本發(fā)明涉及生物檢測(cè)領(lǐng)域，特別涉及對(duì)于細(xì)胞內(nèi)巰基次磺酸化蛋白質(zhì)原位顯影，并通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移fret原理定量檢測(cè)次磺酸化蛋白質(zhì)的熒光探針的制備和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

氧化應(yīng)激是指在各種內(nèi)外因素刺激作用下，生物體內(nèi)的活性氧，即過氧化氫、超氧陰離子、烷氧自由基、羥自由基等(reactiveoxygenspecies,ros)產(chǎn)生過多或發(fā)生代謝障礙，并且內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)不能對(duì)其有效消除時(shí)，ros在體內(nèi)增多并參與氧化生物大分子，誘發(fā)基因突變、蛋白質(zhì)修飾變性和脂質(zhì)過氧化，進(jìn)而損傷溶酶體、線粒體等，最終導(dǎo)致細(xì)胞的氧化損傷。氧化應(yīng)激已被證實(shí)與多個(gè)系統(tǒng)疾病的發(fā)生有著密切聯(lián)系，尤其是阿茲海默病、帕金森氏病、亨丁頓舞蹈癥等神經(jīng)退行性疾??；這些疾病發(fā)生過程中氧化應(yīng)激導(dǎo)致腦細(xì)胞凋亡、自噬等過程造成組織損傷和病變。其中，次磺酸化蛋白是ros氧化蛋白質(zhì)的關(guān)鍵中間產(chǎn)物，即蛋白質(zhì)巰基-sh被ros氧化后轉(zhuǎn)化為次磺酸基團(tuán)-soh，次磺酸基團(tuán)-soh可被還原為硫醇/巰基狀態(tài)，或繼續(xù)氧化為亞磺酸和磺酸。因此，次磺酸化蛋白質(zhì)是機(jī)體和細(xì)胞感受氧化應(yīng)激的重要瞬時(shí)標(biāo)志物，是表征氧化應(yīng)激進(jìn)程的重要信號(hào)。近年來蛋白質(zhì)巰基次磺酸化修飾作為一個(gè)新興的研究熱點(diǎn),越來越受到科學(xué)家的重視,發(fā)展能對(duì)生物體內(nèi)巰基次磺酸化修飾進(jìn)行實(shí)時(shí)追蹤檢測(cè)的方法,可極大推動(dòng)相關(guān)的生物氧化應(yīng)激機(jī)制及生理病理學(xué)研究。

早期的巰基次磺酸化修飾檢測(cè)方法主要是利用比色法、間接法(先把樣品中巰基選擇性封閉，再用亞砷酸將次磺酸基團(tuán)還原成巰基測(cè)定其含量)。但存在定量分析檢測(cè)限高或反應(yīng)步驟多的缺點(diǎn)。目前應(yīng)用最廣泛、體系發(fā)展最成熟的是生物素開關(guān)法,該法目前雖然接受度高,準(zhǔn)確度好,但存在操作步驟繁瑣、樣本必須通過分離后進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，很難應(yīng)用于活細(xì)胞成像及實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)等缺點(diǎn)。也無法獲取蛋白質(zhì)巰基次磺酸化修飾后動(dòng)態(tài)變化等任何信息。小分子熒光探針成像由于靈敏度高,操作簡(jiǎn)單,可用于活體檢測(cè),近年來已成為檢測(cè)完整生物樣本的理想而不可缺少的輔助工具。

但是現(xiàn)有的熒光小分子探針存在以下問題：一是穩(wěn)定性不夠好，不能長(zhǎng)期保存；二是使用時(shí)吸收發(fā)射波長(zhǎng)差較小,不能夠有效避免激發(fā)光的干擾，三是靈敏度相對(duì)不夠高，四是選擇性較小，適用范圍不夠廣。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測(cè)次磺酸化蛋白質(zhì)的熒光探針、制備方法及其應(yīng)用，該熒光探針能夠?qū)?xì)胞內(nèi)巰基次磺酸化蛋白質(zhì)原位顯影，并通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移fret原理定量檢測(cè)次磺酸化蛋白質(zhì)。

本發(fā)明的用于檢測(cè)次磺酸化蛋白質(zhì)的熒光探針，具有如下結(jié)構(gòu)通式(ⅰ)：

其中，x為化學(xué)單鍵或者為中的一種；r為具有親核性碳原子中心結(jié)構(gòu)的基團(tuán)；

進(jìn)一步，結(jié)構(gòu)通式(ⅰ)中，所述r為

中的一種。

本發(fā)明還公開一種用于檢測(cè)次磺酸化蛋白質(zhì)的熒光探針的制備方法，所述用于檢測(cè)次磺酸化蛋白質(zhì)的熒光探針經(jīng)可識(shí)別次磺酸的化合物與熒光化合物經(jīng)縮合反應(yīng)制得；

進(jìn)一步，所述可識(shí)別次磺酸的化合物包括帶有次磺酸-soh特征識(shí)別基團(tuán)的羧酸或者其衍生物；

進(jìn)一步，所述可識(shí)別次磺酸的化合物為帶有次磺酸-soh特征識(shí)別基團(tuán)的羧酸，在咪唑鹽酸鹽及微量水存在的條件下,以n,n'-羰基二咪唑作為縮合劑,經(jīng)研磨，與溴乙胺或者對(duì)氨苯甲酸發(fā)生縮合反應(yīng)，其化學(xué)反應(yīng)式如下：

進(jìn)一步，所述可識(shí)別次磺酸的化合物為帶有次磺酸-soh特征識(shí)別基團(tuán)的羧酸，在咪唑鹽酸鹽及微量水存在的條件下,以n,n'-羰基二咪唑作為縮合劑,經(jīng)研磨，與8-氨基-1，3，6-萘磺酸二鈉鹽發(fā)生縮合反應(yīng)，其化學(xué)反應(yīng)式如下：

進(jìn)一步，所述可識(shí)別次磺酸的化合物為帶有次磺酸-soh特征識(shí)別基團(tuán)的羧酸衍生物，加入三乙胺作為縮合劑和溶劑，經(jīng)研磨，與8-氨基-1，3，6-萘磺酸二鈉鹽發(fā)生縮合反應(yīng)，其化學(xué)反應(yīng)式如下：

進(jìn)一步，還包括縮合反應(yīng)后經(jīng)萃取分離純化的步驟；

本發(fā)明還公開一種用于檢測(cè)次磺酸化蛋白質(zhì)的熒光探針在檢測(cè)蛋白質(zhì)巰基次磺酸化修飾中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果：熒光小分子探針定量檢測(cè)次磺酸化蛋白質(zhì)是基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移fret原理。fret原理是：兩個(gè)熒光發(fā)色基團(tuán)在足夠靠近時(shí)，當(dāng)供體分子吸收一定頻率的光子后被激發(fā)到更高的電子能態(tài)，在該電子回到基態(tài)前，通過偶極子相互作用，實(shí)現(xiàn)了能量向鄰近的受體分子轉(zhuǎn)移。fret發(fā)生條件：a.能量匹配:供體分子的發(fā)射光譜可以被受體分子吸收并產(chǎn)生熒光信號(hào)。供體分子的發(fā)射光譜應(yīng)與受體分子的激發(fā)光譜必須有顯著重疊(>30％)；b.作用距離：供體分子與受體分子的作用距離為1-10nm。

本發(fā)明利用次磺酸-soh與含有親核性的α-碳原子類化合物間,發(fā)生親核取代反應(yīng),設(shè)計(jì)可與蛋白質(zhì)中次磺酸化位點(diǎn)特異性反應(yīng)的熒光探針,這些熒光探針本身在親水性環(huán)境中熒光較弱,與-soh反應(yīng)后可生成疏水性、具有較強(qiáng)熒光的加合產(chǎn)物,因而可用于蛋白質(zhì)次磺酸化修飾程度的靈敏檢測(cè)。其測(cè)定原理是蛋白質(zhì)中的色氨酸殘基作為fret的熒光供體其最大發(fā)射波長(zhǎng)在330nm左右，熒光小分子探針的熒光基團(tuán)作為fret的熒光受體其激發(fā)譜的范圍在330nm左右。fret原理實(shí)現(xiàn)的條件是：反應(yīng)前，熒光小分子探針的熒光基團(tuán)與次磺酸化蛋白質(zhì)的色氨酸殘基相距可超過10nm；反應(yīng)后，熒光小分子探針的熒光基團(tuán)與次磺酸化蛋白質(zhì)的色氨酸殘基相距可小于2nm。

本發(fā)明的熒光探針穩(wěn)定性好,能夠長(zhǎng)期保存使用；對(duì)于環(huán)境很敏感，探針在親水環(huán)境中(如細(xì)胞胞漿)本身熒光不強(qiáng)，只有在與次磺酸化蛋白反應(yīng)后熒光基團(tuán)處于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)疏水環(huán)境，產(chǎn)生較強(qiáng)熒光，能在細(xì)胞內(nèi)原位顯影巰基次磺酸化蛋白質(zhì)。同時(shí)，具有良好的水溶性和較大的吸收發(fā)射波長(zhǎng)差，在細(xì)胞外水溶液檢測(cè)體系，與蛋白質(zhì)中色氨酸殘基(其發(fā)射波長(zhǎng)與探針激發(fā)波長(zhǎng)重疊)能夠配對(duì)產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移fret效應(yīng)，有效避免激發(fā)光和蛋白質(zhì)樣品中發(fā)射光的干擾能在復(fù)雜生物樣品中特異性地定量檢測(cè)次磺酸化蛋白質(zhì)，檢測(cè)信噪比高，靈敏度好，具有優(yōu)秀的選擇性。從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)巰基次磺酸化修飾的特異性檢測(cè)。

本發(fā)明的熒光探針法除適用于檢測(cè)細(xì)胞樣本、血漿、組織勻漿中次磺酸化修飾程度,還適用于細(xì)胞甚至是動(dòng)物組織中次磺酸化修飾的動(dòng)態(tài)檢測(cè)。

附圖說明

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述：

圖1是熒光探針分子ⅰ-1與次磺酸化牛血清白蛋白(bsa-soh)反應(yīng)前后的熒光變化；

圖2是熒光探針分子ⅰ-1對(duì)次磺酸化牛血清白蛋白(bsa-soh)的選擇性；

圖3是熒光探針分子ⅰ-1對(duì)次磺酸化牛血清白蛋白(bsa-soh)濃度依賴性熒光增強(qiáng)；

圖4是熒光探針分子ⅰ-1檢測(cè)細(xì)胞中次磺酸化蛋白；

具體實(shí)施方式

本實(shí)施例的用于檢測(cè)次磺酸化蛋白質(zhì)的熒光探針，具有如下結(jié)構(gòu)通式(ⅰ)：

其中，x為化學(xué)單鍵或者為中的一種；r為具有親核性碳原子中心結(jié)構(gòu)的基團(tuán)；穩(wěn)定性好,能夠長(zhǎng)期保存；使用具有較大的吸收發(fā)射波長(zhǎng)差(>170nm),能夠有效避免激發(fā)光的干擾；檢測(cè)信噪比高,靈敏度好，且具有優(yōu)秀的選擇性。其中，“x為化學(xué)單鍵”的意思為：r直接與-nh-單鍵連接。

本實(shí)施例中，結(jié)構(gòu)通式(ⅰ)中，所述r為

中的一種，為r的優(yōu)選基團(tuán)。

本實(shí)施例的用于檢測(cè)次磺酸化蛋白質(zhì)的熒光探針的制備方法，所述用于檢測(cè)次磺酸化蛋白質(zhì)的熒光探針經(jīng)可識(shí)別次磺酸的化合物與熒光化合物經(jīng)縮合反應(yīng)制得。可識(shí)別次磺酸的化合物如氰基乙酸，參與反應(yīng)的物質(zhì)添加量以能徹底反應(yīng)完成為標(biāo)準(zhǔn)添加量，方法簡(jiǎn)單，易操作。

本實(shí)施例中，所述可識(shí)別次磺酸的化合物包括帶有次磺酸-soh特征識(shí)別基團(tuán)的羧酸或者其衍生物；r只能與次磺酸-soh感應(yīng)，利用次磺酸-soh與含有親核性的α-碳原子類化合物間,發(fā)生親核取代反應(yīng),設(shè)計(jì)可與蛋白質(zhì)中次磺酸化位點(diǎn)特異性反應(yīng)的熒光探針,這些熒光探針本身在親水性環(huán)境中熒光較弱,與-soh反應(yīng)后可生成疏水性、具有較強(qiáng)熒光的加合產(chǎn)物,因而可用于蛋白質(zhì)次磺酸化修飾程度的靈敏檢測(cè)。

本實(shí)施例中，所述可識(shí)別次磺酸的化合物為帶有次磺酸-soh特征識(shí)別基團(tuán)的羧酸，在咪唑鹽酸鹽及微量水存在的條件下,以n,n'-羰基二咪唑(cdi)作為縮合劑,經(jīng)研磨，與溴乙胺或者對(duì)氨基苯甲酸發(fā)生縮合反應(yīng)，其化學(xué)反應(yīng)式如下：

本實(shí)施例中，所述可識(shí)別次磺酸的化合物為帶有次磺酸-soh特征識(shí)別基團(tuán)的羧酸，在咪唑鹽酸鹽及微量水存在的條件下,以n,n'-羰基二咪唑作為縮合劑,經(jīng)研磨，與8-氨基-1，3，6-萘磺酸二鈉鹽發(fā)生縮合反應(yīng)，其化學(xué)反應(yīng)式如下：

本實(shí)施例中，所述可識(shí)別次磺酸的化合物為帶有次磺酸-soh特征識(shí)別基團(tuán)的羧酸衍生物，加入三乙胺作為縮合劑和溶劑，經(jīng)研磨，與8-氨基-1，3，6-萘磺酸二鈉鹽發(fā)生縮合反應(yīng)，其化學(xué)反應(yīng)式如下：

本實(shí)施例中，還包括縮合反應(yīng)后經(jīng)萃取分離純化的步驟；

本發(fā)明還公開一種用于檢測(cè)次磺酸化蛋白質(zhì)的熒光探針在檢測(cè)蛋白質(zhì)巰基次磺酸化修飾中的應(yīng)用：以定位顯色細(xì)胞中次磺酸化蛋白的應(yīng)用為例,可通過以下步驟實(shí)現(xiàn)：細(xì)胞經(jīng)過100μm過氧化氫(h2o2)氧化處理30min,用0.05％戊二醛水溶液固定細(xì)胞15min,pbs緩沖溶液洗三次，細(xì)胞浸潤(rùn)在pbs溶液中，向其中加入式ⅰ所示的熒光探針,使其終濃度為200μm,25℃下避光孵育4小時(shí)(或者搖床避光慢速搖勻30min),觀察記錄細(xì)胞熒光強(qiáng)度,本發(fā)明提供的熒光探針的特征在于它的熒光基團(tuán)本身在親水性生理環(huán)境中的熒光量子產(chǎn)率較弱,當(dāng)與細(xì)胞中次磺酸化蛋白的-soh基團(tuán)特異性快速反應(yīng)后,熒光基團(tuán)處于蛋白質(zhì)疏水結(jié)構(gòu)中，其熒光量子產(chǎn)率大大提高,實(shí)現(xiàn)至倍熒光增強(qiáng),從而實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)次磺酸化修飾的特異性檢測(cè)和定量分析。

下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的闡述。

實(shí)施例一

熒光探針分子ⅰ-1(結(jié)構(gòu)式：)的制備：

稱取85mg氰基乙酸(85.06，1eq)和178mgn,n'-羰基二咪唑cdi(162.14，1.1eq)，50℃在研缽中研磨5分鐘，tlc薄層色譜板監(jiān)測(cè)氰基乙酸完全反應(yīng)，再向研缽中稱入384mg8-氨基-1，3，6-萘磺酸二鈉鹽水合物(427.3，0.9eq)、10.4mg咪唑鹽酸鹽(104，0.1eq)及100μl水，研磨10分鐘，tlc薄層色譜板監(jiān)測(cè)8-氨基-1，3，6-萘磺酸二鈉鹽完全反應(yīng)。加入10ml水和3×15ml乙酸乙酯，分液萃取，水層—60℃冷凍干燥，得到黃色固體產(chǎn)物ⅰ-1。hrms(esi-tof)[m+na]⁺:m/z515.9502。¹³cnmr(126mhz,d2o)δ111.17,116.77,119.30,119.91,124.64,131.52,133.67,135.54,138.78,139.57,141.75,144.62,170.08。

熒光探針分子ⅰ-1與次磺酸化牛血清白蛋白bsa-soh反應(yīng)前后的熒光變化：

將探針分子少量溶解在20mmpbs緩沖液中,分別加入pbs緩沖液或次磺酸化牛血清白蛋白的溶液,使探針分子的終濃度為10μm,而待測(cè)樣品的終濃度為10μm。反應(yīng)5分鐘后，使用熒光分光光度計(jì)以280nm激發(fā),記錄和計(jì)算溶液在發(fā)射波長(zhǎng)范圍下的熒光強(qiáng)度面積積分,進(jìn)而確定探針分子與反應(yīng)后熒光強(qiáng)度增強(qiáng),如圖1所示。

熒光探針分子ⅰ-1對(duì)次磺酸化牛血清白蛋白bas-soh的選擇性：

配置探針分子的pbs溶液,分別加入10μm待測(cè)樣品的pbs溶液,使探針分子的終濃度為10μm。反應(yīng)5分鐘后，使用熒光分光光度計(jì)以280nm激發(fā),記錄和計(jì)算溶液在發(fā)射波長(zhǎng)范圍下的熒光強(qiáng)度面積積分,計(jì)算熒光增強(qiáng)倍數(shù),進(jìn)而確定探針分子對(duì)bsa-soh的選擇性，如圖2所示。

熒光探針分子ⅰ-1對(duì)次磺酸化牛血清白蛋白的濃度依賴性熒光增強(qiáng)：

將探針分子溶解在20mmpbs緩沖液中,分別加入不同濃度的次磺酸化牛血清白蛋白溶液,使探針分子的終濃度為10μm，反應(yīng)5分鐘后使用熒光分光光度計(jì)以280nm激發(fā),記錄和計(jì)算溶液在發(fā)射波長(zhǎng)范圍下的熒光強(qiáng)度面積積分,計(jì)算熒光增強(qiáng)倍數(shù),進(jìn)而確定探針分子對(duì)濃度依賴性熒光增強(qiáng),如圖3所示。

熒光探針分子檢測(cè)細(xì)胞中次磺酸化蛋白：

將人肺腺癌細(xì)胞a549接種于中號(hào)培養(yǎng)皿上,含10％胎牛血清的1640培養(yǎng)液中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育12小時(shí)。隨后，用pbs沖洗三次，加入h2o2使其終濃度為100μm，放入37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱，30分鐘后取出。然后，加200μl濃度為0.05％的戊二醛水溶液固定細(xì)胞，15分鐘后，用pbs沖洗1-2次。加入含有熒光探針ⅰ-1的pbs溶液，使其終濃度為100μm，避光放置4個(gè)小時(shí)。每次用1mlpbs溶液浸洗2次。采用激光共聚焦熒光顯微鏡觀察,拍照。其中采用405nm波長(zhǎng)激發(fā)。結(jié)果表明,熒光探針分子可有效檢測(cè)到人肺腺癌細(xì)胞a549次磺酸化化產(chǎn)物,如圖4所示。

實(shí)施例二

熒光探針分子ⅰ-2(結(jié)構(gòu)式：)的制備：

稱取85mg氰基乙酸(85.06，1eq)和178mgn,n'-羰基二咪唑cdi(162.14，1.1eq)，50℃在研缽中研磨5分鐘，tlc薄層色譜板監(jiān)測(cè)氰基乙酸完全反應(yīng)，再向研缽中稱入205mg溴乙胺氫溴酸鹽(204.89，1eq)和10.4mg咪唑鹽酸鹽(104，0.1eq)，研磨30分鐘，加入10ml水和3×15ml二氯甲烷，收集有機(jī)層，干燥濃縮得到中間產(chǎn)物。在研缽中，加入中間產(chǎn)物，2ml三乙胺和384mg8-氨基-1，3，6-萘磺酸二鈉鹽水合物(427.3，0.9eq)，研磨20分鐘，10ml水和3×15ml二氯甲烷萃取，分液萃取，水層—60℃冷凍干燥，得到黃色固體產(chǎn)物ⅰ-2。hrms(esi-tof)[m+na]⁺:m/z558.9416。¹³cnmr(126mhz,d2o)δ8.34,39.55,46.71,111.02,116.42,119.40,124.60,126.04,131.36,133.78,135.65,137.21,139.97,142.22,169.96。

實(shí)施例三

熒光探針分子ⅰ-3(結(jié)構(gòu)式：)的制備：

稱取85mg氰基乙酸(85.06，1eq)和178mgn,n'-羰基二咪唑cdi(162.14，1.1eq)，50℃在研缽中研磨5分鐘，tlc薄層色譜板監(jiān)測(cè)氰基乙酸完全反應(yīng)，再向研缽中稱入137mg對(duì)氨基苯甲酸(137.14，1eq)和10.4mg咪唑鹽酸鹽(104，0.1eq)，研磨30分鐘，加入10ml水和3×15ml二氯甲烷，收集水層，水層—60℃冷凍干燥得到中間產(chǎn)物。在研缽中，加入中間產(chǎn)物和178mgn,n'-羰基二咪唑cdi(162.14，1.1eq)，50℃在研缽中研磨5分鐘，tlc薄層色譜板監(jiān)測(cè)氰基乙酸完全反應(yīng)，再向研缽中稱入384mg8-氨基-1，3，6-萘磺酸二鈉鹽水合物(427.3，0.9eq)、10.4mg咪唑鹽酸鹽(104，0.1eq)及100μl水，研磨10分鐘，tlc薄層色譜板監(jiān)測(cè)8-氨基-1，3，6-萘磺酸二鈉鹽完全反應(yīng)。在研缽中，加入10ml水和3×15ml二氯甲烷萃取，分液萃取，水層—60℃冷凍干燥，得到黃色固體產(chǎn)物ⅰ-3。hrms(esi-tof)[m+na]⁺:m/z634.9333。¹³cnmr(126mhz,d2o)δ8.04,46.36,110.91,114.79,116.39,118.76,120.41,124.45,127.77,129.95,130.68,131.17,134.64,135.37,137.25,138.91,139.74,140.69,141.90,144.65,154.10,164.84,169.79,174.72.

實(shí)施例四

熒光探針分子ⅰ-4(結(jié)構(gòu)式：)的制備：

稱取156mg3,5-二羰基環(huán)已酸(156.14，1eq)和178mgn,n'-羰基二咪唑cdi(162.14，1.1eq)，50℃在研缽中研磨5分鐘，tlc薄層色譜板監(jiān)測(cè)氰基乙酸完全反應(yīng)，再向研缽中稱入384mg8-氨基-1，3，6-萘磺酸二鈉鹽水合物(427.3，0.9eq)、10.4mg咪唑鹽酸鹽(104，0.1eq)及100μl水，研磨10分鐘，tlc薄層色譜板監(jiān)測(cè)8-氨基-1，3，6-萘磺酸二鈉鹽完全反應(yīng)。加入10ml水和3×15ml乙酸乙酯，分液萃取，水層—60℃冷凍干燥，得到黃色固體產(chǎn)物ⅰ-4。hrms(esi-tof)[m+na]⁺:m/z586.9218。¹³cnmr(126mhz,d2o)δ37.56,42.54,99.99,111.26,116.93,118.98,120.05,124.71,131.66,133.35,135.63,138.77,139.54,141.73,144.62,182.66,197.71。

實(shí)施例五

熒光探針分子ⅰ-5(結(jié)構(gòu)式：)的制備：

稱取200mg(苯磺酰基)乙酸(200.22，1eq)和178mgn,n'-羰基二咪唑cdi(162.14，1.1eq)，50℃在研缽中研磨5分鐘，tlc薄層色譜板監(jiān)測(cè)氰基乙酸完全反應(yīng)，再向研缽中稱入384mg8-氨基-1，3，6-萘磺酸二鈉鹽水合物(427.3，0.9eq)、10.4mg咪唑鹽酸鹽(104，0.1eq)及100μl水，研磨10分鐘，tlc薄層色譜板監(jiān)測(cè)8-氨基-1，3，6-萘磺酸二鈉鹽完全反應(yīng)。加入10ml水和3×15ml乙酸乙酯，分液萃取，水層—60℃冷凍干燥，得到黃色固體產(chǎn)物ⅰ-4。hrms(esi-tof)[m+na]⁺:m/z630.8895。

最后說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的宗旨和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。