本發(fā)明關于人參皂苷M1用于抑制腎纖維化之新穎用途，特別是抑制間質性纖維化

背景技術：

腎纖維化是腎臟疾病的最終階段。造成腎纖維化的原因包括輸尿管阻塞(ureteral obstruction)。

輸尿管阻塞是泌尿科醫(yī)師最常遇到的問題。輸尿管阻塞會造成在輸尿管中尿液流動的阻抗。最常見的阻塞發(fā)生在輸尿管腎盂接合處。較廣義的“阻塞性尿路病變”乙詞可用來表示任何發(fā)生在腎盂與尿道之間的尿液流動阻塞，其導致逐漸形成腎盂積水以及相關的腎損傷。尿道狹窄與良性前列腺肥大是這方面的例子。據(jù)報告，單側輸尿管阻塞(UUO)的發(fā)生率在成人中為1/1,000。輸尿管結石為最常見的原因，且急性阻塞通常伴隨明顯的腎絞痛為主要的癥狀。參見，例如，Docherty等人，抑制腎小管細胞凋亡保護對抗輸尿管阻塞后之腎損傷及纖維化發(fā)展的證據(jù)，Am J Physiol Renal Physiol.2006Jan；290(1):F4-13。

在發(fā)生單側輸尿管阻塞(UUO)初期，間質組織由單核細胞所滲入，其典型地受到活化(classically activated)轉變?yōu)榫奘杉毎?，而釋放細胞激素，如TGF-β1與腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)。接著，TGFβ1促進腎小管上皮細胞的表現(xiàn)型反應，而進入細胞凋亡(造成腎小管萎縮)，或進入上皮間質轉化作用(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，而變成纖維母細胞，其可遷移至間質組織。血管收縮素II(Angiotensin II，ANG II)，由單核細胞的活化所產生，可刺激核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)的產生，其引致更多巨噬細胞的聚集，以及產生活性含氧物(reactive oxygen species，ROS)，其加重了腎小管的損傷。相反地，替代性活化(alternatively activated)的巨噬細胞則增加腎小管細胞的存活與增殖。內皮細胞可以進行內皮間質轉換作用(endothelial-mesenchymal transition，EndMT)或細胞凋亡，其造成毛細管損失與續(xù)發(fā)性腎缺血與缺氧。周邊細胞與浸潤性造血干細胞亦可分化為纖維母細胞。在細胞激素的刺激下，例如由巨噬細胞或其它細胞產生的TGF-β1，纖維母細胞合成壓力纖維，且進一步分化而變成肌纖維母細胞。該肌纖維母細胞可收縮且增加胞外基質(extracellular matrix，ECM)的沈積，導致惡化型間質纖維化。此過程最終導致惡化型腎纖維化以及不可逆的腎功能衰竭。參見，例如，Chevalier等人，以輸尿管阻塞作為腎間質纖維化與阻塞性腎病變的模型，Kidney Int.2009Jun；75(11):1145-52。

人參皂苷是人參之主要成分，已知具有多種藥理學活性，例如，抗腫瘤、抗糖尿病、抗疲勞、抗過敏及抗氧化活性。人參皂苷類具有相同的基礎結構，其系由具17個碳原子排成四個環(huán)的性脂烷類固醇(gonane steroid nucleus)核心組成。人參皂苷會在體內代謝，近來許多研究指出，在體內易吸收而作為活性成分的是人參皂苷代謝物而非天然存在之人參皂苷。其中，人參皂苷M1已知為原人參二醇型(protopanaxadiol-type)人參皂苷代謝物之一，其系經由人體腸道細菌之絞股藍皂苷(gypenoside)途徑生成。迄今，尚未有前案報導人參皂苷M1于狼瘡性腎炎的治療功效。

技術實現(xiàn)要素：

在本發(fā)明中，不可預期地發(fā)現(xiàn)人參皂苷M1可有效抑制腎纖維化。因此，本發(fā)明提供一種治療或預防個體之腎纖維化的新穎方法。

具體而言，本發(fā)明提供一種在有需要的個體抑制腎纖維化的方法，包含對該個體投予治療有效量的人參皂苷M1。

在部分具體實施例中，該個體是具有阻塞性腎病變的病患。

在部分具體實施例中，本發(fā)明的方法能有效降低或緩解一或多種病征或癥狀，包括但不限于，單核白血球發(fā)炎、腎小管擴張、腎小管萎縮、腎小管上皮細胞的增殖、纖維母細胞或肌纖維母細胞的活化，以及膠原蛋白(例如第III型或第IV型)的沈積，具體而言是在該個體的腎小管間質腔室中。

在部分具體實施例中，本發(fā)明的方法可有效降低或緩解在個體的腎間質中的單核血球發(fā)炎或纖維化。

在部分具體實施例中，該人參皂苷M1由非經腸道或腸道內途徑投予。

在部分具體實施例中，該人參皂苷M1于腎纖維化發(fā)生之前或發(fā)生時投予。

在部分具體實施例中，該人參皂苷M1于腎纖維化發(fā)生之后投予。

本發(fā)明提供人參皂苷M1用于制造供治療腎纖維化之藥物的用途

本發(fā)明之一或多個具體實施例之詳述系列于下方之說明中。本發(fā)明之其他特征或優(yōu)勢可由下列數(shù)個具體實施例之詳細說明及所附之主張而更臻清楚。

附圖說明

欲說明本發(fā)明，圖式具體實施例如下。然而，應理解到，本發(fā)明未局限于所示之較佳具體實施例。在圖式中：

圖1顯示UUO動物模式的建立，包括(A)實驗流程、(B)UUO動物模式的手術流程，其中左邊是輸尿管結扎后的疾病腎臟，以及右邊是無輸尿管結扎的正常腎臟。

圖2顯示以蘇木精及伊紅(hematoxylin and eosin，H&E)染色進行之腎臟組織病理學評估，其中箭頭指示處為擴張的腎小管。(A)腎臟組織病理學評估的H&E染色。#表示擴張的腎小管，星狀表示單核細胞，以及＊表示萎縮的腎小管。病理學的原始放大倍數(shù)為400倍。(B)半定量顯示腎小管間質損傷評分(tubulointerstitialscore,TIS)。白色、黑色及灰色柱狀分別代表正常對照組小鼠、疾病對照組小鼠，以及LCHK168+UUO小鼠。***表示p<0.005。

圖3顯示腎細胞凋亡與增殖的評估，包括(A)以免疫組織化學染色偵測PCNA，其中箭頭指示處為陽性染色細胞，以及(B)半定量結果。原始放大倍數(shù)為400倍。白色、黑色與灰色柱狀分別代表正常對照組小鼠、疾病對照組小鼠，以及LCHK168+UUO小鼠。***表示p<0.005。

圖4顯示纖維化表現(xiàn)評估，包括(A)以Masson氏毛狀體染色分析在腎組織中纖維化的膠原蛋白的表現(xiàn)，(B)以免疫組織化學染色分析在腎組織中平滑肌α肌動蛋白(α-SMA)的表現(xiàn)，(C)以免疫組織化學染色分析在腎組織中平滑膠原蛋白第III型的表現(xiàn)，(D)以免疫組織化學染色分析在腎組織中平滑膠原蛋白第IV型的表現(xiàn)，其中箭頭指示處為陽性染色細胞，以及(E)半定量結果。原始放大倍數(shù)為400倍。白色、黑色與灰色柱狀分別代表正常對照組小鼠、疾病對照組小鼠，以及LCHK168+UUO小鼠。*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.005。

圖5顯示(A)以免疫組織化學染色分析在腎組織中NF-κB的表現(xiàn)，其中箭頭指示處為陽性染色細胞，以及(B)半定量結果。原始放大倍數(shù)為400倍。白色、黑色與灰色柱狀分別代表正常對照組小鼠、疾病對照組小鼠，以及LCHK168+UUO小鼠。***表示p<0.005。

圖6顯示在腎組織中單核白血球浸潤，包括以免疫組織化學染色偵測(A)F4/80⁺單核細胞/巨噬細胞以及(B)CD3⁺T細胞，其中箭頭指示處為陽性染色細胞，以及(C)半定量結果。原始放大倍數(shù)為400倍。白色、黑色與灰色柱狀分別代表正常對照組小鼠、疾病對照組小鼠，以及LCHK168+UUO小鼠。***表示p<0.005。

圖7顯示LCHK168抑制腎盂尿中的MCP-1、TNF-α及IL-1β的表現(xiàn)水平。(A)MCP-1、(B)TNF-α及(C)IL-1β以ELISA偵測尿液樣本。白色、黑色與灰色柱狀分別代表正常對照組小鼠、疾病對照組小鼠，以及LCHK168+UUO小鼠。*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.005。

圖8顯示細胞免疫力的活化評估，包括以流式細胞儀偵測(A)CD3⁺CD69⁺T細胞以及(B)CD19⁺CD69⁺T細胞。白色、黑色與灰色柱狀分別代表正常對照組小鼠、疾病對照組小鼠，以及LCHK168+UUO小鼠。

圖9顯示造血干細胞的活化評估，包括以流式細胞儀偵測(A)CD34⁺干細胞以及(B)Sca-1⁺造血干細胞。白色、黑色與灰色柱狀分別代表正常對照組小鼠、疾病對照組小鼠，以及LCHK168+UUO小鼠。

具體實施方式

除非另有定義，本文所使用的技術性及科學性術語具有本發(fā)明領域之技術人員所能常規(guī)理解的意義。除非另有指明，本文所使用的下列術語具有賦予其之涵義。

本文所使用的冠詞“一”與“一者”是指一個或多于一個(亦即，至少一者)之該冠詞語法對象。舉例而言，“一組件”是指一個組件或多于一個之組件。

在本發(fā)明中，意外地發(fā)現(xiàn)人參皂苷M1可有效抑制腎纖維化。特別是，發(fā)現(xiàn)在小鼠UUO模型中，腎損傷/發(fā)炎降低，且腎纖維化的惡化受到抑制或減輕。

對嚙齒科動物進行手術干預的UUO模型數(shù)十年來已被用來作為UO的高通量實驗模型。此模型不會并發(fā)高血壓、蛋白尿或高血脂癥，且不涉及任何明顯的免疫或毒性腎衰竭。取決于阻塞時間的長短，UUO可以模擬不同階段的阻塞性腎病變，其最終導致腎小管間質纖維化。該動物的壽命不會受到損害，因為對側的腎臟仍具有功能，或甚至因為補償功能與解剖肥大之故而增加功能。此模型的其它優(yōu)點包括，腎纖維化的進展為高度可預期且可重復，并在相對短的期間(7-14天)內導致顯著纖維化及腎元損失。參見，例如，Eddy等人，研究小鼠模型中慢性腎臟疾病的機制，Pediatr Nephrol.2012Aug；27(8):1233-47；以及Grande MT與López-Novoa JM，在阻塞性腎病變中的纖維母細胞的活化與肌纖維母細胞的產生，Nat Rev Nephrol.2009Jun；5(6):319-28。

以下的實施例與數(shù)據(jù)顯示出人參皂苷M1的不可預期效果，包括(1)在腎間質組織中降低細胞凋亡與腎小管損傷，(2)在腎間質組織中預防纖維化與膠原蛋白沈積，(3)降低NF-κB的活化，(4)預防腎臟巨噬細胞與T細胞之浸潤，以及(5)維持造血干細胞的正常功能與全身性細胞免疫力。

因此，本發(fā)明提供一種在有需要的個體治療或預防腎纖維化的方法，包含對該個體投予治療有效量的人參皂苷M1。

人參皂苷M1，即20-β-D-吡喃葡萄糖基原人參二醇(20-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxadiol)，為本領域習知之皂素代謝物之一。人參皂苷M1之化學結構如下：

人參皂苷M1已知為原人參二醇型人參皂苷之代謝物之一，其系經由人體腸道細菌之絞股藍皂苷途徑產生。人體服用人參后，可于血液或尿液中發(fā)現(xiàn)人參皂苷M1。人參皂苷M1可制備自人參植物，其系以本領域習知方法如真菌發(fā)酵方式進行，例如，中國臺灣發(fā)明專利申請案第094116005號(I280982)及美國專利第7,932,057號，其全部內容在此列入本案以作為參考數(shù)據(jù)。在部分具體實施例中，用于制備人參皂苷M1的人參植物包括五加科(Araliaceae)、人參屬(Panax genus)，如人參(P.ginseng)及假人參(P.pseudo-ginseng)(亦稱作三七)。一般而言，人參皂苷M1之制備方法包括步驟：(a)提供人參植物材料(如葉或莖)的粉末；(b)提供真菌，以進行人參植物材料之發(fā)酵，其中發(fā)酵溫度范圍為20至50℃、發(fā)酵濕度范圍為70至100％、pH值范圍為4.0至6.0、及發(fā)酵時間范圍為5至15天；(c)萃取及收集發(fā)酵產物；以及(d)自發(fā)酵產物分離20-β-D-吡喃葡萄糖基原人參二醇。

在本發(fā)明中，當以“分離”或“純化”描述人參皂苷M1時，其應理解為非絕對的分離或純化，而是相對的分離或純化。舉例而言，純化的人參皂苷M1是指相較于其天然存在形式而言，純度更高。在一具體實施例中，含有純化的人參皂苷M1的制劑可包含的人參皂苷M1之含量為總制劑的50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、或100％(w/w)。應理解的是，當以某數(shù)字顯示比例或劑量時，該數(shù)字通常包括其10％上下之范圍，或更特別地，包括其5％上下之范圍。

本發(fā)明提供一種抑制腎纖維化之方法，包括將有效量之人參皂苷M1投用于有需要此治療的個體。亦提供的是人參皂苷M1用于制造藥物之用途，其系供于有需要的個體抑制腎纖維化。本發(fā)明的藥物有效于降低或緩解個體的一或多種癥狀或病況，包括但不限于，單核白血球發(fā)炎、腎小管擴張、腎小管萎縮、腎小管上皮細胞的增殖、纖維母細胞或肌纖維母細胞的活化以及膠原蛋白(第III型或第IV型)的沈積，特別是在腎小管間質腔室。特定而言，本發(fā)明的藥物有效于降低或緩解在個體的腎間質中的單核白血球發(fā)炎或纖維化。

本文所使用的“個人”或“個體”等詞包括人類或非人類動物，例如陪伴動物(如狗、貓等)、農場動物(如牛、綿羊、豬、馬等)、或實驗動物(如大鼠、小鼠、天竺鼠等)。

本文所使用的“治療”乙詞是指施加或投予包括一或多種活性藥劑的組合物至具有疾病、疾病之癥狀或病況、或疾病惡化之個體，其目的在于治療、治愈、緩解、減輕、改變、補救、改善、改進、或影響疾病、疾病之癥狀或病況、疾病引發(fā)之失能、或疾病惡化。如本文所使用，“預防”乙詞意指施用或投予包括一或多種活性劑的組合物至易感受或傾向于疾病或其癥狀或病癥的個體內，而因此涉及預防該疾病或其癥狀或病癥或其病因的發(fā)生。

本文所使用的“有效量”乙詞是指于接受處理之個體產生想要的醫(yī)療功效之活性成分的量。例如，用于治療或預防腎纖維化的有效量為可以抑制、改善、緩解、降低或預防一或多種癥狀或病況，例如，單核白血球發(fā)炎、腎小管擴張、腎小管萎縮、腎小管上皮細胞的增殖、纖維母細胞或肌纖維母細胞的活化以及膠原蛋白(第III型或第IV型)的沈積，特別是在腎小管間質腔室。該癥狀可使用本領域習知方法基于不同疾病進展相關指數(shù)予以決定與評估，例如，藉由透過染色分析腎切片。該有效量可根據(jù)不同理由而改變，例如，投予途徑與頻率、接受該藥物的個體的體重與物種，以及投予的目的。本領域技藝者基于本文所揭露者、已建立的方法，以及其經驗來決定在個案中的劑量。例如，在部分具體實施例中，本發(fā)明所使用的人參皂苷M1口服劑量為每日10至1,000mg/kg。在部分實例中，本發(fā)明所使用的人參皂苷M1口服劑量為每日100至300mg/kg、每日50至150mg/kg、每日25至100mg/kg、每日10至50mg/kg、或每日5至30mg/kg。此外，在本發(fā)明之部分具體實施例中，人參皂苷M1系周期性投予一段時間，例如，每日投予達至少15天、一個月或二個月或更久。

依據(jù)本發(fā)明，人參皂苷M1可作為活性成分，以治療或預防腎纖維化。在一具體實施例中，針對輸送及吸收目的，有效量之活性成分可與醫(yī)藥上可接受載體配制成適當形式之醫(yī)藥組合物。依據(jù)投予模式，本發(fā)明之醫(yī)藥組合物較佳為包含約0.1％重至約100％重之活性成分，其中百分比重系以組合物之總重量為基準計算。

本文所使用的“醫(yī)藥上可接受”乙詞是指載體與組合物之活性成分兼容，且較佳為可穩(wěn)定該活性成分且對于接受治療之個體具安全性。該載體可為活性成分之稀釋劑、載劑、賦形劑、或介質。適用之賦形劑的一些實例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、藻酸鹽、黃蓍膠、明膠、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、無菌水、糖漿、及甲基纖維素。本組合物可額外包含潤滑劑如滑石、硬脂酸鎂、及礦物油；潤濕劑；乳化劑及懸浮劑；防腐劑如甲基及丙基羥基苯甲酸酯；增甜劑；以及調味劑。在投予至病患后，本發(fā)明之組合物可提供活性成分快速、持續(xù)、或緩慢釋放之效果。

依據(jù)本發(fā)明，該組合物之形式可為片劑、丸劑、粉劑、錠劑、囊劑、扁囊劑、酏劑、懸劑、乳液、溶液、糖漿、軟與硬明膠膠囊、栓劑、無菌注射液、及包裝粉劑。

本發(fā)明之組合物可經由任何生理上可接受途徑輸送，例如，口服、非口服(如肌內、靜脈、皮下、及腹腔)、經皮、栓劑、及鼻內方法。關于非口服投予，較佳為使用無菌水溶液，其可包含其他物質，如足以使溶液與血液等張的鹽類或葡萄糖。水溶液可視需求適當?shù)亟浘彌_(較佳為具pH值3至9)。本領域之技術人員可由習知之標準藥理學技術于無菌條件下制備適合的非口服組合物。

依據(jù)本發(fā)明，含有以人參皂苷M1作為活性成分的人參皂苷M1或組合物可用于治療或預防罹患腎纖維化之個體。特定而言，含有以人參皂苷M1作為活性成分的人參皂苷M1或組合物可投予至罹患腎纖維化之個體或具有罹患腎纖維化風險之個體，以預防疾病發(fā)生或改善癥狀或推遲癥狀惡化。特定而言，人參皂苷M1可在發(fā)生腎纖維化時或之前投用，或在發(fā)生腎纖維化之后投用。

此外，依據(jù)本發(fā)明，含有以人參皂苷M1作為活性成分的人參皂苷M1或組合物可用于結合現(xiàn)有的療法或藥劑，如醫(yī)藥治療，包括但不限于，皮質類固醇(如腎上腺皮質酮)、非類固醇消炎藥物(NSAIDs)、細胞毒性藥物(如環(huán)磷酰胺、氯芥苯丁酸、及硫唑嘌呤)、免疫抑制劑(如環(huán)孢素及霉酚酸酯)、及血管擴張劑(如血管緊張素轉化酶抑制劑(ACE抑制劑)。在一具體實施例中，用于結合之藥劑或療法可同時(并行)或依序使用。當結合藥劑使用時，可將藥劑混入相同配方或分別使用不同配方，如個別的膠囊、丸劑、片劑、及注射劑。

本發(fā)明系進一步以下列實例說明，其目的旨在闡述而非局限。

實施例

1.材料及方法

1.1動物模型與實驗方法

UUO(單側輸尿管阻塞(Unilateral ureteral obstruction，UUO)動物模型

雄性8周齡C57BL/6小鼠系購自實驗動物繁殖及研究中心(中國臺灣，臺北)，且飼養(yǎng)于NDMC的動物中心(中國臺灣，臺北)。所有動物實驗的進行皆獲得中國臺灣NDMC的IACUC的核準，且符合NIH實驗動物照護及使用指南。

小鼠首先以戊巴比妥鈉(50mg/kg，腹腔注射)麻醉。在小鼠左側切開一開口，暴露出左側輸尿管，以6-0絲縫線捆綁于二個點上，并切斷二個捆綁點之間的輸尿管。最后，縫合圍腸膜與皮膚。依照所有UUO程序的步驟，除了捆綁與切除輸尿管的步驟之外，以進行假手術作為對照組(Xiao等人，腺苷A2A受體：在阻塞性腎病變中調節(jié)腎間質纖維化的目標，PLoS One.2013Apr 9；8(4):e60173)。

簡言之，所有小鼠均接受術前止痛(皮下注射50mg/kg丁基原啡因(Temgesic，Shering-Plough))，右側輸尿管隨后在2.0％異氟醚誘導麻醉下，透過一個小的腹部切口以6.0絲捆綁。腹部以二層縫合關閉，且小鼠于28℃下于通風櫥內進行術后恢復12小時。小鼠在術后7或14天進行犧牲(Pulskens等人，Nlrp3預防早期腎間質水腫以及在單側輸尿管阻塞中的血管通透性，PLoS One.2014Jan 15；9(1):e85775)。

1.2人參皂苷M1與投予

人參皂苷M1，即20-β-D-吡喃葡萄糖基原人參二醇(20-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxadiol，以下稱為LCHK168)，系以本領域習知之方法制備，如中國臺灣專利申請案第094116005號(I280982)及美國專利第7,932,057號所揭示者。LCHK168系溶解于3％cremophore中(Sigma-Aldrich公司)。在UUO手術前一天開始，以腹腔注射方式每天給予小鼠日劑量的LCHK168(30mg/kg)直到犧牲為止。

1.3腎組織病理學

石蠟包埋的腎臟組織進行切片，并使用標準程序以Masson氏三色染劑以及蘇木精及伊紅(hematoxylin and eosin，H&E)染色。針對組織病理學，該組織以10％緩沖的甲醛固定，并包埋于石蠟中，然后制備切片(厚度3μm)并以蘇木精及伊紅(H&E)染色。

所有的切片在固定后檢視。半定量方法是根據(jù)腎小管間質上的發(fā)炎及纖維化的程度進行，隨機選擇20個視野進行評分。0表示正常形態(tài)學，1表示有影響的區(qū)域少于10％，2表示有影響的區(qū)域約10至30％，3表示有影響的區(qū)域約30至50％，以及4表示有影響的區(qū)域大于50％，

1.4免疫組織化學(Immunohistochemistry，IHC)與細胞凋亡的偵測

針對IHC，甲醛固定且石蠟包埋的組織切片于4℃下以抗PCNA抗體(Santa Cruz生物科技公司，Santa Cruz，加州，美國)、CD3抗體(DAKO公司，Glostrup，丹麥)、α-SMA抗體(Thermo Fisher Scietific公司，Waltham，麻州，美國)、膠原蛋白第III型抗體、膠原蛋白第IV型抗體(兩者皆來自SouthernBiotech公司，Birmingham，亞拉巴馬州，美國)、F4/80抗體(單核細胞/巨噬細胞；Serotec公司，Raleigh，北卡羅訥州，美國)、磷酸化-NF-κB p65抗體(pNF-κB p65；Cell Signaling Technology公司，Beverly，麻州，美國)，稀釋于DAKO抗體稀釋緩沖液中(DAKO公司，Glostrup，丹麥)處理整夜，然后在室溫下以在相同緩沖液的共軛連接辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)的二級抗體(DAKO公司)或是抗-兔聚合物-HRP抗體(BioGenex公司，F(xiàn)remont，加州，美國)處理1小時；然后加入DAB(BioGenex公司)。蘇木精系用于復染細胞核。針對細胞凋亡的偵測，使用末端脫氧核苷酸轉移酶-調節(jié)的dUTP缺口末端標記(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL)。使用凋亡標記加上過氧化酶原位細胞凋亡偵測套組(ApopTag Plus Peroxidase In Situ Apoptosis detection kit，Chemicon公司，Temecula，加州，美國)根據(jù)制造商的指示對甲醛固定的組織切片染色。大量的α-SMA、膠原蛋白第III型、膠原蛋白第IV型，或磷酸化NF-κB p65⁺、PCNA⁺、F4/80⁺、CD3⁺以及細胞凋亡的細胞的數(shù)量，在隨機選擇的皮質區(qū)腎小管間質腔室的視野中(放大倍率400倍)，以Pax-It量化圖像分析軟件進行計數(shù)(Paxcam)。

1.5流式細胞儀

來自小鼠的脾細胞以Tris緩沖的氯化銨處理，以去除紅血球，清洗后，再懸浮于補充有10％胎牛血清、Hepes緩沖液、L-麩酰胺酸，以及青霉素/鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中(皆來自Invitrogen/Life Technologies公司，Grand Island，紐約州，美國)。接著細胞以T或B細胞的表面標記染色，使用FITC共軛結合的抗-小鼠CD3抗體(17A2)偵測T細胞，以抗小鼠CD19抗體(1D3)偵測B細胞，以及藻紅蛋白-共軛結合的抗-小鼠CD69抗體(H1.2F3；所有抗體皆來自BD Biosciences公司)。針對骨髓細胞分析，來自小鼠的骨髓依照描述分離(Takeshita S等人，2014年)，且以抗小鼠Sca-1抗體(BD Biosciences公司)或CD34抗體(eBioscience公司，San Diego，加州，美國)染色。使用FACSCalibur儀器(BD Biosciences公司)進行流式細胞分析。

1.6梅生三色染色(Masson's Trichrome Staining)

將3μm的腎切片培養(yǎng)在75℃達15分鐘。將玻片移轉上方至二甲苯及梯度酒精。在蘇木紫染色1分鐘后，將媒染劑固定于玻片上。在以0.75％橘G溶液、梅生染色溶液B、2.5％磷鎢酸溶液及苯胺藍染色溶液染色之后，以1％醋酸清洗兩次并以阿拉伯膠固定。風干數(shù)分鐘，在光學顯微鏡上觀察染色的切片。

1.7酵素免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)

藉由29G胰島素注射針筒從腎大盞及腎盂收集尿液。在正常對照組，則由代謝籠收及尿液。依據(jù)制造商(eBioscience and R&D)的說明書，藉由ELISA偵測MCP-1、TNF-α及IL-1β。簡言之，將捕獲抗體涂布在96孔盤上經過隔夜。以PBST清洗后，將阻斷緩沖液、樣本、偵測抗體及親合素-HRP依序加入。在TMB基質步驟后發(fā)展顏色，然后加入2N H₂SO₄停止反應。最后，測量O.D.450nm。

1.8統(tǒng)計分析

數(shù)值是平均值±SD。以Student’s t檢定進行二組別間之比較。p值<0.05視為具有顯著差異。

2.結果

2.1實驗UUO模型的建立

實驗系以8-10周齡的C57BL/6小鼠進行。小鼠隨機分為假手術對照組、疾病對照組與LCHK168治療組，且在UUO之后7或14天進行犧牲。在UUO腎臟的腎盂中觀察到尿液滯留，顯示UUO模型建立成功。參見圖1A及圖1B。

2.2腎組織病理學評估

收集腎組織、固定并且進行H&E染色。如圖2所示，在UUO第7天，疾病對照組小鼠在間質區(qū)域顯現(xiàn)出顯著的單核白血球浸潤及腎小管擴張，這些組織病理學特征在投予LCHK168后受到抑制。在UUO第14天，觀察到纖維化與腎小管萎縮，這些在投予LCHK168之后也顯著受到抑制。

2.3腎細胞凋亡與增殖的評估

在UUO腎臟中，尿液滯留而造成機械應力，而由腎細胞釋放出細胞激素與ROS響應該應力，導致細胞的損傷，其導致細胞自我更新或凋亡反應。腎切片進行TUNNEL染色以分析凋亡的細胞，結果顯示UUO腎間質區(qū)域的染色在投予LCHK168后下降。參見圖3A。

以增殖的細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)，進行腎切片免疫組織化學染色，其系一種不只針對腎小管上皮細胞增殖狀態(tài)也針對活化的肌纖維母細胞與發(fā)炎細胞的標記，結果顯示在UUO之后PCNA顯現(xiàn)出顯著地增加，特別是在擴張的腎小管中。然而，在投予LCHK168之后，PCNA的表現(xiàn)下降。這些結果顯示，LCHK168可能減弱細胞凋亡與損傷。見圖3B。

2.4纖維化表現(xiàn)評估

在UUO腎臟中，纖維化是一種對腎組織損傷的不良反應，且若阻塞持續(xù)存在，則將會發(fā)展為不可逆的腎功能不全。以梅生三色染色進行腎切片的組織化學染色顯示，相較于假手術對照組，在UUO間質區(qū)域內纖維化組織顯著地增加，而在投予LCHK168后減少。參見圖4A。進一步對腎切片進行α-SMA、膠原蛋白第III型以及膠原蛋白第IV型的免疫組織化學染色分析，結果顯示這些指針都在UUO間質區(qū)域中強烈地表現(xiàn)，且在投予LCHK168后表現(xiàn)下降。參見圖4B-圖4E。這些數(shù)據(jù)顯示，LCHK168可能減緩肌纖維母細胞的活化以及在腎間質中的腎纖維化。

2.5NF-κB調節(jié)的發(fā)炎反應

2.5.1NF-κB在腎組織中的表現(xiàn)

NF-κB是一種針對其細胞激素與細胞黏附分子的刺激之發(fā)炎相關因子的調節(jié)所必需的核轉錄因子。先前的研究顯示，在各種發(fā)炎性疾病中，包括腎臟疾病，NF-κB的表現(xiàn)水平提升。針對NF-κB的腎切片免疫組織化學染色顯示NF-κB表現(xiàn)的增加，且在投予LCHK168后被抑制。參見圖5。這數(shù)據(jù)顯示，LCHK168可抑制在UUO腎臟內的NF-κB。

2.5.2單核白血球浸潤

先前的研究顯示，發(fā)炎細胞在UUO的發(fā)病機制中扮演重要的角色。單核白血球的浸潤可在UUO的早期階段中被觀察到，特別是巨噬細胞與T淋巴細胞。隨著阻塞的持續(xù)，活化的發(fā)炎細胞刺激腎小管上皮細胞或其他發(fā)炎細胞釋放各種細胞激素與趨化激素，引致更多的發(fā)炎細胞聚集至腎間質區(qū)域，以及誘發(fā)的腎發(fā)炎與纖維化。單核白血球浸潤的評估以腎切片的F4/80與CD3+免疫組織化學染色來進行，其為巨噬細胞與T細胞的標記。在UUO之后F4/80與CD3+的表現(xiàn)增加，且在投予LCHK168后減少。參見圖6A、圖6B。這些數(shù)據(jù)顯示，LCHK168可預防腎間質的巨噬細胞與T細胞浸潤。

2.5.3尿液中MCP-1、TNF-α及IL-1β的表現(xiàn)評估

在初始階段，細胞激素及趨化激素集中釋放在腎并可聚集免疫細胞。被聚集的免疫細胞接著釋放越來越多的發(fā)炎因子。偵測腎盂中的MCP-1、TNF-α及IL-1β。UUO及UUO+LCHK組均表現(xiàn)較高的MCP-1、TNF-α及IL-1β，相較于第7天的正常對照組而言。雖然這些細胞激素及趨化激素在第14天，在UUO+LCHK組顯著下降，相較于UUO組而言。圖式顯示LCHK168可顯著降低尿液的MCP-1、TNF-α及IL-1β水平。

2.6細胞免疫力的活化與造血干細胞活化

2.6.1B與T淋巴細胞的活化

為了檢驗LCHK168是否透過抑制全身性細胞免疫力來預防局部發(fā)炎反應與纖維化，我們以流式細胞儀檢驗了在脾細胞中的B細胞與T細胞的活化。如圖8A與圖8B所示，在這三個族群中CD3⁺CD69⁺(活化的泛B細胞)與CD4⁺CD69⁺(活化的泛T細胞)的百分比皆無顯著的改變。這些數(shù)據(jù)顯示，由UUO造成的腎病變可能對全身性細胞免疫力的影響不大，且LCHK168可能并非透過抑制全身性細胞免疫力來預防局部發(fā)炎反應與纖維化。

2.6.2造血干細胞的活化

為了檢驗LCHK168是否透過抑制造血干細胞的活化而預防局部發(fā)炎反應與纖維化，我們以流式細胞儀檢驗了在骨髓細胞中的干細胞與造血干細胞的活化。如圖9A與圖9B所示，在這三個族群中，干細胞抗原-1-陽性細胞(造血干細胞)與CD34⁺(干細胞)的百分比皆無顯著的改變。該獲得的數(shù)據(jù)顯示，由UUO造成的腎病變可能對造血干細胞活化的影響不大，且LCHK168可能并非透過抑制造血干細胞的活化來預防局部發(fā)炎反應與纖維化。

總而言之，我們的研究顯示，人參皂苷M1在UUO模型中能有效預防腎纖維化的發(fā)展。特別是，研究結果顯示人參皂苷M1(1)降低腎間質組織的細胞凋亡與腎小管損傷，(2)預防腎間質組織的纖維化與膠原蛋白沈積，(3)降低NF-κB的活化，(4)預防腎臟的巨噬細胞與T細胞浸潤，以及(5)造血干細胞的正常功能與全身性細胞免疫力。所有的發(fā)現(xiàn)暗示了人參皂苷M1可以進一步被發(fā)展為治療或預防腎纖維化的候選新藥。

相信熟習本發(fā)明領域普通知識之技術人員可基于本文之闡述最大限度利用本發(fā)明，而毋須進一步說明。因此，應理解到，所提供之說明及主張僅用于示例之目的，而非以任何方式局限本發(fā)明之范疇。