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檢測核酸的方法和其應(yīng)用與流程

文檔序號:11109734閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.檢測生物樣品中靶標(biāo)核酸的方法,包括:

a)通過多個捕獲延伸劑捕獲所述靶標(biāo)核酸,其中所述捕獲延伸劑中的每個包括與所述靶標(biāo)核酸上的區(qū)域雜交的捕獲序列和與綴合到固體載體的捕獲探針雜交固定序列,從而將所述靶標(biāo)核酸固定到所述固體載體;

b)使所述靶標(biāo)核酸與多個檢測探針接觸,其中所述多個檢測探針中的每個包括與所述靶標(biāo)核酸相同鏈上的區(qū)域雜交的序列;

c)連接與所述靶標(biāo)核酸雜交的所述多個檢測探針以形成連接的檢測序列;

d)擴(kuò)增所述連接的檢測序列;和

e)檢測擴(kuò)增的連接的檢測序列。

2.權(quán)利要求1所述的方法,其中所述多個檢測探針包括5’檢測探針和3’檢測探針,其中所述5’檢測探針在其5’端被磷酸化。

3.權(quán)利要求2所述的方法,其中所述多個檢測探針進(jìn)一步包括至少一個內(nèi)部檢測探針,所述內(nèi)部檢測探針與所述5’探針雜交的區(qū)域和所述3’探針雜交的區(qū)域之間的區(qū)域雜交,其中所述內(nèi)部檢測探針在其5’端被磷酸化。

4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述連接步驟通過連接酶進(jìn)行。

5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法,其中步驟a)和b)同時(shí)進(jìn)行。

6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法,進(jìn)一步包括通過用DNA聚合酶或反轉(zhuǎn)錄酶處理填補(bǔ)與所述靶標(biāo)核酸雜交的檢測探針之間的任何缺口。

7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述擴(kuò)增步驟包括使用與所述5’檢測探針上的區(qū)域互補(bǔ)的第一引物和在序列上對應(yīng)于所述3’檢測探針上的區(qū)域的第二引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述靶標(biāo)核酸是RNA。

9.權(quán)利要求8所述的方法,其中所述RNA是mRNA、核糖體RNA、mRNA的剪接同種型、非編碼RNA、或循環(huán)RNA。

10.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述靶標(biāo)核酸是DNA。

11.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述生物樣品是細(xì)胞裂解物。

12.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述生物樣品選自細(xì)胞裂解物、組織勻漿、血液樣品、干血斑、血漿樣品、血清樣品、血凝塊、鼻拭子、咽拭子、頰拭子、尿、和唾液。

13.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述方法是高通量的。

14.權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的方法,進(jìn)一步包括診斷個體中的疾病,如由包括所述靶標(biāo)核酸的病原體引起的傳染病,其中所述靶標(biāo)核酸的檢測指示所述個體中所述疾病的陽性診斷。

15.權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的方法,進(jìn)一步包括檢測與疾病相關(guān)的遺傳變異,其中所述靶標(biāo)核酸包括所述變異,和所述多個檢測探針中的至少一個可與包括全部或部分所述變異的所述靶標(biāo)核酸的區(qū)域雜交。

16.權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述靶標(biāo)核酸是外源核酸。

17.檢測生物樣品中多個靶標(biāo)核酸的方法,包括:

a)通過多個捕獲延伸劑捕獲所述多個靶標(biāo)核酸中的一個,其中所述捕獲延伸劑中的每個包括與所述靶標(biāo)核酸上的區(qū)域雜交的捕獲序列和與綴合到固體載體的捕獲探針雜交的固定序列,從而將所述靶標(biāo)核酸固定到所述固體載體;

b)使所述多個靶標(biāo)核酸中的一個與多個檢測探針接觸,所述檢測探針包括第一引物結(jié)合部位和第二引物結(jié)合部位,其中所述多個檢測探針中的每個包括與所述靶標(biāo)核酸上的區(qū)域雜交的序列;

c)針對所述多個靶標(biāo)核酸中的每個進(jìn)行步驟a)和b);

d)連接所述多個檢測探針以形成對所述多個靶標(biāo)核酸中的每個特異的多個連接的檢測序列;

e)擴(kuò)增所述多個連接的檢測序列;和

f)檢測多個擴(kuò)增的連接的檢測序列。

18.權(quán)利要求17所述的方法,其中所述第一引物結(jié)合部位是所述多個檢測探針中每個共有的第一共用引物結(jié)合部位,第二引物結(jié)合部位是所述多個檢測探針中每個共有的第二共用引物結(jié)合部位,和所述擴(kuò)增步驟使用對應(yīng)于所述第一和第二共用引物結(jié)合部位的共用PCR引物對來進(jìn)行。

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