本申請(qǐng)要求享有2014年4月22日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第61/982,784號(hào)的優(yōu)先權(quán)和權(quán)益，該臨時(shí)申請(qǐng)通過(guò)引用全部并入本文。

背景技術(shù)：

雖然核酸擴(kuò)增方法常見(jiàn)并且眾所周知，但是，很大程度上歸因于存在涉及引物設(shè)計(jì)的困難，核酸擴(kuò)增反應(yīng)仍舊受不可預(yù)測(cè)性和/或不良性質(zhì)的影響。核酸擴(kuò)增的不可預(yù)測(cè)性很大程度上歸因于缺少針對(duì)引物和探針的序列-可預(yù)測(cè)性設(shè)計(jì)參數(shù)，這些引物和探針實(shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)-特定引物進(jìn)行定量評(píng)估并且檢測(cè)對(duì)抗脫靶連接的雜合作用、自身/自身和自身/非-自身二聚作用。實(shí)際上，挑選潛在引物序列的可變性和目標(biāo)核酸序列施加的序列約束性使得經(jīng)驗(yàn)性和系統(tǒng)性考查引物組合的外觀及其效果變得困難。

基于PCR試驗(yàn)的設(shè)計(jì)參數(shù)集中于引物和探針融化溫度，GC(鳥(niǎo)嘌呤和胞嘧啶)含量，引物長(zhǎng)度以及最小化引物和目標(biāo)核酸之外所有核酸的相互作用(參見(jiàn)，例如www.premierbiosoft.com/tech_notes/PCR_Primer_Design.html)。特別地，非常不鼓勵(lì)使用可和自身分子間相互作用的引物(例如引物-二聚體)，因?yàn)檫@樣的引物會(huì)不合需要地影響引物和目標(biāo)核酸分子的相互作用。另外，建議核酸引物的最佳長(zhǎng)度是18到22個(gè)核苷酸，這個(gè)長(zhǎng)度認(rèn)為足夠長(zhǎng)因而具有足夠特異性并且足夠短以使在退火溫度下引物可輕易和模板鏈接。對(duì)于GC含量，推薦GC含量為40％到60％。錯(cuò)誤的是，普通試驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)踐假定當(dāng)所有上述參數(shù)為擴(kuò)增試驗(yàn)的正向和反向引物而同等設(shè)計(jì)時(shí)，也會(huì)證明這兩種引物雜交作用的動(dòng)力學(xué)是相似的。這些常用的設(shè)計(jì)參數(shù)沒(méi)有一個(gè)充分和兩階段寡核苷酸雜交作用的復(fù)雜熱力學(xué)相關(guān)，它們涉及焓、熵、溶劑化作用、最臨近效應(yīng)以及從單鏈到雙鏈雜合階段轉(zhuǎn)換中的氫鍵結(jié)合的變化。而且，即使寡核苷酸雜合作用的兩個(gè)階段模型作為熱力學(xué)算法基礎(chǔ)的用途都被過(guò)度簡(jiǎn)化并且沒(méi)有正確反映實(shí)際情況。因此，滿足所有推薦標(biāo)準(zhǔn)的引物的性質(zhì)依然不可預(yù)測(cè)。

確定一組引物于基本等溫的條件下可預(yù)測(cè)性地?cái)U(kuò)增目標(biāo)核酸的效力的進(jìn)展有減少資源消耗的潛力，包括合成和經(jīng)驗(yàn)性地檢測(cè)大量引物組的精力、時(shí)間和費(fèi)用(例如設(shè)計(jì)多種引物和成對(duì)地篩選多種引物組合)。需要新的參數(shù)和方法以增強(qiáng)和更好預(yù)測(cè)核酸擴(kuò)增反應(yīng)的性能和產(chǎn)率。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

如本文所描述的，本發(fā)明提供了用以設(shè)計(jì)能預(yù)測(cè)性地?cái)U(kuò)增目標(biāo)核酸分子的引物的改良方法以及用這些引物進(jìn)行核酸擴(kuò)增的方法，包括增強(qiáng)擴(kuò)增目標(biāo)核酸分子和/或減少或降低生成隱蔽產(chǎn)物。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了用以擴(kuò)增和檢測(cè)試樣目標(biāo)寡核苷酸的組合物和方法。在具體實(shí)施例中，本發(fā)明的組合物和方法與等溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)相容。

本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種從5’到3’包括第一區(qū)和第二區(qū)的分離的引物寡核苷酸，所述第一區(qū)具有自身-互補(bǔ)序列(從5’到3’包括切口酶識(shí)別序列的反向互補(bǔ)序列)，回文序列以及所述切口酶識(shí)別序列，所述第二區(qū)的長(zhǎng)度是至少16個(gè)核苷酸并且特異性結(jié)合至目標(biāo)核酸分子上的互補(bǔ)區(qū)以形成雙鏈雜合體(具有比涉及第二區(qū)或與第二區(qū)互作用的任意交替結(jié)構(gòu)的ΔG低至少15kcal/mol的ΔG)，其中所述第二區(qū)于3’末端上具有一個(gè)或多個(gè)2’修飾的核苷酸。

本發(fā)明的另一方面提供了一種包括兩種寡核苷酸單體的分離的引物-二聚體，所述兩種寡核苷酸單體從5’到3’包含第一區(qū)和第二區(qū)，所述第一區(qū)具有自身-互補(bǔ)序列(從5’到3’包括切口酶識(shí)別序列的反向互補(bǔ)序列)、回文序列以及切口酶識(shí)別序列，所述第二區(qū)的長(zhǎng)度是16個(gè)核苷酸并且特異性結(jié)合至目標(biāo)核酸分子上的互補(bǔ)區(qū)以形成雙鏈雜合體(具有比涉及所述第二區(qū)或和所述第二區(qū)相互作用的任意交替結(jié)構(gòu)的ΔG低至少15kcal/mol的ΔG)，其中所述第二區(qū)在3’末端具有一個(gè)或多個(gè)2’修飾的核苷酸。

本發(fā)明的另一方面提供了用來(lái)檢測(cè)目標(biāo)核酸分子的分離的寡核苷酸探針，包括：寡核苷酸；熒光報(bào)道物；能從熒光報(bào)道物吸收激發(fā)能的淬滅分子；其中熒光報(bào)道物和淬滅分子共價(jià)地附接于和寡核苷酸相對(duì)的5’端和3’端，其中寡核苷酸包括第一區(qū)(具有大致互補(bǔ)于目標(biāo)核酸序列的核酸序列)和第一區(qū)上游的第二區(qū)5’端以及第一區(qū)下游的第三區(qū)3’端(具有互補(bǔ)于所述第二區(qū)的核酸序列)，其中當(dāng)寡核苷酸未結(jié)合至目標(biāo)核酸分子時(shí)，寡核苷酸能通過(guò)將第二區(qū)和第三區(qū)雜合作用形成莖環(huán)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其中寡核苷酸探針的目標(biāo)序列和第一序列之間的雙鏈雜合體的ΔG比涉及寡核苷酸探針或和寡核苷酸探針相互作用的任意交替結(jié)構(gòu)的ΔG低至少15kcal/mol。

本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了在切割和擴(kuò)展擴(kuò)增反應(yīng)中擴(kuò)增特定產(chǎn)物的方法，該方法包括：在大致等溫條件下，將目標(biāo)核酸分子和聚合酶、兩個(gè)或更多引物(每一個(gè)在目標(biāo)核酸分子上都特異性地連接于互補(bǔ)序列)、切口酶以及可檢測(cè)的多核苷酸探針接觸，其中至少一個(gè)引物從5’到3’包括第一區(qū)和第二區(qū)，所述第一區(qū)具有自身-互補(bǔ)序列(從5’到3’包括切口酶識(shí)別序列的反向互補(bǔ)序列、回文序列和所述切口酶識(shí)別序列)，所述第二區(qū)的長(zhǎng)度是16個(gè)核苷酸并且特異性結(jié)合至目標(biāo)核酸分子上的互補(bǔ)區(qū)以形成雙鏈雜合體(具有比涉及第二區(qū)或和第二區(qū)相互作用的任意交替結(jié)構(gòu)的ΔG低至少15kcal/mol的ΔG，其中第二區(qū)在3’末端具有一個(gè)或多個(gè)2’修飾的核苷酸)；以及生成包含至少一部分目標(biāo)核酸分子的擴(kuò)增子。

本發(fā)明的另一方面提供了在切割和擴(kuò)展擴(kuò)增反應(yīng)中檢測(cè)特定產(chǎn)物的方法，該方法包括：在大致等溫條件下，將目標(biāo)核酸分子與聚合酶、兩個(gè)或更多引物(每一個(gè)在目標(biāo)核酸分子上特異性地連接于互補(bǔ)序列)、切口酶以及可檢測(cè)的多核苷酸探針接觸，其中至少一個(gè)引物從5’到3’包括第一區(qū)和第二區(qū)，所述第一區(qū)包括自身-互補(bǔ)序列(從5’到3’具有切口酶識(shí)別序列的反向互補(bǔ)序列)、回文序列、所述切口酶識(shí)別序列，所述第二區(qū)的長(zhǎng)度是16個(gè)核苷酸并且特異性結(jié)合至目標(biāo)核酸分子上的互補(bǔ)區(qū)以形成雙鏈雜合體(具有比涉及第二區(qū)或和第二區(qū)相互作用的任意交替結(jié)構(gòu)的ΔG低至少15kcal/mol的ΔG，其中第二區(qū)在3’末端具有一個(gè)或多個(gè)2’端修飾的核苷酸)；和生成包含至少一部分目標(biāo)核酸分子的擴(kuò)增子；以及檢測(cè)寡核苷酸探針與目標(biāo)核酸分子或其擴(kuò)增子雜合作用的特定信號(hào)，其中所述信號(hào)表明試樣存在目標(biāo)核酸分子或存在其擴(kuò)增子。

本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了在切斷擴(kuò)增反應(yīng)中擴(kuò)增目標(biāo)序列的試劑盒，該試劑盒包括一個(gè)或多個(gè)引物寡核苷酸(從5’到3’包括第一區(qū)和第二區(qū))，所述第一區(qū)包括自身-互補(bǔ)序列(從5’到3’包括切口酶識(shí)別序列的反向互補(bǔ)序列，回文序列以及所述切口酶識(shí)別序列)，所述第二區(qū)長(zhǎng)度是16個(gè)核苷酸并且特異性結(jié)合至目標(biāo)核酸分子上的互補(bǔ)區(qū)以形成雙鏈雜合體(具有比涉及所述第二區(qū)或和所述第二區(qū)相互作用的任意交替結(jié)構(gòu)的ΔG低至少15kcal/mol的ΔG，其中所述第二區(qū)在3’末端具有一個(gè)或多個(gè)2’修飾的核苷酸)；以及本發(fā)明方法中引物寡核苷酸的使用說(shuō)明。

根據(jù)本文描述的本發(fā)明任意方面，本發(fā)明的相關(guān)方面提供了挑選引物寡核苷酸的方法，包括提供在有形、永久計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)上，用來(lái)執(zhí)行挑選寡核苷酸的方法的計(jì)算機(jī)程序指令。

上述方面的不同實(shí)施例中，第一區(qū)的長(zhǎng)度是12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24個(gè)寡核苷酸。在不同實(shí)施例中，所述第一區(qū)全部自身-互補(bǔ)。上述方面的不同實(shí)施例中，所述第一區(qū)的回文序列的長(zhǎng)度是2、4或6個(gè)核苷酸。上述方面的不同實(shí)施例中，所述第二區(qū)的長(zhǎng)度是16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個(gè)核苷酸。

上述方面的不同實(shí)施例中，交替結(jié)構(gòu)是一個(gè)或多個(gè)部分雙鏈的雜合體，所述一個(gè)或多個(gè)部分雙鏈的雜合體能夠由第二區(qū)自身形成(例如自身-自身引物)、由所述第二區(qū)與第一區(qū)的部分序列(例如異質(zhì)二聚體)形成、由所述第二區(qū)與擴(kuò)增反應(yīng)中的其他寡核苷酸，引物或探針形成，或由所述第二區(qū)與目標(biāo)序列區(qū)外部的部分互補(bǔ)的核酸序列(例如脫靶雜合體)形成。

上述方面的不同實(shí)施例中，寡核苷酸(例如引物寡核苷酸，寡核苷酸單體)的形式是通過(guò)將兩種引物寡核苷酸分子自身-互補(bǔ)的第一區(qū)序列雜合作用形成的同源二聚體(例如引物-二聚體)。在不同實(shí)施例中，同源二聚體具有比涉及所引物寡核苷酸或和引物寡核苷酸相互作用的任意交替結(jié)構(gòu)的ΔG低至少15kcal/mol的ΔG，包括含有引物寡核苷酸的最穩(wěn)定交替結(jié)構(gòu)。在上述方面的不同實(shí)施例中，于25℃和/或一個(gè)大氣壓(atm)(101.3kPa)為核酸確定或計(jì)算自由能(ΔG)(ΔG_25℃)。在上述方面的不同實(shí)施例中，自由能(ΔG)通過(guò)mFold算法確定或計(jì)算。

在上述方面的不同實(shí)施例中，寡核苷酸(例如引物寡核苷酸，寡核苷酸引物)的第二區(qū)包括一個(gè)或多個(gè)2’端修飾的核苷酸，其中2’端變體選自由2’-O-甲基、2’-甲氧基乙氧基、2’-氟代、2’-羥基、2’-烷基、2’-O-[2-(甲氨基)-2-氧乙基]、4’-硫代、4’-CH₂-O-2’-橋、4’-(CH₂)₂-O-2’-橋、2’-LNA和2’-O-(N-氨基甲酸甲酯)組成的組或包括堿基類似物的那些結(jié)構(gòu)。在特定實(shí)施例中，一個(gè)或多個(gè)2’修飾的核苷酸放置在第二區(qū)的3’終端。在其他實(shí)施例中，兩個(gè)或更多個(gè)2’修飾的核苷酸是相鄰的。進(jìn)一步地，在其他實(shí)施例中，相鄰的2’修飾的核苷酸的數(shù)量為2、3、4、5或6。本文描述的任意方面中的不同實(shí)施例中，切口酶是一個(gè)或多個(gè)Nt.BspD6I和Nt.BstNBI。本文描述的任意方面中的不同實(shí)施例中，第一區(qū)里的切口酶識(shí)別序列是5’-GAGTC-3’(切口酶識(shí)別序列的反向互補(bǔ)序列是5’-GAGTC-3’)。本文描述的任意方面中的不同實(shí)施例中，放置寡核苷酸(例如引物寡核苷酸，寡核苷酸單體)具有切口酶的識(shí)別序列以切割第一區(qū)和第二區(qū)之間的磷酸二酯鍵。上述方面的不同實(shí)施例中，聚合酶是桿菌屬或嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶I或活性片段及其衍生物。在特定實(shí)施例中，聚合酶是一個(gè)或多個(gè)Bst DNA聚合酶I，Gst DNA聚合酶I或Gka DNA聚合酶I。

本文描述的任意方面的不同實(shí)施例中，寡核苷酸(例如引物寡核苷酸，寡核苷酸單體)具有包含下述的核酸序列的第一區(qū)：

5’-GACTCN₁N_1’GAGTC-3’；

5’-GACTCN₁N_1’GAGTCN-3’；

5’-N₂GACTCN₁N_1’GAGTCN_2’-3’；

5’-N₂GACTCN₁N_1’GAGTCN_2’N-3’；

5’-N₃N₂GACTCN₁N_1’GAGTCN_2’N_3’-3’；

5’-N₃N₂GACTCN₁N_1’GAGTCN_2’N_3’N-3’；

5’-N₄N₃N₂GACTCN₁N_1’GAGTCN_2’N_3’N_4’-3’；

5’-N₄N₃N₂GACTCN₁N_1’GAGTCN_2’N_3’N_4’N-3’；

5’-N₅N₄N₃N₂GACTCN₁N_1’GAGTCN_2’N_3’N_4’N_5’-3’；

5’-GACTCN₂N₁N_1’N_2’GAGTC-3’；

5’-GACTCN₂N₁N_1’N_2’GAGTCN-3’；

5’-N₃GACTCN₂N₁N_1’N_2’GAGTCN_3’-3’；

5’-N₃GACTCN₂N₁N_1’N_2’GAGTCN_3’N-3’；

5’-N₄N₃GACTCN₂N₁N_1’N_2’GAGTCN_3’N_4’-3’；

5’-N₄N₃GACTCN₂N₁N_1’N_2’GAGTCN_3’N_4’N-3’；

5’-N₅N₄N₃GACTCN₂N₁N_1’N_2’GAGTCN_3’N_4’N_5’-3’；

5’-N₅N₄N₃GACTCN₂N₁N_1’N_2’GAGTCN_3’N_4’N_5’N-3’；和

5’-N₆N₅N₄N₃GACTCN₂N₁N_1’N_2’GAGTCN_3’N_4’N_5’N_6’-3’,

5’-GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTC-3’；

5’-GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCN-3’；

5’-GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCNN-3’；

5’-GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCNNN-3’；

5’-GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCNNNN-3’；

5’-N₄GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCN_4’-3’；

5’-N₄GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCN_4’N-3’；

5’-N₄GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCN_4’NN-3’；

5’-N₄GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCN_4’NNN-3’；

5’-N₅N₄GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCN_4’N_5’-3’；

5’-N₅N₄GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCN_4’N_5’N-3’；

5’-N₆N₅N₄GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCN_4’N_5’N_6’-3’；

5’-N₆N₅N₄GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCN_4’N_5’N_6’N-3’；以及

5’-N₇N₆N₅N₄GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCN_4’N_5’N_6’N_7’-3’,

其中，“N”是任意核苷酸(例如，具有腺嘌呤(A)，胸腺嘧啶(T),胞嘧啶(C)或鳥(niǎo)嘌呤(G)核堿基)，并且N₁和N_1’互補(bǔ),N₂和N_2’互補(bǔ),N₃和N_3’互補(bǔ),N₄和N_4’互補(bǔ),N₅和N_5’互補(bǔ),N₆和N_6’互補(bǔ)，以及N₇和N_7’互補(bǔ)。在特定實(shí)施例中，寡核苷酸(例如引物寡核苷酸，寡核苷酸單體)包括含有本文提交的序列列表中列出的序列的5’端尾部區(qū)。

本文描述的任意方面的不同實(shí)施例中，檢測(cè)目標(biāo)核酸分子的寡核苷酸探針包括：寡核苷酸；熒光報(bào)道物；以及能從熒光報(bào)道物中吸收激發(fā)能的淬滅分子；其中熒光報(bào)道物和淬滅分子共價(jià)地附接于和所述寡核苷酸相對(duì)的5’端和3’端，其中寡核苷酸包括具有核酸序列并且大致互補(bǔ)于目標(biāo)核酸序列的第一區(qū)和第一區(qū)上游的第二區(qū)5’端以及第一區(qū)下游并且具有互補(bǔ)于第二區(qū)的核酸序列的第三區(qū)3’端，其中當(dāng)寡核苷酸未結(jié)合至目標(biāo)核酸分子時(shí)，所述寡核苷酸能通過(guò)將第二區(qū)和第三區(qū)雜合形成莖環(huán)發(fā)夾結(jié)構(gòu)。本文描述的任意方面的不同實(shí)施例中，目標(biāo)序列和寡核苷酸探針的第一序列之間的雙鏈雜合體的ΔG比涉及寡核苷酸探針或和寡核苷酸探針相互作用的任意交替結(jié)構(gòu)的ΔG至少低15kcal/mol。在不同的方面，寡核苷酸探針的第二區(qū)和第三區(qū)的長(zhǎng)度是4到8個(gè)核苷酸。

本文描述的任意方面的不同實(shí)施例中，提供了本發(fā)明引物寡核苷酸和/或寡核苷酸探針的使用說(shuō)明。本文描述的任意方面的不同實(shí)施例中，為一起實(shí)施擴(kuò)增和檢測(cè)反應(yīng)而設(shè)計(jì)和/或選擇反應(yīng)中的引物和探針。

通過(guò)詳細(xì)描述以及權(quán)利要求書(shū)，本發(fā)明的其他特征和優(yōu)勢(shì)變得明顯。

定義

“擴(kuò)增子”意指擴(kuò)增受關(guān)注的多核苷酸過(guò)程中生成的多核苷酸。在一個(gè)示例中，聚合酶鏈反應(yīng)過(guò)程中生成了擴(kuò)增子。

“擴(kuò)增速率改良劑”意指可影響聚合酶擴(kuò)展速率的試劑。

“堿基置換”意指將不會(huì)顯著干擾互補(bǔ)核苷酸鏈之間雜合作用的核堿基聚合物置換。

在本公開(kāi)中，“包括(comprises)”，“包括(comprising)”，“含有(containing)”和“具有(having)”及其類似表述具有美國(guó)專利法對(duì)其所描述的意義并且可意指“包含(comprises)”和“包含(comprising)”及其類似表述；“基本上由…….構(gòu)成”或類似“基本上構(gòu)成……”及其類似表述具有美國(guó)專利法所描述的意義并且術(shù)語(yǔ)是開(kāi)放式的，可允許多于所引用表述(只要是基本或新穎的特征)的意義存在，可允許沒(méi)有改變所引用表述的意義存在，可允許多于所引用表述的意義存在，但排除現(xiàn)有技術(shù)的實(shí)施例。

通過(guò)“互補(bǔ)”或“互補(bǔ)性”意指通過(guò)傳統(tǒng)沃森-克里克或胡斯坦堿基配對(duì)核酸可和另一個(gè)核酸序列形成氫鍵。互補(bǔ)堿基配對(duì)不僅包括G-C和A-T堿基配對(duì)，也包括涉及普通堿基(例如肌苷)的堿基配對(duì)。以百分比表示的互補(bǔ)性顯示核酸分子中相鄰殘基的百分?jǐn)?shù)，所述核酸分子可和第二核酸序列(例如第一寡核苷酸里的全部10個(gè)核苷酸中的5、6、7、8、9或10個(gè)核苷酸分別呈現(xiàn)出50％、60％、70％、80％、90％和100％互補(bǔ)性，所述第一寡核苷酸的堿基和具有10個(gè)核苷酸的第二核酸序列配對(duì))形成氫鍵(例如沃森-克里克堿基配對(duì))。為了確定以百分比表示互補(bǔ)性至少是特定的百分?jǐn)?shù)，計(jì)算核酸分子里可和第二核酸序列形成氫鍵(例如沃森-克里克堿基配對(duì))的相鄰殘基的百分?jǐn)?shù)并且取整到最近的整數(shù)(例如第一寡核苷酸里的全部23個(gè)核苷酸中的12、13、14、15、16或17個(gè)核苷酸可分別呈現(xiàn)52％、57％、61％、65％、70％和74％并且分別至少具有50％、50％、60％、60％、70％和70％的互補(bǔ)性，所述第一寡核苷酸的堿基和第二核酸序列配對(duì))。如本文使用的，“大致互補(bǔ)”意指鏈之間的互補(bǔ)性，這樣它們能在生物條件下雜合。大致互補(bǔ)序列具有60％、70％、80％、90％、95％或甚至100％的互補(bǔ)性。另外，通過(guò)檢查它們的核苷酸序列來(lái)確定兩條鏈?zhǔn)欠衲茉谏飾l件下雜合的技術(shù)是所屬領(lǐng)域所熟知的。

如本文使用的，“雙螺旋”意指通過(guò)兩個(gè)單鏈核酸相互作用形成的雙螺旋結(jié)構(gòu)。雙螺旋通常在兩個(gè)相互反向平行的單鏈核酸之間通過(guò)堿基的配對(duì)氫鍵結(jié)合，即“堿基配對(duì)”形成。雙螺旋的堿基配對(duì)通常以沃森-克里克堿基配對(duì)呈現(xiàn)，例如DNA和RNA中鳥(niǎo)嘌呤(G)和胞嘧啶(C)形成堿基配對(duì)，DNA中腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)形成堿基配對(duì)，RNA中腺嘌呤(A)和尿嘧啶(U)形成堿基配對(duì)。形成堿基配對(duì)的條件包括生理或生物相關(guān)條件(例如細(xì)胞內(nèi)：pH值：7.2,140mM鉀離子；細(xì)胞外：pH值：7.4,145mM鈉離子)。進(jìn)一步地，雙螺旋通過(guò)相鄰核苷酸之間的堆積相互作用得以穩(wěn)定。如本文使用的，通過(guò)堿基配對(duì)或堆積相互作用可建立或維持雙螺旋。雙螺旋通過(guò)互補(bǔ)的核酸鏈形成，它們可大致互補(bǔ)或完全互補(bǔ)。和若干堿基進(jìn)行堿基配對(duì)的單鏈核酸就認(rèn)為進(jìn)行了“雜合”。

“探測(cè)”意指鑒定出現(xiàn)、缺失待測(cè)檢測(cè)的分析物或其數(shù)量。

“可檢測(cè)的一部分”意指當(dāng)連接到受關(guān)注分子時(shí)，將靠后的可檢測(cè)的分子經(jīng)由光譜、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)或化學(xué)手段染色的組合物。例如，有用的標(biāo)記物包括放射性同位素、磁珠、金屬珠、膠體粒子、熒光染料、電子致密試劑、酶類(例如在ELISA中通常使用的那些)、生物素、洋地黃毒苷或半抗原。

“片段”意指核酸分子的一部分。優(yōu)選地，這個(gè)部分至少包括參照核酸分子或多肽的全部長(zhǎng)度的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。片段可包括5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100個(gè)核苷酸。

“自由能(ΔG)”意指在公式ΔG＝ΔH-TΔS描述的恒定溫度和壓力下，系統(tǒng)和其環(huán)境之間凈交換的能量。自由能代表形成結(jié)構(gòu)有多有利，其中具有更負(fù)ΔG(例如以kcal/mol表述)的形成結(jié)構(gòu)在多種交替結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)平衡中熱力學(xué)上更加有利。因此，ΔΔG可測(cè)量形成具有不同ΔG的兩種結(jié)構(gòu)之間傾向性的差異。一方面，ΔΔG提供了在動(dòng)態(tài)平衡中測(cè)量形成需要的寡核苷酸結(jié)構(gòu)而不形成其他可能不需要結(jié)構(gòu)的傾向性的數(shù)值計(jì)分。在一個(gè)實(shí)施例中，第一結(jié)構(gòu)是在一個(gè)寡核苷酸的第一區(qū)(5’端尾部區(qū))和第二寡核苷酸(具有和第一寡核苷酸相同的核酸序列)的第一區(qū)(5’端尾部區(qū))之間形成的雙螺旋雜合體；并且第二結(jié)構(gòu)是包括寡核苷酸的任意其他交替結(jié)構(gòu)。

“雜合”意指在不同嚴(yán)格條件下，在互補(bǔ)性多核苷酸序列(例如，本文描述的基因)，或其部分之間形成雙鏈分子。(參見(jiàn)，例如Wahl,G.M.和S.L.Berger(1987)酶學(xué)方法.152:399；Kimmel,A.R.(1987)酶學(xué)方法.152:507)。雜合作用通過(guò)氫鍵結(jié)合呈現(xiàn)，它可為在互補(bǔ)核堿基之間的沃森-克里克，胡斯坦或反向胡斯坦氫鍵結(jié)合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是通過(guò)形成氫鍵而配對(duì)的互補(bǔ)性核堿基。

“核酸雜合體”意指通過(guò)將互補(bǔ)核酸分子結(jié)合而形成的大致雙鏈的分子。在一個(gè)實(shí)施例中，雙鏈的分子是部分或全部雙鏈。

“分離的寡核苷酸”意指在脫除基因的核酸(例如DNA)，它在從本發(fā)明的核酸分子衍生得到的有機(jī)體天然出現(xiàn)的基因組中從兩側(cè)保護(hù)基因。因此，這個(gè)術(shù)語(yǔ)包括，例如，并入載體、自主修復(fù)質(zhì)?；虿《?、原核細(xì)胞或真核細(xì)胞的染色體DNA或作為獨(dú)立于其他序列的獨(dú)立分子(例如，cDNA或PCR或限制性內(nèi)切酶核酸酶消化生成染色體的或cDNA片段)的重組DNA。另外，該術(shù)語(yǔ)包括DNA轉(zhuǎn)錄的RNA分子和重組DNA(一部分編碼額外多肽序列的雜合體基因)。

術(shù)語(yǔ)“分離的”、“純凈的”或“生物學(xué)上純合的”意指組分的變化程度恒定的物質(zhì)，如在其天然態(tài)中發(fā)現(xiàn)的，所述組分通常伴隨所述物質(zhì)?！胺蛛x”表示一定程度上從原始來(lái)源或環(huán)境中分離?！凹兓北硎疽欢ǔ潭壬媳雀綦x更強(qiáng)的分離?！凹儍舻摹被颉吧飳W(xué)上純合的”蛋白質(zhì)充分地脫除了其他物質(zhì)，這樣任何雜質(zhì)都不會(huì)實(shí)質(zhì)性影響蛋白質(zhì)的生物性質(zhì)或?qū)е缕渌焕蠊?。換言之，如果大致不含微孔物質(zhì)、病毒性物質(zhì)、或利用重組DNA技術(shù)生成的培養(yǎng)基、或化學(xué)合成的化學(xué)前體或其他化學(xué)物質(zhì)，本發(fā)明的核酸或肽類就是純凈的。純度和同質(zhì)性通常利用分析化學(xué)技術(shù)(例如凝膠電泳或高效液相色譜法)測(cè)定。術(shù)語(yǔ)“純凈的”可表示核酸或蛋白質(zhì)實(shí)質(zhì)上產(chǎn)生了在凝膠電泳上的一條帶。對(duì)于可進(jìn)行修飾(例如磷酸化或糖基化)的蛋白質(zhì)而言，不同修飾可能會(huì)產(chǎn)生不同分離蛋白質(zhì)，這可分別純化。

“融化溫度(Tm)”意指平衡中系統(tǒng)的溫度，所述平衡中50％分子群體處于一個(gè)狀態(tài)并且50％群體是處于另外的狀態(tài)。對(duì)于本發(fā)明的核酸而言，Tm是50％群體為單鏈并且50％為雙鏈(例如分子內(nèi)或分子間的雙鏈)的溫度。

“監(jiān)測(cè)反應(yīng)”意指檢測(cè)反應(yīng)的進(jìn)程。在一個(gè)實(shí)施例中，監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程包括檢測(cè)聚合酶擴(kuò)展和/或檢測(cè)擴(kuò)增反應(yīng)完成。

如本文使用的，“獲得(obtaining)試劑”里的“獲得”包括合成、購(gòu)買或用其他方法獲得試劑。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“核酸”意指單鏈或雙鏈形式的脫氧核苷酸、核糖核苷酸或修飾了的核苷酸及其聚合物。這個(gè)術(shù)語(yǔ)包括含有已知核酸類似物或修飾了的骨架殘基或連接的核酸，它們是合成的、天然出現(xiàn)的以及非天然出現(xiàn)的，它們具有和參照核酸相似的結(jié)合性質(zhì)，并且它們以和參照核苷酸相似的方式被新陳代謝。這種類似物的示例包括，但不限定為，2’端修飾的核苷酸(例如2’-O-甲基核糖核苷酸、2’-F核苷酸)。

如本文使用的，“修飾的核苷酸”意指對(duì)核苷、核堿基、戊糖環(huán)或磷酸基進(jìn)行具有一種或更多修飾的核苷酸。例如，修飾的核苷酸排除包括單磷酸腺苷、單磷酸鳥(niǎo)苷、單磷酸尿苷和單磷酸胞苷的核糖核苷酸和包括單磷酸脫氧腺苷、單磷酸脫氧鳥(niǎo)苷、單磷酸脫氧尿苷和單磷酸脫氧胞苷的脫氧核苷酸。變體包括由使用修飾核苷酸的酶(例如甲基轉(zhuǎn)移酶)的修飾生成的、天然出現(xiàn)的那些變體。修飾的核苷酸也包括合成或非天然出現(xiàn)的核苷酸。核苷酸中合成的或非天然出現(xiàn)的變體包括2’-O-甲基、2’-甲氧基乙氧基、2’-氟代、2’-羥基、2’-烷基、2’-O-[2-(甲氨基)-2-氧乙基]、4’-硫代、4’-CH₂-O-2’-橋、4’-(CH₂)₂-O-2’-橋、2’-LNA和2’-O-(N-氨基甲酸甲酯)或包括堿基類似物的那些結(jié)構(gòu)。

“核苷酸加合物”意指必然會(huì)共價(jià)地或以其他方式固定于標(biāo)準(zhǔn)核苷酸堿基的一部分。

“切口酶”意指能識(shí)別和連接到雙鏈的核酸分子的特定結(jié)構(gòu)并且一旦連接到其識(shí)別的特定結(jié)構(gòu)，可破壞單鏈上相鄰核苷酸之間的磷酸二酯鍵，由此在切斷位點(diǎn)之前的終端核苷酸上生成3’-羥基的化學(xué)實(shí)體。在優(yōu)選的實(shí)施例中，3’末端可通過(guò)缺少核酸外切酶的聚合酶而擴(kuò)展。示例性的切斷試劑包括切口酶、RNA酶、DNA酶和過(guò)渡金屬螯合劑。

“回文”意指當(dāng)從一條鏈上的5’端到3’端或互補(bǔ)鏈上的5’端到3’端讀取時(shí)，核酸序列是相同的。完美的回文結(jié)構(gòu)指的是具有相鄰子序列的序列(例如當(dāng)一個(gè)子序列從端到3’端的方向讀取的序列)，它和其他從5’端到3’端的方向讀取子序列相同。

“聚合酶-捕捉分子”意指和阻止或顯著減少多核苷酸模板上的聚合酶前進(jìn)的多核苷酸模板或引物關(guān)聯(lián)的一部分。優(yōu)選地，這部分并入到多核苷酸。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，這部分阻止聚合酶在模板上前進(jìn)。

“聚合酶擴(kuò)展”意指在模板多核苷酸上，將即將進(jìn)入的單體和其結(jié)合對(duì)象進(jìn)行匹配的聚合酶向前運(yùn)動(dòng)。

如本文使用的，“引物-二聚體”意指兩個(gè)單體寡核苷酸引物的二聚體。本發(fā)明的寡核苷酸引物中，5’端尾部區(qū)的單體引物進(jìn)行二聚。

“特定產(chǎn)物”意指將寡核苷酸雜合到互補(bǔ)目標(biāo)序列和隨后介導(dǎo)目標(biāo)序列擴(kuò)展的聚合酶而得到的多核苷酸產(chǎn)物。

“大致等溫條件”意指單一溫度或沒(méi)有顯著變化的狹窄溫度范圍。在一個(gè)實(shí)施例中，在大致等溫條件下進(jìn)行的反應(yīng)在僅變化1℃到5℃(例如以1、2、3、4或5度變化)的溫度下進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施例中，反應(yīng)在使用儀器的操作參數(shù)內(nèi)的單一溫度進(jìn)行。

“參照”意指標(biāo)準(zhǔn)或?qū)φ諚l件。如所屬領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的，合適的參照是為了測(cè)定元素效果而改變?cè)氐臈l件。

“對(duì)象”意指哺乳動(dòng)物，包括但不限制于，人類，非人類動(dòng)物，例如牛、馬、犬類、綿羊或貓。

“目標(biāo)核酸分子”意指待分析的多核苷酸。這樣的多核苷酸可為目標(biāo)序列的正義或反義鏈。術(shù)語(yǔ)“目標(biāo)核酸分子”也意指原始目標(biāo)序列的擴(kuò)增子。

本文提供的范圍理解為速記范圍內(nèi)的所有數(shù)值。例如，1到50的范圍理解為包括任何數(shù)字，數(shù)字的組合或包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50的組的子范圍。

除非特別闡明或從上下文顯而易見(jiàn)，如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“或”理解為包含。除非特別闡明或從上下文顯而易見(jiàn)，如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“一個(gè)(a)”，“一個(gè)(an)”和“那/這些(the)”理解為單數(shù)或復(fù)數(shù)。

除非特別闡明或從上下文顯而易見(jiàn)，如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“大約”理解為在所屬領(lǐng)域正常容忍范圍之內(nèi)，例如2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)平均差之內(nèi)。大約可理解為陳述數(shù)值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％之內(nèi)。除非上下文另有澄清，本文所提供的所有數(shù)值通過(guò)術(shù)語(yǔ)大約修飾。

引用本文定義的任何變量中一系列化學(xué)基團(tuán)包括定義可變型為任何單一基團(tuán)或所列舉的基團(tuán)的組合。本文引用的變型或方面的實(shí)施例包括作為任何單一實(shí)施例或和任何其他實(shí)施例或其部分的組合的實(shí)施例。

本文提供的任何組合物或方法可和一個(gè)或多個(gè)本文提供的任何其他組合物或方法而結(jié)合使用。

附圖說(shuō)明

圖1描述了表示可高效指數(shù)式擴(kuò)增的目標(biāo)核酸分子的鏈置換核酸擴(kuò)增反應(yīng)的機(jī)理。它顯示了目標(biāo)核酸分子(灰色)的3’末端和對(duì)應(yīng)、序列特異性引物(具有3’端識(shí)別區(qū)(紅色)和可進(jìn)行二聚作用(黑色)的“5’端尾部”區(qū))相互作用。對(duì)于目標(biāo)特定擴(kuò)增，3’端識(shí)別區(qū)(紅色)和在序列里互補(bǔ)于并且能特異性雜合到目標(biāo)核酸?；钚詷?gòu)型的引物是通過(guò)兩個(gè)單體引物的5’端尾部區(qū)二聚作用形成的穩(wěn)定同源二聚體(術(shù)語(yǔ)稱為“引物-二聚體”)。在一個(gè)特定實(shí)施例中，引物具有自身-互補(bǔ)的、對(duì)稱翻轉(zhuǎn)的序列。得到的引物-二聚體具有雙鏈的或大致雙鏈的二聚作用區(qū)(黑色)，它相對(duì)于單鏈的識(shí)別區(qū)(紅色)是5’端。換言之，引物(能對(duì)目標(biāo)核酸分子退火)的目標(biāo)特定部分在引物-二聚體暴露為3’端單鏈的區(qū)。反應(yīng)開(kāi)始時(shí)，引物-二聚體的3’端單鏈的部分將目標(biāo)核酸分子退火并且啟動(dòng)目標(biāo)核酸分子的復(fù)制。反應(yīng)過(guò)程中，單體引物通過(guò)聚合酶鏈置換行為、以合成互補(bǔ)鏈從伸展的引物-二聚體中釋放。為了增強(qiáng)擴(kuò)增反應(yīng)的特異性和/或效率，單體引物設(shè)計(jì)為具有(1)5’端尾部區(qū)(含有自身-互補(bǔ)、對(duì)稱或大致對(duì)稱并且能和自身堿基配對(duì)的序列)和(2)3’端識(shí)別區(qū)(在序列里完美地或大致互補(bǔ)于并且能特異性雜合到目標(biāo)核酸分子)。當(dāng)引物-二聚體形成的ΔG較低時(shí)，引物以具有展開(kāi)構(gòu)型的單體呈現(xiàn)的時(shí)間減少到最低。不需要單體引物，因?yàn)樗鼈兛稍诜悄繕?biāo)特異性引物擴(kuò)展反應(yīng)中作為模板或引物，由此生成和/或擴(kuò)增隱蔽物。優(yōu)選地，單體到二聚體的過(guò)渡期“幾乎是瞬間的”或可能像動(dòng)力學(xué)那樣短暫。動(dòng)力學(xué)因素(例如形成引物-二聚體的較低ΔG，高的引物濃度，高二聚體Tm)用來(lái)支持形成引物-二聚體。

圖2描述了表示可低效擴(kuò)增的目標(biāo)核酸的鏈置換核酸擴(kuò)增反應(yīng)的機(jī)理。它顯示了目標(biāo)核酸分子(灰色)的3’末端和對(duì)應(yīng)的序列-特異性引物(紅色和黑色)的相互作用。等溫反應(yīng)(展開(kāi)構(gòu)型的單體引物持續(xù)存在于其中)導(dǎo)致線性非特異性地?cái)U(kuò)增隱蔽物。不支持形成引物-二聚體的引物單體具有，例如，在單體引物(黑色)的5’端部位最少或非自身-互補(bǔ)的序列，這會(huì)導(dǎo)致形成引物-二聚體需要較高的ΔG。由于引物-二聚體和目標(biāo)核酸分子的相互作用驅(qū)動(dòng)退火和擴(kuò)展反應(yīng)，所以形成引物-二聚體可影響合成和/或擴(kuò)增目標(biāo)核酸的效率。在完全或部分展開(kāi)的構(gòu)型中，引物單體可作為非目標(biāo)特異性引物擴(kuò)展反應(yīng)(參見(jiàn)插圖)的模板或引物，這會(huì)導(dǎo)致額外的反應(yīng)失效。當(dāng)單體引物的展開(kāi)構(gòu)型沒(méi)有最少化(例如通過(guò)序列設(shè)計(jì))，單體到二聚體過(guò)渡緩慢，因?yàn)樗皇軣崃W(xué)因素(例如多種二聚體和同時(shí)具有相似ΔG和Tm的部分二聚體構(gòu)型)的支持。

圖3描述阻止形成引物-二聚體的引物結(jié)構(gòu)，例如導(dǎo)致非特異性副產(chǎn)品擴(kuò)增的結(jié)構(gòu)(結(jié)構(gòu)(H)到(J))的結(jié)構(gòu)(A)到(C)或結(jié)構(gòu)(D)到(K)，它們不能進(jìn)行目標(biāo)雜合作用。它顯示了引物(紅色和黑色)核酸片段(灰色)之間的相互作用。結(jié)構(gòu)(A)描述了在目標(biāo)特異性區(qū)里具有非連續(xù)反向序列的引物單體，它能向后“成環(huán)”以形成可擴(kuò)展的3’末端以進(jìn)行“自身-復(fù)制”。結(jié)構(gòu)(A)也具有在自身上向后成環(huán)的5’端區(qū)。結(jié)構(gòu)(B)描述了在引物的目標(biāo)特異性區(qū)具有非連續(xù)反向序列的引物-二聚體，它能向后“成環(huán)”以形成可擴(kuò)展的3’末端以進(jìn)行“自身-復(fù)制”。結(jié)構(gòu)(C)描述了“展開(kāi)”構(gòu)型里的引物單體和單鏈的DNA片段(灰色)(以DNA聚合酶切斷擴(kuò)展反應(yīng)以緊密放置的隨機(jī)行為和/或模板DNA中的序列-特異性缺口而取代)之間的偽雜合體結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)(D)描述了部分雙鏈的二聚體結(jié)構(gòu)，其中目標(biāo)特異性區(qū)的重要部分不易進(jìn)行目標(biāo)雜合作用?？赏ㄟ^(guò)引物單體的反向序列復(fù)制形成結(jié)構(gòu)(D)。結(jié)構(gòu)(E)描述了從結(jié)構(gòu)(A)生成的，過(guò)渡的、偽引物擴(kuò)展/鏈置換的反應(yīng)產(chǎn)物。結(jié)構(gòu)(G)描述了從結(jié)構(gòu)(B)生成的，過(guò)渡的、偽引物擴(kuò)展/鏈置換的反應(yīng)產(chǎn)物。結(jié)構(gòu)(H)描述了“切口&凹底”模式的成熟的、偽反應(yīng)產(chǎn)物，導(dǎo)致出現(xiàn)連續(xù)性循環(huán)并且擴(kuò)增單鏈副產(chǎn)品。結(jié)構(gòu)(J)描述了“切口&凹底”模式的成熟的、偽反應(yīng)產(chǎn)物，導(dǎo)致出現(xiàn)連續(xù)性循環(huán)并且進(jìn)行擴(kuò)增單鏈副產(chǎn)品。結(jié)構(gòu)(K)描述了反應(yīng)中結(jié)構(gòu)(D)的部分雙鏈的二聚體的持續(xù)性。因?yàn)槟繕?biāo)特異性區(qū)的重要部分不易進(jìn)行目標(biāo)雜合作用，復(fù)制和/或擴(kuò)增阻止或沒(méi)有啟動(dòng)目標(biāo)核酸。根據(jù)跟本發(fā)明的引物設(shè)計(jì)促進(jìn)形成最佳的引物-二聚體，這就導(dǎo)致形成不需要引物結(jié)構(gòu)并且將它們對(duì)目標(biāo)特異性核酸擴(kuò)增的抑制作用最低化。

圖4顯示了理想的(右邊)和不理想的(左邊)的引物結(jié)構(gòu)。由于存在自身-互補(bǔ)序列，本發(fā)明的引物可選擇對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)有利的結(jié)構(gòu)，包括引物-二聚體和/或發(fā)夾。不限于理論，引物二聚體更加穩(wěn)定并且當(dāng)引物在反應(yīng)(例如反應(yīng)開(kāi)始時(shí))中以高濃度存在時(shí)形成，當(dāng)引物濃度降低時(shí)(例如反應(yīng)進(jìn)程開(kāi)始時(shí))，形成發(fā)夾。

圖5描述了非最佳引物的構(gòu)型之間存在動(dòng)力學(xué)平衡時(shí)的不理想的引物構(gòu)型。當(dāng)對(duì)應(yīng)于形成每個(gè)結(jié)構(gòu)的ΔG大約相同(即ΔG₁≈ΔG₂≈ΔG₃≈ΔG₄)時(shí)，不存在優(yōu)選的引物構(gòu)型或結(jié)構(gòu)。當(dāng)引物存在于這樣的多種構(gòu)型時(shí)，將其構(gòu)造為促進(jìn)核酸擴(kuò)增反應(yīng)并非最佳。

圖6顯示最佳引物是高度優(yōu)選(即ΔG₁>>ΔG₂)，特別是比下一個(gè)優(yōu)選構(gòu)型(例如當(dāng)引物和自身分子內(nèi)相互作用時(shí))優(yōu)選的二聚體構(gòu)型的引物。這種構(gòu)型和附圖5形成對(duì)照，其中構(gòu)型之間存在動(dòng)態(tài)平衡。引物可設(shè)計(jì)為具有對(duì)核酸擴(kuò)增反應(yīng)有利的穩(wěn)定構(gòu)型和結(jié)構(gòu)，同時(shí)減少或消除形成不理想的引物構(gòu)型和結(jié)構(gòu)。對(duì)于具有5’端尾部二聚作用區(qū)的引物而言，優(yōu)選5’端尾部序列并且比其他結(jié)構(gòu)(ΔG₁≤-30到-62kcal/mol)更加穩(wěn)定。對(duì)于切斷反應(yīng)中的引物，5’端尾部序列大致自身-互補(bǔ)并且對(duì)稱性地反轉(zhuǎn)。這樣的引物可能具有形成分子內(nèi)相互作用(例如發(fā)夾環(huán))的潛力。但是，如引物-二聚體比發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)(具有和ΔG₂相比很低的ΔG₁)更穩(wěn)定所表明的，當(dāng)對(duì)稱性反向序列完全互補(bǔ)時(shí)，這樣的構(gòu)型減少到最低。因此，當(dāng)引物的濃度足夠高時(shí)，沒(méi)有有效地形成發(fā)夾。

圖7描述了在切斷擴(kuò)增反應(yīng)中有用的引物中的穩(wěn)定引物-二聚體結(jié)構(gòu)序列。圖7描述了具有5’端尾部區(qū)(具有頂鏈切口酶(Nt.BstNBI)的切口酶識(shí)別序列)的引物二聚體的同源二聚體。切斷位點(diǎn)設(shè)計(jì)為放置在5’端尾部區(qū)上3’末端的核苷酸和3’端識(shí)別區(qū)的5’末端的核苷酸之間。不限于理論，當(dāng)3’端識(shí)別區(qū)是單鏈時(shí)，切口酶沒(méi)有在切斷位點(diǎn)切割。但是，當(dāng)3’端識(shí)別區(qū)是雙鏈時(shí)(例如，核酸擴(kuò)增反應(yīng)過(guò)程中引物并入到雙鏈目標(biāo)核酸分子時(shí))，在切斷位點(diǎn)出現(xiàn)切割。

圖8A-8C描述了示例性5’端尾部區(qū)的序列。圖8A描述了長(zhǎng)度是24個(gè)核苷酸的5’端尾部區(qū)，它具有Nt.BstNBI識(shí)別序列并且基于下述公式：5’-NNNNGACTCNNNNNNGAGTCNNNN-3’。根據(jù)這個(gè)公式，有537,824個(gè)5’端尾部區(qū)，它們具有下述性質(zhì)：ΔG＝-34.2kcal/mole到-65kcal/mole；ΔΔG<-40kcal/mole；并且GC含量是68％到84％。當(dāng)然，提供了1050個(gè)選擇的序列，代表了全部序列空間(248,832)的0.2％。圖8B描述了長(zhǎng)度是22個(gè)核苷酸的示例性5’端尾部區(qū)序列，它具有Nt.BstNBI識(shí)別序列并且基于下述公式：5’-NNNNGACTCNNNNGAGTCNNNN-3’。根據(jù)這個(gè)公式，有248,832個(gè)5’端尾部序列，它們具有下述性質(zhì)：ΔG＝-47kcal/mole到-55kcal/mole；ΔΔG<-40kcal/mole；并且GC含量是72％到82％。當(dāng)然，提供了200個(gè)選擇的序列，代表了全部序列空間(248,832)的0.08％。圖8C描述了具有6個(gè)核苷酸間隔區(qū)的示例性5’端尾部區(qū)序列。

圖9是顯示利用本發(fā)明引物進(jìn)行引物特異性核酸擴(kuò)增(具有如DNA擴(kuò)增雙通道檢測(cè)所檢測(cè)的5’端尾部和3’端識(shí)別區(qū))的圖表。目標(biāo)特異性產(chǎn)品通過(guò)分子信標(biāo)探針(頂面板)檢測(cè)。非特異性核酸擴(kuò)增利用SYBRGreen檢測(cè)。如兩個(gè)圖表中所顯示的，在大約6分鐘時(shí)開(kāi)始指數(shù)擴(kuò)增，這表明擴(kuò)增是目標(biāo)特異性的。不具有輸入的對(duì)照反應(yīng)沒(méi)有產(chǎn)生實(shí)質(zhì)上的隱蔽物。

圖10是表明利用本發(fā)明的引物(具有5’端尾部和3’端識(shí)別區(qū))的核酸擴(kuò)增具有對(duì)快速檢測(cè)目標(biāo)核酸有用的特征的圖表。這樣的反應(yīng)的特征在于高信噪比([RFU_MAX-RFU_BL])、斜率([RFU_MAX-RFU_BL]/[T_OSEA-T_RFUmax]的高數(shù)值)、較早開(kāi)始指數(shù)擴(kuò)增階段(T_OSEA<10min)以及相同試樣的復(fù)制試驗(yàn)反應(yīng)之間的較低信號(hào)差異。

圖11是根據(jù)它們相對(duì)穩(wěn)定性描繪的生效和失效的試驗(yàn)引物的圖表。觀察到具有3’端識(shí)別序列(ΔΔG≤大約-16kcal/mole)的引物在切斷擴(kuò)增反應(yīng)中生效，同時(shí)引物(ΔΔG>大約-16kcal/mole)易于失效。觀察到具有3’端識(shí)別區(qū)(ΔΔG≤大約-16kcal/mole)和5’端尾部(ΔΔG≤大約-30kcal/mole)的引物生效了。

圖12描述了對(duì)來(lái)自一對(duì)預(yù)測(cè)的最佳引物結(jié)構(gòu)的大豆凝集素的等溫DNA擴(kuò)增試驗(yàn)，和單一預(yù)測(cè)而不用篩選性能不知的大量待選引物組合的最佳探針的設(shè)計(jì)。

圖13是描述了大豆凝集素的等溫DNA擴(kuò)增試驗(yàn)的第一試驗(yàn)性嘗試結(jié)果的圖表，它經(jīng)驗(yàn)性地確認(rèn)了對(duì)試驗(yàn)性能的預(yù)測(cè)。在包含大豆基因組DNA的反應(yīng)中觀察到目標(biāo)特異性擴(kuò)增。在沒(méi)有目標(biāo)對(duì)照的反應(yīng)中沒(méi)有觀察到擴(kuò)增。

圖14描述了對(duì)來(lái)自一對(duì)預(yù)測(cè)的最佳引物結(jié)構(gòu)的致病性沙門氏菌invA基因的等溫DNA擴(kuò)增試驗(yàn)和單一預(yù)測(cè)而不用篩選性能不知的大量待選引物組合的最佳探針的設(shè)計(jì)。

圖15是描述了致病性沙門氏菌invA基因的等溫DNA擴(kuò)增試驗(yàn)的第一試驗(yàn)性嘗試結(jié)果的圖表，它經(jīng)驗(yàn)性地確認(rèn)了對(duì)試驗(yàn)性能的預(yù)測(cè)。在包含大豆基因組DNA的反應(yīng)中觀察到目標(biāo)特異性擴(kuò)增。在無(wú)目標(biāo)對(duì)照的反應(yīng)中沒(méi)有觀察到擴(kuò)增。

圖16包括因沙門氏菌invA基因輕易地優(yōu)化而顯示等溫DNA擴(kuò)增試驗(yàn)的兩個(gè)圖表。

圖17A到17I顯示引物結(jié)構(gòu)參數(shù)(Tm,％GC,bp長(zhǎng)度,ΔG_25℃,ΔΔG_25℃)集群分析。圖17A是描繪生效試驗(yàn)引物和失效試驗(yàn)引物的第一引物區(qū)(5’-尾部)自身-自身二聚體的ΔΔG(kcal/mol)對(duì)第二引物區(qū)/目標(biāo)雜合雙螺旋的ΔΔG(kcal/mol)的圖表。生效試驗(yàn)引物和失效試驗(yàn)引物的集群顯示了和功能/非功能的聯(lián)系。圖17B是描繪生效試驗(yàn)引物和失效試驗(yàn)引物的第二引物目標(biāo)-互補(bǔ)區(qū)的堿基表示的長(zhǎng)度對(duì)第二引物目標(biāo)-互補(bǔ)區(qū)的％GC含量的圖表。生效試驗(yàn)引物和失效試驗(yàn)引物顯示出隨機(jī)分布。圖17C是描繪生效試驗(yàn)引物和失效試驗(yàn)引物的第二引物目標(biāo)-互補(bǔ)區(qū)的堿基表示的長(zhǎng)度對(duì)第二引物區(qū)/目標(biāo)雜合雙螺旋的ΔG(kcal/mol)的圖表。生效試驗(yàn)引物和失效試驗(yàn)引物顯示出隨機(jī)分布。圖17D是描繪生效試驗(yàn)引物和失效試驗(yàn)引物的第二引物區(qū)/目標(biāo)雜合雙螺旋的Tm(℃)對(duì)第二引物區(qū)/目標(biāo)雜合雙螺旋的圖表。生效試驗(yàn)引物和失效試驗(yàn)引物顯示其和功能/非功能沒(méi)有關(guān)系。圖17E是描繪生效試驗(yàn)引物和失效試驗(yàn)引物的最優(yōu)選第二引物區(qū)/脫靶雜合雙螺旋的ΔG(kcal/mol)對(duì)引物區(qū)/目標(biāo)雜合雙螺旋ΔG(kcal/mol)的圖表。生效試驗(yàn)引物和失效試驗(yàn)引物顯示出隨機(jī)分布。圖17F是描繪了生效試驗(yàn)引物和失效試驗(yàn)引物的第二引物區(qū)的％GC含量對(duì)第二引物區(qū)/目標(biāo)雜合雙螺旋的Tm(℃)的圖表。生效試驗(yàn)引物和失效試驗(yàn)引物顯示出隨機(jī)分布。圖17G是描繪生效試驗(yàn)引物和失效試驗(yàn)引物的第二引物區(qū)的％GC含量對(duì)第二引物區(qū)/目標(biāo)雜合雙螺旋的ΔG(kcal/mol)的圖表。生效試驗(yàn)引物和失效試驗(yàn)引物顯示出隨機(jī)分布。圖17H是描繪生效試驗(yàn)引物和失效試驗(yàn)引物的第二引物區(qū)的％GC含量對(duì)第二引物區(qū)/目標(biāo)雜合雙螺旋的Tm(℃)的圖表。生效試驗(yàn)引物和失效試驗(yàn)引物顯示出隨機(jī)分布。圖17I是描繪生效試驗(yàn)引物和失效試驗(yàn)引物的引物(3’端識(shí)別區(qū))的堿基表示的長(zhǎng)度對(duì)引物-目標(biāo)雜合雙螺旋的Tm(℃)的圖表。生效試驗(yàn)引物和失效試驗(yàn)引物顯示出隨機(jī)分布。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明涉及對(duì)引物的可預(yù)測(cè)設(shè)計(jì)有益的方法以及利用這樣的引物在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中的目標(biāo)核酸分子進(jìn)行擴(kuò)增的方法。該組合物和方法對(duì)核酸擴(kuò)增反應(yīng)(包括切斷擴(kuò)增反應(yīng))中的目標(biāo)核酸分子擴(kuò)增和檢測(cè)也有益。

本發(fā)明至少部分基于涉及核酸擴(kuò)增反應(yīng)中使用的寡核苷酸的若干發(fā)現(xiàn)，包括引物和探針以及它們?cè)鰪?qiáng)或?qū)崿F(xiàn)核酸擴(kuò)增反應(yīng)的效果。申請(qǐng)人首先理解的是這些發(fā)現(xiàn)的一個(gè)或多個(gè)組合可應(yīng)用于設(shè)計(jì)核酸擴(kuò)增反應(yīng)和/或檢測(cè)試驗(yàn)使用的引物和探針。

本發(fā)明至少部分基于在特定構(gòu)型中寡核苷酸(例如引物和探針)具有增強(qiáng)核酸擴(kuò)增反應(yīng)性能的潛力以及能通過(guò)檢查需要的特異性寡核苷酸-目標(biāo)序列雜合體和不同非特異性分子內(nèi)(部分雙鏈的單體)和寡核苷酸的分子間絡(luò)合物(引物-引物和引物-探針二聚體，脫靶雜合體)之間自由能變化(ΔG)差異的能力(寡核苷酸選擇優(yōu)選構(gòu)型)的發(fā)現(xiàn)。迄今為止，設(shè)計(jì)引物和探針將目標(biāo)特異性和非特異性引物和探針結(jié)構(gòu)之間自由能的差異作為排名工具以鑒別對(duì)目標(biāo)序列擴(kuò)增試驗(yàn)最適合的引物。應(yīng)用上述引物設(shè)計(jì)的考量需要設(shè)計(jì)可預(yù)測(cè)性發(fā)揮功能(減少或消除經(jīng)驗(yàn)性測(cè)試的需要)的引物。因此，本發(fā)明提供了選擇引物序列、引物修飾和/或探針設(shè)計(jì)(促進(jìn)可操作性的核酸擴(kuò)增和檢測(cè)反應(yīng))的方法。

申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)含有3’端序列(形成引物-目標(biāo)穩(wěn)定(例如G_25℃≤大約-20kcal/mol或更多))的引物具有增強(qiáng)核酸擴(kuò)增反應(yīng)性能。在特定實(shí)施例中，3’端目標(biāo)識(shí)別序列包括12到24、12到17或12到14個(gè)堿基。在特定實(shí)施例中，形成引物-目標(biāo)比形成自身二聚體(例如ΔΔG≤大約-15、-16、-17、-18、-19、-20kcal/mol)更加穩(wěn)定。實(shí)際上，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了生效和不生效試驗(yàn)之間的差異在ΔΔG<大約-15kcal/mol(參見(jiàn)，例如附圖11)時(shí)出現(xiàn)。

另外，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)具有5’端尾部區(qū)(能進(jìn)行自身二聚作用)的引物會(huì)增強(qiáng)核酸擴(kuò)增反應(yīng)性能。不限于理論，在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中，引物將將目標(biāo)核酸退火成為引物-二聚體(參見(jiàn)，例如附圖1)。令人驚奇并且意外的是，這種引物-二聚體構(gòu)型沒(méi)有可檢測(cè)性地干擾聚合酶活性并且減少或阻止引物5’端部分和自身或其他核酸分子進(jìn)行非特異性的相互作用。5’端尾部區(qū)包括完美的回文序列，它可通過(guò)單體引物二聚作用形成。例如，引物具有位于5’末端的切斷試劑識(shí)別位點(diǎn)(和目標(biāo)識(shí)別序列的引物結(jié)合特異性相關(guān))。從非特異性引物相互作用得到非特異性隱蔽產(chǎn)品具有隔絕反應(yīng)組分(本來(lái)是用在特定產(chǎn)品的擴(kuò)增)的潛力。在不同實(shí)施例中，形成同源二聚體是穩(wěn)定的(例如G_25℃≤大約-30、-35、-40、-45、-50、-55、-60kcal/mol或更多)。在不同的實(shí)施例中，同源二聚體具有比擴(kuò)展反應(yīng)溫度更高的融化溫度。在特定實(shí)施例中，5’端尾部區(qū)具有回文的結(jié)構(gòu)。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，5’端尾部區(qū)的長(zhǎng)度是至少20個(gè)堿基(例如20、21、22、23、24個(gè)堿基)。在另外的實(shí)施例中，5’端尾部區(qū)的GC含量是80％到90％。在特定實(shí)施例中，形成同源二聚體比形成其他穩(wěn)定性差一些的引物二聚體構(gòu)型(ΔΔG≤大約-15、-20、-25、-30、-35、-40kcal/mol或更多)更加穩(wěn)定。

進(jìn)一步地，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)在3’端識(shí)別區(qū)的3’末端上包括2’端修飾(例如2’-O-甲基,2’-氟,2’-烷基)的核苷酸的引物會(huì)減少或消除非特異性隱蔽產(chǎn)品。這就增加了核酸擴(kuò)增反應(yīng)中生成特定產(chǎn)品而不生成隱蔽產(chǎn)品的情況。在不同實(shí)施例中，3’端識(shí)別區(qū)的一個(gè)或多個(gè)核苷酸包括可動(dòng)搖錯(cuò)配堿基對(duì)的修飾了的核堿基。在特定實(shí)施例中，當(dāng)位置1位于3’終端的核苷酸時(shí)，修飾了的核堿基位于兩個(gè)或更多連續(xù)核苷酸上(從3’終端，于位置1、2、3、4、5或6開(kāi)始)。在特定實(shí)施例中，不少于8個(gè)以及不多于10個(gè)未修飾的核苷酸放置于3’端識(shí)別區(qū)的第一5’端核苷酸和最近3’端修飾的核苷酸之間。

在特定實(shí)施例中，引物包括3’端識(shí)別區(qū)和5’端尾部二聚作用區(qū)。在反應(yīng)條件下，單體引物通過(guò)將他們的5’端尾部二聚作用區(qū)結(jié)合進(jìn)行二聚以形成引物-二聚體。不限于理論，引物-二聚體的單鏈3’端識(shí)別區(qū)將目標(biāo)核酸分子退火并且合成互補(bǔ)目標(biāo)鏈。通過(guò)合成互補(bǔ)鏈進(jìn)行聚合酶鏈置換，單體引物從擴(kuò)展鏈中釋放。釋放的單體引物通過(guò)和5’端尾部區(qū)結(jié)合和另一個(gè)自由單體進(jìn)行二聚作用。多個(gè)循環(huán)實(shí)現(xiàn)了指數(shù)目標(biāo)核酸擴(kuò)增。

引物設(shè)計(jì)

引物設(shè)計(jì)的常規(guī)方法集中于引物融化溫度、引物退火溫度、GC(鳥(niǎo)嘌呤和胞嘧啶)含量、引物長(zhǎng)度以及最小化引物和目標(biāo)核酸以外所有核酸(參見(jiàn)，例如www.premierbiosoft.com/tech_notes/PCR_Primer_Design.html)的相互作用。和這些方法相反，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)形成穩(wěn)定引物/二聚體并以術(shù)語(yǔ)形成自由能(ΔG)表述的引物在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中可預(yù)測(cè)性地發(fā)揮作用。雖然自由能(ΔG)和融化溫度(Tm)具有相同主要成分焓(ΔH)和熵(ΔS)，但是得到了不同ΔG和Tm數(shù)值并且它們沒(méi)有相關(guān)聯(lián)系，將給出ΔG和給出Tm關(guān)聯(lián)的唯一方法是從得到它們的地方(曼迪,“mFold,Delta G,和融化溫度”和2011整合DNA技術(shù))明確了解ΔH和ΔS的數(shù)值。圖1到11涉及最佳引物的設(shè)計(jì)。

可利用所屬領(lǐng)域的公式計(jì)算分子間引物結(jié)構(gòu)的形成自由能(ΔG)。大量的程序可用來(lái)確定形成了不同分子內(nèi)和分子間引物結(jié)構(gòu)和計(jì)算它們的ΔG，包括，例如mfold和UNAfold預(yù)測(cè)算法(參見(jiàn)，例如，Markham和Zucker.UNAFold：核酸折疊和雜合作用軟件.生物信息學(xué)：第2卷，第1章，3到31頁(yè),Humana出版社.,2008；Zucker等。RNA次級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的算法和熱力學(xué)：RNA生物化學(xué)和生物技術(shù)的實(shí)用手冊(cè)，11到43，NATO ASI系列，Kluwer學(xué)術(shù)出版社，1999；M,Zucker.利用能量最低化預(yù)測(cè)RNA次級(jí)結(jié)構(gòu).《分子生物學(xué)方法》，267到294,1994；Jaeger等。預(yù)測(cè)RNA最佳和次佳二級(jí)結(jié)構(gòu)。分子進(jìn)化：蛋白質(zhì)和核酸序列的計(jì)算機(jī)分析，《酶學(xué)方法》183，281到306，1990；Zucker。關(guān)于發(fā)現(xiàn)所有次佳的RNA分子折疊?？茖W(xué)244,48到52，1989)。寡核苷酸分析器3.1利用mfold這樣實(shí)施一個(gè)引物設(shè)計(jì)(www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/)。例如，關(guān)于寡核苷酸分析器3.1，可利用下述參數(shù)計(jì)算ΔG：目標(biāo)類型：DNA；寡核苷酸濃度0.25μM；Na⁺濃度：60mM；Mg⁺⁺濃度：15mM；以及dNTPs濃度:0.3mM。

3’端識(shí)別區(qū)

本發(fā)明提供了具有3’端識(shí)別序列(其形成引物-目標(biāo)是穩(wěn)定的并且具有增強(qiáng)核酸擴(kuò)增反應(yīng)性能的潛力)的引物。3’端識(shí)別區(qū)特異性和目標(biāo)核酸結(jié)合，例如目標(biāo)核酸的互補(bǔ)序列。在特定實(shí)施例中，3’端識(shí)別區(qū)具有互補(bǔ)于目標(biāo)核酸序列12、13、14、15、16、17、18、19或20或更多的堿基的序列。在不同實(shí)施例中，引物-目標(biāo)融化溫度等于或高于8℃或比反應(yīng)或試驗(yàn)的擴(kuò)展溫度(Tm≥試驗(yàn)溫度-8℃)低6℃。在特定實(shí)施例中，3’端識(shí)別序列包括12到20，12到17或12到14個(gè)核苷酸。在特定實(shí)施例中，引物-目標(biāo)形成比自身二聚體形成(例如ΔΔG≤大約-15、-16、-17、-18、-19、-20kcal/mol或更多)更加穩(wěn)定。實(shí)際上，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了生效和不生效試驗(yàn)之間的差異存在于ΔΔG<大約-15kcal/mol之時(shí)(參見(jiàn)，例如附圖11)。優(yōu)選地，3’端識(shí)別序列不包括自身-互補(bǔ)序列，短的反向重復(fù)序列(例如,>4個(gè)堿基/重復(fù)序列)，或本來(lái)會(huì)促進(jìn)分子內(nèi)相互作用的序列，它有干擾引物目標(biāo)退火的潛力。

具體地，本發(fā)明具有3’端識(shí)別序列的引物對(duì)切斷擴(kuò)增試驗(yàn)有益。另外，目標(biāo)特異性3’端識(shí)別區(qū)包括一個(gè)或多個(gè)2’端修飾的核苷酸(例如2’-O-甲基、2’-甲氧基乙氧基、2’-氟代、2’-羥基、2’-烷基、2’-O-[2-(甲氨基)-2-氧乙基]、4’-硫代、4’-CH₂-O-2’-橋、4’-(CH₂)₂-O-2’-橋、2’-LNA和2’-O-(N-氨基甲酸甲酯))。不限于理論，假設(shè)一個(gè)或多個(gè)2’端修飾的核苷酸并入識(shí)別序列會(huì)減少或消除引物的分子間和/或分子間相互作用(例如引物-二聚體形成)以及由此減少或消除了等溫?cái)U(kuò)增中的隱蔽信號(hào)。2’端修飾的核苷酸優(yōu)選具有和目標(biāo)序列堿基配對(duì)的堿基。在特定實(shí)施例中，目標(biāo)特異性識(shí)別區(qū)的兩個(gè)或更多2’端修飾的核苷酸(例如2、3、4、5或更多的2’端修飾的核苷酸)是連續(xù)的。在一些實(shí)施例中，在目標(biāo)特異性識(shí)別區(qū)的3’末端上對(duì)2’端修飾的核苷酸進(jìn)行封阻。在其他實(shí)施例中，在目標(biāo)特異性識(shí)別區(qū)的5’末端上對(duì)2’端修飾的核苷酸進(jìn)行封阻。當(dāng)在目標(biāo)特異性識(shí)別區(qū)的5’末端上對(duì)2’端修飾的核苷酸進(jìn)行封阻，可利用一個(gè)會(huì)或更多未修飾的核苷酸(例如2、3、4、5或更多的2’端修飾的核苷酸)從切斷位點(diǎn)上分離的2’端修飾的核苷酸。申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)定位一個(gè)或多個(gè)2’端修飾的核苷酸或?qū)?’端修飾的核苷酸進(jìn)行封阻改變了擴(kuò)增的動(dòng)力學(xué)。當(dāng)一個(gè)或多個(gè)2’端修飾的核苷酸或?qū)?’端修飾的核苷酸進(jìn)行封阻定位于或接近于識(shí)別區(qū)的5’末端或鄰近切斷位點(diǎn)時(shí)，實(shí)時(shí)擴(kuò)增反應(yīng)顯示檢測(cè)的時(shí)間增加。另外，信號(hào)曲線縮短了并且曲線斜率改變了。

在相關(guān)實(shí)施例中，具有一個(gè)或多個(gè)2’端修飾的核苷酸的引物的比例可用來(lái)改變檢測(cè)時(shí)間和/或調(diào)諧反應(yīng)的效率，實(shí)現(xiàn)了對(duì)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的可預(yù)測(cè)性控制。增加在識(shí)別捕獵的3’末端具有一個(gè)或多個(gè)2’端修飾的核苷酸的引物和在識(shí)別捕獵的5’末端具有一個(gè)或多個(gè)2’端修飾的核苷酸的引物的比例縮短了信號(hào)曲線并且改變了曲線斜率。能調(diào)諧反應(yīng)(提供控制檢測(cè)時(shí)間和反應(yīng)效率的手段)是有利的。調(diào)諧反應(yīng)可用來(lái)在定量PCR(qPCR)中匹配目標(biāo)核酸擴(kuò)增和參照核酸擴(kuò)增的效率。另外，目標(biāo)核酸的擴(kuò)增曲線和內(nèi)標(biāo)可改變，這樣它們的擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)時(shí)間可分離開(kāi)，同時(shí)為目標(biāo)核酸擴(kuò)增和內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增提供相同的效率。通過(guò)使用特定組合和反應(yīng)中的寡核苷酸結(jié)構(gòu)的比例，可創(chuàng)造能實(shí)現(xiàn)能調(diào)諧反應(yīng)性能的條件是有可能的。

5’端尾部二聚作用區(qū)

本發(fā)明提供了具有5’端尾部區(qū)(能自身二聚作用)的引物，它可增強(qiáng)核酸擴(kuò)增反應(yīng)性能。不受限于理論，在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中，引物將目標(biāo)核酸退火成為引物-二聚體(參見(jiàn)，例如附圖1)。例如，切斷擴(kuò)增引物在5’末端具有切斷試劑識(shí)別位點(diǎn)，它和目標(biāo)識(shí)別序列的引物特異性結(jié)合無(wú)關(guān)。來(lái)自非特異性引物相互作用的非特異性隱蔽產(chǎn)品具有隔絕反應(yīng)成分(原本是用作特定產(chǎn)品擴(kuò)增)的潛力。在不同實(shí)施例中，形成同源二聚體穩(wěn)定(例如ΔG≤大約-30、-35、-40、-45、-50、-55、-60kcal/mol或更多)。在不同實(shí)施例中，同源二聚體具有比擴(kuò)展反應(yīng)溫度更高的融化溫度。在特定實(shí)施例中，具有回文的序列。在進(jìn)一步實(shí)施例中，5’端尾部區(qū)的長(zhǎng)度是至少12個(gè)堿基(例如12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24個(gè)堿基)。在另外的實(shí)施例中，5’端尾部區(qū)的GC含量是80％到90％。在特定實(shí)施例中，同源二聚體形成比其他穩(wěn)定性差一些的引物二聚體構(gòu)型形成更加穩(wěn)定(例如ΔΔG≤大約-12、-13、-14、-15、-16、-17、-18、-19、-20、-25、-30、-35、-40kcal/mol或更多)。

具體地，本發(fā)明具有5’端尾部序列的引物對(duì)切斷擴(kuò)增反應(yīng)有益。為了在切斷擴(kuò)增反應(yīng)中使用，5’端尾部區(qū)包括一個(gè)或多個(gè)切斷試劑識(shí)別位點(diǎn)并且5’端尾部區(qū)具有對(duì)稱翻轉(zhuǎn)序列。在一些實(shí)施例中，切斷位點(diǎn)設(shè)計(jì)為在5’端尾部區(qū)的3’末端上的核苷酸和3’端識(shí)別區(qū)的5’末端上的核苷酸之間。不受限于理論，當(dāng)3’端識(shí)別是單鏈時(shí)，切口酶沒(méi)有在切斷位點(diǎn)進(jìn)行切割。但是，當(dāng)3’端識(shí)別區(qū)是單鏈時(shí)(例如當(dāng)核酸擴(kuò)增反應(yīng)過(guò)程中引物并入雙鏈目標(biāo)核酸分子時(shí))，切斷位點(diǎn)出現(xiàn)切割。

不同實(shí)施例中，5’端尾部序列從5’端到3’端包括反向切口酶識(shí)別序列，它可操作性地連接到回文序列(或自身-互補(bǔ)序列)，也可操作性連接到切口酶識(shí)別序列。在特定實(shí)施例中，間隔區(qū)具有偶數(shù)個(gè)核苷酸(例如2、4、6個(gè)等等)。

基于Nt.BstNBI切口酶識(shí)別序列(5’-GAGTC-3’)并且具有2個(gè)核苷酸間隔區(qū)的示例性5’端尾部包括根據(jù)下述公式的核酸序列：

5’-GACTCN₁N_1’GAGTC-3’

其中，“N”是任意核苷酸(例如，具有腺嘌呤(A)，胸腺嘧啶(T),胞嘧啶(C)或鳥(niǎo)嘌呤(G)核堿基)，并且N₁和N_1’互補(bǔ)。

這樣2個(gè)堿基間隔尾部序列的示例性序列包括，例如，根據(jù)下述公式的核酸序列：

5’-GACTCN₁N_1’GAGTC-3’；

5’-GACTCN₁N_1’GAGTCN-3’；

5’-N₂GACTCN₁N_1’GAGTCN_2’-3’；

5’-N₂GACTCN₁N_1’GAGTCN_2’N-3’；

5’-N₃N₂GACTCN₁N_1’GAGTCN_2’N_3’-3’；

5’-N₃N₂GACTCN₁N_1’GAGTCN_2’N_3’N-3’；

5’-N₄N₃N₂GACTCN₁N_1’GAGTCN_2’N_3’N_4’-3’；

5’-N₄N₃N₂GACTCN₁N_1’GAGTCN_2’N_3’N_4’N-3’；and

5’-N₅N₄N₃N₂GACTCN₁N_1’GAGTCN_2’N_3’N_4’N_5’-3’,

其中，“N”是任意核苷酸(例如，具有腺嘌呤(A)，胸腺嘧啶(T),胞嘧啶(C)或鳥(niǎo)嘌呤(G)核堿基)，并且N₁和N_1’互補(bǔ),N₂和N_2’互補(bǔ),N₃和N_3’互補(bǔ),N₄和N_4’互補(bǔ),N₅和N_5’互補(bǔ)等等。

在一些實(shí)施例中，2個(gè)堿基間隔尾部排除包括根據(jù)下述公式的核酸序列的那些核酸序列：

5’-TCGACTCN₁N_1’GAGTCGA-3’；

5’-TCGACTCN₁N_1’GAGTCGAN-3’；

5’-N₂TCGACTCN₁N_1’GAGTCGAN_2’-3’；

5’-N₂TCGACTCN₁N_1’GAGTCGAN_2’N-3’；

5’-GTCGACTCN₁N_1’GAGTCGAC-3’；

5’-GTCGACTCN₁N_1’GAGTCGACN-3’；

5’-N₃N₂TCGACTCN₁N_1’GAGTCGAN_2’N_3’-3’；

5’-N₃GTCGACTCN₁N_1’GAGTCGACN_3’-3’；and

5’-AGTCGACTCN₁N_1’GAGTCGACT-3’,

其中，“N”是任意核苷酸(例如，具有腺嘌呤(A)，胸腺嘧啶(T),胞嘧啶(C)或鳥(niǎo)嘌呤(G)核堿基)，并且N₁和N_1’互補(bǔ),N₂和N_2’互補(bǔ),N₃和N_3’互補(bǔ)等等。

基于Nt.BstNBI切口酶識(shí)別序列(5’-GAGTC-3’)并且具有4個(gè)核苷酸間隔區(qū)的示例性5’端尾部包括根據(jù)下述公式的核酸序列：

5’-GACTCN₂N₁N_1’N_2’GAGTC-3’

其中，“N”是任意核苷酸(例如，具有腺嘌呤(A)，胸腺嘧啶(T),胞嘧啶(C)或鳥(niǎo)嘌呤(G)核堿基)，并且N₁和N_1’互補(bǔ),N₂和N_2’互補(bǔ)。

這樣4個(gè)堿基間隔尾部序列的示例性序列包括，例如，根據(jù)下述公式的核酸序列：

5’-GACTCN₂N₁N_1’N_2’GAGTC-3’；

5’-GACTCN₂N₁N_1’N_2’GAGTCN-3’；

5’-N₃GACTCN₂N₁N_1’N_2’GAGTCN_3’-3’；

5’-N₃GACTCN₂N₁N_1’N_2’GAGTCN_3’N-3’；

5’-N₄N₃GACTCN₂N₁N_1’N_2’GAGTCN_3’N_4’-3’；

5’-N₄N₃GACTCN₂N₁N_1’N_2’GAGTCN_3’N_4’N-3’；

5’-N₅N₄N₃GACTCN₂N₁N_1’N_2’GAGTCN_3’N_4’N_5’-3’；

5’-N₅N₄N₃GACTCN₂N₁N_1’N_2’GAGTCN_3’N_4’N_5’N-3’；和

5’-N₆N₅N₄N₃GACTCN₂N₁N_1’N_2’GAGTCN_3’N_4’N_5’N_6’-3’,

其中，“N”是任意核苷酸(例如，具有腺嘌呤(A)，胸腺嘧啶(T),胞嘧啶(C)或鳥(niǎo)嘌呤(G)核堿基)，并且N₁和N_1’互補(bǔ),N₂和N_2’互補(bǔ),N₃和N_3’互補(bǔ),N₄和N_4’互補(bǔ),N₅和N_5’互補(bǔ)和N₆和N_6’等等。

在一些實(shí)施例中，4個(gè)堿基間隔尾部排除包括根據(jù)下述公式的核酸序列的那些核酸序列：

5’-GACTCGATCGAGTC-3’；

5’-GACTCGATCGAGTCN-3’；

5’-N₁GACTCGATCGAGTCN_1’-3’；

5’-N₁GACTCGATCGAGTCN_1’N-3’；

5’-N₂N₁GACTCGATCGAGTCN_1’N_2’-3’；

5’-N₂N₁GACTCGATCGAGTCN_1’N_2’N-3’；

5’-TCGACTCN₂N₁N_1’N_2’GAGTCGA-3’；

5’-TCGACTCN₂N₁N_1’N_2’GAGTCGAN-3’；

5’-N₃N₂N₁GACTCGATCGAGTCN_1’N_2’N_3’-3’；

5’-N₃N₂N₁GACTCGATCGAGTCN_1’N_2’N_3’N-3’；

5’-N₃TCGACTCN₂N₁N_1’N_2’GAGTCGAN_3’-3’；

5’-N₃TCGACTCN₂N₁N_1’N_2’GAGTCGAN_3’N-3’；

5’-GTCGACTCN₂N₁N_1’N_2’GAGTCGAC-3’；

5’-GTCGACTCN₂N₁N_1’N_2’GAGTCGACN-3’；

5’-N₄N₃N₂N₁GACTCGATCGAGTCN_1’N_2’N_3’N_4’-3’；

5’-N₄N₃TCGACTCN₂N₁N_1’N_2’GAGTCGAN_3’N_4’-3’；

5’-N₃GTCGACTCN₂N₁N_1’N_2’GAGTCGACN_3’-3’；和

5’-AGTCGACTCN₂N₁N_1’N_2’GAGTCGACT-3’,

其中，“N”是任意核苷酸(例如，具有腺嘌呤(A)，胸腺嘧啶(T),胞嘧啶(C)或鳥(niǎo)嘌呤(G)核堿基)，并且N₁和N_1’互補(bǔ),N₂和N_2’互補(bǔ),N₃和N_3’互補(bǔ)等等。

基于Nt.BstNBI切口酶識(shí)別序列(5’-GAGTC-3’)并且具有6個(gè)核苷酸間隔區(qū)的示例性5’端尾部包括根據(jù)下述公式的核酸序列：

5’-GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTC-3’

其中，“N”是任意核苷酸(例如，具有腺嘌呤(A)，胸腺嘧啶(T),胞嘧啶(C)或鳥(niǎo)嘌呤(G)核堿基)，并且N₁和N_1’互補(bǔ),N₂和N_2’互補(bǔ),N₃和N_3’互補(bǔ)。

6個(gè)堿基間隔區(qū)尾部序列的示例性序列包括，例如，根據(jù)下述公式的核酸序列：

5’-GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTC-3’；

5’-GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCN-3’；

5’-GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCNN-3’；

5’-GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCNNN-3’；

5’-GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCNNNN-3’；

5’-N₄GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCN_4’-3’；

5’-N₄GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCN_4’N-3’；

5’-N₄GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCN_4’NN-3’；

5’-N₄GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCN_4’NNN-3’；

5’-N₅N₄GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCN_4’N_5’-3’；

5’-N₅N₄GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCN_4’N_5’N-3’；

5’-N₆N₅N₄GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCN_4’N_5’N_6’-3’；

5’-N₆N₅N₄GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCN_4’N_5’N_6’N-3’；和

5’-N₇N₆N₅N₄GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCN_4’N_5’N_6’N_7’-3’,

其中，“N”是任意核苷酸(例如，具有腺嘌呤(A)，胸腺嘧啶(T),胞嘧啶(C)或鳥(niǎo)嘌呤(G)核堿基)，并且N₁和N_1’互補(bǔ),N₂和N_2’互補(bǔ),N₃和N_3’互補(bǔ),N₄和N_4’互補(bǔ),N₅和N_5’互補(bǔ),N₆和N_6’互補(bǔ)，以及N₇和N_7’互補(bǔ)。

在一些實(shí)施例中，6個(gè)堿基間隔區(qū)尾部排除具有根據(jù)下述公式的核酸序列的那些核酸序列：

5’-GACTCGAN₁N_1’TCGAGTC-3’；

5’-GACTCGAN₁N_1’TCGAGTCN-3’；

5’-N₂GACTCGAN₁N_1’TCGAGTCN_2’-3’；

5’-N₂GACTCGAN₁N_1’TCGAGTCN_2’N-3’；

5’-N₃N₂GACTCGAN₁N_1’TCGAGTCN_2’N_3’-3’；

5’-N₃N₂GACTCGAN₁N_1’TCGAGTCN_2’N_3’N-3’；

5’-TCGACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCGA-3’；

5’-TCGACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCGAN-3’；

5’-N₄N₃N₂GACTCGAN₁N_1’TCGAGTCN_2’N_3’N_4’-3’；

5’-N₄N₃N₂GACTCGAN₁N_1’TCGAGTCN_2’N_3’N_4’N-3’；

5’-N₄GTCGACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCGACN_4’-3’；

5’-GTCGACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCGAC-3’；

5’-GTCGACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCGACN-3’；

5’-N₅N₄N₃N₂GACTCGAN₁N_1’TCGAGTCN_2’N_3’N_4’N_5’-3’；

5’-N₅N₄TCGACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCGAN_4’N_5’-3’；

5’-N₄GTCGACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCGACN_4’-3’；和

5’-AGTCGACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCGACT-3’,

其中，“N”是任意核苷酸(例如，具有腺嘌呤(A)，胸腺嘧啶(T),胞嘧啶(C)或鳥(niǎo)嘌呤(G)核堿基)，并且N₁和N_1’互補(bǔ),N₂和N_2’互補(bǔ),N₃和N_3’互補(bǔ),N₄和N_4’互補(bǔ),N₅和N_5’互補(bǔ)等等。

附圖8E到8E提供了示例性5’端尾部區(qū)序列。長(zhǎng)度是24個(gè)核苷酸并且具有Nt.BstNBI識(shí)別序列的示例性5’端尾部區(qū)序列的可根據(jù)下述模板5’-NNNNGACTCNNNNNNGAGTCNNNN-3’(附圖8A)而生成。基于這種模板，存在具有下述性質(zhì)的537,824個(gè)5’端尾部序列：ΔG＝-48kcal/mole到-62kcal/mole；ΔΔG<-40kcal/mole；并且GC含量是68％到84％。當(dāng)然，提供了1050個(gè)選擇的序列，代表了全部序列空間(248,832)的0.2％。長(zhǎng)度是22個(gè)核苷酸并且具有Nt.BstNBI識(shí)別序列示例性5’端尾部區(qū)序列基于下述模板5’-NNNNGACTCNNNNGAGTCNNNN-3’(附圖8B)?；谶@個(gè)模板，存在具有下述性質(zhì)的248,832個(gè)5’尾部序列：ΔG＝-47kcal/mole到-55kcal/mole；ΔΔG<-40kcal/mole；并且GC含量是72％到82％。當(dāng)然，提供了200個(gè)選擇的序列，代表了全部序列空間(248,832)的0.08％。

核酸擴(kuò)增方法

核酸擴(kuò)增技術(shù)提供了可理解的復(fù)雜生物工藝、檢測(cè)和鑒別的手段以及致病和非致病生物體、法醫(yī)犯罪分析、疾病相關(guān)研究、基因修飾有機(jī)體檢測(cè)事項(xiàng)等的手段。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)是常見(jiàn)的取決于熱循環(huán)的核酸擴(kuò)增技術(shù)，它用來(lái)利用DNA聚合酶擴(kuò)增DNA，它包括重復(fù)加熱和冷卻反應(yīng)(為DNA融化和DNA酶復(fù)制進(jìn)行)的循環(huán)。實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)是在生物試樣中用來(lái)量化給出核酸序列的復(fù)制品數(shù)量的技術(shù)。當(dāng)前，qPCR在反應(yīng)實(shí)始末時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)產(chǎn)品并且將擴(kuò)增情況和對(duì)照試驗(yàn)擴(kuò)增比較，它在每個(gè)反應(yīng)開(kāi)始時(shí)包括已知并且量化的核酸(或核酸和未知測(cè)試核酸的已知相對(duì)比例)。對(duì)照的結(jié)果用來(lái)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，而這通常基于標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)擴(kuò)增曲線的對(duì)數(shù)部分。基于它們的擴(kuò)增曲線(和標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照數(shù)量相比)，這些數(shù)值用來(lái)插入未知物的數(shù)量。

除了PCR，取決于熱力學(xué)循環(huán)的擴(kuò)增系統(tǒng)或等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)存在于，包括，但不限于：切斷擴(kuò)增反應(yīng)、滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)、解旋酶-依賴性擴(kuò)增(HDA)、環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增(LAMP)、鏈置換擴(kuò)增(SDA)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增(TMA)、自給序列復(fù)制(3SR)、基于核酸序列擴(kuò)增(NASBA)、單一引物等溫?cái)U(kuò)增(SPIA)、Q-β復(fù)制酶系統(tǒng)以及重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)。

等溫切斷擴(kuò)增反應(yīng)具有和PCR熱循環(huán)類似之處。如PCR，切斷擴(kuò)增反應(yīng)使用互補(bǔ)于目標(biāo)序列(稱為引物)的寡核苷酸序列。另外，目標(biāo)序列的切斷擴(kuò)增反應(yīng)導(dǎo)致目標(biāo)序列對(duì)數(shù)增加，就像它在標(biāo)準(zhǔn)PCR中一樣。不像標(biāo)準(zhǔn)PCR，切斷擴(kuò)增反應(yīng)等溫地行進(jìn)。在標(biāo)準(zhǔn)PCR中，升高溫度以使得DNA的兩條鏈分離。在切斷擴(kuò)增反應(yīng)中，目標(biāo)核酸序列在存在于測(cè)試試樣的特定切斷位點(diǎn)上進(jìn)行切割。聚合酶浸潤(rùn)切斷位點(diǎn)并且開(kāi)始合成切割目標(biāo)核酸序列(加入的外源DNA)的互補(bǔ)鏈同時(shí)將存在的互補(bǔ)DNA鏈置換。鏈置換復(fù)制工藝不再需要熱鏈分離。此時(shí)，引物分子將加入的外源DNA的置換互補(bǔ)序列退火?，F(xiàn)在聚合酶從引物3’末端擴(kuò)展，為先前的置換鏈生成了互補(bǔ)鏈。第二引物寡核苷酸隨后將新合成的互補(bǔ)鏈退火并且擴(kuò)展以生成DNA雙螺旋，它包括切斷試劑識(shí)別序列。這個(gè)鏈隨后易于通過(guò)聚合酶利用利用后續(xù)鏈置換擴(kuò)展而被切割，這就導(dǎo)致生成DNA(在原始目標(biāo)DNA的兩端上具有切斷位點(diǎn))雙鏈的臨時(shí)擴(kuò)增子。一旦合成這種臨時(shí)擴(kuò)增子，通過(guò)利用線引物分子將置換鏈復(fù)制，分子繼續(xù)指數(shù)擴(kuò)增。另外，通過(guò)在引物模板的切斷位點(diǎn)上重復(fù)切口平移合成行為，擴(kuò)增也從每個(gè)產(chǎn)品分子線性前進(jìn)。結(jié)果是快速增加目標(biāo)信號(hào)的擴(kuò)增；這比通過(guò)PCR熱循環(huán)生成更加快速并且擴(kuò)增時(shí)間少于10分鐘。

切斷試劑依賴性等溫核酸擴(kuò)增試驗(yàn)

本發(fā)明提供了檢測(cè)目標(biāo)核酸分子(在等溫切斷擴(kuò)增試驗(yàn)擴(kuò)增而得)。對(duì)本文描述方法有用的聚合酶能催化并入核苷酸用來(lái)協(xié)同鏈置換行為擴(kuò)展寡核苷酸(例如引物)束縛于目標(biāo)核酸分子中的3’羥基終端和/或雙鏈DNA分子上的切斷位點(diǎn)上的3’羥基終端。這樣的聚合酶也缺少或?qū)嵸|(zhì)減少了5’-3’外切酶行為并且可能包括嗜熱性的這些聚合酶。對(duì)涉及引物(在引物區(qū)上具有2’端修飾的核苷酸(包括6個(gè)3’終端核苷酸))的方法有用的DNA聚合酶包括衍生物和DNA聚合酶I(從嗜熱脂肪芽孢桿菌分離，也分類為嗜熱脂肪芽孢桿菌并且來(lái)自密切聯(lián)系的菌株，隔離群和種類(包括桿菌屬))的變體，這缺少或?qū)嵸|(zhì)上減少了5’-3’外切酶活性并且具有鏈置換活性。示例性聚合酶包括，但不限制于Bst DNA聚合酶I、Gst DNA聚合酶I、Gka DNA聚合酶I的大片段。

對(duì)本發(fā)明描述方法有用的切斷試劑是能在雙鏈核酸分子上識(shí)別和結(jié)合特定結(jié)構(gòu)并且在頂鏈的相鄰核苷酸之間切割磷酸二酯鍵(當(dāng)結(jié)合到其識(shí)別的特定結(jié)構(gòu)時(shí)，其速率實(shí)質(zhì)上比切割底鏈上的結(jié)合核苷酸之間的磷酸二酯鍵的更快)，由此，生成在切斷位點(diǎn)(可利用缺少5’-3’外切酶的鏈置換聚合酶而被擴(kuò)展)之前的終端核苷酸上的自由3’羥基。在本文公開(kāi)的方法的優(yōu)選實(shí)施例中，“切斷試劑”切割頂鏈磷酸二酯鍵的速率接近100％同時(shí)切割底鏈磷酸二酯鍵的速率接近0％。對(duì)本文描述方法有利的切斷試劑可為酶，即可翻轉(zhuǎn)多種底物分子的自身-再生催化劑或以等摩爾比例只翻轉(zhuǎn)單一底物分子的非再生催化劑。

切口酶和雙鏈的DNA并且切割雙鏈雙螺旋的一條鏈。本發(fā)明的方法中，切口酶切割頂鏈(這條鏈包括切斷試劑識(shí)別位點(diǎn)的5’-3’序列)。切口酶可切割結(jié)合位點(diǎn)或切口酶識(shí)別位點(diǎn)的上游或下游。本文中本發(fā)明公開(kāi)的特定實(shí)施例中，切口酶僅切割頂鏈和識(shí)別位點(diǎn)的3’端下游。在示例性實(shí)施例中，反應(yīng)包括使用可切割或切斷結(jié)合位點(diǎn)的下游(這樣產(chǎn)品序列不包括切斷位點(diǎn))的切口酶。使用可切割結(jié)合位點(diǎn)下游的酶使得聚合酶更加輕易地?cái)U(kuò)展而不必置換切口酶。理想地，在和聚合酶相同的反應(yīng)條件下，切口酶生效。示例性切口酶包括，但不限于N.Bst9I、N.BstSEI、Nb.BbvCI(NEB),Nb.Bpu10I(Fermentas)、Nb.BsmI(NEB)、Nb.BsrDI(NEB)、Nb.BtsI(NEB)、Nt.AlwI(NEB)、Nt.BbvCI(NEB)、Nt.Bpu10I(Fermentas)、Nt.BsmAI、Nt.BspD6I、Nt.BspQI(NEB)、Nt.BstNBI(NEB)和Nt.CviPII(NEB)。表1提供了切口酶識(shí)別位點(diǎn)的序列。

表1.切口酶識(shí)別序列

切口酶也包括通過(guò)修飾限制酶(NEB公式，2006年7月，卷1.2)的切割活性而生成的設(shè)計(jì)的切口酶。當(dāng)限制酶結(jié)合到它們DNA中的識(shí)別序列，用來(lái)水解每條鏈、位于每個(gè)酶之內(nèi)的兩個(gè)催化劑位點(diǎn)驅(qū)動(dòng)可平行進(jìn)行的兩個(gè)獨(dú)立水解反應(yīng)?？稍O(shè)計(jì)變化的限制酶，它僅水解雙螺旋的一條鏈以生成被“切斷”(3’-羥基,5’-磷酸鹽)而不被切割的DNA分子。切口酶也可包括修飾的CRISPR/Cas蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)錄活化劑類似物效應(yīng)因子核酸酶(TALENs)和具有切口酶活性的鋅-指狀結(jié)構(gòu)核酸酶。

切斷擴(kuò)增反應(yīng)通常包括核苷，例如雙脫氧核苷三磷酸(dNTPs)。反應(yīng)也可在包括可檢測(cè)部分的dNTPs(包括但不限定于放射性同位素標(biāo)記(例如³²P,³³P,¹²⁵I,³⁵S)、酶(例如堿性磷酸酶)、熒光標(biāo)記(例如異硫氰酸熒光素(FITC))、生物素、卵白素、洋地黃毒、抗原、半抗原或熒光染料)存在時(shí)進(jìn)行。反應(yīng)還包括特定鹽和緩沖液，它們可為切口酶和聚合酶提供活性。

有利的是，當(dāng)擴(kuò)增反應(yīng)過(guò)程中反應(yīng)溫度大約恒定時(shí)，切斷擴(kuò)增反應(yīng)在大致等溫條件下進(jìn)行。因?yàn)闇囟炔恍枰谳^高溫度和較低溫度之間循環(huán)，所以切斷擴(kuò)增反應(yīng)可在難以進(jìn)行常規(guī)PCR的條件下進(jìn)行。通常，反應(yīng)大約在35℃和90℃(例如大約35、37、42、55、60、65、70、75、80或85℃)之間進(jìn)行。有利的是，以很大精確度維持溫度是不必要的。溫度有一些變化性能是可接受的。

選擇ΔΔG≤-15、-16、17、-18、-19、-20、-25、-30kcal/mole或更多的擴(kuò)增反應(yīng)的引物組。可通過(guò)增加一個(gè)或多個(gè)寡核苷酸(例如一個(gè)或多個(gè)引物和/或探針)濃度改變擴(kuò)增反應(yīng)的性能特征。引物的高濃度也支持形成引物-二聚體。在不同實(shí)施例中，引物的濃度是100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000nM或更多。融化溫度(Tm)和反應(yīng)速率改良劑也可用來(lái)降低寡核苷酸的融化溫度，例如(但不限定于)乙二醇和甘油。另外，DNA聚合酶反應(yīng)速率改良劑(例如dNTP和鎂濃度)也可用來(lái)改變反應(yīng)速率。在特定實(shí)施例中，正反向引物的5’端尾部序列具有相同的核酸序列。

本發(fā)明也提供了設(shè)計(jì)切斷試劑依賴性的等溫鏈置換擴(kuò)增試驗(yàn)而不用試驗(yàn)性篩選大量待選正向引物和/或待選反向引物的組合的方法。長(zhǎng)度是35到70bp位于目標(biāo)序列之內(nèi)的的區(qū)認(rèn)為是具有在中部長(zhǎng)度是12到20bp序列，其Tm≥試驗(yàn)溫度(例如～55℃)。根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)，識(shí)別了直接位于中部(長(zhǎng)度是15到20bp)的下游和上游、長(zhǎng)度是12到20bp的相鄰序列。所選擇雙鏈的上游和下游相鄰序列的Tm之間偏離少于±3℃。通過(guò)將穩(wěn)定二聚體-形成引物的5’端尾部區(qū)附接到12到20個(gè)堿基上游處的相鄰序列的5’終端和12到20個(gè)堿基下游處的相鄰序列互補(bǔ)鏈的5’終端形成目標(biāo)特異性的正向和反向引物對(duì)。當(dāng)和正向引物、反向引物和探針結(jié)合，驅(qū)動(dòng)合成互補(bǔ)于探針的鏈的引物以大約1.1:1到10:1的摩爾比多于其他引物而過(guò)量。試驗(yàn)中引物的組合濃度不高于1000nM。試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法也可用來(lái)將擴(kuò)增子≤70bp的預(yù)先確定的PCR試驗(yàn)轉(zhuǎn)換為切斷劑依賴性等溫鏈-置換擴(kuò)增試驗(yàn)。

目標(biāo)核酸分子

本發(fā)明的方法和組分對(duì)測(cè)試試樣的目標(biāo)核酸分子的擴(kuò)增和/或鑒別有用。目標(biāo)序列從幾乎任意試樣(包括目標(biāo)核酸分子)中擴(kuò)增，包括但不限定于包括真菌、孢子、病毒或細(xì)胞(例如原核細(xì)胞，真核細(xì)胞)的試樣。在特定實(shí)施例中，本發(fā)明的組分和方法檢測(cè)了細(xì)菌性潰瘍病菌屬潰瘍、細(xì)菌性潰瘍病菌屬馬鈴薯環(huán)腐病菌、丁香假單胞菌番茄病致病變、野油菜黃單胞菌辣椒斑點(diǎn)病致病變、鏈格孢屬、枝孢屬、頭孢鐮刀菌、輪枝孢屬大麗花、假單胞菌薄片鏡蛤、胡蘿卜軟腐歐文氏菌屬和青枯病。示例性測(cè)試試樣包括體液(例如血液、血清、血漿、羊水、痰液、尿液、腦脊液、淋巴、撕裂液、糞便或胃液體)、組織提取物、培養(yǎng)基(例如細(xì)胞，舉個(gè)例子病原體細(xì)胞生長(zhǎng)的液體)、環(huán)境試樣、農(nóng)產(chǎn)品或其他食品以及它們的提取物和DNA鑒別標(biāo)簽。如果有需要，試樣在進(jìn)行利用任何標(biāo)準(zhǔn)方法(通常用來(lái)從生物試樣中分離核酸分子)的切斷擴(kuò)增反應(yīng)之前進(jìn)行純化。

在一個(gè)實(shí)施例中，引物擴(kuò)增了病原體的目標(biāo)核酸以探測(cè)試樣中存在病原體。示例性病原體包括真菌、細(xì)菌、病毒和酵母。可通過(guò)鑒別核酸分子(在測(cè)試試樣中編碼病原體蛋白質(zhì)，例如毒素)檢測(cè)這樣的病原體。示例性毒素包括，但不限定于黃曲毒素霍亂毒素、白喉毒素、沙門氏菌毒素、志賀毒素、梭菌肉毒毒素、內(nèi)毒素和霉菌毒素。對(duì)于環(huán)境應(yīng)用，測(cè)試試樣可包括水、空氣過(guò)濾器的液體提取物、土壤樣本、建筑材料(例如干壁、吊頂板、壁紙、面料、壁紙和底板覆蓋物)、環(huán)境化驗(yàn)標(biāo)本或任何其試樣。在一個(gè)實(shí)施例中，引物寡核苷酸將用作分子育種試驗(yàn)(針對(duì)增強(qiáng)，例如，植物耐旱性、植物的耐除草劑性或耐害蟲(chóng)捕食性)里內(nèi)控的植物的目標(biāo)核酸擴(kuò)增。

目標(biāo)核酸分子包括雙鏈和單鏈核酸分子(例如所屬領(lǐng)域已知的能和本文描述核酸分子雜合的DNA和其他核堿基聚合物)。適合利用本發(fā)明的可檢測(cè)的寡核苷酸探針或引物檢測(cè)的DNA分子包括，但不限定于雙鏈的DNA(例如基因組DNA、質(zhì)粒DNA/線粒體DNA、病毒DNA和合成雙鏈DNA)。單鏈DNA目標(biāo)核酸分子包括，例如，病毒DNA、cDNA和合成單鏈的DNA或其他所屬領(lǐng)域已知類型的DNA。

通常，檢測(cè)的目標(biāo)序列的長(zhǎng)度在10到100之間(例如10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100個(gè)核苷酸)的核苷酸。選擇目標(biāo)核酸分子的GC含量少于45％、50％、55％或60％。令人滿意的是，選擇目標(biāo)核酸和切口酶，這樣目標(biāo)序列不包含任何切口酶的切斷位點(diǎn)，它會(huì)包含于反應(yīng)混合物中。

應(yīng)用

利用本發(fā)明的引物的目標(biāo)核酸擴(kuò)增具有對(duì)目標(biāo)核酸快速檢測(cè)有利的特征(附圖10)。這樣的反應(yīng)的特征在于([RFU_MAX-RFU_BL])、斜率([RFU_MAX-RFU_BL]/[T_OSEA-T_RFUmax]的高數(shù)值)、較早開(kāi)始指數(shù)擴(kuò)增階段(T_OSEA<10分鐘)以及相同試樣的復(fù)制試驗(yàn)反應(yīng)之間的較低信號(hào)差異。在特定實(shí)施例中，T_OSEA-T_RFUmax≈3分鐘。

本發(fā)明提供了實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)。需要快速檢測(cè)時(shí)(例如20、15、10、9、8、7、6、5分鐘或更少的條件下進(jìn)行可檢測(cè)性的擴(kuò)增)，本發(fā)明的組分和方法對(duì)于人體診斷有利。在特定實(shí)施例中，本發(fā)明提供了切斷擴(kuò)增反應(yīng)在臨床情況下人類診斷中的用途。在其他實(shí)施例中，當(dāng)不能利用熱循環(huán)設(shè)備或其價(jià)格昂貴，本發(fā)明提供了切斷擴(kuò)增反應(yīng)試驗(yàn)在診斷現(xiàn)場(chǎng)工作中的用途。進(jìn)一步地，在其他實(shí)施例中，當(dāng)需要快速核酸擴(kuò)增和檢測(cè)時(shí)，本發(fā)明提供了切斷擴(kuò)增反應(yīng)試驗(yàn)在學(xué)術(shù)背景中的用途。

可檢測(cè)的寡核苷酸探針

本發(fā)明提供了在切斷擴(kuò)增反應(yīng)中利用非擴(kuò)增性、可檢測(cè)的寡核苷酸探針(包括至少一個(gè)聚合酶捕獲分子)檢測(cè)目標(biāo)核酸分子或其擴(kuò)增子(例如將寡核苷酸著色的核苷酸變體或其他部分，它能結(jié)合目標(biāo)核酸分子，但不能利用可檢測(cè)的寡核苷酸探針作為目標(biāo)支持聚合酶擴(kuò)增)。不希望受限于理論，存在一個(gè)或多個(gè)部分(不允許聚合酶前進(jìn))可能導(dǎo)致寡核苷酸和非核酸骨架捕獲聚合酶或通過(guò)拖延復(fù)制的聚合酶而捕獲聚合酶(即C3-間隔區(qū)、受損DNA堿基,其他間隔區(qū)部分,O-2-Me堿基)。因此，在切斷擴(kuò)增反應(yīng)過(guò)程中，這些結(jié)構(gòu)阻止或減少探針的非正規(guī)擴(kuò)增。這就將它們和常規(guī)檢測(cè)探針區(qū)分，必須在切斷擴(kuò)增反應(yīng)的末端加入以阻止它們的擴(kuò)增。

常規(guī)檢測(cè)探針在實(shí)時(shí)檢測(cè)切斷擴(kuò)增反應(yīng)中證明是不可行的。如果常規(guī)檢測(cè)探針并入切斷擴(kuò)增反應(yīng)，這些擴(kuò)增檢測(cè)探針同時(shí)和目標(biāo)擴(kuò)增。歸因于反應(yīng)開(kāi)始的檢測(cè)探針的原始分子數(shù)量，擴(kuò)增這些檢測(cè)分子掩飾了對(duì)正規(guī)目標(biāo)擴(kuò)增子的檢測(cè)。

本發(fā)明提供了非擴(kuò)增性、可檢測(cè)的多核苷酸探針，它們包括至少一種聚合酶捕獲分子。本發(fā)明的聚合酶捕獲分子包括，但不限定于，利用復(fù)制DNA聚合酶封阻擴(kuò)增但能實(shí)現(xiàn)合適雜合作用或?qū)⒑塑账衢g隔到目標(biāo)分子或目標(biāo)分子的擴(kuò)增復(fù)制體的核苷酸變體或其他部分(由此防止擴(kuò)增檢測(cè)分子)。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的可檢測(cè)寡核苷酸包括3個(gè)碳間隔區(qū)(C3間隔區(qū))，它會(huì)阻止或減少非常規(guī)擴(kuò)增檢測(cè)分子。

在一個(gè)實(shí)施例中，可檢測(cè)寡核苷酸探針包括一個(gè)或多個(gè)修飾的核苷酸堿基(具有增強(qiáng)的結(jié)合于互補(bǔ)核苷酸的親和性)。修飾的堿基示例包括，但不限定于，2’氟酰胺和2’OMe RNA酰胺(也起聚合酶捕獲分子到的作用)。本發(fā)明的可檢測(cè)寡核苷酸探針可利用不同著色熒光素合成并且可設(shè)計(jì)為和任何目標(biāo)序列雜合。鑒于他們顯著的特異性，本發(fā)明的非擴(kuò)增的可檢測(cè)的多核苷酸探針用來(lái)檢測(cè)試樣中的單一目標(biāo)核酸分子，或和可檢測(cè)的寡核苷酸探針(每一個(gè)和不同目標(biāo)核酸分子結(jié)合)一起使用。因此，本發(fā)明非擴(kuò)增性、可檢測(cè)的寡核苷酸可用來(lái)檢測(cè)相同反應(yīng)中的一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)核酸分子，使得這些目標(biāo)同時(shí)檢測(cè)。本發(fā)明包括協(xié)同本文描述的可檢測(cè)的寡核苷酸探針使用這樣的熒光素。

非擴(kuò)增性、可檢測(cè)的多核苷酸探針的用途

非擴(kuò)增性、可檢測(cè)的多核苷酸探針對(duì)切斷擴(kuò)增反應(yīng)中擴(kuò)增和檢測(cè)目標(biāo)核酸分子有利。該方法涉及在大致等溫條件下和合適緩沖液和dNTPs存在時(shí)，將目標(biāo)核酸分子和聚合酶、兩個(gè)引物(每一個(gè)特異性連接于目標(biāo)核苷酸分子上的互補(bǔ)序列)、切口酶和可檢測(cè)寡核苷酸探針接觸；生成包括至少部分所述目標(biāo)核酸分子的擴(kuò)增子；以及基于熒光強(qiáng)度的反應(yīng)過(guò)程中通過(guò)從反應(yīng)中探針?lè)肿又袡z測(cè)寡核苷酸探針(實(shí)時(shí)雜合目標(biāo)核算分子)而檢測(cè)存在于反應(yīng)中的目標(biāo)核酸分子。

通常，切斷擴(kuò)增反應(yīng)包括本發(fā)明的非擴(kuò)增性、可檢測(cè)的寡核苷酸探針，所述切斷擴(kuò)增反應(yīng)包括:(1)目標(biāo)核酸分子：(2)包括若干數(shù)量的寡核苷酸的兩個(gè)引物(互補(bǔ)與目標(biāo)核酸分子)和可利用切口酶切割的位點(diǎn)；(3)dNTPs；(4)鏈置換聚合酶；以及(5)切口酶。因此，本發(fā)明提供了利用這些組分檢測(cè)目標(biāo)核算分子的方法。

在硬件和/或軟件里執(zhí)行

本文描述的方法可在一般用途或特殊編程的硬件或軟件上執(zhí)行。例如，該方法可通過(guò)計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)而執(zhí)行。因此，本發(fā)明也提供了(設(shè)置為執(zhí)行根據(jù)本發(fā)明任何實(shí)施例的算法和/或方法)軟件和/或計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品。眾所周知，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員知道如何設(shè)置軟件，它可執(zhí)行根據(jù)本發(fā)明任何實(shí)施例的算法和/或方法。計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)可為永久和/或有形的。例如，計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)可為非永存儲(chǔ)器(例如隨機(jī)存取存儲(chǔ)器及其類似物)或永久存儲(chǔ)器(例如只讀存儲(chǔ)器、硬盤、軟盤、磁帶、光盤、紙臺(tái)、打孔卡以及類似物)。計(jì)算機(jī)可執(zhí)行的指令可寫入合適計(jì)算機(jī)語(yǔ)言或幾種語(yǔ)言的組合。基礎(chǔ)計(jì)算生物學(xué)方法在，例如Setubal和Meidanis等人，計(jì)算生物學(xué)方法介紹(PWS出版社，波士頓，1997)；Salzberg,Searles,Kasif,(Ed.),分子生物學(xué)計(jì)算機(jī)方法，(艾斯維爾，阿姆斯特丹，1998)；Rashidi和Buehler，生物信息學(xué)基礎(chǔ)；生物科學(xué)和醫(yī)學(xué)應(yīng)用(CRC出版社,倫敦,2000)和Ouelette和Bzevani,生物信息學(xué)：基因和蛋白質(zhì)分析的實(shí)用向?qū)?Wiley&Sons,Inc.,第二版,2001)中描述。

本發(fā)明也可為不同目的使用不同計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品和軟件，這樣的探針設(shè)計(jì)，數(shù)據(jù)管理，分析和儀器操作(參見(jiàn)號(hào)為5,593，839、5,795,716、5,733,729、5,974,164、6,066,454、6,090,555、6,185,561、6,188,783、6,223,127、6,229,911和6,308,170的美國(guó)專利)。另外，本發(fā)明就具有優(yōu)選實(shí)施例，它們包括提供遍歷諸如美國(guó)序列號(hào)10/197,621、10/063,559(美國(guó)公開(kāi)號(hào)20020183936)、10/065,856、10/065,868、10/328,818、10/328,872、10/423,403和60/482,389顯示的互聯(lián)網(wǎng)的網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的基因信息的方法。

試劑盒

本發(fā)明也提供了擴(kuò)增目標(biāo)核酸分子的試劑盒。這樣的試劑盒對(duì)擴(kuò)增和檢測(cè)取自主體的生物試樣中的目標(biāo)核酸有效。如本文描述的，本發(fā)明的試劑盒可包括，例如，一個(gè)或多個(gè)聚合酶，正向和反向引物和一個(gè)或多個(gè)切口酶。當(dāng)一個(gè)目標(biāo)將要擴(kuò)增，一個(gè)或兩個(gè)切口酶可包含于試劑盒。當(dāng)多個(gè)目標(biāo)序列將要擴(kuò)增，為這些目標(biāo)序列設(shè)計(jì)的引物包括相同切口酶的切斷位點(diǎn)，然后一個(gè)或兩個(gè)切口酶可包括其中。當(dāng)引物通過(guò)不同切口酶識(shí)別，更多切口酶可包括于試劑盒，例如，舉個(gè)例子，3個(gè)或更多。

一方面，本發(fā)明提供了擴(kuò)增核酸的試劑盒，所述試劑盒包括DNA聚合酶、一級(jí)引物、二級(jí)引物、對(duì)引物內(nèi)的切口酶結(jié)合位點(diǎn)具有特異性的切口酶以及三磷酸及脫氧核苷酸(dNTP’s)(例如在包含足夠擴(kuò)增的組分的緩沖溶液)。在不同實(shí)施例中，一級(jí)引物和二級(jí)引物每個(gè)具有互補(bǔ)于或大致互補(bǔ)于目標(biāo)序列的3’末端特異性區(qū)序列(當(dāng)末端識(shí)別區(qū)包括一個(gè)或多個(gè)2’端修飾的核苷酸)和包括位于3’末端特異性識(shí)別區(qū)序列(能和自身進(jìn)行二聚作用，即自身-互補(bǔ))上游的切口酶結(jié)合位點(diǎn)的5’末端尾部區(qū)。在特定實(shí)施例中，一個(gè)或多個(gè)引物具有引物-二聚體構(gòu)型(例如通過(guò)大約在Tm加熱和緩慢冷卻生成)。

本發(fā)明的試劑盒也可包括一個(gè)或多個(gè)任意數(shù)量的單獨(dú)容器、包、導(dǎo)管(例如<0.2ml、0.2ml、0.6ml、1.5ml、5.0ml、>5.0ml)、小瓶、微量滴定板(例如<96孔、96孔、384孔、1536孔、>1536孔)、ArrayTape和類似物里的一個(gè)或多個(gè)組分，或者組分可和這樣的容器中的不同組合物而結(jié)合。在不同實(shí)施例中，試劑盒還包括能結(jié)合并且擴(kuò)增參照序列的一對(duì)引物。在特定實(shí)施例中，試劑盒包括一個(gè)或多個(gè)引物-二聚體構(gòu)型的引物(例如通過(guò)大約在Tm加熱和緩慢冷卻生成)。在其他實(shí)施例中，試劑盒包括含有引物的無(wú)菌容器；這樣的容器可為盒子、安瓿、瓶子、小瓶、軟管、袋子、保護(hù)套、吸塑裝或所屬領(lǐng)域已知的其他合適的容器。這樣的容器可由塑料、玻璃、復(fù)合層壓紙、金屬箔或適合容納核酸的其他材料制造。

試劑盒的組分，例如，可在出現(xiàn)在一個(gè)或多個(gè)容器中，例如，所有組分可在一個(gè)容器中，或例如，酶可存在于單獨(dú)容器中和引物分開(kāi)。組份，舉個(gè)例子，可干燥(例如粉末)或放置在穩(wěn)定緩沖液中(例如化學(xué)穩(wěn)定，熱力學(xué)穩(wěn)定)。干燥組分，例如，通過(guò)凍干法、真空和離心輔助干燥和/或常壓干燥而制備。在不同實(shí)施例中，聚合酶和切口酶在單獨(dú)容器中以凍干形式存在并且引物在不同容器中干燥、冷凍干燥或在緩沖液中。在一些實(shí)施例中，聚合酶、切口酶和引物以凍干的形式存在于單獨(dú)容器中。在其他實(shí)施例中，聚合酶和切口酶可分離到不同容器中。

試劑盒還包括，例如，反應(yīng)中使用的dNTPs，或修飾的核苷酸，比色皿或反應(yīng)使用的其他容器，或再水合凍干組分的小瓶水或緩沖液。使用的緩沖液可，例如，適合于聚合酶和切口酶活性。

本發(fā)明的試劑盒也可包括執(zhí)行本文描述一個(gè)或多個(gè)說(shuō)明和描述本文的一個(gè)或多個(gè)組分或試劑。說(shuō)明和/或描述可印刷并且可包括于試劑盒插入物。試劑盒也可包括對(duì)提供這樣說(shuō)明或描述的互聯(lián)網(wǎng)位置進(jìn)行書(shū)面描寫。

試劑盒還包括檢測(cè)方法(例如實(shí)時(shí)或端點(diǎn))使用的試劑，例如，舉個(gè)例子，雜合探針或DNA結(jié)合染料。試劑盒還包括檢測(cè)方法使用的試劑，例如，舉個(gè)例子，F(xiàn)RET使用的試劑、橫流裝置、量油計(jì)、熒光染料、膠體金粒子、乳膠粒子、分子信標(biāo)或聚苯乙烯微珠。檢測(cè)組分可并入橫流裝置。橫流裝置可用在臨床檢測(cè)。

除非另有所指，本發(fā)明的實(shí)施利用分子生物學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)(包括重組技術(shù))，它們都在技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。這樣的技術(shù)在文獻(xiàn)(例如，《分子克隆》：試驗(yàn)手冊(cè)，第2版(Sambrook,1989)；《寡核苷酸合成方法》(Gait,1984)；《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)》(Freshney,1987)；酶學(xué)方法，《實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊(cè)》(Weir,1996)；《哺乳動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因載體》(Miller and Calos,1987)；《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(Ausubel,1987)；PCR:《聚合酶鏈反應(yīng)》(Mullis,1994)；《免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》(Coligan,1991))中完整解釋。這些技術(shù)可用于生產(chǎn)本發(fā)明的多核苷酸和多肽，并且同樣地可考慮制造和實(shí)施本發(fā)明。對(duì)特定實(shí)施例特別有用的技術(shù)將在下述部分中討論。

提出下述示例以向所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員提供完整公開(kāi)和描述如何實(shí)施和使用本發(fā)明的試驗(yàn)、篩選和治療方法，并且不旨在限制發(fā)明人視作他們發(fā)明的范圍。

示例

示例1.通過(guò)確定引物目標(biāo)結(jié)合穩(wěn)定性設(shè)計(jì)大豆凝集素等溫DNA擴(kuò)增系統(tǒng)

僅利用根據(jù)本發(fā)明的設(shè)計(jì)原理并且不借助引物設(shè)計(jì)測(cè)試，設(shè)計(jì)成功生效的檢測(cè)大豆凝集素的等溫DNA擴(kuò)增試驗(yàn)(附圖12)。

基于30到60bp序列窗口:

5’-ccaaggttctcattacctatgatgcctccaccagcctcttggttgcttctttggtctacccttcacagagaa-3’

中缺乏單核苷酸多態(tài)性(SNP’s)，選擇大豆凝集素基因的試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)序列。粗體顯示的是分別選自正向和反向引物設(shè)計(jì)的序列區(qū)。

為了選擇正向引物(5’-ATTACCTATGATGCC-3’)的目標(biāo)結(jié)合序列，結(jié)合到目標(biāo)的正向鏈的穩(wěn)定性和正向引物自身二聚作用的穩(wěn)定性做如下比較：

正向引物-目標(biāo)雜合體(PrTH)的ΔG_25℃＝-25.99kcal/mole；

引物-目標(biāo)結(jié)合區(qū)自身二聚體(PrTBRHD)的ΔG_25℃＝-3.14kcal/mole；

ΔΔG_25℃＝ΔG_PTH-ΔG_PTBRHD＝-22.85kcal/mole.

低ΔΔG(≤大約-16kcal/mole)表明正向引物能將目標(biāo)核酸分子的互補(bǔ)鏈退火并且啟動(dòng)對(duì)之的合成。

為了選擇反向引物(5’-ACCAAAGAAGCAAC-3’)的目標(biāo)結(jié)合序列，結(jié)合到目標(biāo)的反向引物的穩(wěn)定性和反向引物自身-二聚體作用的穩(wěn)定性做如下比較：

穩(wěn)定性(ΔG)和反向引物5’-ACCAAAGAAGCAAC-3’的目標(biāo)結(jié)合區(qū)的最近(ΔΔG)的相對(duì)穩(wěn)定性如下確定：

正向引物-目標(biāo)雜合體(PrTH)的ΔG_25℃＝-25.35kcal/mole；

引物-目標(biāo)結(jié)合區(qū)自身二聚體(PrTBRHD)的ΔG_25℃＝-3.14kcal/mole；

ΔΔG_25℃＝ΔG_PTH-ΔG_PTBRHD＝-22.21kcal/mole.

低ΔΔG(≤大約-16kcal/mole)表明反向引物能將目標(biāo)核酸分子的互補(bǔ)鏈退火并且啟動(dòng)對(duì)之的合成。

切斷擴(kuò)增反應(yīng)(50μl)包括0.3mM dNTPs,0.38U/ml Bst 2.0WarmStart DNA聚合酶(新英格蘭生物學(xué)實(shí)驗(yàn)),0.15單位Nt.BstNBI(新英格蘭生物學(xué)實(shí)驗(yàn)),250nM正向鏈,250nM反向鏈,利用CalRed(BioSearch)標(biāo)識(shí)于5’終端和利用BHQ2(BioSearch)標(biāo)識(shí)于3’終端的200nM分子信標(biāo)探針以及野生大豆基因組DNA(1000個(gè)復(fù)制品)。引物和探針序列(通過(guò)BioSearch Inc.,Novato,CA合成)如下：

正向引物(“m”＝2’-甲氧基核苷酸)

5’-ACGCGACTCGTCGACGAGTCGCGTATTACCTATGAmUmGmCmC-3’

反向引物(“m”＝2’-甲氧基核苷酸)

5’-ACGCGACTCGTCGACGAGTCGCGTACCAAAGAAmGmCmAmAmC-3’

分子信標(biāo)探針(“I”代表通用肌苷核苷酸)

5’-CalRed₆₁₀-CGCGCTCCACCAICCTCTTGCGCG-BHQ2-3’

在IQ5熱循環(huán)機(jī)(BioRad)內(nèi)、于56℃將反應(yīng)孵化大約10分鐘。熒光信號(hào)記錄在ROX通道上(激發(fā)態(tài)：575nm；發(fā)射態(tài):602nm)。包含大豆gDNA(n＝3)的反應(yīng)生成了s狀的曲線(附圖13)。相比之下，不包含信號(hào)DNA(n＝3)對(duì)照反應(yīng)沒(méi)有生成信號(hào)。開(kāi)始指數(shù)擴(kuò)增的時(shí)間大約是3分鐘并且開(kāi)始最大相對(duì)熒光單位的時(shí)間是大約6分鐘。反應(yīng)的指數(shù)擴(kuò)增階段的斜率確定為660RFU/分鐘。

示例2.通過(guò)確定引物目標(biāo)結(jié)合的穩(wěn)定性設(shè)計(jì)沙門氏菌invA的等溫DNA擴(kuò)增系統(tǒng)

僅利用根據(jù)本發(fā)明的設(shè)計(jì)原理并且不借助引物設(shè)計(jì)測(cè)試，設(shè)計(jì)容易的、可操作的檢測(cè)沙門氏菌invA的等溫DNA擴(kuò)增試驗(yàn)。

基于30到60bp序列窗口:

5’-ATACTCATCTGTTTACCGGGCATACCATCCAGAGAAAA-3’

中缺乏單核苷酸多態(tài)性(SNP’s)，選擇沙門氏菌invA基因的試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)序列。粗體顯示的是分別選自正向和反向引物設(shè)計(jì)的序列區(qū)。

為了選擇正向引物(5’-ATACTCATCTGTTTACC-3’)的目標(biāo)結(jié)合序列，結(jié)合到目標(biāo)的正向鏈的穩(wěn)定性和正向引物自身二聚作用的穩(wěn)定性做如下比較：

正向引物-目標(biāo)雜合體(PrTH)的ΔG_25℃＝-26.11kcal/mole；

引物-目標(biāo)結(jié)合區(qū)自身二聚體(PrTBRHD)的ΔG_25℃＝-1.95kcal/mole；

ΔΔG_25℃＝ΔG_PTH-ΔG_PTBRHD＝-24.16kcal/mole.

低ΔΔG(≤大約-16kcal/mole)表明正向引物能將目標(biāo)核酸分子的互補(bǔ)鏈退火并且啟動(dòng)對(duì)之的合成。

為了選擇反向引物(5’-TTTTCTCTGGATGG-3’)的目標(biāo)結(jié)合序列，結(jié)合到目標(biāo)的反向引物的穩(wěn)定性和反向引物自身-二聚體作用的穩(wěn)定性做如下比較：

穩(wěn)定性(ΔG)和反向鏈5’-ACCAAAGAAGCAAC-3’的目標(biāo)結(jié)合區(qū)的最近(ΔΔG)的相對(duì)穩(wěn)定性如下確定：

正向引物-目標(biāo)雜合體(PrTH)的ΔG_25℃＝-25.28kcal/mole；

引物-目標(biāo)結(jié)合區(qū)自身二聚體(PrTBRHD)的ΔG_25℃＝-1.57kcal/mole；

ΔΔG_25℃＝ΔG_PTH-ΔG_PTBRHD＝-23.71kcal/mole.

低ΔΔG(≤大約-16kcal/mole)表明反向引物能將目標(biāo)核酸分子的互補(bǔ)鏈退火并且啟動(dòng)對(duì)之的合成。

切斷擴(kuò)增反應(yīng)(26μl)包括0.3mM dNTPs,0.38U/ml Bst 2.0WarmStart DNA聚合酶(新英格蘭生物學(xué)實(shí)驗(yàn)),0.15單位Nt.BstNBI(新英格蘭生物學(xué)實(shí)驗(yàn)),250nM正向鏈,250nM反向鏈,利用CalRed(BioSearch)標(biāo)識(shí)于5’終端和利用BHQ2(BioSearch)標(biāo)識(shí)于3’終端的300nM分子信標(biāo)探針以及野生大豆基因組DNA(1000復(fù)制品)。引物和探針序列(通過(guò)BioSearch Inc.,Novato,CA合成)如下：

正向引物1(“m”＝2’-甲氧基核苷酸)

5’-ACGCGACTCGTCGACGAGTCGCGTATTACCTATGAmUmGmCmC-3’

反向引物(“m”＝2’-甲氧基核苷酸)

5’-GGCTGACTCCTGCAGGAGTCAGCCTTTTCTCTGmGmAmUmGmG-3’

分子信標(biāo)探針(“I”代表通用肌苷核苷酸)

5’-ACCTGTTTACCGGGCATACAAACAGGT-BHQ2-3’

在IQ5熱循環(huán)機(jī)(BioRad)內(nèi)、于56℃將反應(yīng)孵化大約10分鐘。熒光信號(hào)記錄在ROX通道上(激發(fā)態(tài)：575nm；發(fā)射態(tài):602nm)。包含大豆gDNA(n＝3)的反應(yīng)生成了s狀的曲線(附圖15)。相比之下，不包含信號(hào)DNA(n＝3)對(duì)照反應(yīng)沒(méi)有生成信號(hào)。開(kāi)始指數(shù)擴(kuò)增的時(shí)間大約是3分鐘并且開(kāi)始最大相對(duì)熒光單位的時(shí)間是大約6分鐘。反應(yīng)的指數(shù)擴(kuò)增階段的斜率確定為660RFU/分鐘。

附圖16A和16B顯示了試驗(yàn)優(yōu)化的結(jié)果。

示例3.鑒別作為相對(duì)熱動(dòng)力參數(shù)(和為等溫?cái)U(kuò)增試驗(yàn)設(shè)計(jì)的待選引物/探針組的性能相關(guān))的ΔΔG。確定預(yù)測(cè)設(shè)計(jì)于“硅片上”的引物/探針組里引物寡核苷酸生效或失效的閾值。

分析5’端-3’端方向上包含自身-互補(bǔ)的第一區(qū)(具有切口酶識(shí)別序列的5’-尾部)和互補(bǔ)于第二區(qū)的目標(biāo)序列的一組34個(gè)寡核苷酸引物的通常用于引物設(shè)計(jì)算法的大量參數(shù)，例如雜合雙螺旋的融化溫度(Tm)、％GC含量、序列長(zhǎng)度和ΔG。獨(dú)立確定了第一和第二引物區(qū)各自的所有參數(shù)。25個(gè)引物的子集屬于待選引物/探針組，它們沒(méi)有在試驗(yàn)篩選實(shí)驗(yàn)中生成探針-可檢測(cè)的擴(kuò)增產(chǎn)品。

分別利用X軸和Y軸的設(shè)計(jì)參數(shù)不同組合生成若干二維基質(zhì)點(diǎn)(附圖17A-17H)，目的是鑒別參數(shù)組合，其中失效試驗(yàn)引物的數(shù)據(jù)點(diǎn)可分別從功能性試驗(yàn)引物的數(shù)據(jù)點(diǎn)群聚得到。如附圖17B-17H的點(diǎn)所顯示的，沒(méi)有現(xiàn)有技術(shù)(設(shè)計(jì)引物)使用的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)參數(shù)的組合從在二維點(diǎn)基質(zhì)中的非功能性引物中生成可辨識(shí)的功能性分離。歸因于功能性和非功能性寡核苷酸引物中的標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)值的廣泛重疊范圍，兩個(gè)引物群的數(shù)據(jù)點(diǎn)，如所期望的，廣泛地重疊于這些點(diǎn)中。

令人驚奇的是，如本申請(qǐng)發(fā)明人定義的，僅僅新的相對(duì)熱動(dòng)力參數(shù)的ΔΔG生成了基質(zhì)(其中關(guān)聯(lián)于篩選測(cè)試的引物組實(shí)驗(yàn)效果，功能性和非功能性引物的數(shù)據(jù)點(diǎn)分別群聚)。附圖17A的圖顯示了基質(zhì)，它的X軸和Y軸分別提供了描繪互補(bǔ)第一引物區(qū)的ΔΔG值的比例和描繪目標(biāo)-互補(bǔ)第二引物區(qū)的ΔΔG值的比例。所有失效試驗(yàn)引物具有第二區(qū)/目標(biāo)雙螺旋(多數(shù)情況下)或第一區(qū)自身-互補(bǔ)雙螺旋(一種情況下)的少于-15kcal/mol的ΔΔG值。因此，大約-15kcal/mol的ΔΔG值變成這種區(qū)分功能性和非功能性引物的寡核苷酸數(shù)據(jù)組的實(shí)驗(yàn)性閾值。

ΔΔG是測(cè)量差異的相關(guān)參數(shù)，即，在室溫和常壓下于動(dòng)態(tài)平衡中，形成需要的寡核苷酸結(jié)構(gòu)(特定引物/目標(biāo)雜合體和第一區(qū)自身二聚體)熱動(dòng)力學(xué)優(yōu)選性相對(duì)形成大量預(yù)測(cè)的可選結(jié)構(gòu)的優(yōu)選性的優(yōu)勢(shì)。令人驚奇的是，待選引物寡核苷酸設(shè)計(jì)為硅片時(shí)，這種ΔG優(yōu)勢(shì)(ΔΔG)證明是可預(yù)測(cè)試驗(yàn)成功的參數(shù)。計(jì)算得到的ΔΔG作為功能性等溫試驗(yàn)的登記評(píng)分和預(yù)測(cè)指標(biāo)的用途減少實(shí)踐下述描述和測(cè)試等溫試驗(yàn)(為了檢測(cè)大豆凝集素基因和沙門氏菌invA基因)的示例。第一次利用計(jì)算的ΔΔG值僅在硅片上篩選待選引物和探針。每中情況下，僅僅用試驗(yàn)方法選擇和測(cè)試單引物/探針組。初次試驗(yàn)中進(jìn)行兩種功能性試驗(yàn)而不費(fèi)時(shí)并且成本高昂的篩選大量待選引物/探針組。

其他實(shí)施例

從上述的描述中顯而易見(jiàn)的是本文描述的發(fā)明的不同用法和條件可采用變型和變體。這樣的實(shí)施例也在下述權(quán)利要求的范圍中。

引用一系列本文對(duì)變量的任何定義里元素包括將變量定義為任意單一元素或所列元素的組合(或子組合)。引用本文實(shí)施例包括作為單一實(shí)施例或和任意其他實(shí)施例或其部分的組合的實(shí)施例。

本申請(qǐng)可涉及國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朠CT/US2013/035750,于2013年4月9日申請(qǐng)，其要求享有美國(guó)專利號(hào)61/621,975，于2012年4月9日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)的權(quán)利，它的內(nèi)容通過(guò)引用并入本文。

本申請(qǐng)可涉及國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朠CT/US2011/047049,于2011年8月9日申請(qǐng)，其要求享有美國(guó)專利號(hào)61/621,975，于2010年8月13日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)的權(quán)利，它的內(nèi)容通過(guò)引用并入本文。

和每個(gè)獨(dú)立專利和公開(kāi)特異性和單獨(dú)地表明通過(guò)引用并入程度相同，本說(shuō)明書(shū)提及的所有專利和公開(kāi)通過(guò)引用并入本文。