該申請(qǐng)要求2014年9月5日提交的名稱為“Methods of detecting nucleic acids and applications thereof(檢測(cè)核酸的方法和其應(yīng)用)”的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?2/046,810的優(yōu)先權(quán)，其以其全部通過引用被并入本文。

發(fā)明背景

核酸，作為診斷靶標(biāo)，在臨床環(huán)境中具有很大的重要性。許多年來，DNA已成功用作許多疾病診斷的分子靶標(biāo)，這些疾病包括出生前狀況(Lun et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105(50):19920-5,2008)、癌癥(Gormally et al.,Mutat.Res.635(2-3):105-17,2007)和傳染病(Hawkes和Kain,Expert Rev.Anti Infect.Ther.5(3):485-95,2007)。基于DNA的診斷學(xué)包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)(Rougemont et al.,J.Clin.Microbiol.42(12):5636-43,2004)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)(Hopkins et al.,J.Infect.Dis.208(4)；645-652,2013)等，其全部提供靶標(biāo)DNA的敏感檢測(cè)。然而，它們主要依賴檢測(cè)前DNA的提取，提取過程可以是艱苦的和易于污染。這在大量樣品被處理的環(huán)境中特別有問題。

RNA也是診斷學(xué)的良好靶標(biāo)(Miura et al.,Clin.Med.Oncol.2:511-27,2008；Ng et al.,Clin.Chem.48(8):1212-7,2002；Skog et al.,Nat.Cell Biol.10(12):1470-U209,2008；Murphy et al.,Amer.J.Trop.Med.Hyg.86(3):383-94,2012；Mens et al.,Malar.J.5:80,2006；Mitra et al.,Front.Genet.3:17,2012)。目前的RNA檢測(cè)方法主要包括微陣列雜交、反轉(zhuǎn)錄PCR、基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)和RNA雜交試驗(yàn)。微陣列試驗(yàn)?zāi)芡瑫r(shí)測(cè)量大量基因的表達(dá)水平或基因分型單個(gè)RNA樣品中基因組的多個(gè)區(qū)域。然而當(dāng)大量樣品中只有少量基因需要測(cè)試時(shí)，如在臨床診斷環(huán)境中，微陣列的使用變得不切實(shí)際，因?yàn)槌杀拘б娴秃蛣趧?dòng)力需求高。反轉(zhuǎn)錄PCR是目前最廣泛使用的RNA定量技術(shù)，但是由于它依賴RNA的純化和反轉(zhuǎn)錄，所以定量的準(zhǔn)確性和再現(xiàn)性可由提取和反轉(zhuǎn)錄過程的多變效率而減少(Bustin和Nolan,J.Biomol.Tech.15(3):155-66,2004)。

NASBA(Schneider et al.,J.Clin.Microbiol.43(1):402-5,2005)和大小編碼的連接介導(dǎo)的聚合酶鏈反應(yīng)(SL-PCR)(Arefian et al.,Nucleic Acids Res.39(12),2011)檢測(cè)RNA，無需在前的反轉(zhuǎn)錄，使特異、敏感、定量的RNA檢測(cè)成為可能。然而，它們都仍然依賴RNA的提取和DNA的凈化，這都是需要專家經(jīng)驗(yàn)和易錯(cuò)的過程(Peirson和Butler,Methods Mol.Biol.362:315-27,2007)。

先前由發(fā)明人開發(fā)的基于雜交的RNA檢測(cè)技術(shù)避免了RNA純化和反轉(zhuǎn)錄，敏感和特異、高通量測(cè)量全血中RNA水平(Zheng et al.,Clin.Chem.52(7):1294-302,2006)。雖然能多重檢測(cè)，但是該方法要求特別制作的分支DNA多聚體作為信號(hào)放大器，這妨礙其在普通實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中的應(yīng)用。

依賴連接的PCR試驗(yàn)(Hsuih et al.,J.Clin.Microbiol.34(3):501-7,1996)也檢測(cè)RNA而無需RNA提取或反轉(zhuǎn)錄。該試驗(yàn)使用兩個(gè)DNA捕獲探針用于RNA分離和兩個(gè)DNA半探針(hemiprobes)用于隨后的PCR。DNA捕獲探針具有靶標(biāo)互補(bǔ)序列以及生物素部分——其可結(jié)合到具有鏈霉親和素的表面。兩個(gè)DNA半探針被設(shè)計(jì)為彼此并排結(jié)合到靶標(biāo)RNA。靶標(biāo)RNA由錨定到固體表面的捕獲探針通過生物素和鏈霉親和素之間的相互作用直接從樣品裂解物純化。然后半探針可通過與連接酶溫育而互相連接(參見EP1311703)以形成充當(dāng)PCR模板的完全探針。

本文討論的所有參考文獻(xiàn)以其全部通過引用被并入。

發(fā)明簡(jiǎn)述

一方面，本發(fā)明提供檢測(cè)生物樣品中靶標(biāo)核酸(target necleic acid)的方法，包括：a)通過多個(gè)捕獲延伸劑(extender)捕獲所述靶標(biāo)核酸，其中捕獲延伸劑中的每個(gè)包括與靶標(biāo)核酸上的區(qū)域雜交的捕獲序列(靶標(biāo)核酸上的這種區(qū)域本文稱作捕獲靶向序列)和與綴合到固體載體的捕獲探針雜交的固定序列，從而將靶標(biāo)核酸固定到固體載體；b)使靶標(biāo)核酸與多個(gè)檢測(cè)探針接觸，其中所述多個(gè)檢測(cè)探針中的每個(gè)包括與靶標(biāo)核酸上的區(qū)域雜交的序列(靶標(biāo)核酸上的這種區(qū)域本文稱作檢測(cè)靶向序列)；c)連接所述多個(gè)檢測(cè)探針以形成連接的檢測(cè)序列，其中檢測(cè)探針與固定到固體載體的靶標(biāo)核酸雜交；d)擴(kuò)增所述連接的檢測(cè)序列；和e)檢測(cè)擴(kuò)增的連接的檢測(cè)序列。

在一些實(shí)施方式中，所述多個(gè)檢測(cè)探針包括5’檢測(cè)探針和3’檢測(cè)探針，其中與5’檢測(cè)探針中的序列互補(bǔ)的靶標(biāo)核酸的區(qū)域(靶標(biāo)核酸的所述區(qū)域?yàn)?’檢測(cè)探針的檢測(cè)靶向序列)是5’至與3’檢測(cè)探針中的序列互補(bǔ)的靶標(biāo)核酸的區(qū)域(靶標(biāo)核酸的所述區(qū)域?yàn)?’檢測(cè)探針的檢測(cè)靶向序列)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述多個(gè)檢測(cè)探針進(jìn)一步包括至少一個(gè)內(nèi)部檢測(cè)探針，其與5’和3’檢測(cè)探針的檢測(cè)靶向序列之間的靶標(biāo)核酸的區(qū)域互補(bǔ)。在一些實(shí)施方式中，5’檢測(cè)探針和任何內(nèi)部檢測(cè)探針在它們的5’端被磷酸化。在一些實(shí)施方式中，5’檢測(cè)探針和任何內(nèi)部檢測(cè)探針在它們的5’端未被磷酸化。

在一些實(shí)施方式中，連接步驟通過連接酶，如T4連接酶進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，當(dāng)與靶標(biāo)核酸雜交時(shí)檢測(cè)探針之間的任何缺口已用聚合酶或反轉(zhuǎn)錄酶填補(bǔ)之后，連接步驟通過連接酶，如T4連接酶進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，檢測(cè)探針未磷酸化，在用聚核苷酸激酶，如T4聚核苷酸激酶磷酸化檢測(cè)探針之后，連接步驟通過連接酶，如T4連接酶進(jìn)行。

在一些實(shí)施方式中，擴(kuò)增步驟包括使用與5’檢測(cè)探針上的區(qū)域互補(bǔ)的第一引物和對(duì)應(yīng)于3’檢測(cè)探針上的區(qū)域的第二引物的PCR擴(kuò)增。

在一些實(shí)施方式中，靶標(biāo)核酸在細(xì)胞內(nèi)。在一些實(shí)施方式中，靶標(biāo)核酸不在細(xì)胞內(nèi)。在一些實(shí)施方式中，靶標(biāo)核酸是RNA。在一些實(shí)施方式中，RNA是mRNA、核糖體RNA、mRNA的剪接同種型、或非編碼RNA。在一些實(shí)施方式中，核糖體RNA是18S核糖體RNA。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，靶標(biāo)核酸是DNA。

在一些實(shí)施方式中，生物樣品選自細(xì)胞裂解物、組織勻漿、血液樣品、干血斑、血漿樣品、血清樣品、血凝塊、鼻拭子、咽拭子、頰拭子、尿、和唾液。

在一些實(shí)施方式中，所述方法是高通量的。

另一方面，本發(fā)明提供診斷個(gè)體中疾病的方法。在一些實(shí)施方式中，疾病由病原體引起。在一些實(shí)施方式中，疾病，如傳染病，通過檢測(cè)來自個(gè)體的生物樣品中的病原體核酸來診斷。在一些實(shí)施方式中，疾病與異常靶標(biāo)核酸(如體液樣品中的循環(huán)腫瘤核酸或出生前核酸)相關(guān)，并通過檢測(cè)來自個(gè)體的生物樣品中的異常靶標(biāo)核酸來診斷。

再一方面，本發(fā)明提供檢測(cè)個(gè)體中遺傳變異(如突變)的方法。在一些實(shí)施方式中，遺傳變異與疾病相關(guān)。

再一方面，本發(fā)明提供檢測(cè)生物樣品中外來核酸的方法。在一些實(shí)施方式中，外來核酸的來源選自污染物、病原體等。

在一些實(shí)施方式中，提供檢測(cè)生物樣品中多個(gè)靶標(biāo)核酸的方法。

在一些實(shí)施方式中，提供使用矩陣混合策略針對(duì)一種或多種靶標(biāo)核酸的存在篩選大量樣品的方法。

附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示使用能夠連接的PCR檢測(cè)生物樣品中靶標(biāo)核酸存在的示例方法的示意圖。

圖2A和2B每個(gè)顯示當(dāng)使用連接形成線性連接的檢測(cè)序列的檢測(cè)探針時(shí)，使用基于核酸雜交的捕獲組合本申請(qǐng)的能夠連接的PCR，在靶標(biāo)核酸的捕獲和檢測(cè)期間形成的示例復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和特點(diǎn)的示意圖。

圖3A和3B每個(gè)顯示當(dāng)使用連接形成環(huán)狀連接的檢測(cè)序列的一種或多種檢測(cè)探針時(shí)，使用基于核酸雜交的捕獲組合本申請(qǐng)的能夠連接的PCR，在靶標(biāo)核酸的捕獲和檢測(cè)期間形成的示例復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和特點(diǎn)的示意圖。

圖4顯示LE-PCR技術(shù)的定量性質(zhì)，其中來自樣品RT-qPCR的Ct值與樣品中惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)的濃度相關(guān)。

圖5顯示來自在不同溫度儲(chǔ)存的干血斑的18S rRNA的穩(wěn)定性，如使用分支DNA探針檢測(cè)通過RNA雜交所測(cè)定的。

圖6顯示用來自干血斑的混合樣品的LE-PCR的檢測(cè)靈敏度的保持。

圖7顯示通過LE-PCR組合使用Taqman探針的RT-qPCR的非編碼RNA的特異檢測(cè)。

圖8A、8B和8C顯示檢測(cè)A/B型流感和副流感病毒1IVT-RNA的LE-PCR的靈敏度。

圖9顯示LE-PCR的工作流程的示意圖。

發(fā)明詳述

本發(fā)明提供適合樣品如生物樣品中感興趣的核酸的臨床測(cè)定的簡(jiǎn)化的核酸擴(kuò)增和檢測(cè)系統(tǒng)。該方法利用基于核酸雜交的捕獲和擴(kuò)增，如基于連接的擴(kuò)增，以直接檢測(cè)生物樣品中的核酸，無需核酸制備。該方法敏感、有效和易于適應(yīng)使用者的需要，因此特別適合臨床環(huán)境，尤其當(dāng)同時(shí)分析多個(gè)生物樣品時(shí)。

本申請(qǐng)的方法代表較現(xiàn)有的依賴連接的擴(kuò)增方法——其依賴生物素-鏈霉親和素(strepavidin)相互作用以將靶標(biāo)核酸錨定到固體載體——的顯著進(jìn)步。參見，例如，Hsuih et al.,J.Clin.Microbiol.34(3):501-7,1996。生物素和鏈霉親和素之間的親和性格外高，二者的綴合在RNA/DNA雜交溫度迅速且不可逆(Anders et al.,Electrophoresis 26(3):501-510,2005)。另一方面，捕獲探針和靶標(biāo)核酸(如RNA)之間的雜交緩慢并可占用超過16小時(shí)，尤其當(dāng)靶標(biāo)稀少時(shí)。因此，在具有生物素的捕獲探針與靶標(biāo)RNA雜交之前，具有生物素的捕獲探針將被錨定到涂有鏈霉親和素的表面。這導(dǎo)致三個(gè)后果。第一，與處于溶液相中的捕獲探針相比，當(dāng)捕獲探針被錨定到表面時(shí)，捕獲探針將具有較低的捕獲效率。第二，由于生物素-鏈霉親和素綴合是不依賴序列的過程，所以靶標(biāo)特異的捕獲探針將以隨機(jī)方式而不是有利于捕獲的構(gòu)型被錨定到表面，和由于空間效應(yīng)將不能有效捕獲靶標(biāo)。第三，由于生物素和鏈霉親和素相互作用是不可逆的，所以結(jié)合到表面的游離捕獲探針將阻止靶標(biāo)/捕獲探針復(fù)合物結(jié)合到表面。因此，使用基于生物素-鏈霉親和素的捕獲的依賴連接的PCR試驗(yàn)的靈敏度低(Hsuih et al.,J.Clin.Microbiol.34(3):501-7,1996)，該試驗(yàn)尚未廣泛使用。

本發(fā)明提供可選的擴(kuò)增系統(tǒng)——稱作能夠連接的PCR(LE-PCR)，其利用核酸雜交以將靶標(biāo)核酸錨定到固體載體?；诤怂犭s交的捕獲依賴互補(bǔ)核酸序列的退火——可逆過程，并且當(dāng)組合基于連接的PCR時(shí)具有通過改變參數(shù)而優(yōu)化雜交嚴(yán)格性，產(chǎn)生用于檢測(cè)稀釋的靶標(biāo)核酸的高度選擇性和敏感的試驗(yàn)的潛力，所述參數(shù)包括但不限于溫度、溫育時(shí)間、洗滌、和不同靶標(biāo)核酸特異的探針的數(shù)目和構(gòu)型。該方法與現(xiàn)有方法相比因此顯著更靈敏和特異，和導(dǎo)致至少以下優(yōu)點(diǎn)：1)適合臨床實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，2)檢測(cè)生物樣品中少量核酸的能力，任選地沒有核酸制備，3)獲得可控和一致的(可標(biāo)準(zhǔn)化的)結(jié)果的能力，4)同時(shí)檢測(cè)生物樣品中多個(gè)不同靶標(biāo)核酸的能力，5)混合樣品和保持檢測(cè)靈敏度的能力，和6)與目前可獲得的方法相比減少的所需成本和技術(shù)。

進(jìn)一步，本方法允許多個(gè)樣品的較容易自動(dòng)化和連續(xù)處理。例如，多個(gè)樣品，不論來源(例如，人、家畜、植物、水)或類型(例如，血液、唾液、鼻拭子、咽拭子、頰拭子、尿等)可平行測(cè)定。不同的靶標(biāo)核酸可在被平行處理的樣品的每個(gè)中檢測(cè)。多個(gè)靶標(biāo)核酸(如來自單個(gè)病原體或來自多個(gè)不同病原體)可在被平行處理的樣品的每個(gè)中同時(shí)檢測(cè)。

因此，本申請(qǐng)一方面提供使用基于連接的擴(kuò)增聯(lián)合基于核酸雜交的靶標(biāo)核酸捕獲(LE-PCR)來檢測(cè)(包括測(cè)序)來自生物樣品的靶標(biāo)核酸的方法。另一方面，提供使用其它已知的核酸擴(kuò)增技術(shù)，如PCR、LAMP和RCA，聯(lián)合基于核酸雜交的靶標(biāo)核酸捕獲來檢測(cè)(包括測(cè)序)來自生物樣品的靶標(biāo)核酸的方法。另一方面，提供使用本文描述的方法檢測(cè)生物樣品中的病原體的方法。進(jìn)一步提供使用本文描述的方法診斷疾病和檢測(cè)遺傳變異的方法。還提供用于實(shí)施本文描述的方法的試劑盒和制品。

如本文和所附權(quán)利要求中所用，單數(shù)形式“一(a)”、“一(an)”和“所述或該(the)”包括復(fù)數(shù)的指示物，除非上下文另外清楚地指出。

本文提到“約”值或參數(shù)包括(和描述)涉及該值或參數(shù)本身的實(shí)施方式。例如，提到“約X”的描述包括“X”的描述。

本發(fā)明的方法

本申請(qǐng)?zhí)峁z測(cè)生物樣品中靶標(biāo)核酸的方法，包括使生物樣品與檢測(cè)探針、捕獲延伸劑和捕獲探針接觸。捕獲延伸劑每個(gè)包括a)與靶標(biāo)核酸的區(qū)域互補(bǔ)的捕獲序列；和b)與捕獲探針中的序列互補(bǔ)的固定序列。捕獲探針結(jié)合到固體載體，因此通過結(jié)合的捕獲探針與捕獲延伸劑的固定序列的雜交來固定與捕獲延伸劑的捕獲序列雜交的靶標(biāo)核酸。檢測(cè)探針每個(gè)包括與靶標(biāo)核酸的區(qū)域互補(bǔ)的序列，并可進(jìn)一步包括與靶標(biāo)核酸的任何區(qū)域都不互補(bǔ)的共用(generic)序列和包括用于擴(kuò)增的共用引物結(jié)合部位。在提供識(shí)別單個(gè)靶標(biāo)核酸的多個(gè)檢測(cè)探針的情況下，與固定在固體載體上的靶標(biāo)核酸雜交的檢測(cè)探針可被連接以形成單個(gè)連接的檢測(cè)序列。一旦連接，連接的檢測(cè)序列可被擴(kuò)增和檢測(cè)。這樣的方法允許生物樣品被處理而無需來自生物樣品的核酸的純化或當(dāng)靶標(biāo)核酸是RNA時(shí)無需反轉(zhuǎn)錄。檢測(cè)探針可在靶標(biāo)核酸被固定到固體載體之前或之后與靶標(biāo)核酸雜交?？蛇x地，檢測(cè)探針的雜交和固定反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行。

本文所用的“生物樣品”指來自生物源如動(dòng)物、植物、食物來源、或環(huán)境來源的樣品，也指包括來自多個(gè)生物源的樣品。

本文所用的“核酸”包括DNA(如基因組DNA)和RNA(如mRNA或rRNA)。

當(dāng)提到核酸區(qū)域時(shí)本文所用的“連續(xù)的”指該區(qū)域無重疊和不同區(qū)域之間有不超過約500個(gè)堿基，例如，核酸的連續(xù)區(qū)域可被0、50、100、150、200、250、300、350、400、450或500個(gè)堿基中的約任意一個(gè)分隔。連續(xù)區(qū)域之間可具有或可沒有缺口。當(dāng)不同區(qū)域之間沒有缺口時(shí)連續(xù)區(qū)域視為彼此“相鄰”。當(dāng)提到核酸區(qū)域時(shí)本文所用的“非連續(xù)的”指該區(qū)域無重疊和它們由超過約500個(gè)堿基分隔，例如，核酸的非連續(xù)區(qū)域可由550、750、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000個(gè)堿基中約任意一個(gè)分隔。

因此，在一些實(shí)施方式中，提供檢測(cè)樣品中靶標(biāo)核酸的方法，包括：a)通過多個(gè)捕獲延伸劑捕獲靶標(biāo)核酸，其中捕獲延伸劑中的每個(gè)包括與靶標(biāo)核酸上的區(qū)域雜交的捕獲序列和與綴合到固體載體的捕獲探針雜交的固定序列，從而將靶標(biāo)核酸固定到固體載體；b)使靶標(biāo)核酸與多個(gè)檢測(cè)探針接觸，其中所述多個(gè)檢測(cè)探針中的每個(gè)包括與靶標(biāo)核酸上的區(qū)域雜交的序列；c)連接所述多個(gè)檢測(cè)探針以形成連接的檢測(cè)序列；d)擴(kuò)增所述連接的檢測(cè)序列；和e)檢測(cè)(如測(cè)序)擴(kuò)增的連接的檢測(cè)序列。在一些實(shí)施方式中，所述多個(gè)檢測(cè)探針與靶標(biāo)核酸的連續(xù)區(qū)域雜交。鄰近的連續(xù)區(qū)域可彼此相鄰(即，它們之間沒有缺口)，或它們之間可具有不超過約500個(gè)堿基的缺口。在一些實(shí)施方式中，所述多個(gè)檢測(cè)探針與靶標(biāo)核酸的相鄰區(qū)域雜交。在一些實(shí)施方式中，所述多個(gè)檢測(cè)探針中的至少一些與靶標(biāo)核酸的非連續(xù)區(qū)域雜交。鄰近的非連續(xù)區(qū)域由超過約500個(gè)堿基分隔。在一些實(shí)施方式中，所述多個(gè)捕獲延伸劑與靶標(biāo)核酸的連續(xù)(如相鄰)區(qū)域雜交。在一些實(shí)施方式中，所述多個(gè)捕獲延伸劑中的至少一些與靶標(biāo)核酸的非連續(xù)區(qū)域雜交。在一些實(shí)施方式中，所述檢測(cè)探針和捕獲延伸劑中的至少一些與靶標(biāo)核酸的連續(xù)(如相鄰)區(qū)域雜交。在一些實(shí)施方式中，所述捕獲延伸劑不與檢測(cè)探針雜交的區(qū)域之間的任何區(qū)域雜交。在一些實(shí)施方式中，在靶標(biāo)核酸具有超過一條鏈的情況下，捕獲延伸劑與靶標(biāo)核酸的同一條鏈雜交。在一些實(shí)施方式中，在靶標(biāo)核酸具有超過一條鏈的情況下，捕獲延伸劑中的至少一些與靶標(biāo)核酸的不同鏈雜交。在一些實(shí)施方式中，步驟a)在步驟b)之前進(jìn)行，以便通過與靶標(biāo)核酸雜交的捕獲延伸劑和結(jié)合到固體載體的捕獲探針的相互作用，靶標(biāo)核酸首先被捕獲和固定到固體載體，之后是檢測(cè)探針與結(jié)合的靶標(biāo)核酸的雜交。在一些實(shí)施方式中，步驟a)在步驟b)之后進(jìn)行，以便首先形成靶標(biāo)核酸和雜交的檢測(cè)探針的復(fù)合物，之后是通過與靶標(biāo)核酸雜交的捕獲延伸劑和結(jié)合到固體載體的捕獲探針的相互作用，捕獲和固定靶標(biāo)核酸/檢測(cè)探針復(fù)合物。在一些實(shí)施方式中，步驟a)和步驟b)同時(shí)進(jìn)行，以便允許靶標(biāo)核酸與以下雜交：i)檢測(cè)探針；ii)游離的捕獲延伸劑；和iii)與結(jié)合的捕獲探針雜交的固定的捕獲延伸劑。在一些實(shí)施方式中，樣品是生物樣品。在一些實(shí)施方式中，生物樣品選自細(xì)胞裂解物、組織勻漿、血液樣品、血漿樣品、血清樣品、干血斑、血凝塊、鼻拭子、咽拭子、頰拭子、尿和唾液。在一些實(shí)施方式中，靶標(biāo)核酸在生物樣品中是游離的，如不在細(xì)胞內(nèi)。在一些實(shí)施方式中，靶標(biāo)核酸在生物樣品中結(jié)合在細(xì)胞內(nèi)，所述方法進(jìn)一步包括在步驟a)和b)之前的細(xì)胞裂解。在一些實(shí)施方式中，靶標(biāo)核酸是RNA。在一些實(shí)施方式中，RNA是信使RNA。在一些實(shí)施方式中，RNA是核糖體RNA，如18S rRNA。在一些實(shí)施方式中，靶標(biāo)核酸是DNA，如基因組DNA。

在一些實(shí)施方式中，提供檢測(cè)生物樣品中包括靶標(biāo)核酸的病原體的方法，包括：a)通過多個(gè)捕獲延伸劑捕獲所述靶標(biāo)核酸，其中所述捕獲延伸劑中的每個(gè)包括與靶標(biāo)核酸上的區(qū)域雜交的捕獲序列和與綴合到固體載體的捕獲探針雜交的固定序列，從而將靶標(biāo)核酸固定到固體載體；b)使靶標(biāo)核酸與多個(gè)檢測(cè)探針接觸，其中所述多個(gè)檢測(cè)探針中的每個(gè)包括與靶標(biāo)核酸上的區(qū)域雜交的序列；c)連接所述多個(gè)檢測(cè)探針以形成連接的檢測(cè)序列；d)擴(kuò)增所述連接的檢測(cè)序列；和e)檢測(cè)(如測(cè)序)擴(kuò)增的連接的檢測(cè)序列，其中擴(kuò)增的連接的檢測(cè)序列的檢測(cè)指示生物樣品中病原體的存在。在一些實(shí)施方式中，所述多個(gè)檢測(cè)探針與靶標(biāo)核酸的連續(xù)區(qū)域雜交。在一些實(shí)施方式中，所述多個(gè)檢測(cè)探針與靶標(biāo)核酸的相鄰區(qū)域雜交。在一些實(shí)施方式中，所述多個(gè)檢測(cè)探針中的至少一些與靶標(biāo)核酸的非連續(xù)區(qū)域雜交。在一些實(shí)施方式中，所述多個(gè)捕獲延伸劑與靶標(biāo)核酸的連續(xù)(如相鄰)區(qū)域雜交。在一些實(shí)施方式中，所述多個(gè)捕獲延伸劑中的至少一些與靶標(biāo)核酸的非連續(xù)區(qū)域雜交。在一些實(shí)施方式中，所述檢測(cè)探針和捕獲延伸劑中的至少一些與靶標(biāo)核酸的連續(xù)(如相鄰)區(qū)域雜交。在一些實(shí)施方式中，捕獲延伸劑不與檢測(cè)探針雜交的區(qū)域之間的任何區(qū)域雜交。在一些實(shí)施方式中，在靶標(biāo)核酸具有超過一條鏈的情況下，捕獲延伸劑與靶標(biāo)核酸的同一條鏈雜交。在一些實(shí)施方式中，在靶標(biāo)核酸具有超過一條鏈的情況下，捕獲延伸劑中的至少一些與靶標(biāo)核酸的不同鏈雜交。在一些實(shí)施方式中，步驟a)在步驟b)之前進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，步驟a)在步驟b)之后進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，步驟a)和步驟b)同時(shí)進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，生物樣品選自細(xì)胞裂解物、組織勻漿、血液樣品、干血斑、血凝塊、血漿樣品、血清樣品、鼻拭子、咽拭子、頰拭子、尿和唾液。在一些實(shí)施方式中，靶標(biāo)核酸在生物樣品中是游離的，如不在細(xì)胞內(nèi)。在一些實(shí)施方式中，靶標(biāo)核酸在生物樣品中結(jié)合在細(xì)胞內(nèi)，所述方法進(jìn)一步包括在步驟a)和b)之前的細(xì)胞裂解。在一些實(shí)施方式中，靶標(biāo)核酸是RNA。在一些實(shí)施方式中，RNA是信使RNA。在一些實(shí)施方式中，RNA是核糖體RNA，如18S rRNA。在一些實(shí)施方式中，靶標(biāo)核酸是DNA，如基因組DNA。

在一些實(shí)施方式中，提供診斷個(gè)體中由包括靶標(biāo)核酸的病原體引起的疾病的方法，包括：a)通過多個(gè)捕獲延伸劑捕獲所述靶標(biāo)核酸，其中所述捕獲延伸劑中的每個(gè)包括與靶標(biāo)核酸上的區(qū)域雜交的捕獲序列和與綴合到固體載體的捕獲探針雜交的固定序列，從而將靶標(biāo)核酸固定到固體載體；b)使靶標(biāo)核酸與多個(gè)檢測(cè)探針接觸，其中所述多個(gè)檢測(cè)探針中的每個(gè)包括與靶標(biāo)核酸上的區(qū)域雜交的序列；c)連接所述多個(gè)檢測(cè)探針以形成連接的檢測(cè)序列；d)擴(kuò)增所述連接的檢測(cè)序列；和e)檢測(cè)(如測(cè)序)擴(kuò)增的連接的檢測(cè)序列，其中所述擴(kuò)增的連接的檢測(cè)序列的檢測(cè)指示個(gè)體中疾病的陽性診斷。在一些實(shí)施方式中，所述多個(gè)檢測(cè)探針與靶標(biāo)核酸的連續(xù)區(qū)域雜交。在一些實(shí)施方式中，所述多個(gè)檢測(cè)探針與靶標(biāo)核酸的相鄰區(qū)域雜交。在一些實(shí)施方式中，所述多個(gè)檢測(cè)探針中的至少一些與靶標(biāo)核酸的非連續(xù)區(qū)域雜交。在一些實(shí)施方式中，所述多個(gè)捕獲延伸劑與靶標(biāo)核酸的連續(xù)(如相鄰)區(qū)域雜交。在一些實(shí)施方式中，所述多個(gè)捕獲延伸劑中的至少一些與靶標(biāo)核酸的非連續(xù)區(qū)域雜交。在一些實(shí)施方式中，所述檢測(cè)探針和捕獲延伸劑中的至少一些與靶標(biāo)核酸的連續(xù)(如相鄰)區(qū)域雜交。在一些實(shí)施方式中，所述捕獲延伸劑不與檢測(cè)探針雜交的區(qū)域之間的任何區(qū)域雜交。在一些實(shí)施方式中，在靶標(biāo)核酸具有超過一條鏈的情況下，所述捕獲延伸劑與靶標(biāo)核酸的同一條鏈雜交。在一些實(shí)施方式中，在靶標(biāo)核酸具有超過一條鏈的情況下，捕獲延伸劑中的至少一些與靶標(biāo)核酸的不同鏈雜交。在一些實(shí)施方式中，步驟a)在步驟b)之前進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，步驟a)在步驟b)之后進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，步驟a)和步驟b)同時(shí)進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，生物樣品選自細(xì)胞裂解物、組織勻漿、血液樣品、干血斑、血凝塊、血漿樣品、血清樣品、鼻拭子、咽拭子、頰拭子、尿和唾液。在一些實(shí)施方式中靶標(biāo)核酸在生物樣品中是游離的，如不在細(xì)胞內(nèi)。在一些實(shí)施方式中，靶標(biāo)核酸在生物樣品中結(jié)合在細(xì)胞內(nèi)，所述方法進(jìn)一步包括在步驟a)和b)之前的細(xì)胞裂解。在一些實(shí)施方式中，靶標(biāo)核酸是RNA。在一些實(shí)施方式中，RNA是信使RNA。在一些實(shí)施方式中，RNA是核糖體RNA，如18S rRNA。在一些實(shí)施方式中，靶標(biāo)核酸是DNA，如基因組DNA。

在一些實(shí)施方式中，提供診斷個(gè)體中與異常靶標(biāo)核酸(如體液樣品中的循環(huán)腫瘤核酸或出生前核酸)相關(guān)的疾病的方法，包括：a)通過多個(gè)捕獲延伸劑捕獲所述靶標(biāo)核酸，其中所述捕獲延伸劑中的每個(gè)包括與靶標(biāo)核酸上的區(qū)域雜交的捕獲序列和與綴合到固體載體的捕獲探針雜交的固定序列，從而將靶標(biāo)核酸固定到固體載體；b)使靶標(biāo)核酸與多個(gè)檢測(cè)探針接觸，其中所述多個(gè)檢測(cè)探針中的每個(gè)包括與靶標(biāo)核酸上的區(qū)域雜交的序列；c)連接所述多個(gè)檢測(cè)探針以形成連接的檢測(cè)序列；d)擴(kuò)增所述連接的檢測(cè)序列；和e)檢測(cè)(如測(cè)序)擴(kuò)增的連接的檢測(cè)序列，其中所述擴(kuò)增的連接的檢測(cè)序列的檢測(cè)指示個(gè)體中疾病的陽性診斷。在一些實(shí)施方式中，所述多個(gè)檢測(cè)探針與靶標(biāo)核酸的連續(xù)區(qū)域雜交。在一些實(shí)施方式中，所述多個(gè)檢測(cè)探針與靶標(biāo)核酸的相鄰區(qū)域雜交。在一些實(shí)施方式中，所述多個(gè)檢測(cè)探針中的至少一些與靶標(biāo)核酸的非連續(xù)區(qū)域雜交。在一些實(shí)施方式中，所述多個(gè)捕獲延伸劑與靶標(biāo)核酸的連續(xù)(如相鄰)區(qū)域雜交。在一些實(shí)施方式中，所述多個(gè)捕獲延伸劑中的至少一些與靶標(biāo)核酸的非連續(xù)區(qū)域雜交。在一些實(shí)施方式中，所述檢測(cè)探針和捕獲延伸劑中的至少一些與靶標(biāo)核酸的連續(xù)(如相鄰)區(qū)域雜交。在一些實(shí)施方式中，所述捕獲延伸劑不與檢測(cè)探針雜交的區(qū)域之間的任何區(qū)域雜交。在一些實(shí)施方式中，在靶標(biāo)核酸具有超過一條鏈的情況下，捕獲延伸劑與靶標(biāo)核酸的同一條鏈雜交。在一些實(shí)施方式中，在靶標(biāo)核酸具有超過一條鏈的情況下，捕獲延伸劑中的至少一些與靶標(biāo)核酸的不同鏈雜交。在一些實(shí)施方式中，步驟a)在步驟b)之前進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，步驟a)在步驟b)之后進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，步驟a)和步驟b)同時(shí)進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，生物樣品選自細(xì)胞裂解物、組織勻漿、血液樣品、干血斑、血凝塊、血漿樣品、血清樣品、鼻拭子、咽拭子、頰拭子、尿和唾液。在一些實(shí)施方式中靶標(biāo)核酸在生物樣品中是游離的，如不在細(xì)胞內(nèi)。在一些實(shí)施方式中，靶標(biāo)核酸在生物樣品中結(jié)合在細(xì)胞內(nèi)，所述方法進(jìn)一步包括在步驟a)和b)之前的細(xì)胞裂解。在一些實(shí)施方式中，靶標(biāo)核酸是RNA。在一些實(shí)施方式中，RNA是信使RNA。在一些實(shí)施方式中，RNA是核糖體RNA，如18S rRNA。在一些實(shí)施方式中，靶標(biāo)核酸是DNA，如基因組DNA。

在一些實(shí)施方式中，提供通過檢測(cè)個(gè)體中的遺傳變異來診斷個(gè)體中疾病的方法，包括：a)通過多個(gè)捕獲延伸劑從個(gè)體的生物樣品捕獲包括遺傳變異的靶標(biāo)核酸，其中所述捕獲延伸劑中的每個(gè)包括與靶標(biāo)核酸上的區(qū)域雜交的捕獲序列和與綴合到固體載體的捕獲探針雜交的固定序列，從而將靶標(biāo)核酸固定到固體載體；b)使靶標(biāo)核酸與多個(gè)檢測(cè)探針接觸，其中所述多個(gè)檢測(cè)探針中的每個(gè)包括與靶標(biāo)核酸上的區(qū)域雜交的序列，并且其中檢測(cè)探針中的至少一個(gè)是變異特異的檢測(cè)探針，其優(yōu)先與包括全部或部分變異的靶標(biāo)核酸上的區(qū)域雜交；c)連接所述多個(gè)檢測(cè)探針以形成連接的檢測(cè)序列；d)擴(kuò)增所述連接的檢測(cè)序列；和e)檢測(cè)擴(kuò)增的連接的檢測(cè)序列，其中擴(kuò)增的連接的檢測(cè)序列的檢測(cè)指示個(gè)體中疾病的陽性診斷。在一些實(shí)施方式中，變異特異的檢測(cè)探針與包括全部或部分變異的靶標(biāo)核酸上的區(qū)域而不與不包括全部或部分變異的相應(yīng)區(qū)域雜交。在一些實(shí)施方式中，變異特異的檢測(cè)探針與包括全部或部分變異的靶標(biāo)核酸上的區(qū)域雜交比與不包括全部或部分變異的相應(yīng)區(qū)域雜交強(qiáng)至少約10x、20x、30x、40x、50x、100x、150x、200x、300x、400x、500x、或更多倍。在一些實(shí)施方式中，變異是突變或單核苷酸多態(tài)性(SNP)等。在一些實(shí)施方式中，與包括全部或部分變異的靶標(biāo)核酸上的區(qū)域雜交的變異特異的檢測(cè)探針和與不包括全部或部分變異的靶標(biāo)核酸上的區(qū)域雜交的相應(yīng)的野生型特異的探針均存在，以便野生型特異的檢測(cè)探針將抑制變異特異的檢測(cè)探針與不包括全部或部分變異的區(qū)域雜交。野生型特異的檢測(cè)探針在其5’端未磷酸化，而變異特異的探針在其5’端磷酸化，以便在隨后的連接反應(yīng)中與靶標(biāo)核酸雜交的野生型特異的檢測(cè)探針不能與相鄰檢測(cè)探針連接，阻止連接的檢測(cè)序列的形成和隨后來自不包括變異的靶標(biāo)核酸的所述連接的檢測(cè)序列的擴(kuò)增。在一些實(shí)施方式中，所述多個(gè)檢測(cè)探針與靶標(biāo)核酸的連續(xù)區(qū)域雜交。在一些實(shí)施方式中，所述多個(gè)檢測(cè)探針與靶標(biāo)核酸的相鄰區(qū)域雜交。在一些實(shí)施方式中，所述多個(gè)檢測(cè)探針中的至少一些與靶標(biāo)核酸的非連續(xù)區(qū)域雜交。在一些實(shí)施方式中，所述多個(gè)捕獲延伸劑與靶標(biāo)核酸的連續(xù)(如相鄰)區(qū)域雜交。在一些實(shí)施方式中，所述多個(gè)捕獲延伸劑中的至少一些與靶標(biāo)核酸的非連續(xù)區(qū)域雜交。在一些實(shí)施方式中，所述檢測(cè)探針和捕獲延伸劑中的至少一些與靶標(biāo)核酸的連續(xù)(如相鄰)區(qū)域雜交。在一些實(shí)施方式中，所述捕獲延伸劑不與檢測(cè)探針雜交的區(qū)域之間的任何區(qū)域雜交。在一些實(shí)施方式中，在靶標(biāo)核酸具有超過一條鏈的情況下，捕獲延伸劑與靶標(biāo)核酸的同一條鏈雜交。在一些實(shí)施方式中，在靶標(biāo)核酸具有超過一條鏈的情況下，捕獲延伸劑中的至少一些與靶標(biāo)核酸的不同鏈雜交。在一些實(shí)施方式中，步驟a)在步驟b)之前進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，步驟a)在步驟b)之后進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，步驟a)和步驟b)同時(shí)進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，生物樣品選自細(xì)胞裂解物、組織勻漿、血液樣品、干血斑、血凝塊、血漿樣品、血清樣品、鼻拭子、咽拭子、頰拭子、尿和唾液。在一些實(shí)施方式中靶標(biāo)核酸在生物樣品中是游離的，如不在細(xì)胞內(nèi)。在一些實(shí)施方式中，靶標(biāo)核酸在生物樣品中結(jié)合在細(xì)胞內(nèi)，所述方法進(jìn)一步包括在步驟a)和b)之前的細(xì)胞裂解。在一些實(shí)施方式中，靶標(biāo)核酸是RNA。在一些實(shí)施方式中，RNA是信使RNA。在一些實(shí)施方式中，RNA是核糖體RNA，如18S rRNA。在一些實(shí)施方式中，靶標(biāo)核酸是DNA，如基因組DNA。

在一些實(shí)施方式中，提供通過檢測(cè)個(gè)體中的遺傳變異來診斷個(gè)體中疾病的方法，包括：a)通過多個(gè)捕獲延伸劑從個(gè)體的生物樣品捕獲包括遺傳變異的靶標(biāo)核酸，其中所述捕獲延伸劑中的每個(gè)包括與靶標(biāo)核酸上的區(qū)域雜交的捕獲序列和與綴合到固體載體的捕獲探針雜交的固定序列，從而將靶標(biāo)核酸固定到固體載體；b)使靶標(biāo)核酸與多個(gè)檢測(cè)探針接觸，其中所述多個(gè)檢測(cè)探針中的每個(gè)包括與靶標(biāo)核酸上的區(qū)域雜交的序列，其中靶標(biāo)核酸包括兩個(gè)檢測(cè)靶向序列之間的缺口區(qū)域，其與檢測(cè)探針中任何一個(gè)是不可雜交的，并且其中缺口區(qū)域包括變異；c)填補(bǔ)由包括變異的缺口區(qū)域分隔的兩個(gè)檢測(cè)探針之間的缺口；d)連接所述多個(gè)檢測(cè)探針以形成包括變異的連接的檢測(cè)序列；e)擴(kuò)增所述連接的檢測(cè)序列；和f)檢測(cè)擴(kuò)增的連接的檢測(cè)序列中的變異，其中擴(kuò)增的連接的檢測(cè)序列中變異的存在指示個(gè)體中疾病的陽性診斷。在一些實(shí)施方式中，變異是突變或SNP等。在一些實(shí)施方式中，檢測(cè)通過測(cè)序擴(kuò)增的連接的檢測(cè)序列來進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，檢測(cè)通過進(jìn)行單堿基延伸來進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，檢測(cè)通過MALDI-TOF來進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，缺口填補(bǔ)通過DNA聚合酶或反轉(zhuǎn)錄酶來進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，所述多個(gè)檢測(cè)探針與靶標(biāo)核酸的連續(xù)區(qū)域雜交。在一些實(shí)施方式中，所述多個(gè)檢測(cè)探針中的至少一些與靶標(biāo)核酸的非連續(xù)區(qū)域雜交。在一些實(shí)施方式中，所述多個(gè)捕獲延伸劑與靶標(biāo)核酸的連續(xù)(如相鄰)區(qū)域雜交。在一些實(shí)施方式中，所述多個(gè)捕獲延伸劑中的至少一些與靶標(biāo)核酸的非連續(xù)區(qū)域雜交。在一些實(shí)施方式中，所述檢測(cè)探針和捕獲延伸劑中的至少一些與靶標(biāo)核酸的連續(xù)(如相鄰)區(qū)域雜交。在一些實(shí)施方式中，捕獲延伸劑不與檢測(cè)探針雜交的區(qū)域之間的任何區(qū)域雜交。在一些實(shí)施方式中，在靶標(biāo)核酸具有超過一條鏈的情況下，捕獲延伸劑與靶標(biāo)核酸的同一條鏈雜交。在一些實(shí)施方式中，在靶標(biāo)核酸具有超過一條鏈的情況下，捕獲延伸劑中的至少一些與靶標(biāo)核酸的不同鏈雜交。在一些實(shí)施方式中，缺口填補(bǔ)通過引物延伸來進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，步驟a)在步驟b)之前進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，步驟a)在步驟b)之后進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，步驟a)和步驟b)同時(shí)進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，生物樣品選自細(xì)胞裂解物、組織勻漿、血液樣品、血漿樣品、血清樣品、干血斑、血凝塊、鼻拭子、咽拭子、頰拭子、尿和唾液。在一些實(shí)施方式中靶標(biāo)核酸在生物樣品中是游離的，如不在細(xì)胞內(nèi)。在一些實(shí)施方式中，靶標(biāo)核酸在生物樣品中結(jié)合在細(xì)胞內(nèi)，所述方法進(jìn)一步包括在步驟a)和b)之前的細(xì)胞裂解。在一些實(shí)施方式中，靶標(biāo)核酸是RNA。在一些實(shí)施方式中，RNA是信使RNA。在一些實(shí)施方式中，RNA是核糖體RNA，如18S rRNA。在一些實(shí)施方式中，靶標(biāo)核酸是DNA，如基因組DNA。

在一些實(shí)施方式中，靶標(biāo)核酸在生物樣品的細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞裂解可使用本領(lǐng)域已知的任何方法來進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，裂解通過向反應(yīng)容器中的生物樣品添加足夠體積的裂解溶液來進(jìn)行。裂解溶液可以是本領(lǐng)域已知的用于裂解細(xì)胞的任何溶液，包括，例如，包括以下的溶液：a)調(diào)節(jié)裂解物的酸度和滲透性的鹽；和b)破碎膜結(jié)構(gòu)的洗滌劑，如Triton X-100和SDS。在一些實(shí)施方式中，裂解溶液是這樣的溶液，其包括約10至約20mM Tris-HCl(如約15mM Tris-HCl)、約130至約170mM NaCl(如約150mM NaCl)、約0.5至約2mM EDTA(如約1mM EDTA)、和約0.5至約2％Triton X-100(如約1％Triton X-100)。在一些實(shí)施方式中，裂解溶液進(jìn)一步包括約0.5至約2mM EGTA(如約1mM EGTA)。在一些實(shí)施方式中，裂解溶液進(jìn)一步包括約0.5至約3mg/ml蛋白酶K(如約1.5mg/ml蛋白酶K)。在一些實(shí)施方式中，裂解溶液進(jìn)一步包括探針混合物，所述探針混合物包括檢測(cè)探針和捕獲延伸劑。在一些實(shí)施方式中裂解反應(yīng)在反應(yīng)容器中進(jìn)行，包括但不限于，離心管(如微量離心管)或多孔板。在一些實(shí)施方式中，裂解反應(yīng)在約37至約65℃(如約50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60℃中的任何一個(gè))的溫度溫育。在一些實(shí)施方式中，裂解反應(yīng)溫育約10至約60分鐘(如約20、25、30、35或40分鐘中的任何一個(gè))。在一些實(shí)施方式中，裂解反應(yīng)伴隨劇烈的震動(dòng)進(jìn)行。

固定捕獲探針的固體載體可以是微?；蚬腆w表面，例如許多種容器，例如，離心管、柱、多孔板孔、過濾器、管道等任一個(gè)的器壁表面。固體表面還可以是紙，例如，硝酸纖維素紙的表面，或膜，例如，尼龍膜的表面。在一些實(shí)施方式中，多孔板孔是優(yōu)選的固體表面。在一些實(shí)施方式中，當(dāng)使用顆粒時(shí)，它們將具有約0.4至約200微米，更通常約0.8至約10微米范圍的尺寸。顆?？砂ㄈ魏畏奖愕牟牧?，如氧化鐵、多種聚合物或玻璃。在一些實(shí)施方式中，顆粒是選自磁珠、Luminex微球體和Illumina珠的珠。捕獲探針可通過本領(lǐng)域已知的任何方法通過官能團(tuán)穩(wěn)定地附接于固體載體。在一些實(shí)施方式中，當(dāng)使用珠用于多重靶標(biāo)擴(kuò)增時(shí)，珠被設(shè)計(jì)以捕獲不同靶標(biāo)核酸，且每個(gè)珠與僅僅一個(gè)具有不同序列的捕獲探針變體結(jié)合，并且用于不同靶標(biāo)核酸的捕獲延伸劑含有不同固定序列，其與不同捕獲探針變體中的僅僅一個(gè)中存在的序列互補(bǔ)，以便一個(gè)靶標(biāo)核酸將不會(huì)同時(shí)固定到兩個(gè)或多個(gè)與不同捕獲探針結(jié)合的珠上，兩個(gè)或多個(gè)不同靶標(biāo)核酸也不會(huì)固定到單個(gè)珠上，因此防止這些情況中任一個(gè)引起的固定效率的減低。相似地，多孔板可用于通過不同捕獲探針來捕獲不同靶標(biāo)核酸。

在一些實(shí)施方式中，雜交在水性介質(zhì)，特別地緩沖的水性介質(zhì)中進(jìn)行，其可包括多種添加物。在一些實(shí)施方式中，可被使用的添加物包括低濃度的洗滌劑(約0.1至約1％)、鹽，例如，檸檬酸鈉(約0.017至約0.170M)、聚蔗糖、聚乙烯吡咯烷、載體核酸、載體蛋白等。在一些實(shí)施方式中，非水性溶劑可添加到水性介質(zhì)中，如二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、醇、和甲酰胺。在一些實(shí)施方式中，這些其它溶劑將以約2至約50％范圍的量存在。在一些實(shí)施方式中，雜交在約45至約65℃(如約50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60℃中的任何一個(gè))進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，雜交進(jìn)行約4至約24小時(shí)(如約10、12、14、16、18、或20小時(shí)中的任何一個(gè))。雜交的嚴(yán)格性可通過控制溫度、鹽濃度、溶劑系統(tǒng)、溫育時(shí)間等來控制以實(shí)現(xiàn)期望的選擇性和/或靈敏度。因此在一些實(shí)施方式中，取決于感興趣的序列的長(zhǎng)度和性質(zhì)，嚴(yán)格性將變化。通常，當(dāng)需要變異特異的檢測(cè)探針檢測(cè)靶標(biāo)核酸中的變異時(shí)，雜交條件的嚴(yán)格性使得靶標(biāo)核酸的區(qū)域和經(jīng)設(shè)計(jì)與靶標(biāo)核酸的區(qū)域互補(bǔ)的檢測(cè)探針的序列之間的單個(gè)錯(cuò)配將阻止雜交。可選地，可使用不太嚴(yán)格的雜交反應(yīng)條件，例如當(dāng)通用、簡(jiǎn)并檢測(cè)探針用于與靶標(biāo)核酸的多個(gè)區(qū)域雜交時(shí)。

在一些實(shí)施方式中，雜交在雜交容器中進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，在存在裂解步驟的情況下，雜交容器可以是用于裂解的同一反應(yīng)容器。在一些實(shí)施方式中，在存在裂解步驟的情況下，雜交容器不是用于裂解的反應(yīng)容器，并且將裂解物從用于裂解的反應(yīng)容器轉(zhuǎn)移至雜交容器。在一些實(shí)施方式中，雜交容器是多孔板(包括但不限于96孔板)。在一些實(shí)施方式中，雜交容器，如多孔板的孔的表面，與可與捕獲延伸劑雜交的捕獲探針預(yù)綴合。在一些實(shí)施方式中，雜交容器是離心管(如微量離心管)。在一些實(shí)施方式中，雜交容器沒有與捕獲探針預(yù)綴合，并且微粒固體載體，如珠或微球體，與可與捕獲延伸劑雜交的捕獲探針預(yù)綴合和添加至雜交容器。

在一些實(shí)施方式中，雜交步驟的未結(jié)合的組分——包括未結(jié)合的探針和核酸——與結(jié)合到固體載體的雜交的復(fù)合物分離。在一些實(shí)施方式中，雜交步驟的未結(jié)合的組分通過洗滌結(jié)合的雜交的復(fù)合物而分離。在一些實(shí)施方式中，洗滌結(jié)合的雜交的復(fù)合物包括約1至約5個(gè)用適當(dāng)洗滌溶液的洗滌步驟中的任何一個(gè)，其中每個(gè)洗滌步驟之后上清液可被分離或丟棄。洗滌步驟的條件可通過本領(lǐng)域已知的任何方法來改變以控制針對(duì)結(jié)合的雜交的復(fù)合物的選擇性和/或靈敏度的水平，所述方法可包括改變洗滌溶液的嚴(yán)格性、改變與洗滌溶液的溫育時(shí)間、改變洗滌步驟進(jìn)行的溫度、和/或改變?cè)谙礈觳襟E期間施加的攪拌等。洗滌步驟的洗滌溶液可以是本領(lǐng)域已知的用于雜交后洗滌以去除未結(jié)合的組分的任何溶液。在一些實(shí)施方式中，洗滌溶液包括約0.1至約2X SSC中任何一個(gè)(約如0.1、0.2、0.5、1、或2X SSC中任何一個(gè))。在一些實(shí)施方式中，在每個(gè)連續(xù)的洗滌步驟，洗滌溶液的嚴(yán)格性保持一樣，例如，第一、第二和第三洗滌步驟用包括約0.1X SSC的洗滌溶液進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，在每個(gè)連續(xù)的洗滌步驟，洗滌溶液的嚴(yán)格性增加，例如，第一洗滌溶液包括約2X SSC，第二洗滌溶液包括約1X SSC和第三洗滌溶液包括約0.1X SSC。洗滌溶液的嚴(yán)格性可使用本領(lǐng)域已知的任何方法，如例如改變洗滌溶液的鹽濃度來控制。

用于本發(fā)明的洗滌步驟中的程序?qū)⒁蕾嚬腆w載體的性質(zhì)而變化。在一些實(shí)施方式中，在固體載體是表面，如多孔板孔的表面的情況下，如上所述，上清液可被分離或丟棄和表面被洗滌。在一些實(shí)施方式中，在固體載體是顆粒的情況下，如上所述，顆粒可被洗滌，其中離心、過濾或在外部磁場(chǎng)的影響下分配到容器側(cè)面將提供顆粒與上清液的分離，允許上清液的分離或丟棄。

在一些實(shí)施方式中，在包括靶標(biāo)核酸和雜交的檢測(cè)探針的復(fù)合物捕獲在固體載體上和未結(jié)合的反應(yīng)組分分離之后，雜交的檢測(cè)探針的相鄰5’和3'端使用連接劑連接在一起以形成包括雜交的檢測(cè)探針的單個(gè)核酸分子，本文稱作連接的檢測(cè)序列。在一些實(shí)施方式中，連接劑可以是酶，例如，DNA或RNA連接酶，或化學(xué)接合劑，例如，溴化氰或碳二亞胺(Sokolova et al.,FEBS Lett.232:153-155,1988)。優(yōu)選的DNA連接酶包括T4DNA連接酶。連接的檢測(cè)序列的存在指示樣品中靶標(biāo)核酸的存在。在一些實(shí)施方式中，連接的檢測(cè)序列充當(dāng)多種擴(kuò)增系統(tǒng)，如PCR、LAMP或SDA中任何一種的模板。處理之后保持未連接的檢測(cè)探針中的任何一個(gè)在方法中的隨后步驟中不會(huì)被擴(kuò)增。

在一些實(shí)施方式中，5’檢測(cè)探針和任何內(nèi)部檢測(cè)探針提供有磷酸化的5’端，并且連接可進(jìn)行而沒有額外的步驟。在一些實(shí)施方式中，檢測(cè)探針未磷酸化，并且連接步驟進(jìn)一步包括用能磷酸化檢測(cè)探針5’端的酶處理。檢測(cè)探針的磷酸化可使用本領(lǐng)域已知的任何方法來進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，磷酸化酶是激酶，如T4聚核苷酸激酶。在一些實(shí)施方式中，磷酸化反應(yīng)在連接之前但是雜交之后進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，磷酸化步驟在與連接相同的時(shí)間進(jìn)行。

在一些實(shí)施方式中，沒有酶用于檢測(cè)探針的連接，連接自動(dòng)地進(jìn)行。3’檢測(cè)探針和任何內(nèi)部檢測(cè)探針的3’端以及5’檢測(cè)探針和任何內(nèi)部檢測(cè)探針的5’端可分別含有適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)修飾，如化學(xué)攻擊基團(tuán)和離去基團(tuán)，以便連接步驟通過在相鄰的檢測(cè)探針之間形成共價(jià)鍵化學(xué)地進(jìn)行，而不使用酶。(Y.Xu,N.B.Karalkar,E.T.Kool."Nonenzymatic Autoligation in Direct Three-Color Detection of RNA and DNA Point Mutations"Nat.Biotech.2001,19,148-152.)

在一些實(shí)施方式中，在雜交的檢測(cè)探針包括與靶標(biāo)核酸的非相鄰區(qū)域互補(bǔ)的序列的情況下，連接步驟進(jìn)一步包括用能填補(bǔ)非相鄰的檢測(cè)探針之間缺口的酶處理。缺口填補(bǔ)反應(yīng)可使用本領(lǐng)域已知的任何方法進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，缺口填補(bǔ)酶是DNA聚合酶或反轉(zhuǎn)錄酶，分別取決于靶標(biāo)核酸是DNA或RNA。在一些實(shí)施方式中，缺口在連接之前填補(bǔ)。在一些實(shí)施方式中，缺口在與連接相同的時(shí)間填補(bǔ)。

連接的檢測(cè)序列可通過本領(lǐng)域已知的任何方法來檢測(cè)，包括實(shí)時(shí)PCR或其等同物、凝膠電泳、基于質(zhì)譜的檢測(cè)或測(cè)序等。在一些實(shí)施方式中，連接的檢測(cè)序列通過本領(lǐng)域已知的任何方法來擴(kuò)增。在一些實(shí)施方式中，連接的檢測(cè)序列通過PCR擴(kuò)增以產(chǎn)生PCR產(chǎn)物。在一些實(shí)施方式中，PCR產(chǎn)物通過本領(lǐng)域已知的任何方法來檢測(cè)。在一些實(shí)施方式中，連接的檢測(cè)序列使用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)來擴(kuò)增和檢測(cè)。在一些實(shí)施方式中，連接的檢測(cè)序列(有或沒有擴(kuò)增)通過測(cè)序來檢測(cè)。

在一些實(shí)施方式中，在基于PCR的技術(shù)用于擴(kuò)增的情況下，提供PCR引物，即，與5’檢測(cè)探針上的區(qū)域互補(bǔ)的第一引物，該區(qū)域本文稱作5’引物結(jié)合部位，和對(duì)應(yīng)于3’檢測(cè)探針上的區(qū)域的第二引物，該區(qū)域本文稱作3’引物結(jié)合部位。在一些實(shí)施方式中，5’和3’檢測(cè)探針上的引物結(jié)合部位是與靶標(biāo)核酸可雜交的序列的部分?？蛇x地，在一些實(shí)施方式中至少一個(gè)5’檢測(cè)探針的3’端含有共用的3’尾序列，以及至少一個(gè)3’檢測(cè)探針的5’端含有共用的5’尾序列，這些共用的尾序列用于設(shè)計(jì)通用PCR引物。當(dāng)多個(gè)靶標(biāo)核酸被檢測(cè)時(shí)，通用PCR引物特別有用。例如，兩組探針(每組包括：a)檢測(cè)探針，包括共用的3’和5’尾——分別包括共用的5’和3’引物結(jié)合部位；和b)捕獲延伸劑；其中第一組的檢測(cè)探針和捕獲延伸劑對(duì)HIV-1特異，而第二組的檢測(cè)探針和捕獲延伸劑對(duì)HCV特異)可在本發(fā)明的方法中的任何一個(gè)中一起使用，只有一對(duì)共用的PCR引物用于擴(kuò)增對(duì)HIV-1或HCV特異的連接的檢測(cè)序列中的每個(gè)。

因此，在一些實(shí)施方式中，提供檢測(cè)樣品中多個(gè)靶標(biāo)核酸的方法，包括：a)通過多個(gè)捕獲延伸劑捕獲所述多個(gè)靶標(biāo)核酸中的一個(gè)，其中捕獲延伸劑中的每個(gè)包括與靶標(biāo)核酸上的區(qū)域雜交的捕獲序列和與綴合到固體載體的捕獲探針雜交的固定序列，從而將靶標(biāo)核酸固定到固體載體；b)使所述多個(gè)靶標(biāo)核酸中的一個(gè)與包括第一引物結(jié)合部位和第二引物結(jié)合部位的多個(gè)檢測(cè)探針接觸，其中所述多個(gè)檢測(cè)探針中的每個(gè)包括與靶標(biāo)核酸上的區(qū)域雜交的序列；c)對(duì)所述多個(gè)靶標(biāo)核酸中的每個(gè)進(jìn)行步驟a)和b)；d)連接所述多個(gè)檢測(cè)探針以形成對(duì)所述多個(gè)靶標(biāo)核酸中的每個(gè)特異的多個(gè)連接的檢測(cè)序列；e)擴(kuò)增所述多個(gè)連接的檢測(cè)序列；和f)檢測(cè)多個(gè)擴(kuò)增的連接的檢測(cè)序列。在一些實(shí)施方式中，對(duì)所述多個(gè)靶標(biāo)核酸中的每個(gè)特異的多個(gè)檢測(cè)探針中的每個(gè)包括相同的第一引物結(jié)合部位和相同的第二引物結(jié)合部位，以及擴(kuò)增步驟使用具有對(duì)應(yīng)于第一和第二引物結(jié)合部位的引物對(duì)的PCR來進(jìn)行。該方法和用于檢測(cè)多個(gè)靶標(biāo)核酸的該方法的變型，稱作多重LE-PCR。在一些實(shí)施方式中，對(duì)于靶標(biāo)核酸中的每個(gè)，對(duì)應(yīng)于靶標(biāo)核酸的所述多個(gè)檢測(cè)探針與靶標(biāo)核酸的連續(xù)區(qū)域雜交。在一些實(shí)施方式中，對(duì)于靶標(biāo)核酸中的每個(gè)，對(duì)應(yīng)于靶標(biāo)核酸的所述多個(gè)檢測(cè)探針與靶標(biāo)核酸的相鄰區(qū)域雜交。在一些實(shí)施方式中，對(duì)于靶標(biāo)核酸中的每個(gè)，對(duì)應(yīng)于靶標(biāo)核酸的所述多個(gè)檢測(cè)探針中的至少一些與靶標(biāo)核酸的非連續(xù)區(qū)域雜交。在一些實(shí)施方式中，對(duì)于靶標(biāo)核酸中的每個(gè)，對(duì)應(yīng)于靶標(biāo)核酸的所述多個(gè)捕獲延伸劑與靶標(biāo)核酸的連續(xù)(如相鄰)區(qū)域雜交。在一些實(shí)施方式中，對(duì)于靶標(biāo)核酸中的每個(gè)，對(duì)應(yīng)于靶標(biāo)核酸的所述多個(gè)捕獲延伸劑中的至少一些與靶標(biāo)核酸的非連續(xù)區(qū)域雜交。在一些實(shí)施方式中，對(duì)于靶標(biāo)核酸中的每個(gè)，對(duì)應(yīng)于靶標(biāo)核酸的檢測(cè)探針和捕獲延伸劑中的至少一些與靶標(biāo)核酸的連續(xù)(如相鄰)區(qū)域雜交。在一些實(shí)施方式中，對(duì)于靶標(biāo)核酸中的每個(gè)，對(duì)應(yīng)于靶標(biāo)核酸的捕獲延伸劑不與對(duì)應(yīng)于靶標(biāo)核酸的檢測(cè)探針雜交的區(qū)域之間的任何區(qū)域雜交。在一些實(shí)施方式中，步驟a)在步驟b)之前進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，步驟a)在步驟b)之后進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，步驟a)和步驟b)同時(shí)進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，樣品是生物樣品。在一些實(shí)施方式中，生物樣品選自細(xì)胞裂解物、組織勻漿、血液樣品、干血斑、血凝塊、血漿樣品、血清樣品、鼻拭子、咽拭子、頰拭子、尿和唾液。在一些實(shí)施方式中靶標(biāo)核酸在生物樣品中是游離的，如不在細(xì)胞內(nèi)。在一些實(shí)施方式中，靶標(biāo)核酸在生物樣品中結(jié)合在細(xì)胞內(nèi)，所述方法進(jìn)一步包括在步驟a)和b)之前的細(xì)胞裂解。在一些實(shí)施方式中，靶標(biāo)核酸是RNA。在一些實(shí)施方式中，RNA是信使RNA。在一些實(shí)施方式中，RNA是核糖體RNA，如18S rRNA。在一些實(shí)施方式中，靶標(biāo)核酸是DNA，如基因組DNA。

在如上所述的多重LE-PCR的一些實(shí)施方式中，捕獲延伸劑中的每個(gè)包括相同的共用固定序列，以及捕獲探針中的每個(gè)包括與共用固定序列雜交的相同的共用區(qū)域，允許對(duì)靶標(biāo)核酸中任何一個(gè)特異的連接的檢測(cè)序列的擴(kuò)增和檢測(cè)。在多重LE-PCR的一些實(shí)施方式中，對(duì)于靶標(biāo)核酸中的每個(gè)，對(duì)靶標(biāo)核酸特異的所述多個(gè)捕獲延伸劑中的每個(gè)包括相同的固定序列，其不同于對(duì)不同靶標(biāo)核酸特異的其它捕獲延伸劑中的任何一個(gè)的固定序列，以及對(duì)于每個(gè)固定序列提供包括與固定序列雜交的區(qū)域的捕獲探針，其中不同的捕獲探針中的每個(gè)只附接至特異的固體載體，該特異的固體載體可與其它捕獲探針附接的固體載體分離。例如，在多重LE-PCR的一些實(shí)施方式中，對(duì)靶標(biāo)核酸A特異的多個(gè)捕獲延伸劑每個(gè)包括固定序列A，對(duì)靶標(biāo)核酸B特異的多個(gè)捕獲延伸劑每個(gè)包括固定序列B，捕獲探針A可與固定序列A雜交并且只附接至A型珠，捕獲探針B可與固定序列B雜交并且只附接至B型珠，以及A型珠可通過本領(lǐng)域已知的任何方法如通過流式細(xì)胞術(shù)等與B型珠分離，以便對(duì)靶標(biāo)核酸A特異的連接的檢測(cè)序列的擴(kuò)增和檢測(cè)可與對(duì)靶標(biāo)核酸B特異的連接的檢測(cè)序列的擴(kuò)增和檢測(cè)單獨(dú)進(jìn)行，因此允許單獨(dú)檢測(cè)來自單個(gè)樣品的靶標(biāo)核酸中的每個(gè)，同時(shí)仍然需要只使用一個(gè)共用的PCR引物對(duì)。

在靶標(biāo)核酸PCR擴(kuò)增的現(xiàn)有方法中，在單個(gè)反應(yīng)容器中用多個(gè)引物對(duì)檢測(cè)多個(gè)靶標(biāo)的嘗試已受限于變化的引物效率和引物對(duì)之間的競(jìng)爭(zhēng)。相比之下，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，提供檢測(cè)探針以便產(chǎn)生多個(gè)連接的檢測(cè)序列，每個(gè)對(duì)應(yīng)于不同的靶標(biāo)核酸，其中每個(gè)連接的檢測(cè)序列包括相同的共用3’和5’引物結(jié)合部位。在多重LE-PCR的一些實(shí)施方式中，對(duì)于所述多個(gè)靶標(biāo)核酸中的每個(gè)，對(duì)應(yīng)于靶標(biāo)核酸的所述多個(gè)檢測(cè)探針包括相同的共用5’和3’引物結(jié)合部位。因此可使用多組檢測(cè)探針和捕獲延伸劑，每組對(duì)多個(gè)靶標(biāo)核酸中的一個(gè)特異，但是只需要一對(duì)共用PCR引物來擴(kuò)增對(duì)應(yīng)于所述多個(gè)靶標(biāo)核酸中每個(gè)的連接的檢測(cè)探針。通過改變檢測(cè)探針的靶標(biāo)特異區(qū)域的長(zhǎng)度，對(duì)應(yīng)于特定靶標(biāo)的擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物可通過大小來鑒定。對(duì)不同靶標(biāo)核酸特異的Taqman探針也可用于RT-qPCR以檢測(cè)多重LE-PCR測(cè)定中相應(yīng)靶標(biāo)核酸的存在。

在一些實(shí)施方式中提供測(cè)序多個(gè)靶標(biāo)核酸的方法，包括：a)如上所述進(jìn)行多重LE-PCR捕獲，其中對(duì)于每個(gè)靶標(biāo)核酸，對(duì)應(yīng)于靶標(biāo)核酸的所述多個(gè)檢測(cè)探針的檢測(cè)靶向序列包括缺口；b)用聚合酶填補(bǔ)與靶標(biāo)核酸結(jié)合的檢測(cè)探針之間的任何缺口；c)連接結(jié)合的檢測(cè)探針以形成連接的檢測(cè)序列；d)用一對(duì)共用PCR引物擴(kuò)增連接的檢測(cè)序列，其中引物具有與下一代測(cè)序(NGS)程序相容的額外的5’指標(biāo)序列，導(dǎo)致對(duì)應(yīng)于所述多個(gè)靶標(biāo)核酸中每個(gè)的擴(kuò)增的連接的檢測(cè)序列的混合物；和e)將混合物進(jìn)行測(cè)序(例如Illumina NGS程序)。在一些實(shí)施方式中，混合物中每個(gè)靶標(biāo)的量通過測(cè)量靶標(biāo)序列的“數(shù)字計(jì)數(shù)”來測(cè)定。在一些實(shí)施方式中，任何序列變體通過比較序列讀數(shù)與參考序列來鑒定。在一些實(shí)施方式中，MALDI-TOF檢測(cè)用于檢測(cè)已知序列變體的存在，例如通過使用ddNTP和只是結(jié)合變異部位上游的引物使混合物進(jìn)行一輪單堿基延伸反應(yīng)和使用MALDI-TOF質(zhì)譜儀檢測(cè)延伸產(chǎn)物。

在一些實(shí)施方式中，多組檢測(cè)探針和捕獲延伸劑可靶向例如特定病原體，例如丙型肝炎病毒(HCV)的所有菌種，并且探針可被剪裁以檢測(cè)和進(jìn)一步鑒定病原體(例如HCV)的各個(gè)HCV基因型。

在一些實(shí)施方式中，多組檢測(cè)探針和捕獲延伸劑可靶向例如特定基因的所有外顯子，其的突變可對(duì)疾病例如癌癥的診斷、治療和預(yù)后具有重要性。在一些實(shí)施方式中，多組檢測(cè)探針和捕獲延伸劑可靶向候選基因組的所有已知的序列變體，其的序列變異可對(duì)疾病例如癌癥的診斷、治療和預(yù)后具有重要性。

在一些實(shí)施方式中，提供檢測(cè)探針以便連接的檢測(cè)序列形成環(huán)化核酸分子，其中檢測(cè)探針具有與靶標(biāo)核酸的連續(xù)區(qū)域互補(bǔ)的5’和3’端，并且該檢測(cè)探針在本文稱作環(huán)化檢測(cè)探針。在一些實(shí)施方式中，當(dāng)與環(huán)化檢測(cè)探針一起使用基于PCR的技術(shù)擴(kuò)增時(shí)，提供兩個(gè)引物，第一引物與環(huán)化檢測(cè)探針的第一引物結(jié)合部位互補(bǔ)，第二引物具有位于環(huán)化檢測(cè)探針的第一引物結(jié)合部位和3’端之間的第二引物結(jié)合部位的序列。在一些實(shí)施方式中，如上所述包括第一引物和第二引物的引物對(duì)被設(shè)計(jì)為共用的，其中引物對(duì)應(yīng)于環(huán)化檢測(cè)探針和靶標(biāo)核酸之間的互補(bǔ)區(qū)域外的環(huán)化檢測(cè)探針的共用區(qū)域，以便引物對(duì)可用于擴(kuò)增本發(fā)明的所有連接的檢測(cè)序列，其由包括對(duì)應(yīng)于共用引物對(duì)的共用引物結(jié)合部位的環(huán)化檢測(cè)探針的連接引起，而不論靶標(biāo)核酸的序列。在一些實(shí)施方式中，環(huán)化的連接的檢測(cè)序列使用滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)來擴(kuò)增，其中RCA擴(kuò)增的產(chǎn)物將保持附接至與固體載體結(jié)合的靶標(biāo)核酸-捕獲延伸劑-捕獲探針復(fù)合物，允許RCA擴(kuò)增的產(chǎn)物被單獨(dú)檢測(cè)。

在本文描述的方法中任何一個(gè)的一些實(shí)施方式中，所述多個(gè)檢測(cè)探針由單個(gè)檢測(cè)探針替換，省略了連接步驟，檢測(cè)探針通過本領(lǐng)域已知的任何方法，如PCR、LAMP和RCA來擴(kuò)增和檢測(cè)。因此，例如，在一些實(shí)施方式中提供檢測(cè)樣品中靶標(biāo)核酸的方法，包括：a)通過多個(gè)捕獲延伸劑捕獲靶標(biāo)核酸，其中捕獲延伸劑中的每個(gè)包括與靶標(biāo)核酸上的區(qū)域雜交的捕獲序列和與綴合到固體載體的捕獲探針雜交的固定序列，從而將靶標(biāo)核酸固定到固體載體；b)使靶標(biāo)核酸與包括與靶標(biāo)核酸上的區(qū)域雜交的序列的檢測(cè)探針接觸；c)擴(kuò)增所述檢測(cè)探針；和d)檢測(cè)(如測(cè)序)擴(kuò)增的檢測(cè)探針。在一些實(shí)施方式中，所述多個(gè)捕獲延伸劑與靶標(biāo)核酸的連續(xù)(如相鄰)區(qū)域雜交。在一些實(shí)施方式中，所述多個(gè)捕獲延伸劑中的至少一些與靶標(biāo)核酸的非連續(xù)區(qū)域雜交。在一些實(shí)施方式中，檢測(cè)探針和至少一個(gè)捕獲延伸劑與靶標(biāo)核酸的連續(xù)(如相鄰)區(qū)域雜交。在一些實(shí)施方式中，在靶標(biāo)核酸具有超過一條鏈的情況下，捕獲延伸劑與靶標(biāo)核酸的同一條鏈雜交。在一些實(shí)施方式中，在靶標(biāo)核酸具有超過一條鏈的情況下，捕獲延伸劑中的至少一些與靶標(biāo)核酸的不同鏈雜交。在一些實(shí)施方式中，步驟a)在步驟b)之前進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，步驟a)在步驟b)之后進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，步驟a)和步驟b)同時(shí)進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，樣品是生物樣品。在一些實(shí)施方式中，生物樣品選自細(xì)胞裂解物、組織勻漿、血液樣品、血漿樣品、血清樣品、干血斑、血凝塊、鼻拭子、咽拭子、頰拭子、尿和唾液。在一些實(shí)施方式中靶標(biāo)核酸在生物樣品中是游離的，如不在細(xì)胞內(nèi)。在一些實(shí)施方式中，靶標(biāo)核酸在生物樣品中結(jié)合在細(xì)胞內(nèi)，所述方法進(jìn)一步包括在步驟a)和b)之前的細(xì)胞裂解。在一些實(shí)施方式中，靶標(biāo)核酸是RNA。在一些實(shí)施方式中，RNA是信使RNA。在一些實(shí)施方式中，RNA是核糖體RNA，如18S rRNA。在一些實(shí)施方式中，靶標(biāo)核酸是DNA，如基因組DNA。

PCR產(chǎn)物還可通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)來鑒定。PCR產(chǎn)物可在擴(kuò)增期間用抗原，例如地高辛配基標(biāo)記。標(biāo)記的PCR產(chǎn)物然后在其上具有與檢測(cè)探針的靶標(biāo)特異區(qū)域雜交的核酸探針的多孔板上被捕獲，該靶標(biāo)特異區(qū)域存在于擴(kuò)增的產(chǎn)物中。標(biāo)記的捕獲的產(chǎn)物然后可通過向多孔板的每個(gè)孔加入針對(duì)抗原標(biāo)記的酶綴合的抗體，例如辣根過氧化物酶抗地高辛配基抗體，以及顏色指示劑來檢測(cè)。每個(gè)孔的光密度提供PCR產(chǎn)物的量的度量，其進(jìn)而指示原始樣品中靶標(biāo)核酸的存在。

取決于標(biāo)記的性質(zhì)，多種技術(shù)可用于檢測(cè)標(biāo)記的存在。對(duì)于熒光劑，大量不同的熒光計(jì)可用。對(duì)于化學(xué)發(fā)光劑，發(fā)光計(jì)或薄膜可用。關(guān)于酶，熒光的、化學(xué)發(fā)光的(chemiluminiscent)或有色產(chǎn)物可被提供并且進(jìn)行熒光測(cè)量、發(fā)光測(cè)量(luminometrically)、分光光度測(cè)量或視覺測(cè)定。已用于免疫測(cè)定和適用于免疫測(cè)定的技術(shù)的多種標(biāo)記可與主題測(cè)定一起使用。

本方法可以與為了測(cè)試目的由臨床診斷實(shí)驗(yàn)室獲得的常規(guī)生物樣品一起使用。在一些實(shí)施方式中，可用于本方法的生物樣品包括全血、干血斑、分離的白血細(xì)胞、血漿樣品、血清樣品、培養(yǎng)的細(xì)胞、組織活組織檢查、鼻拭子、咽拭子、頰拭子、痰、尿等，即，通常送到臨床實(shí)驗(yàn)室分析的任何患者樣品

本文描述的方法可用于高通量環(huán)境，即，至少約100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、或10,000個(gè)生物樣品中任何一個(gè)可通過進(jìn)行本文描述的方法中的任何一個(gè)而同時(shí)處理。

在一些實(shí)施方式中，提供用于檢測(cè)多個(gè)樣品中每個(gè)的靶標(biāo)核酸的樣品混合策略，包括：a)將待測(cè)的所述多個(gè)樣品隨機(jī)分布進(jìn)n x m矩陣(n＝m或n＝m+1)，其中m由樣品大小決定；b)混合來自每行的每個(gè)樣品部分和混合來自每列的每個(gè)樣品部分；c)使用本文描述的方法中任一個(gè)檢測(cè)混合的樣品中靶標(biāo)核酸的存在；和d)單獨(dú)重新測(cè)試在陽性行和陽性列交叉處的樣品，其中在陰性行和陰性列交叉處的樣品被宣告對(duì)靶標(biāo)核酸陰性，當(dāng)重新測(cè)試時(shí)發(fā)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)核酸陽性的單獨(dú)重新測(cè)試的樣品被宣告對(duì)靶標(biāo)核酸陽性。

本連接依賴的擴(kuò)增方法特別用于福爾馬林固定的、石蠟包埋的(FFPE)樣本中靶標(biāo)序列的檢測(cè)和克服了用于FFPE樣本中靶標(biāo)RNA序列檢測(cè)的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)的現(xiàn)有技術(shù)方法中的缺陷。RT-PCR具有可變的檢測(cè)靈敏度，可能是因?yàn)楦栺R林固定期間RNA-RNA和RNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)物的形成阻止反轉(zhuǎn)錄酶延伸引物。在本方法中，不管交聯(lián)物，探針可與靶標(biāo)雜交，不需要反轉(zhuǎn)錄，并且擴(kuò)增探針而不是靶標(biāo)序列。因此本方法的靈敏度沒有被交聯(lián)物的存在而損害。

使用基于核酸雜交的捕獲和能夠連接的PCR檢測(cè)生物樣品中靶標(biāo)核酸的總示意性描述在圖1中提供。

探針和PCR引物

用于本發(fā)明方法的多核苷酸探針和PCR引物可通過已知的自動(dòng)化多核苷酸合成技術(shù)，例如通過利用核酸合成儀的標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺技術(shù)，從三磷酸核苷合成。這樣的合成儀可獲自，例如Applied Biosystems,Inc.(Foster City,Calif.)。

在一些實(shí)施方式中，如圖2中所描述的，所述方法使用多核苷酸探針用于捕獲和檢測(cè)靶標(biāo)核酸。在一些實(shí)施方式中，提供多個(gè)多核苷酸檢測(cè)探針，例如第一檢測(cè)探針(5’檢測(cè)探針)和第二檢測(cè)探針(3’檢測(cè)探針)，以及多個(gè)多核苷酸捕獲延伸劑，例如第一捕獲延伸劑(捕獲延伸劑1)和第二捕獲延伸劑(捕獲延伸劑2)。在一些實(shí)施方式中，進(jìn)一步提供額外的檢測(cè)探針，其是內(nèi)部檢測(cè)探針(內(nèi)部檢測(cè)探針1，IDP1)。在一些實(shí)施方式中，提供多個(gè)內(nèi)部檢測(cè)探針。在一些實(shí)施方式中提供多核苷酸捕獲探針。在一些實(shí)施方式中提供多個(gè)捕獲探針。探針可以是脫氧核糖核酸或核糖核酸分子，分子類型的選擇取決于隨后的擴(kuò)增方法。本文提到"探針"通常指多拷貝探針。也考慮具有修飾主鏈的核苷酸。

在一些實(shí)施方式中，檢測(cè)探針包括兩種探針(5’檢測(cè)探針和3’檢測(cè)探針)，其每個(gè)包括與靶標(biāo)核酸的區(qū)域互補(bǔ)的序列(這樣的序列在本文稱作CR)。在一些實(shí)施方式中，5’和3’檢測(cè)探針進(jìn)一步包括不與靶標(biāo)核酸的任何區(qū)域互補(bǔ)的序列(這樣的序列在本文稱作NCR)。參見圖2。在一些實(shí)施方式中，5’和3’檢測(cè)探針的NCR分別包括共用的5’和3’引物結(jié)合部位，并可與不同CR——其與不同靶標(biāo)核酸序列互補(bǔ)——組合，允許使用單個(gè)PCR引物對(duì)用于對(duì)不同靶標(biāo)核酸序列特異的不同的連接的檢測(cè)序列隨后的擴(kuò)增和檢測(cè)。在一些實(shí)施方式中，檢測(cè)探針進(jìn)一步包括至少一個(gè)內(nèi)部檢測(cè)探針(IDP)，其與位于5’和3’檢測(cè)探針的檢測(cè)靶向序列兩側(cè)的靶標(biāo)核酸的區(qū)域互補(bǔ)。在一些實(shí)施方式中，設(shè)計(jì)靶向單個(gè)核酸的檢測(cè)探針，以便它們的檢測(cè)靶向序列是連續(xù)的，例如它們由不超過約500個(gè)核苷酸(如約0、50、100、150、200、250、300、350、400、450或500個(gè)核苷酸中任何一個(gè))分隔。在一些實(shí)施方式中，設(shè)計(jì)靶向單個(gè)核酸的檢測(cè)探針，以便它們的檢測(cè)靶向序列是相鄰的，即，檢測(cè)靶向序列包括靶標(biāo)核酸的不間斷序列。在一些實(shí)施方式中，設(shè)計(jì)靶向單個(gè)核酸的檢測(cè)探針以便它們的檢測(cè)靶向序列中的至少一些是非連續(xù)的，例如它們由至少約500個(gè)核苷酸(如約550、750、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000個(gè)堿基中任何一個(gè))分隔。檢測(cè)靶向序列是無重疊的。

在一些實(shí)施方式中，5’檢測(cè)探針和任何內(nèi)部檢測(cè)探針的5’端被磷酸化。在一些實(shí)施方式中，5’檢測(cè)探針和任何內(nèi)部檢測(cè)探針的5’端未被磷酸化。

在一些實(shí)施方式中，多核苷酸檢測(cè)探針中的每個(gè)的長(zhǎng)度為約20至約200個(gè)核苷酸，例如長(zhǎng)度為約20至約40、約40至約60、約60至約80、約80至約100、約100至約120、約120至約140、約140至約160、約160至約180、約180至約200個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方式中，探針連接之后，連接的檢測(cè)序列的長(zhǎng)度為至少約80至約400，包括例如約80至約120、約120至約160、約160至約200、約200至約300、約300至約400個(gè)核苷酸。連接的檢測(cè)序列的長(zhǎng)度使得該序列適合通過PCR、LAMP、Qβ復(fù)制酶或SDA反應(yīng)擴(kuò)增。在一些實(shí)施方式中，對(duì)于5’和3’檢測(cè)探針CR的長(zhǎng)度與NCR的長(zhǎng)度之比為約0.5至約2。

在一些實(shí)施方式中，捕獲延伸劑中的每個(gè)包括捕獲序列(CS)和固定序列(IS)，其中捕獲序列與靶標(biāo)核酸的區(qū)域互補(bǔ)以及固定序列與靶標(biāo)核酸的任何區(qū)域不互補(bǔ)并包括與捕獲探針的部分互補(bǔ)的序列，如圖2中所描繪的。在一些實(shí)施方式中，捕獲延伸劑的固定序列是共用的，并且可與對(duì)不同靶標(biāo)核酸序列特異的不同捕獲序列組合，允許使用可與每個(gè)捕獲延伸劑雜交的單個(gè)捕獲探針。在一些實(shí)施方式中，固定序列可直接連接至捕獲序列或由中間的非互補(bǔ)序列與其隔開。在一些實(shí)施方式中，如需要，捕獲延伸劑可包括其它非互補(bǔ)序列。這些非互補(bǔ)序列不應(yīng)阻礙捕獲或固定序列與它們的靶標(biāo)雜交或引起非特異雜交發(fā)生。在一些實(shí)施方式中，設(shè)計(jì)靶向單個(gè)核酸的捕獲延伸劑，以便它們的捕獲靶向序列中的至少一些是連續(xù)的(如相鄰的)，例如它們由不超過約500個(gè)核苷酸(如約0、50、100、150、200、250、300、350、400、450或500個(gè)核苷酸中任何一個(gè))分隔。在一些實(shí)施方式中，設(shè)計(jì)靶向單個(gè)核酸的捕獲延伸劑，以便它們的捕獲靶向序列中的至少一些是非連續(xù)的，例如它們由至少約500個(gè)核苷酸(如約550、750、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000個(gè)堿基中任何一個(gè))分隔。捕獲靶向序列是無重疊的。

在一些實(shí)施方式中，多核苷酸捕獲延伸劑中的每個(gè)的長(zhǎng)度為約50至約300個(gè)核苷酸，例如長(zhǎng)度為約50至約70、約70至約90、約90至約110、約110至約130、約130至約150、約150至約200、約200至約300個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方式中，捕獲延伸劑中捕獲序列的長(zhǎng)度與固定序列的長(zhǎng)度之比為約0.5:1至約2:1，包括例如約0.5:1至約1:1、約1:1至約1.5:1、約1.5:1至約2:1。

在一些實(shí)施方式中，本文描述的捕獲探針包括與捕獲延伸劑的固定序列互補(bǔ)的序列。在一些實(shí)施方式中，捕獲延伸劑中的每個(gè)包括共用的固定序列，和提供單個(gè)捕獲探針，其包括與共用的固定序列互補(bǔ)的序列。在一些實(shí)施方式中，提供a)多個(gè)捕獲延伸劑，每個(gè)包括不同的固定序列，和b)多個(gè)捕獲探針，每個(gè)包括與不同的固定序列中的一個(gè)互補(bǔ)的序列。在一些實(shí)施方式中，捕獲探針以允許隨后與相應(yīng)的捕獲延伸劑雜交的方式結(jié)合至固體載體。捕獲探針與結(jié)合至靶標(biāo)核酸的捕獲延伸劑的雜交導(dǎo)致靶標(biāo)核酸連同任何雜交的檢測(cè)探針與固體載體的締合。

在一些實(shí)施方式中，提供：a)包括5’捕獲序列和3’固定序列的捕獲延伸劑和經(jīng)設(shè)計(jì)以在5’端連接至固體載體的相應(yīng)捕獲探針，如圖2A所描繪的，或b)包括3'捕獲序列和5'固定序列的捕獲延伸劑和經(jīng)設(shè)計(jì)以在3’端連接至固體載體的相應(yīng)捕獲探針。在一些實(shí)施方式中，提供a)和b)，如圖2B所描繪的。

將理解，兩個(gè)核酸序列的雜交無需所述序列之間的完全互補(bǔ)。因此在本發(fā)明的方法中任何一個(gè)的一些實(shí)施方式中，檢測(cè)探針和捕獲延伸劑的靶標(biāo)結(jié)合序列不必具有與它們的靶標(biāo)核酸序列的完全互補(bǔ)性。在一些實(shí)施方式中，捕獲延伸劑的固定序列不必具有與相應(yīng)的捕獲探針中的序列的完全互補(bǔ)性。在一些實(shí)施方式中，異源雙鏈體將滿足這樣的情況：少于約20％的堿基(如少于約20、15、10或5％的堿基中任何一個(gè))是錯(cuò)配，忽略五個(gè)或更多個(gè)核苷酸的環(huán)。因此在一些實(shí)施方式中，檢測(cè)探針和/或捕獲延伸劑包括與靶標(biāo)核酸中它們的相應(yīng)靶標(biāo)序列少于約20％(如少于約20、15、10或5％中任何一個(gè))的堿基對(duì)錯(cuò)配。在一些實(shí)施方式中，捕獲延伸劑包括固定序列，固定序列包括與相應(yīng)的捕獲探針中它們的靶標(biāo)序列少于約20％(如少于約20、15、10或5％中任何一個(gè))的堿基對(duì)錯(cuò)配。在其它實(shí)施方式中，如當(dāng)使用變異特異的檢測(cè)探針(如突變特異的檢測(cè)探針)時(shí)，具有100％互補(bǔ)性——即，無堿基對(duì)錯(cuò)配——的同源雙鏈體是期望的。

在一些實(shí)施方式中，提供a)多個(gè)檢測(cè)探針，以便靶向單個(gè)核酸的檢測(cè)探針的檢測(cè)靶向序列是連續(xù)的和無重疊的，和b)多個(gè)捕獲延伸劑，以便靶向單個(gè)核酸的檢測(cè)探針和捕獲延伸劑的檢測(cè)靶向序列和捕獲靶向序列是無重疊的。在一些實(shí)施方式中，提供a)多個(gè)檢測(cè)探針，以便靶向單個(gè)核酸的檢測(cè)探針的檢測(cè)靶向序列是連續(xù)的和無重疊的，和b)多個(gè)捕獲延伸劑，以便靶向單個(gè)核酸的檢測(cè)探針和捕獲延伸劑的檢測(cè)靶向序列和捕獲靶向序列是連續(xù)的和無重疊的，如圖2中所描繪的。在一些實(shí)施方式中，捕獲靶向序列不在檢測(cè)靶向序列之間。與檢測(cè)探針和捕獲延伸劑的序列互補(bǔ)的靶標(biāo)核酸區(qū)域的連續(xù)安排允許增加靶標(biāo)核酸復(fù)合物捕獲的效率。這是因?yàn)?)由于相鄰的堿基配對(duì)之間的堿基堆積作用(Dimitrov and Zuker,Biophys.J.87(1):215-226,2004)，即由于堿基堆積作用，相鄰探針和靶標(biāo)之間的相互作用導(dǎo)致更強(qiáng)的、更穩(wěn)定的螺旋形成，一個(gè)捕獲延伸劑/檢測(cè)探針與靶標(biāo)的雜交將促進(jìn)相鄰捕獲延伸劑/檢測(cè)探針與靶標(biāo)的雜交，且產(chǎn)生的雙螺旋比單個(gè)捕獲延伸劑/檢測(cè)探針與靶標(biāo)的雜交形成的雙螺旋更穩(wěn)定；和2)一個(gè)捕獲延伸劑與捕獲探針的雜交將使鄰近的捕獲延伸劑接近附近的捕獲探針用于進(jìn)一步雜交和與捕獲探針結(jié)合的固體載體的締合，因此增加檢測(cè)測(cè)定的靈敏度。這種構(gòu)型的增加的熱動(dòng)力穩(wěn)定性將有利于雜交的靶標(biāo)核酸復(fù)合物與多個(gè)捕獲延伸劑的結(jié)合，因此增加相對(duì)于與少于全組捕獲延伸劑雜交的脫靶標(biāo)核酸的區(qū)別，導(dǎo)致增加的檢測(cè)測(cè)定的特異性。這對(duì)于其中單個(gè)反應(yīng)中多個(gè)靶標(biāo)可被檢測(cè)的多重PCR反應(yīng)是特別期望的。

在本發(fā)明的方法中任何一個(gè)的一些實(shí)施方式中，該方法進(jìn)一步包括提供：a)超過兩種檢測(cè)探針；和/或b)超過兩種捕獲延伸劑，增加與靶標(biāo)核酸互補(bǔ)的檢測(cè)探針和捕獲延伸劑的總特異序列，和從而提供甚至更高的捕獲效率。

本發(fā)明的進(jìn)一步方面提供一種或多種捕獲延伸劑，如上面所描述的那些，以及單個(gè)檢測(cè)探針，也稱作環(huán)化檢測(cè)探針，其與靶標(biāo)核酸雜交并在它的游離末端連接之后環(huán)化，如圖3A所示。在一些實(shí)施方式中，設(shè)計(jì)環(huán)化檢測(cè)探針以便與靶標(biāo)核酸序列互補(bǔ)的探針區(qū)域位于探針的每一端。在一些實(shí)施方式中，當(dāng)環(huán)化檢測(cè)探針與靶標(biāo)雜交時(shí)，它的末端彼此相鄰放置，導(dǎo)致與連接劑如連接酶連接之后閉合的環(huán)狀分子的形成。該環(huán)狀分子，也稱作連接的檢測(cè)序列，或更具體地，環(huán)化的連接的檢測(cè)序列，然后可在擴(kuò)增步驟，例如PCR、RCA期間充當(dāng)模板。

進(jìn)一步考慮使用多個(gè)檢測(cè)探針，其可被連接以形成單個(gè)共價(jià)閉合的連接的檢測(cè)序列。在本文呈現(xiàn)的方法中任何一個(gè)的一些實(shí)施方式中，所述多個(gè)檢測(cè)探針(在本文稱作環(huán)化檢測(cè)探針)包括：a)一個(gè)或多個(gè)內(nèi)部檢測(cè)探針，其與靶標(biāo)核酸的區(qū)域雜交；和b)額外的檢測(cè)探針，包括i)與靶標(biāo)核酸的區(qū)域互補(bǔ)的3'末端，該靶標(biāo)核酸的區(qū)域?yàn)榕c內(nèi)部檢測(cè)探針互補(bǔ)的靶標(biāo)核酸區(qū)域的下游；和ii)與靶標(biāo)核酸的區(qū)域互補(bǔ)的5'末端，該靶標(biāo)核酸的區(qū)域?yàn)榕c內(nèi)部檢測(cè)探針互補(bǔ)的靶標(biāo)核酸區(qū)域的上游，通過多個(gè)連接事件其可形成單個(gè)共價(jià)閉合的連接的檢測(cè)序列，如圖3B所描繪的。在一些實(shí)施方式中，兩種連接酶，例如酶促和化學(xué)連接酶，用于使環(huán)化檢測(cè)探針共價(jià)閉合，其中連接的順序被控制。

因此，在本文呈現(xiàn)的方法中任何一個(gè)的一些實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括設(shè)計(jì)檢測(cè)探針為環(huán)化檢測(cè)探針。

本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式提供減少利用環(huán)化檢測(cè)探針的擴(kuò)增方法中的遺留污染和背景的方法。目前的能夠連接的擴(kuò)增方法，不像常規(guī)的擴(kuò)增方法，涉及連接的檢測(cè)序列而不是靶標(biāo)核酸的擴(kuò)增。當(dāng)連接的檢測(cè)序列是閉合的環(huán)狀分子時(shí)，它沒有易受外切核酸酶消化的游離端。環(huán)化檢測(cè)探針連接，即環(huán)化之后，用外切核酸酶處理反應(yīng)混合物提供"清理"步驟和因此通過消化未連接的檢測(cè)探針和其它線性DNA片段但不是閉合的環(huán)狀分子而減少背景和遺留污染。環(huán)化的檢測(cè)序列保持完整，用于隨后的擴(kuò)增和檢測(cè)。在常規(guī)PCR中，使用外切核酸酶消除單鏈引物或遺留DNA片段引起靶標(biāo)核酸也將被降解的風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明沒有遭受這種風(fēng)險(xiǎn)，因?yàn)榘袠?biāo)核酸未被擴(kuò)增。在優(yōu)選實(shí)施方式中，外切核酸酶是外切核酸酶III、外切核酸酶VII、綠豆核酸酶或核酸酶BAL-31。外切核酸酶在連接之后和擴(kuò)增之前加入反應(yīng)，以及例如在37℃溫育三十分鐘。

因此，在本文呈現(xiàn)的方法中任何一個(gè)的一些實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括：a)設(shè)計(jì)檢測(cè)探針為環(huán)化檢測(cè)探針；和b)環(huán)化檢測(cè)探針連接之后，但在連接的檢測(cè)序列擴(kuò)增之前，使用本領(lǐng)域已知的任何方法通過外切核酸酶處理來消化未連接的環(huán)化檢測(cè)探針和其它線性核酸。

在一些實(shí)施方式中，環(huán)化的連接的檢測(cè)序列也可通過大的聚合物的產(chǎn)生而被擴(kuò)增和檢測(cè)。在一些實(shí)施方式中，聚合物通過以下產(chǎn)生：a)第一引物沿著環(huán)化的連接的檢測(cè)序列滾環(huán)延伸和下游序列的置換，產(chǎn)生包括多單元的連接的檢測(cè)序列的單鏈DNA，其中每個(gè)單元充當(dāng)隨后擴(kuò)增的模板；和b)第二引物與單鏈DNA聚合物的結(jié)合和延伸。通過使用引物延伸/置換和PCR，用相同循環(huán)數(shù)產(chǎn)生更加可檢測(cè)到的產(chǎn)物。

在一些實(shí)施方式中，與靶標(biāo)核酸互補(bǔ)的檢測(cè)探針和捕獲延伸劑的序列每個(gè)長(zhǎng)度為約15至約60個(gè)核苷酸，優(yōu)選長(zhǎng)度為約18至約35個(gè)核苷酸，其提供用于探針與靶標(biāo)核酸充分雜交的足夠長(zhǎng)度。它們被設(shè)計(jì)以與靶標(biāo)核酸的不同序列雜交。該序列可基于許多種考慮來選擇。在一些實(shí)施方式中，取決于靶標(biāo)核酸的性質(zhì)，與靶標(biāo)核酸互補(bǔ)的檢測(cè)探針和捕獲延伸劑的序列包括選自共有序列、與多態(tài)性相關(guān)的序列、對(duì)具體表型或基因型特異的序列、對(duì)具體菌株特異的序列等的序列。

在一些實(shí)施方式中，連接的檢測(cè)序列的引物結(jié)合部位包括富G-C序列，其在與引物雜交后，如下面所討論的，提供更穩(wěn)定的雙鏈體分子，即，需要較高的溫度來變性的雙鏈體分子。在一些實(shí)施方式中，包括富G-C引物結(jié)合部位的連接的檢測(cè)序列可使用雙溫PCR反應(yīng)來擴(kuò)增，其中引物雜交和延伸均可在約60至約65℃的溫度進(jìn)行(與在通常用于PCR擴(kuò)增的較低溫度雜交相反)和在約92℃的溫度變性，如下面所討論的。雙溫反應(yīng)的使用減少每個(gè)PCR擴(kuò)增循環(huán)的長(zhǎng)度和導(dǎo)致較少的測(cè)定時(shí)間。

在一些實(shí)施方式中，檢測(cè)探針和捕獲延伸劑與預(yù)期摩爾的靶標(biāo)核酸之比將每個(gè)為至少化學(xué)計(jì)量的和優(yōu)選過量的。在一些實(shí)施方式中，它將在約2:1至約10,000:1的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方式中，每種探針的濃度可在約10^-9至約10^-6M的范圍，靶標(biāo)核酸濃度在約10^-18至約10^-10M變化。

用于本方法的PCR引物可通過已知的自動(dòng)化合成技術(shù)從三磷酸核苷合成，如上面針對(duì)多核苷酸探針的合成而討論的。在一些實(shí)施方式中，PCR引物的長(zhǎng)度可為約10至約60個(gè)核苷酸，優(yōu)選長(zhǎng)度為約18至約35個(gè)核苷酸，長(zhǎng)度為約16至約21個(gè)核苷酸最優(yōu)選。還優(yōu)選引物被設(shè)計(jì)以便它們不具有任何二級(jí)結(jié)構(gòu)，即，每個(gè)引物自身內(nèi)不含有互補(bǔ)區(qū)域——其可導(dǎo)致自身退火。

在一些實(shí)施方式中，PCR引物和連接的檢測(cè)序列的PCR引物結(jié)合部位的高G-C含量允許在雙溫進(jìn)行PCR反應(yīng)，而不是通常的三溫方法。

PCR和RT-PCR反應(yīng)

在一些實(shí)施方式中，本文描述的PCR和RT-PCR反應(yīng)混合物可包括dNTP、引物、熱穩(wěn)定的DNA聚合酶、和/或緩沖劑。

在一些實(shí)施方式中，可使用的DNA聚合酶包括但不限于Taq、Pfu、Vent、和Sequitherm DNA聚合酶(EPICENTRE)。

在一些實(shí)施方式中，PCR和RT-PCR反應(yīng)混合物可獲自商業(yè)上可用的試劑盒，例如，PCT試劑盒、實(shí)時(shí)PCR試劑盒、一步RT-PCR試劑盒或一步RT-qPCR試劑盒。

在一些實(shí)施方式中，合適的緩沖劑可用于維持PCR反應(yīng)的pH，例如，可使用兩性離子緩沖劑如Tricine、HEPES、和Bicine或可使用非兩性離子緩沖劑如Tris。在一些實(shí)施方式中，緩沖劑可通過包括多種鹽和添加物來優(yōu)化，包括氯化鎂、氯化鉀、硫酸銨、明膠、牛血清白蛋白(BSA)、二甲基亞砜(DMSO)、聚胺、甜菜堿、氯化四甲銨(TMAC)、和二硫蘇糖醇(DTT)。在一些實(shí)施方式中，也可使用非還原糖如海藻糖、蔗糖和棉子糖和兩性離子表面活性劑如CHAPS。

用于本發(fā)明方法中任何一個(gè)的引物對(duì)可基于檢測(cè)探針的非互補(bǔ)區(qū)域(NCRs)來設(shè)計(jì)。在一些實(shí)施方式中，引物對(duì)將是共用的引物對(duì)，對(duì)應(yīng)于存在于由于與它們的靶標(biāo)核酸雜交的檢測(cè)探針的連接而形成的多個(gè)連接的檢測(cè)序列中的共用引物結(jié)合部位。在一些實(shí)施方式中，引物，例如用熒光染料標(biāo)記，以容易檢測(cè)。

PCR擴(kuò)增的連接的檢測(cè)序列可通過本領(lǐng)域已知的任何方法來檢測(cè)，其可包括，例如實(shí)時(shí)PCR、熒光檢測(cè)、凝膠電泳、測(cè)序、MALDI-TOF質(zhì)譜法如MassARRAY測(cè)定、微陣列雜交測(cè)定或執(zhí)行相似功能的其它方法。

在一些實(shí)施方式中，實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)可用雙鏈DNA結(jié)合染料，例如SYBR Green或EvaGreen來檢測(cè)。在一些實(shí)施方式中，實(shí)時(shí)PCR產(chǎn)物通過將熒光標(biāo)記，例如Cy3、Cy5、熒光素、羅丹明、羅丹明紅、TET、或其它熒光分子摻入引物中來檢測(cè)。

在一些實(shí)施方式中，含有5’熒光報(bào)道分子和3’猝滅劑的雙標(biāo)記探針用于增加實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)的靈敏度。在一些實(shí)施方式中，熒光報(bào)道分子是Cy3、Cy5、熒光素、羅丹明、羅丹明紅、TET或其它熒光分子。在一些實(shí)施方式中，使用的猝滅劑包括BHQ-1、TAMRA、BHA-2、BHQ-3和其它猝滅分子。在一些實(shí)施方式中，含有5’熒光報(bào)道分子和3’猝滅劑和形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的雙標(biāo)記探針用于增加實(shí)時(shí)PCR的靈敏度。

在本發(fā)明的方法中任何一個(gè)的一些實(shí)施方式中，連接的檢測(cè)序列的擴(kuò)增和檢測(cè)包括：a)使用RT-qPCR來擴(kuò)增連接的檢測(cè)序列，其中測(cè)定Ct值；和b)比較測(cè)定的Ct值與預(yù)定的閾值Ct，其中低于預(yù)定的閾值的Ct值指示樣品中連接的檢測(cè)序列的存在。在一些實(shí)施方式中，閾值Ct設(shè)為40。在一些實(shí)施方式中，閾值Ct是約35、36、37、38、39或40中任何一個(gè)。在一些實(shí)施方式中閾值Ct實(shí)驗(yàn)地設(shè)為對(duì)照反應(yīng)的Ct，其中所有的反應(yīng)條件，包括試劑濃度和循環(huán)溫度，與測(cè)試反應(yīng)相同，除了已知缺少靶標(biāo)核酸外。

PCR的變型已被開發(fā)和可用于本發(fā)明。在一些實(shí)施方式中，使用兩組引物和兩個(gè)連續(xù)的PCR運(yùn)行來嵌套PCR反應(yīng)以增加特異性?？蛇x地，在一些實(shí)施方式中通過添加多組引物至反應(yīng)，PCR反應(yīng)被多重化。

在一些實(shí)施方式中，引物退火至連接的檢測(cè)序列在約37至約50℃進(jìn)行；在存在三磷酸核苷的情況下通過Taq聚合酶延伸引物序列在約70至約75℃進(jìn)行；和釋放延伸的引物的變性步驟在約90至約95℃進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，使用雙溫PCR技術(shù)，并且退火和延伸步驟均在約60至約65℃進(jìn)行，因此減少每個(gè)擴(kuò)增循環(huán)的長(zhǎng)度和導(dǎo)致較少的測(cè)定時(shí)間。

例如，合適的三溫PCR擴(kuò)增(如Saiki et al.,Science 239:487-491,1988所提供的)可如下進(jìn)行：

聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)在含有0.01至1.0ng的模板連接的檢測(cè)序列、10至100pmol的每個(gè)共用引物、1.5單位的Taq DNA聚合酶(Promega Corp.)、0.2mM dATP、0.2mM dCTP、0.2mM dGTP、0.2mM dTTP、15mM MgCl2、10mM Tris-HCl(pH 9.0)、50mM KCl、1μg/ml明膠、和10μl/ml Triton X-100(Saiki,1988)的約25-50μl樣品中進(jìn)行。反應(yīng)在94℃溫育1分鐘，約37至約55℃溫育2分鐘(取決于引物的特性)，和約72℃溫育3分鐘和重復(fù)30-40，優(yōu)選35個(gè)循環(huán)。每個(gè)反應(yīng)的4μl等分部分由通過2％瓊脂糖凝膠的電泳來分析，并且樣品中的DNA產(chǎn)物通過用溴化乙錠染色凝膠來可視化。

雙溫PCR技術(shù)，如上面所討論的，與上面的區(qū)別僅在于在單個(gè)溫度，例如約60至約65℃約5分鐘而不是在兩個(gè)溫度進(jìn)行退火/延伸步驟。例如，連接的檢測(cè)序列可通過實(shí)時(shí)定量PCR通過以下來檢測(cè)：添加含有1XPremix Ex(Takara,RR820)和100nM引物的25ul PCR混合物至含有如本發(fā)明的方法中任何一個(gè)所述制備的連接的檢測(cè)序列的微孔板的每個(gè)孔，在Roche LC480II上使用在95℃30sec的最初變性步驟，之后在95℃變性5sec和在60℃退火20sec的45個(gè)循環(huán)來擴(kuò)增和檢測(cè)。

待檢測(cè)的病原體

本文描述的方法可用于診斷疾病，例如與本文描述的病原體中任一個(gè)相關(guān)的疾病。在一些實(shí)施方式中，個(gè)體不具有該疾病的癥狀。

可被診斷的疾病的實(shí)例包括但不限于：瘧疾，例如通過檢測(cè)瘧原蟲屬(genus Plasmodium)的原生動(dòng)物；肝炎，例如通過檢測(cè)甲型肝炎、乙型肝炎或丙型肝炎病毒；HIV感染，例如通過檢測(cè)人免疫缺陷病毒；皰疹，例如通過檢測(cè)單純皰疹病毒1型或單純皰疹病毒2型；單核細(xì)胞增多癥，例如通過檢測(cè)Epstein-Barr病毒；睡眠病，例如通過檢測(cè)錐蟲；水痘，例如通過水痘帶狀皰疹病毒檢測(cè),麻疹和腮腺炎，通過檢測(cè)副粘病毒科病毒、葡萄球菌感染或中毒性休克綜合征，通過檢測(cè)金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、氣性壞疽，通過檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)、結(jié)膜炎，通過檢測(cè)埃及嗜血桿菌(Haemophilus aegyptius)、百日咳，通過檢測(cè)百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)、肺結(jié)核，通過檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、軍團(tuán)病，通過檢測(cè)嗜肺軍團(tuán)菌(Legionella pneumophilia)、炭疽感染，通過檢測(cè)炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)、梅毒，通過檢測(cè)蒼白密螺旋體(Treponema pallidum)、霍亂，通過檢測(cè)霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、傷寒，通過檢測(cè)傷寒沙門菌(S.Typhi)、消化性潰瘍病，通過檢測(cè)幽門螺桿菌(Heliobacter pylori)、破傷風(fēng)，通過檢測(cè)破傷風(fēng)桿菌(Clostridum tetani)、肉毒中毒，通過檢測(cè)肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、萊姆病，通過檢測(cè)伯氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi)、伽氏疏螺旋體(B.Garinii)和阿氏疏螺旋體(B.afzelii)、和流感，通過檢測(cè)H5N1、H1N1、H3N2、H7N9和其它病毒。

使用本文描述的方法可檢測(cè)的病原體包括，但不限于，細(xì)菌、真菌、病毒、古細(xì)菌、原生生物、原生動(dòng)物和孢子。在一些實(shí)施方式中，病原體是熱穩(wěn)定的。

在一些實(shí)施方式中，病原體是原生動(dòng)物。示例的原生動(dòng)物包括，但不限于，惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)、間日瘧原蟲(Plasmodium vivax)、卵形瘧原蟲(Plasmodium ovale)、三日瘧原蟲(Plasmodium malariae)、諾氏瘧原蟲(Plasmodium knowlesi)、熱帶利什曼原蟲(Leishmania tropica)、布魯斯錐蟲(Trypanosoma brucei)、克魯斯錐蟲(Trypanosoma cruzi)、隱孢子蟲屬(Cryptosporidium)、溶組織內(nèi)阿米巴(Entamoeba histolytica)、蘭伯賈第蟲(Giardia lamblia)、和鼠弓形蟲(Toxoplasma gondii)。

在一些實(shí)施方式中，病原體是病毒。示例的病毒包括，但不限于，HIV-I、HIV-2、肝炎病毒(包括乙型肝炎和丙型肝炎)、埃博拉病毒、西尼羅病毒、和皰疹病毒如HSV-2、腺病毒、登革熱血清型1至4、埃博拉、腸病毒、單純皰疹病毒1型或2型、流感、日本馬腦炎(Japanese equine encephalitis)、諾沃克(Norwalk)、乳頭瘤病毒、細(xì)小病毒B19、風(fēng)疹、麻疹、牛痘、水痘、巨細(xì)胞病毒、Epstein-Barr病毒、人類皰疹病毒6、人類皰疹病毒7、人類皰疹病毒8、天花病毒、水皰性口炎病毒、流感病毒B、麻疹病毒、多瘤病毒、人乳頭瘤病毒、呼吸道合胞病毒、狂犬病病毒、Rous肉瘤病毒、黃熱病毒、埃博拉病毒、馬爾堡病毒、拉沙熱病毒、東方馬腦炎病毒、日本腦炎病毒、圣路易斯腦炎病毒、墨累山谷熱病毒、西尼羅病毒、立夫特山谷熱病毒、輪狀病毒A、輪狀病毒B、輪狀病毒C、Sindbis病毒、人T細(xì)胞白血病病毒1型、漢他病毒、風(fēng)疹病毒、猴免疫缺陷病毒、H3N2病毒、H5N1病毒、H1N1病毒和其任何組合。

在一些實(shí)施方式中，病原體是流感病毒。流感病毒可被分成三組：A型流感、B型流感、和C型流感。A型和B型流感病毒引起季節(jié)性流行病。A型流感病毒根據(jù)它們的血凝素(HA)類型和它們的神經(jīng)氨酸酶(NA)類型來表征。有17種不同H抗原(H1至H17)和10種不同N抗原(N1至N10)，總共170種不同的可能組合。此外，每個(gè)類型內(nèi)有含有遺傳變異的菌株。在每個(gè)流行季節(jié)，不同流感變體在人群中流通，這可導(dǎo)致基因交換和可導(dǎo)致新的和更多病原變體。因此監(jiān)測(cè)和能夠檢測(cè)和診斷流感病毒型和亞型具有極其重要的重要性。

A型流感病毒可感染人類、鳥類、豬、馬、犬、鯨、海豹和貓。鳥類是A型流感病毒的無癥狀攜帶者。此外，A型流感病毒的一些株可在不同物種之間傳播，例如從豬或鳥類到人類。因此期望本病原體檢測(cè)方法可用于檢測(cè)人類以及動(dòng)物中的流感感染。

H1N1病毒是一類A型流感病毒。H1N1是季節(jié)性流感的主要原因，其每年影響大約15％的全球人口。此外，H1N1病毒已引起幾種主要的流行病和大流行病。例如，1918-19的流感流行是最具破壞性的流感爆發(fā)，已估計(jì)殺死2千5百萬人，并且由H1N1病毒引起。在2009年，發(fā)生了另一次H1N1爆發(fā)，在豬開始，并蔓延到全世界，引起大流行病。

H7N9和H5N1也是流感A型禽流感病毒。H7N9病毒首先在2013年4月在中國(guó)報(bào)道并已在鳥類和人類中被報(bào)道。盡管有許多例與禽暴露相關(guān)的H7N9病毒感染，但是尚未有持續(xù)向前的病毒傳播給其它人的證據(jù)。盡管先前H7亞型禽流感病毒的感染是輕的，但是新的H7N9株已導(dǎo)致超過40人死亡。具有確認(rèn)的H7N9感染的患者的臨床所見包括高熱、無痰干咳和痰咳、呼吸短促、呼吸困難、缺氧、胸成像上記錄的下呼吸道模糊的證據(jù)、固結(jié)和浸潤(rùn)。H7N9病毒的并發(fā)癥包括膿毒性休克、呼吸衰竭、急性呼吸窘迫綜合征、難治的低氧血癥、急性腎功能障礙、多器官功能障礙、橫紋肌溶解、腦病、以及細(xì)菌和真菌感染。

流感病毒可通過靶向HA或NA基因的探針來檢測(cè)。探針可被設(shè)計(jì)以擴(kuò)增種型。例如H1通用探針可用于檢測(cè)禽、豬和人源的H1病毒?？蛇x地，探針可被設(shè)計(jì)以特異地檢測(cè)病毒亞型。例如，靶向人源的H1N1探針可被設(shè)計(jì)，其將不靶向豬源的H1N1病毒。作為另一個(gè)實(shí)例，可使用核苷酸125和302之間的HA基因片段，并且可設(shè)計(jì)可在大流行和季節(jié)性H1N1株之間區(qū)分的探針。可利用相似的方法來檢測(cè)其它流感株和亞型。

在一些實(shí)施方式中，病原體是真菌或酵母。示例的真菌和酵母包括，但不限于，新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)、白色念珠菌(Candida albicans)、熱帶念珠菌(Candida tropicalis)、類星形念珠菌(Candida stellatoidea)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、克魯斯念珠菌(Candida krusei)、近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)、吉利蒙念珠菌(Candida guilliermondii)、維斯念珠菌(Candida viswanathii)、葡萄牙念珠菌(Candida lusitaniae)、膠紅酵母(Rhodotorula mucilaginosa)、煙曲霉菌(Aspergillus fumigatus)、黃曲霉菌(Aspergillus flavus)、棒曲霉(Aspergillus clavatus)、新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)、勞倫梯隱球菌(Cryptococcus laurentii)、白色隱球菌(Cryptococcus albidus)、加特隱球酵母(Cryptococcus gattii)、莢膜組織胞漿菌(Histoplasma capsulatum)、耶氏肺囊蟲(Pneumocystis jirovecii)、卡氏肺囊蟲(Pneumocystis carini)、葡萄穗霉(Stachybotrys chartarum)、和其任何組合。

在一些實(shí)施方式中，病原體是細(xì)菌。示例的細(xì)菌包括但不限于：炭疽、彎曲桿菌(Campylobacter)、霍亂、白喉、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌、賈第蟲(giardia)、淋球菌(gonococcus)、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)、流感嗜血桿菌B(Hemophilus influenza B)、未分型的流感嗜血桿菌(Hemophilus influenza non-typable)、腦膜炎球菌(meningococcus)、百日咳(pertussis)、肺炎球菌(pneumococcus)、沙門氏菌(salmonella)、志賀菌(shigella)、鏈球菌B(Streptococcus B)、A組鏈球菌(group A Streptococcus)、破傷風(fēng)(tetanus)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、耶爾森菌(yersinia)、葡萄球菌(Staphylococcus)、假單胞菌種(Pseudomonas species)、梭狀芽胞桿菌種(Clostridia species)、結(jié)核分枝桿菌(Myocobacterium tuberculosis)、麻風(fēng)分枝桿菌(Mycobacterium leprae)、單核細(xì)胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes)、傷寒沙門菌(Salmonella typhi)、痢疾志賀菌(Shigella dysenteriae)、鼠疫耶爾森菌(Yersinia pestis)、布魯桿菌種(Brucella species)、嗜肺軍團(tuán)病桿菌(Legionella pneumophila)、立克次體(Rickettsiae)、魏氏梭菌(Clostridium peifringens)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、蒼白密螺旋體(Treponema pallidum)、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)、蒼白密螺旋體(Treponema pallidum)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、小隱孢子蟲(Cryptosporidium parvum)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)、腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitides)、和其任何組合。

在一些實(shí)施方式中，病原體是植物病原體。示例的植物病原體包括，但不限于，例如，黑曲霉菌(Aspergillus niger)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、支孢樣支孢霉(Cladosporium cladosporioides)、青霉菌某種(Penicillium spp.)、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、李痘病毒(plum pox virus)、擬莖點(diǎn)霉(Phomopsis viticola)、梨水疫病歐文氏菌(Erwinia amylovora)、菊花褪綠斑駁類病毒(chrysanthemum clorotic mottle viroid)、菊花矮化類病毒(chrysanthemum stunt viroid)、馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒(potato spindle tuber viroid)、啤酒花潛隱類病毒(hop latent viroid)、鱷梨日斑病類病毒素(avocado sunblotch viroid)、番茄黃化類并素(tomato chlorotic viroid)、柑桔裂皮類病毒(citrus exocortis voroid)、椰子死亡類病毒(coconut cadang-cadang viroid)、椰子敗生類病毒(coconut tinangaja viroid)、蕃茄雄株類病毒(tomato plant macho viroid)、柑橘黃龍病菌(Candidatus Liberibacter asiaticus)、Cordana johnstonii、尖孢鐮刀菌(Fusarium)、oxysporum、白銹菌(Albugo candida)、麥角菌(Claviceps purpurea)、柄銹菌(Puccinia coronata)、柑橘黑斑病菌(Guignardia citricarpa)、咖啡銹菌(Hemileia coffeicola)、咖啡駝孢銹菌(Hemileia vastatrix)、棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)、棉根腐病菌(Phymatotrichopsis omnivora)、粒線蟲屬某種(Anguina spp.)、薄孔菌屬某種(Antrodia spp.)、重蜜環(huán)菌某種(Armillaria spp.)、球二孢某種(Botryodiplodia spp.)、葡萄座腔菌屬某種(Botryosphaeria spp.)、尾孢某種(Cercospora spp.)、旋孢腔菌某種(Cochliobolus spp.)、Diaphorthe屬某種、鐮刀菌某種(Fusarium spp.)、異皮線蟲某種(Heterodera spp.)、小球腔菌某種(Leptosphaeria spp.)、小球殼屬某種(Mycosphaerella spp.)、粉孢子某種(Oidium spp.)、斜尖狀孢子菌某種(Peronospora spp.)、擬盤多毛孢屬某種(Pestalotiosis spp.)、莖點(diǎn)霉某種(Phoma spp.)、疫霉某種(Phytophthora spp.)、假尾孢菌屬某種(Pseudocercospora spp.)、Phythium屬某種、柱隔孢某種(Ramularia spp.)、殼針孢某種(Septoria spp.)、外囊菌屬某種(Taphrina spp.)、單胞銹菌某種(Uromyces spp.)、黑星菌某種(Venturia spp.)和黃單胞菌某種(Xanthomonas spp.)。

在一些實(shí)施方式中，病原體是食物病原體。示例的食物病原體包括但不限于，例如，蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)、空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)、小隱孢子蟲(Cryptosporidium parvum)、大腸桿菌0157:H7(Escherichia coli 0157:H7)、蘭伯賈第蟲(Escherichia coli 0157:H7)、甲型肝炎、戊型肝炎、單核細(xì)胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes)、弗氏志賀菌(Shigella flexneri)、諾瓦克(Norwalk)或諾瓦克樣病毒(Norwalk-like virus)、諾如病毒(norovirus)、沙門菌某種(Salmonella spp.)、葡萄球菌某種(Staphylococcus spp.)、鼠弓形蟲(Toxoplasma gondii)、弧菌某種(Vibrio spp.)、耶爾森菌某種(Yersinia spp.)、杯狀病毒(calciviruses)、札幌病毒(Sapporo virus)、輪狀病毒(rotavirus)、星狀病毒(astrovirus)、麥角真菌(ergot fungus)、黃曲霉菌(Aspergillus flavus)、寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)、麥角菌某種(Claviceps spp.)、毛線蟲(Trichinella)、禽流感(Avian influenza)、鏈球菌某種(Streptococcus spp.)、布魯菌某種(Brucella spp.)、潰瘍棒狀桿菌(Corynebacterium ulcerans)、伯內(nèi)特考克斯體(Coxiella burnetii)、類志賀毗鄰單胞菌(Pleisomonas shigelloides)、溫和氣單胞菌(Aeromonas sobira)、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophilia)、豚鼠氣單胞菌(Aeromonas caviae)、和其它。

試劑盒和裝置

本文還提供用于進(jìn)行本文描述的方法中任何一個(gè)的試劑盒。例如，在一些實(shí)施方式中，提供試劑盒，其包括：1)多個(gè)捕獲延伸劑，2)多個(gè)檢測(cè)探針；和3)多個(gè)捕獲探針。在一些實(shí)施方式中，試劑盒進(jìn)一步包括固體載體。在一些實(shí)施方式中，捕獲探針固定在固體載體上。在一些實(shí)施方式中，試劑盒進(jìn)一步包括一組或多組用于PCR擴(kuò)增的引物。

試劑盒可進(jìn)一步包括，例如，用于進(jìn)行本發(fā)明的裂解和雜交步驟的反應(yīng)混合物。在一些實(shí)施方式中，試劑盒包括裂解混合物，如例如，包括約10至約20mM Tris-HCl(如約15mM Tris-HCl)、約130至約170mM NaCl(如約150mM NaCl)、約0.5至約2mM EDTA(如約1mM EDTA)、和約0.5至約2％Triton X-100(如約1％Triton X-100)的溶液。在一些實(shí)施方式中，裂解溶液進(jìn)一步包括約0.5至約2mM EGTA(如約1mM EGTA)。在一些實(shí)施方式中，裂解溶液進(jìn)一步包括約0.5至約3mg/ml蛋白酶K(如約1.5mg/ml蛋白酶K)。在一些實(shí)施方式中，裂解溶液進(jìn)一步包括探針混合物，其包括檢測(cè)探針和捕獲延伸劑。

在一些實(shí)施方式中，檢測(cè)探針和捕獲延伸劑靶向單個(gè)靶標(biāo)核酸。在一些實(shí)施方式中，檢測(cè)探針和捕獲延伸劑靶向多個(gè)不同靶標(biāo)核酸。在一些實(shí)施方式中，試劑盒包括可與固體載體綴合的捕獲探針。在一些實(shí)施方式中，試劑盒包括與固體載體，如96孔板中孔的表面綴合的捕獲探針。在一些實(shí)施方式中，試劑盒包括可與捕獲探針綴合的珠。在一些實(shí)施方式中，試劑盒包括與捕獲探針預(yù)先綴合的珠。在一些實(shí)施方式中，試劑盒進(jìn)一步包括進(jìn)行本文描述的方法中任何一個(gè)的說明書。在一些實(shí)施方式中，試劑盒進(jìn)一步包括陽性或陰性對(duì)照樣品。在一些實(shí)施方式中，試劑盒進(jìn)一步包括針對(duì)生物樣品中對(duì)照核酸的檢測(cè)探針和捕獲延伸劑的對(duì)照組。

實(shí)施例

提供以下實(shí)施例來說明但不是限制本發(fā)明。

實(shí)施例1：針對(duì)來自中國(guó)當(dāng)?shù)鼐用窈蜌w來的旅行者的混合的干血斑中瘧原蟲的靈敏、低成本的活性分子篩選

材料和方法

來自研究組的現(xiàn)場(chǎng)樣品

血涂片和干血斑從2013年5月至10月采集自兩個(gè)組。第一組(n＝505)來自中國(guó)云南秋山(Qiushan)，包括226名當(dāng)?shù)鼐用窈?79名小學(xué)兒童。雖然在過去的6個(gè)月里兩名兒童已被診斷有間日瘧原蟲感染，但是在取樣日該研究中測(cè)試的人沒有顯示瘧疾相關(guān)的癥狀。該組的全血液樣品本采集在EDTA或肝素管中和在-20℃儲(chǔ)存直到實(shí)時(shí)PCR測(cè)試。第二組(n＝2855)來自中國(guó)云南騰沖和安徽肥東，由當(dāng)?shù)鼗颊吆蛷寞懠擦餍协h(huán)境返回的旅行者(n＝560)組成。

采集樣品伴有書面知情同意。倫理批準(zhǔn)由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所倫理審查委員會(huì)授予。

通過能夠連接的PCR檢測(cè)18S rRNA

DBS的3mm直徑穿鑿樣(punched-out)圓在56℃伴隨劇烈震動(dòng)用100μl裂解混合物(中國(guó)北京的Diacurate Inc)、191μl水、3μl探針混合物——檢測(cè)探針1(SEQ ID NO：1)、檢測(cè)探針2(SEQ ID NO：2)、內(nèi)部檢測(cè)探針(SEQ ID NO：3)、捕獲延伸劑1(包括捕獲序列1，SEQ ID NO：4，可操作地連接至與捕獲探針的17個(gè)堿基互補(bǔ)的序列)、捕獲延伸劑2(包括捕獲序列2，SEQ ID NO：5，可操作地連接至與捕獲探針的17個(gè)堿基互補(bǔ)的序列)和捕獲延伸劑3(包括捕獲序列3，SEQ ID NO：6，可操作地連接至與捕獲探針的17個(gè)堿基互補(bǔ)的序列)，每個(gè)對(duì)瘧原蟲某種18S rRNA特異——和3μl蛋白酶K(50mg/ml)裂解30min(混合的血斑作為單個(gè)穿孔(punch)裂解)。然后將裂解物轉(zhuǎn)移至與捕獲探針(瘧疾PAN HT-PCR篩選1.0試劑盒，中國(guó)北京的Diacurate Inc)預(yù)先綴合的96孔板。在55℃過夜溫育之后，每個(gè)孔用150μl洗滌緩沖劑(中國(guó)北京的Diacurate Inc)洗滌3次，然后與50μl連接緩沖劑(中國(guó)北京的Diacurate Inc)在37℃溫育30分鐘。然后將板再次相似地洗滌，和用于實(shí)時(shí)qPCR，25μl/孔PCR混合物——含有1xPremix Ex(Takara,RR820)和100nM引物(PCR引物1，SEQ ID NO：7和PCR引物2，SEQ ID NO：8)。擴(kuò)增和檢測(cè)在Roche LC480II上在以下條件下進(jìn)行：在95℃30s，以及在95℃5s和在60℃20s的45個(gè)循環(huán)。使用默認(rèn)設(shè)置從65℃至90℃制作解鏈曲線(melt curve)。如果Ct<40和解鏈曲線與陽性對(duì)照中的相同，則認(rèn)為樣品為陽性。至少一個(gè)陽性對(duì)照和一個(gè)陰性對(duì)照包括在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中。每個(gè)測(cè)試一式兩份地(in duplicate)進(jìn)行。

通過RDT的診斷

該研究中每個(gè)樣品的RDT測(cè)試根據(jù)制造商的協(xié)議用CARESTART^TM(Accessbio,Monmouth Junction,NJ)進(jìn)行。試劑盒在W.H.O.發(fā)行的RDT采購(gòu)?fù)扑]的名單之中。(W.H.O.,Information note on recommended selection criteria for malaria rapid diagnostic test,http://www.who.int/malaria/diagnosis_treatment/diagnosis/RDT_selection_criteria.pdf)。

通過標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)時(shí)qPCR的診斷

DNA用QIAamp DNA血微型試劑盒(QIAGEN)，根據(jù)制造商的說明書從200μl解凍的血液或干血斑提取。瘧原蟲屬18s rRNA篩選引物、探針序列和實(shí)時(shí)qPCR條件獲自Rougemont et al(Rougemont et al.,J.Clin.Microbiol.42(12):5636-43,2004)。如果Ct大于40，則認(rèn)為樣品是陰性的。對(duì)于每個(gè)實(shí)驗(yàn)，包括至少一個(gè)陽性和一個(gè)陰性樣品。每個(gè)樣品一式兩份地測(cè)試。

混合體大小(Pool size)

為了測(cè)定能夠連接的PCR檢測(cè)混合的干血斑中靶標(biāo)RNA的能力，我們通過將75μl培養(yǎng)的惡性瘧原蟲株3D7(50個(gè)寄生蟲/μl)、或來自健康志愿者的全血在Whatman 3MM濾紙上弄上斑點(diǎn)，和風(fēng)干4小時(shí)，制備了對(duì)照。將直徑3mm的穿孔從陽性對(duì)照惡性瘧原蟲斑點(diǎn)和陰性對(duì)照干血斑移除，1個(gè)陽性對(duì)照穿孔與0、10、20、25或35個(gè)陰性對(duì)照穿孔組合?；旌系拇┛资褂脴?biāo)準(zhǔn)的裂解方案裂解和使用能夠連接的PCR一式兩份地測(cè)試。

應(yīng)用于活性篩選的混合策略

我們采用矩陣混合策略。所有的樣品在n×m矩陣(n＝m或n＝m+1,m由樣品大小決定)中隨機(jī)分布，樣品根據(jù)行和列來混合，混合體通過能夠連接的PCR來測(cè)試。以這種方式，每個(gè)樣品在行混合體中測(cè)試一次和在列混合體中測(cè)試一次。在陽性行和列混合體的交叉處的樣品再單獨(dú)測(cè)試，并且所有其它的宣告為陰性。每個(gè)測(cè)試一式兩份地進(jìn)行。

結(jié)果

能夠連接的PCR的分析性能

我們首先制備了新鮮人紅細(xì)胞培養(yǎng)的惡性瘧原蟲(隔離群3D7)的3倍、11個(gè)點(diǎn)連續(xù)稀釋物，范圍是70p/μl至0.0012p/μl。檢測(cè)限確定為產(chǎn)生陽性結(jié)果的添加到健康人血的最小量的紅細(xì)胞培養(yǎng)的惡性瘧原蟲。測(cè)定給出了約0.01個(gè)寄生蟲/μl的檢測(cè)限，信號(hào)與寄生蟲數(shù)目成比例(R²＝0.996)(圖4，標(biāo)準(zhǔn)曲線)，指示我們的測(cè)定是高度敏感的，和能夠在完整樣品中定量低寄生蟲血癥。采集自健康志愿者的全血液樣品本用作陰性對(duì)照。

在不同溫度儲(chǔ)存的干血斑中瘧原蟲18S rRNA的穩(wěn)定性

我們通過以下模擬了在現(xiàn)場(chǎng)干血斑的采集：將培養(yǎng)的惡性瘧原蟲(50p/μl)以75-μl等分部分在Whatman 903濾紙上弄上斑點(diǎn)，風(fēng)干4小時(shí)，密封在具有干燥劑的塑料袋中，和儲(chǔ)存在室溫、4℃或-20℃直到使用。在第3、6、12和21天，一個(gè)3mm直徑的穿孔從不同儲(chǔ)存的干血斑中的每個(gè)移除和進(jìn)行細(xì)胞裂解。測(cè)試之前將裂解物儲(chǔ)存在-20℃。我們先前的研究指出這樣的裂解物中的RNA在-20℃超過3個(gè)月是穩(wěn)定的(Cheng et al.,J.Clin.Microbiol.51(1)：125-30,2013)。所有的裂解物在第21天通過RNA雜交試驗(yàn)來平行測(cè)定。沒有觀察到顯著的18S rRNA降解(圖5，儲(chǔ)存和信號(hào))。

混合體大小

雖然陽性DBS與陰性DBS的混合沒有顯著減小檢測(cè)信號(hào)(圖6，混合體大小)，但是超過20個(gè)穿孔的混合使得用移液器吸取足夠的裂解物進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)變得困難。大混合體的第二洗脫只給出減小的信號(hào)(圖6，混合體大小)。雖然離心可用于更有效地回收裂解物，但是這可將復(fù)雜性添加至試驗(yàn)和潛在地引起交叉污染。小于20的混合體大小因此被鑒定為最優(yōu)策略。對(duì)于在本研究中進(jìn)行的活性瘧疾篩選，在DBS樣品分批到達(dá)我們的實(shí)驗(yàn)室的情況下，為了提供及時(shí)的診斷結(jié)果，一旦收到足夠的數(shù)量，就測(cè)試樣品以允許15和20之間的混合體大小的矩陣混合策略。

針對(duì)瘧疾的活性篩選

對(duì)于505個(gè)無癥狀個(gè)體的組，使用全血液樣品本，顯微鏡檢查沒有檢測(cè)到任何感染，而RDT檢測(cè)到三個(gè)。使用混合的DBS，LE-PCR檢測(cè)到四個(gè)陽性樣品，不同于通過RDT檢測(cè)的那些(表1)。所有7個(gè)陽性DBS樣品來自兒童。7個(gè)相應(yīng)的全血液樣品也通過標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)時(shí)qPCR來檢測(cè)，給出與能夠連接的PCR相同的結(jié)果。3個(gè)月之后的隨訪和醫(yī)療史回顧也指示能夠連接的PCR診斷比RDT提供的那些診斷更可靠：取樣日之后沒有RDT-陽性兒童顯示瘧疾相關(guān)的癥狀，雖然1個(gè)月之前他們中有一個(gè)具有瘧疾相關(guān)的癥狀，并且取樣之后10天能夠連接的PCR-陽性兒童其中有一個(gè)發(fā)展了瘧疾相關(guān)的癥狀和由當(dāng)?shù)谻DC證實(shí)具有間日瘧原蟲感染。剩下的3個(gè)能夠連接的PCR-陽性兒童在取樣日之后2個(gè)月內(nèi)發(fā)展了瘧疾相關(guān)的癥狀。由于極端受限的當(dāng)?shù)蒯t(yī)療資源，他們轉(zhuǎn)向私人醫(yī)療保健機(jī)構(gòu)進(jìn)行治療，而沒有進(jìn)行任何瘧疾測(cè)試。

表1

對(duì)于第二組受試者，我們檢測(cè)了來自2855個(gè)DBS的10個(gè)感染，其中8個(gè)是返回的旅行者，而2個(gè)是當(dāng)?shù)鼐用瘛＿@些結(jié)果與對(duì)全血樣品的顯微鏡檢查一致。10個(gè)陽性樣品也通過實(shí)時(shí)qPCR測(cè)試：7個(gè)證明是間日瘧原蟲感染，2個(gè)是惡性瘧原蟲感染和1個(gè)是混合感染。

討論

為了努力消除瘧疾，瘧疾監(jiān)測(cè)系統(tǒng)的目的是通過足夠早地檢測(cè)和治療所有的瘧疾感染，不論有癥狀或沒有癥狀的，包括當(dāng)?shù)貍鞑ズ洼斎敫腥?，來停止?dāng)?shù)貍鞑?Cotter et al.,Lancet 382(9895)：900-11,2013；W.H.O.,World Malaria Report 2013)。這使針對(duì)全體有危險(xiǎn)的群體的活性瘧疾篩選而不是傳統(tǒng)的診所被動(dòng)診斷成為必要。W.H.O.最近提出在消除階段，所有的實(shí)驗(yàn)室診斷服務(wù)應(yīng)對(duì)患者免費(fèi)(W.H.O.,Disease Surveillance for malaria elimination:An operational manual,2012)。對(duì)能夠以低成本和高通量方式檢測(cè)非常低水平感染的診斷方法的需求從未如此強(qiáng)烈。

在我們先前的工作中描述的瘧原蟲18S rRNA雜交試驗(yàn)顯示比RDT和標(biāo)準(zhǔn)實(shí)時(shí)qPCR更好的靈敏度和通量(Cheng et al.,J.Clin.Microbiol.51(1)：125-30,2013)，提供在發(fā)達(dá)國(guó)家瘧疾大規(guī)模篩選的理想的備選。然而，對(duì)于大多數(shù)瘧疾消除努力集中的資源有限的地區(qū)，雜交試驗(yàn)的成本可呈現(xiàn)問題。該研究中描述的能夠連接的實(shí)時(shí)qPCR方法通過顯著減少需要的多核苷酸探針的數(shù)目和通過用常用的基于SYBR綠的實(shí)時(shí)qPCR代替昂貴的分支DNA檢測(cè)而具有與先前的RNA雜交試驗(yàn)相比幾乎90％減少的成本，同時(shí)保留檢測(cè)靈敏度和高樣品通量和維持相似的樣品處理工作流程。它能夠以96孔板形式檢測(cè)惡性瘧原蟲的18S rRNA，全血中檢測(cè)閾值低至0.01p/μl，并且不需要RNA純化或反轉(zhuǎn)錄。每個(gè)測(cè)試(包括副本(duplicate))總成本少于2美元，而其它基于RNA/DNA的診斷方法僅僅針對(duì)RNA/DNA制備程序就可花費(fèi)更多。

如本研究所描述的矩陣混合策略的實(shí)行允許成本的進(jìn)一步減少，同時(shí)提高樣品通量。不像更早的利用混合策略的瘧疾測(cè)試(Taylor et al.,J.Clin.Microbiol.48(2):512-9,2010；Hsiang et al.,J.Clinc Microbiol.48(10):3539-43,2010)，當(dāng)與DBS的混合組合時(shí)LE-PCR顯現(xiàn)不犧牲任何靈敏度；針對(duì)多達(dá)36個(gè)的混合體大小，隨著增加與單個(gè)低寄生蟲血癥的樣品混合的陰性樣品的數(shù)目，Ct值保持幾乎恒定。這不是令人驚訝的，因?yàn)殛幮詷悠返幕旌蠜]有減少裂解混合物中陽性樣品的濃度，并且在過夜雜交期間LE-PCR優(yōu)先保持靶向的RNA。脫靶標(biāo)的核酸在PCR模板形成之前被洗掉。以這種方式，每個(gè)混合體中的陰性樣品很少影響陽性樣品的檢測(cè)。

在該研究中，針對(duì)無癥狀的個(gè)體的活性篩選，LE-PCR花費(fèi)少于152美元(包括副本)以從505個(gè)樣品檢測(cè)中到所有4個(gè)感染。低傳播區(qū)域的較大規(guī)模的篩選根據(jù)樣品比率將產(chǎn)生甚至更低的成本，因?yàn)榛旌象w大小可被增加，在更多的樣品當(dāng)中分?jǐn)偯總€(gè)測(cè)試的成本。這在第二組的活性篩選中被證明，在我們的策略使用小于400個(gè)測(cè)試從2855個(gè)DBS中檢測(cè)到10個(gè)感染的情況下，與單獨(dú)測(cè)試每個(gè)樣品相比節(jié)省約86％的成本和勞動(dòng)。

基于PCR的測(cè)試眾所周知需要高水平的專門技術(shù)，以及難以避免的交叉/遺留污染。另一方面，LE-PCR沒有遭受這些問題。我們讓兩個(gè)有很少分子診斷學(xué)經(jīng)驗(yàn)的臨床醫(yī)師培訓(xùn)5天，他們就能夠獨(dú)立地使用矩陣混合策略進(jìn)行LE-PCR。在LE-PCR中污染也是可容易避免的，因?yàn)榘袠?biāo)核酸和PCR模板均錨定到了板底部，直到實(shí)時(shí)qPCR過程開始，并且實(shí)時(shí)qPCR結(jié)束之后板沒有打開就被丟棄。以這種方式，交叉污染和遺留污染均被避免。

當(dāng)使用矩陣混合策略篩選大量樣品時(shí)，在該研究中實(shí)行的LE-PCR變得格外具有時(shí)效性。當(dāng)使用96孔板用ELISA樣工作流程平行測(cè)試樣品時(shí)，在每個(gè)運(yùn)行中數(shù)千樣品可由單個(gè)技師診斷。此外，LE-PCR適合自動(dòng)化，其可進(jìn)一步增加樣品處理能力。

低流行環(huán)境中的亞明顯感染(subpatent infections)可以是所有傳播事件中20–50％的根源(Okell et al.,Nat.Commun.3：1237,2012)。在該研究中，LE-PCR在顯微鏡檢查和RDT均未檢測(cè)到的4名兒童中成功地檢測(cè)到了無癥狀的感染，這些兒童中的一個(gè)在取樣后10天內(nèi)顯示癥狀。如果基于LE-PCR的活性篩選變成每天的常規(guī)，它的3天周轉(zhuǎn)時(shí)間將足以幫助像該兒童的無癥狀患者獲得治療，允許他們避免遭受疾病痛苦和有助于消除其它人重要的感染源頭。

對(duì)沒有瘧疾感染的人開過量抗瘧藥仍然盛行，導(dǎo)致不必要的副作用和增加的抗藥性風(fēng)險(xiǎn)(W.H.O.,World Malaria Report:2014；Sansom,.Lancet Infec.Dis.9(10):596,2009；W.H.O.,WHO informal consultation on fever management in peripheral health care settings:A global review of evidence and practice,2013)。經(jīng)W.H.O.推薦(W.H.O.,WHO informal consultation on fever management in peripheral health care settings:A global review of evidence and practice,2013)，RDT已成功實(shí)行以排除許多寄生蟲陰性的患者免于接受抗瘧藥(W.H.O.,World Malaria Report：2014)。然而，如在本研究所示，RDT不可足以停止抗瘧藥的過量開處方：對(duì)于本研究中的3個(gè)RDT-陽性兒童，通過標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)時(shí)qPCR(Rougemont et al.,J.Clin.Microbiol.42(12):5636-43,2004)、RNA雜交試驗(yàn)(Cheng et al.,J.Clin.Microbiol.51(1):125-30,2013)和LE-PCR，他們被確定為寄生蟲陰性的，指示RDT診斷學(xué)可不足以消除過量開處方。另一方面，LE-PCR顯示0％假陽性率，如通過與使用標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)時(shí)qPCR的診斷相比所測(cè)定的，并且如果作為針對(duì)瘧疾檢測(cè)的常規(guī)活性篩選診斷學(xué)實(shí)行，可顯著減少過量開處方的可能性。

作為全世界瘧疾根除努力的一部分，在資源有限、有危險(xiǎn)的地區(qū)，當(dāng)?shù)貍鞑セ蜉斎氲寞懠哺腥镜蔫b定現(xiàn)在可使用如下的策略進(jìn)行：首先，干血斑由當(dāng)?shù)丶膊】刂茩C(jī)構(gòu)在活性篩選中采集和通過郵件送到中心臨床實(shí)驗(yàn)室；然后實(shí)驗(yàn)室用混合策略使用能夠連接的實(shí)時(shí)qPCR以96孔板形式逐批測(cè)試樣品(單個(gè)運(yùn)行中一個(gè)技師可容易處理對(duì)來自數(shù)千個(gè)個(gè)體的混合樣品的數(shù)百個(gè)試驗(yàn))；陽性樣品在2至3天內(nèi)被鑒定，并且可包括另外的天數(shù)用于使用標(biāo)準(zhǔn)的qPCR證實(shí)和種鑒定；結(jié)果通過網(wǎng)絡(luò)化的快速通訊迅速反饋到當(dāng)?shù)睾椭荼O(jiān)測(cè)機(jī)構(gòu)?？傊苻D(zhuǎn)時(shí)間應(yīng)在一周內(nèi)，提供實(shí)行有效干預(yù)策略的時(shí)間，因此最小化疾病的傳播。

實(shí)施例2：非編碼RNA的特異檢測(cè)

為了監(jiān)測(cè)培養(yǎng)的細(xì)胞中長(zhǎng)的非編碼RNA MALAT的水平，我們首先制備了裂解細(xì)胞的10倍連續(xù)稀釋物，然后使用LE-PCR測(cè)試裂解物。使用34個(gè)細(xì)胞/孔至34400個(gè)細(xì)胞/孔的范圍，試驗(yàn)顯示Ct和細(xì)胞數(shù)之間良好的關(guān)聯(lián)(R²＝0.96，圖1)，證明該試驗(yàn)的定量性質(zhì)。為了測(cè)定該試驗(yàn)的特異性，用對(duì)MALAT(FAM標(biāo)記的)或GAPDH(HEX標(biāo)記的)特異的taqman探針使用針對(duì)MALAT或GAPDH的LE-PCR探針進(jìn)行實(shí)時(shí)qPCR。只有當(dāng)使用MALAT捕獲延伸劑與MALAT taqman探針，或當(dāng)使用GAPDH捕獲延伸劑與GAPDH taqman探針時(shí)檢測(cè)到擴(kuò)增(圖7)。該結(jié)果顯示該試驗(yàn)是高度特異的。還進(jìn)行了使用混合組的探針的MALAT/GAPDH的多重檢測(cè)(數(shù)據(jù)未顯示)。

實(shí)施例3：A/B型流感和副流感病毒1的檢測(cè)

用于檢測(cè)A/B型流感和副流感存在的LE-PCR的閾值使用對(duì)應(yīng)于每個(gè)病毒的體外轉(zhuǎn)錄的RNA的連續(xù)稀釋物如在實(shí)施例1中針對(duì)惡性瘧原蟲所先前描述的那樣來測(cè)定，并發(fā)現(xiàn)為低至每100ul反應(yīng)7528個(gè)IVT-RNA分子(圖8A、8B和8C)。

實(shí)施例4：來自鼻和咽拭子的檢測(cè)

我們還用臨床鼻和咽拭子樣品測(cè)試了LE-PCR。鼻和咽拭子樣本采集自流感患者(n＝13)。樣品使用如實(shí)施例1中所描述的LE-PCR以及通過seeplexTMRV試劑盒(Seegene,Korea)來診斷。我們的LE-PCR試驗(yàn)具有與針對(duì)B型流感的seeplexTMRV試劑盒的結(jié)果80％的一致和針對(duì)A型流感的結(jié)果75％的一致。

實(shí)施例5：LE-PCR的工作流程

LE-PCR包括三個(gè)步驟。第一，樣品處理：干的血液樣品在一步驟中裂解以釋放18S rRNA。第二，PCR模板形成：與樣品裂解物過夜溫育期間，捕獲延伸劑和檢測(cè)探針與瘧原蟲18S核糖體RNA的高度保守區(qū)中的連續(xù)序列雜交；捕獲延伸劑的尾與預(yù)先綴合到96孔板中孔表面的捕獲探針雜交，而檢測(cè)探針的尾提供通用引物結(jié)合部位；未結(jié)合的探針被洗掉，而相鄰彼此雜交的檢測(cè)探針被連接以形成含有通用引物結(jié)合部位的單個(gè)ssDNA。第三，實(shí)時(shí)qPCR：先前步驟中形成的ssDNA連同通用引物用作PCR模板。參見圖9。

序列

檢測(cè)探針1

TGGAAGTATTTTAGACAAATGCTTTCTTTTTGGTCATAGCTGTTTCCTG(SEQ ID NO：1)

檢測(cè)探針2

TGTAAAACGACGGCCAGTTTTTTCGACGGTATCTGATCGTCTTCACT(SEQ ID NO：2)

內(nèi)部檢測(cè)探針

CCCTTAACTTTCGTTCTTGATTAA(SEQ ID NO：3)

捕獲序列1

TCTAAGAATTTCACCTCTGACATCTG(SEQ ID NO：4)

捕獲序列2

GCAGTTGTTCGTCTCCAGAAAA(SEQ ID NO：5)

捕獲序列3

TCGGCATAGTTTATGGTTAAGATTA(SEQ ID NO：6)

PCR引物1

TGTAAAACGACGGCCAGT(SEQ ID NO：7)

PCR引物2

CAGGAAACAGCTATGACC(SEQ ID NO：8)