₂的存在下表達(dá)GtHNL-A40H/V42T/Q110H。

^b通過螯合劑2,4-吡啶二羧酸除去結(jié)合的金屬。由ICP-OES檢測痕量的錳。

^c用各自的金屬鹽溫育脫輔基蛋白。

實施例6.具有硝基醛醇活性的其它Cupin-HNL

具有與SEQ ID NO：1和3的58％和84％之間的序列同一性的幾個其他cupin(Wiedner,R.；et al.,Comp.Struct.Biotechnol.J.,(2014),10,58)被用于測試其催化硝基醛醇反應(yīng)的能力。如實施例1中所述進行蛋白的表達(dá)和無細(xì)胞裂解物的制備。

表7.具有與SEQ ID NO：1和3的高至適中的序列同一性(Seq id)的Cupin-HNL。

1.Chen Y,Crombie A,Rahman MT,Dedysh SN,Liesack W et al.(2010)J Bacteriol 192:3840-3841.

2.de Groot A,Dulermo R,Ortet P,Blanchard L,Guerin P et al.(2009)JPLoS Genet 5.Available:http://dx.plos.org/10.1371/journal.pgen.1000434.

3.Reeve W,Chain P,O'Hara G,Ardley J,Nandesena K et al.(2010)Genomic Sci 2:77-86.

4.Chen Y,He Y,Zhang B,Yang J,Li W et al.(2011)J Bacteriol 193:5602-5603.

如實施例2中所述進行反應(yīng)。

表8.轉(zhuǎn)化率和ee值。

實施例7.水系統(tǒng)中的硝基醛醇反應(yīng)

采用由5μmol苯甲醛、0.3mmol硝基甲烷、和在pH 6，500μL的50mM磷酸鉀緩沖液中的0.375mg總裂解物蛋白(含約50％cupin-硝基醛縮酶)或0.5mg純化蛋白組成的單相系統(tǒng)檢測cupin-硝基醛縮酶催化合成β-硝基醇的能力。在30℃下和1200rpm下溫育1小時后，通過利用含有0.2％內(nèi)標(biāo)(1,3,5-三異丙基苯，IS)的500μL MTBE萃取來使反應(yīng)停止。五十μL的有機相用450μL的HPLC溶劑混合物稀釋并通過手性HPLC分析。

用苯甲醛和硝基甲烷進行的第一cupin-硝基醛縮酶催化的亨利反應(yīng)的結(jié)果顯示在表9中。

表9.轉(zhuǎn)化率和ee值。