本發(fā)明涉及一種用于測定結(jié)合蛋白與靶物質(zhì)之間的相互作用的方法，包括使用相互作用陷阱(IT)細(xì)胞測定結(jié)合蛋白和靶物質(zhì)之間的相互作用的方法。IT細(xì)胞具有展示在細(xì)胞內(nèi)包涵體表面的結(jié)合蛋白，通過表達(dá)可形成包含結(jié)合蛋白的活性蛋白顆粒的融合蛋白，即不溶性聚集物(包涵體)。所述方法包括增加細(xì)胞透性，其不影響展示在活性包涵體上的結(jié)合蛋白活性及遺傳信息。此外，本發(fā)明涉及篩選文庫的方法，還包括以單個細(xì)胞單位的回收。此外，本發(fā)明還涉及細(xì)胞和細(xì)胞文庫，其特征在于可將靶物質(zhì)從細(xì)胞外導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，同時保留展示在細(xì)胞內(nèi)包涵體表面的結(jié)合蛋白活性和遺傳信息；還包括含有編碼融合蛋白的多核苷酸構(gòu)建或者使得結(jié)合蛋白展示在活性包涵體上的融合蛋白。

背景技術(shù)：

所有通過活有機(jī)體實施的方法是通過細(xì)胞內(nèi)蛋白介導(dǎo)的相互作用網(wǎng)絡(luò)復(fù)合體(相互作用組)建立的?？刂葡嗷プ饔弥械娜魏螁栴}可影響整個網(wǎng)絡(luò)并且可引發(fā)疾病。因此，其是一個用于理解和控制參與相互作用的蛋白的平臺，可用于理解網(wǎng)絡(luò)復(fù)合體，并且其對于研究疾病治療和開發(fā)治療制劑也是非常重要的。

關(guān)于這點，已通過以下對多種用于理解體內(nèi)蛋白相互作用的篩選方法進(jìn)行了研究：通過靶向具有已知功能和特性的細(xì)胞內(nèi)蛋白構(gòu)建蛋白文庫(細(xì)胞內(nèi)蛋白的相互作用配體)；從文庫中僅選擇與所述靶相互作用的蛋白并驗證其特性(Hening Lin and Virginia W.Cornish.,2002.Screening and Selection Methods for Large-Scale Analysis of Protein Function.Angew.Chem.Int.Ed 41；4402～25)。

目前，大多數(shù)文庫篩選方法可主要分為無細(xì)胞系統(tǒng)和表面展示系統(tǒng)。常規(guī)的文庫篩選方法中，代表性的無細(xì)胞系統(tǒng)實例可包括核糖體展示和體外區(qū)室化(IVC)方法，表面展示系統(tǒng)的實例可包括噬菌體展示和細(xì)菌/酵母展示方法。

首先，核糖體展示是用于通過RT-PCR擴(kuò)增肽類mRNA的方法，其通過形成mRNA-核糖體-肽三元復(fù)合體共軛到靶，從所述復(fù)合體解離后可通過RT-PCR擴(kuò)增。核糖體展示的優(yōu)勢在于其可提供的文庫最大容量可達(dá)10¹³，由于全部過程在體外進(jìn)行所以不需要轉(zhuǎn)化。但是，核糖體展示的劣勢在于僅有27％呈現(xiàn)為復(fù)合體，并且展示在mRNA-核糖體上的蛋白尺寸是受限制的，并且在核糖體復(fù)合體的穩(wěn)定性和技術(shù)靈敏度等方面也是有限的(Hanes,J and Pluckthun,A.,1997.In vitro selection and evolution of functional proteins by using ribosome display.Proc.Natl.Acad.Sci.94:4937～42)。

體外區(qū)室化(IVC)是基于分散在油(代替體內(nèi))中的水性乳劑進(jìn)行對基因區(qū)室化的方法，并且在所述乳劑中使區(qū)室化的基因轉(zhuǎn)錄及翻譯，以此形成蛋白文庫?？芍瞥芍辽?0⁹個體積為1mL的小滴，這些小滴可作為獨立的微反應(yīng)器，其在多種外界條件下(溫度、pH、鹽濃度)是穩(wěn)定的。但是，乳劑可在蛋白回收過程中使用有機(jī)溶劑被破壞，并且所用的有機(jī)溶劑可減低蛋白活性，因此回收的蛋白可能在體內(nèi)不具有活性(Dan S.Tawfik and Andrew D.Griffiths.,1998.Man-made cell-like compartments for molecular evolution.Nat.Biotechnol.16；652-56)。

噬菌體展示，目前最常用于文庫篩選，是基于對固定靶的結(jié)合親和力篩選文庫的方法，使用通過共軛到噬菌體展示末端的pIII蛋白展示的文庫蛋白，并且噬菌體展示的優(yōu)勢在于其可容易地篩選文庫中大量的克隆。但是，由于1到5中結(jié)合蛋白展示在噬菌體的pIII蛋白上，并且在將其固定到珠子和平板底部時才使用靶，多種結(jié)合可能同時發(fā)生，因此產(chǎn)生親和力效應(yīng)，即顯示出個體蛋白對靶的實際親和力不同的問題。此外，由于所述方法的特點，需要洗脫步驟。關(guān)于這點，存在的限制是當(dāng)展示的蛋白與靶具有高結(jié)合親和力時，所展示的蛋白不能容易地從固定相洗脫。此外，用于噬菌體展示中篩選文庫的平移法(panning method)的限制在于其具有低信噪比，因此獲得具有對靶結(jié)合親和力的蛋白需要3到5次平移過程，還有限制在于其具有高假陽性率(George P.Smith and Valery A.Petrenko,1997.Phage Display.Chem.Rev.97:391～410)。

表面展示，被開發(fā)用于克服噬菌體展示的限制，是用于在微生物例如細(xì)菌和酵母表面穩(wěn)定表達(dá)蛋白作為表面錨定基序的方法，并且由于在使用熒光探針共軛的靶篩選文庫時使用熒光激活的細(xì)胞分選(FACS)，表面展示方法的優(yōu)勢在于其能夠高通量篩選(1×10⁹細(xì)胞/h)，并且與噬菌體展示的平移法相比具有較低的非特異本底。但是，表面展示系統(tǒng)需要蛋白文庫成功地突出細(xì)胞壁之外，同時使成功通過膜的蛋白穩(wěn)定地展示到細(xì)胞表面且共軛到細(xì)胞表面的蛋白沒有三維結(jié)構(gòu)改變(即保持蛋白活性)。為此目的，能夠輔助蛋白通過膜到達(dá)細(xì)胞表面的非常有效的信號序列以及所述蛋白需要成功地突出到細(xì)胞外，因此表面展示系統(tǒng)的限制在于展示在細(xì)胞表面的蛋白大小及蛋白數(shù)量等(Eric T.Boder and K.Dane Wittrup,1997.Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries.Nat.Biotech.15；553～57)。

因此，為克服目前篩選系統(tǒng)的限制，需要開發(fā)有效并且高效的篩選系統(tǒng)，其應(yīng)具有提高的篩選靈敏度并因此能夠篩選具有多種結(jié)合親和力(范圍從數(shù)毫摩爾到數(shù)納摩爾)的靶，并且具有高信噪比，因而能夠容易地從文庫內(nèi)的多種蛋白中篩選細(xì)胞中期望的蛋白和具有特異性結(jié)合的結(jié)合蛋白。

為解決上述問題，提供了當(dāng)將數(shù)種結(jié)合蛋白通過固定到單一基質(zhì)而鏈接到靶并且使用熒光介導(dǎo)的檢測方法增加信噪比時擴(kuò)增檢測信號的方法。開發(fā)的具有所述特征的測定方法的實例可包括使用具有自組裝性能的鐵蛋白通過納米組裝的交互式檢測方法(Sangkyu Lee et al.,2011.Small-Molecule-Based Nanoassemblies as Inducible Nanoprobes for Monitoring Dynamic Molecular Interactions Inside Live Cells.Angew Chem Int Ed Engl 50；8709-13)，使用納米顆粒作為固定化基質(zhì)用于與生物分子的相互作用和催化作用的方法(Wenwan Zhong.,2009.Nanomaterials in fluorescence-based biosensing.,394；47～59)。

最近，報道了通過將酶固定進(jìn)入包涵體(IB)蛋白(蛋白的不溶性沉淀)利用生物催化的研究(Jozef Nahalka,Bernd Nidetzky,2007.Fusion to a pull-down domain:a novel approach of producing trigonopsis variabilis D-amino acid oxidase as insoluble enzyme aggregates.Biotechnology and Bioengineering.97；454～61)。

包涵體(IB)通常是指無活性聚集體，但是近期的報道顯示某些包涵體是能夠保持蛋白質(zhì)大部分原有的生化活性的活性蛋白顆粒(Antonio Villaverd et al.,2005.Aggregation as bacterial inclusion bodies does not imply inactivation of enzymes and fluorescent proteins.Microbial Cell Factories 4；1-6)。當(dāng)將活性蛋白顆粒用作固定化基質(zhì)時，藉此向其固定酶和熒光蛋白，并測定所述酶和熒光蛋白的活性結(jié)果，顯示與未固定的酶和熒光蛋白的活性相比可保持高達(dá)30％到100％的活性，顯示出可有效地提高酶的穩(wěn)定性、再循環(huán)能力等，因此在酶工業(yè)中對利用活性蛋白顆粒的研究是非?；钴S的。

此前，本發(fā)明人已證實了來自纖維單胞菌(Cellulomonas fimi)的II型纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)可在大腸桿菌(E.coli)中通過自聚集形成包涵體(IB)，由此通過利用在真核細(xì)胞和細(xì)菌細(xì)胞中都可以表達(dá)的蛋白都可以聚集形成包涵體顆粒的現(xiàn)象，開發(fā)了檢測體內(nèi)生物分子間相互作用的方法(韓國專利公布公開No.10-2013-0023057)。但是，上述方法的限制在于其只允許檢測都可在體內(nèi)表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)生物分子之間的相互作用，并且由于其信噪比低而很難以單個細(xì)胞單位有效地區(qū)分并回收與靶物質(zhì)相互作用的結(jié)合物質(zhì)。此外，所述方法的限制在于靶物質(zhì)必須限于能夠在細(xì)胞內(nèi)合成的物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)、肽、核酸等，并且只有熒光蛋白可被用作熒光信號。也就是說，所述方法的缺點在于可從外部導(dǎo)入的多種形式的靶物質(zhì)無法被使用，并且多種形式的熒光化學(xué)物質(zhì)不能被用作熒光信號。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

技術(shù)問題

本發(fā)明開發(fā)了一種系統(tǒng)，可直接檢測生物分子和外界物質(zhì)之間發(fā)生的相互作用，其通過增加細(xì)胞壁透性以避免任何對包涵體上展示的結(jié)合蛋白活性和遺傳信息的影響，并且將外源靶物質(zhì)導(dǎo)入展示于包涵體上將與其互作的結(jié)合蛋白所在的細(xì)胞中，結(jié)果證實信噪比提高450倍或更高，由此可在單個細(xì)胞水平直接檢測物質(zhì)之間的相互作用。此外，本發(fā)明實質(zhì)上構(gòu)建了文庫并進(jìn)行了篩選，結(jié)果證實可通過分子之間的相互作用的高通量篩選而選擇性地回收能夠與靶蛋白相互作用的結(jié)合蛋白，并且發(fā)現(xiàn)通過最多2次重復(fù)篩選可檢測到納摩爾水平的高親和力結(jié)合物，從而完成本發(fā)明。

技術(shù)方案

本發(fā)明的一個目的是提供篩選文庫的方法，包括提供包含構(gòu)建的細(xì)胞文庫，所述構(gòu)建包含編碼含有結(jié)合蛋白和活性包涵體蛋白的融合蛋白的多核苷酸；在細(xì)胞文庫中表達(dá)所述融合蛋白，以此形成相互作用陷阱(IT)細(xì)胞，其中所述結(jié)合蛋白展示于包涵體上；通過增加細(xì)胞透性依據(jù)步驟(b)將熒光物質(zhì)共軛的靶物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞中；和基于共軛到靶物質(zhì)的熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度測定結(jié)合蛋白和靶物質(zhì)之間的相互作用并以單個細(xì)胞單位回收細(xì)胞。

本發(fā)明的另一個目的是提供測定結(jié)合蛋白和靶物質(zhì)之間相互作用的方法，包括提供細(xì)胞，其包含構(gòu)建，所述構(gòu)建包含對編碼含有結(jié)合蛋白和活性包涵體蛋白的融合蛋白的多核苷酸；在細(xì)胞中表達(dá)所述融合蛋白，以此形成相互作用陷阱(IT)細(xì)胞，其中所述結(jié)合蛋白展示于包涵體上；通過增加細(xì)胞透性依據(jù)步驟(b)將熒光物質(zhì)共軛的靶物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞中；和基于共軛到靶物質(zhì)的熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度測定結(jié)合蛋白和從細(xì)胞外導(dǎo)入的靶物質(zhì)之間的相互作用。

本發(fā)明的又一個目的是提供了細(xì)胞，其包括構(gòu)建，所述構(gòu)建包含對含有編碼結(jié)合蛋白和活性包涵體蛋白融合蛋白的多核苷酸。

本發(fā)明的又一個目的是提供了細(xì)胞文庫，其包括構(gòu)建，所述構(gòu)建包含編碼含有結(jié)合蛋白和活性包涵體蛋白的融合蛋白的多核苷酸。

本發(fā)明的又一個目的是提供了相互作用陷阱(IT)細(xì)胞和細(xì)胞文庫，其中表達(dá)了含有結(jié)合蛋白和活性包涵體蛋白的融合蛋白，并且將結(jié)合蛋白展示在包涵體上。

有益效果

本發(fā)明的方法提供了靶物質(zhì)的敏感標(biāo)記，其由于結(jié)合蛋白的過表達(dá)可相互作用，并由于與傳統(tǒng)篩選方法相比具有顯著更高的信噪比(提高450倍)而提高篩選效率，并且本發(fā)明的方法還可以單個細(xì)胞單位容易地分離細(xì)胞，因而可提供能夠使用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀從大量的文庫中篩選并分離相互作用蛋白的高通量篩選(HTS)技術(shù)。此外，不易體內(nèi)表達(dá)的任意外源靶物質(zhì)中的生物分子之間的相互作用可通過將其在細(xì)胞外表達(dá)后引入細(xì)胞中而迅速容易地測定。本發(fā)明可用于多個領(lǐng)域，包括開發(fā)抗體/人工抗體、制備新的相互作用蛋白以及測定并優(yōu)化靶蛋白和候選藥物之間的相互作用。

附圖說明

圖1：以示意圖示出了本發(fā)明代表性的圖解，表明細(xì)胞內(nèi)顆粒展示可高速測定物質(zhì)之間的相互作用，及使用其測定相互作用的結(jié)果；

圖2：以方法的視角示出了細(xì)胞內(nèi)顆粒展示技術(shù)的完整示意圖；

圖3：示出了相互作用陷阱(IT)細(xì)胞的圖像，其中使用可形成活性包涵體的CBD蛋白展示了結(jié)合蛋白(VLR)和熒光蛋白(mRFP)，并且僅在熒光顯微鏡下觀測了通過超聲破碎從IT細(xì)胞分離的包涵體；

圖4：示出了根據(jù)存在/不存在結(jié)合蛋白的活性包涵體展示測定用于本發(fā)明開發(fā)的增加細(xì)胞透性的細(xì)胞融化/冷凍過程影響的結(jié)果；

圖5：示出了流式細(xì)胞儀測定的結(jié)果，證實了雖然在本發(fā)明開發(fā)的增加細(xì)胞透性過程期間細(xì)胞冷凍過程可保持展示在活性包涵體上的結(jié)合蛋白的活性和表達(dá)，但其不足以導(dǎo)入外源靶物質(zhì)；

圖6：示出了流式細(xì)胞儀測定的結(jié)果，其證實了在本發(fā)明開發(fā)的增加細(xì)胞透性過程期間通過使用酸性溶液處理經(jīng)過細(xì)胞冷凍過程的包涵體細(xì)胞而導(dǎo)入外源靶物質(zhì)，其中A和B示出了依據(jù)酸性溶液的種類和pH導(dǎo)入外源靶物質(zhì)的結(jié)果，C示出了EDTA(能夠滲透外部細(xì)胞膜的螯合劑)和酸性溶液之間的透性結(jié)果；

圖7：示出的結(jié)果證實了通過圖6中優(yōu)化的透性而導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)的結(jié)合蛋白和外源靶物質(zhì)之間的相互作用，其中A所示的熒光圖像證實了結(jié)合蛋白和靶物質(zhì)之間的相互作用，B所示的基于靶物質(zhì)熒光強(qiáng)度的結(jié)果依據(jù)增加IT細(xì)胞透性之后的培養(yǎng)時間通過靶物質(zhì)和結(jié)合蛋白之間的相互作用確定了細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入靶物質(zhì)的水平；

圖8：示出了流式細(xì)胞儀測定結(jié)果，通過增加細(xì)胞透性的優(yōu)化方法經(jīng)由活性包涵體證實了結(jié)合蛋白和靶物質(zhì)之間的相互作用是能夠保持本質(zhì)特征的特異性結(jié)合；

圖9：示出了通過增加活性包涵體細(xì)胞的細(xì)胞透性檢測的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外變化的結(jié)果，其中圖9A示出了使用蛋白測定系統(tǒng)Experion^TM Pro260(Bio-rad)測定的通過增加細(xì)胞透性的細(xì)胞內(nèi)蛋白變化的結(jié)果，圖9B示出了在電子顯微鏡下觀測的增加細(xì)胞透性之前及其后活性包涵體細(xì)胞的變化；

圖10：示出的基于定量PCR(RT-PCR)的結(jié)果證實了即使在本發(fā)明開發(fā)的增加細(xì)胞透性的過程之后由于活性包涵體蛋白而大部分地保持了細(xì)胞內(nèi)結(jié)合蛋白的遺傳信息；

圖11a：示出的結(jié)果使用模式蛋白和模式靶物質(zhì)證實了經(jīng)過本發(fā)明開發(fā)的增加細(xì)胞透性過程的細(xì)胞內(nèi)顆粒展示，并且示出的流式細(xì)胞儀測定結(jié)果和熒光圖像結(jié)果證實了通過增加細(xì)胞透性導(dǎo)入外源靶物質(zhì)產(chǎn)生的結(jié)合蛋白和靶物質(zhì)之間的相互作用；

圖11b：示出的基于定量PCR(RT-PCR)和凝膠電泳測定的結(jié)果使用模式蛋白和模式靶物質(zhì)證實了經(jīng)過本發(fā)明開發(fā)的增加細(xì)胞透性過程的細(xì)胞內(nèi)顆粒展示，并且示出的結(jié)果證實了即使在本發(fā)明開發(fā)的增加細(xì)胞透性的過程之后大部分地保持了IT細(xì)胞中結(jié)合蛋白的遺傳信息；

圖11c：示出的使用流式細(xì)胞儀和電子顯微鏡測定的結(jié)果使用模式蛋白和模式靶物質(zhì)證實了經(jīng)過本發(fā)明開發(fā)的增加細(xì)胞透性方法的細(xì)胞內(nèi)顆粒展示，并且示出的結(jié)果證實了增加細(xì)胞透性之前或其后活性包涵體中的變化；

圖12：示出了使用本發(fā)明開發(fā)的增加細(xì)胞透性的過程利用C20通過多種不同分子量葡聚糖-FITC處理的細(xì)胞透性水平結(jié)果，C20為通過細(xì)胞內(nèi)顆粒展示技術(shù)獲得的葡聚糖-FITC共軛物；

圖13：示出了熒光圖像(A)，通過使用本發(fā)明開發(fā)的增加細(xì)胞透性的優(yōu)化方法將靶物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)依據(jù)對結(jié)合蛋白親和力的存在/不存在的蛋白之間相互作用的流式細(xì)胞儀測定結(jié)果(B)，以及使用增加細(xì)胞透性的優(yōu)化方法將靶物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)依據(jù)親和力差異存在/不存在的結(jié)合蛋白和靶物質(zhì)之間相互作用的流式細(xì)胞儀測定結(jié)果(C)；

圖14：示出的結(jié)果證實了可使用細(xì)胞內(nèi)顆粒展示篩選文庫。示出了將具有結(jié)合蛋白和靶物質(zhì)之間相互作用的包涵體細(xì)胞(PPI+)和不具有結(jié)合蛋白和靶物質(zhì)之間相互作用的包涵體細(xì)胞(PPI-)混合建立文庫類似環(huán)境后，使用流式細(xì)胞儀通過共軛到靶物質(zhì)的GFP的熒光分析細(xì)胞(其中結(jié)合蛋白與靶物質(zhì)相互作用)后回收具有高GFP熒光的10,000個大腸桿菌細(xì)胞(PPI+)，通過PCR擴(kuò)增測定的篩選效率結(jié)果。

圖15a：示出了使用實質(zhì)文庫通過細(xì)胞內(nèi)顆粒展示進(jìn)行篩選的結(jié)果，并且圖示了尋找多種靶結(jié)合蛋白的篩選過程的結(jié)果；

圖15b：示出了使用實質(zhì)文庫通過細(xì)胞內(nèi)顆粒展示進(jìn)行篩選的結(jié)果，并示出了全部結(jié)構(gòu)的示意圖，其中示出了氨基酸殘基，用于構(gòu)建用作模型結(jié)合蛋白的repebody隨機(jī)文庫；

圖15c：示出了使用實質(zhì)文庫通過細(xì)胞內(nèi)顆粒展示進(jìn)行篩選的結(jié)果，并使用流式細(xì)胞儀驗證了從文庫篩選所選擇的每種蛋白結(jié)合物與靶之間的相互作用；

圖16：示出了通過等溫滴定量熱法(ITC)的H2(其是篩選實質(zhì)文庫獲得的sfGFP蛋白結(jié)合物)的結(jié)合親和力測定結(jié)果；

圖17：示出了電子顯微鏡下觀測到的CBD活性包涵體蛋白的圖像；

圖18：示出了本發(fā)明的文庫篩選系統(tǒng)和傳統(tǒng)文庫篩選系統(tǒng)之間的比較結(jié)果。

具體實施方式

為實現(xiàn)上述目標(biāo)，一方面，本發(fā)明提供了靶物質(zhì)特異文庫的篩選方法，包括：(a)提供細(xì)胞文庫，其所含構(gòu)建包括編碼包含結(jié)合蛋白和活性包涵體蛋白的融合蛋白的多核苷酸；(b)在所述細(xì)胞文庫中表達(dá)融合蛋白，以形成相互作用陷阱(IT)細(xì)胞，其中結(jié)合蛋白展示在包涵體上；(c)通過增加細(xì)胞透性依據(jù)步驟(b)將熒光物質(zhì)共軛的靶物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞中；和(d)依據(jù)共軛到靶物質(zhì)的熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度測定結(jié)合蛋白和靶物質(zhì)之間的相互作用，并以單個細(xì)胞單位回收細(xì)胞。

步驟(c)的增加細(xì)胞透性的實施可無限制地通過本領(lǐng)域慣用的方法實施，只要增加細(xì)胞透性的方法不影響細(xì)胞內(nèi)包涵體上展示的結(jié)合蛋白活性和遺傳信息并且可允許靶物質(zhì)通過有縫隙的膜導(dǎo)入細(xì)胞即可。特別地，增加細(xì)胞透性的方法可包括冷凍細(xì)胞、融化冷凍的細(xì)胞以及使用酸性溶液處理細(xì)胞，例如(i)在-80℃到-10℃下冷凍細(xì)胞；(ii)在室溫到37℃下融化所冷凍的細(xì)胞；以及(iii)使用酸性溶液處理所述融化的細(xì)胞。酸性溶液的種類和pH可不具體限制，并且酸性溶液的pH可以是4到6。所述方法可以是優(yōu)化的方法，其可增加細(xì)胞透性而不影響細(xì)胞內(nèi)包涵體上展示的結(jié)合蛋白活性和遺傳信息并且可允許靶物質(zhì)通過有縫隙的膜導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，從而可將外源靶物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)并能產(chǎn)生結(jié)合蛋白和靶物質(zhì)之間的相互作用。

在本發(fā)明的一個示例性實施方案中，增加細(xì)胞透性方法的實施是通過將步驟(b)中的細(xì)胞(其中表達(dá)結(jié)合蛋白)離心形成沉淀；冷凍所得的細(xì)胞；在37℃融化所冷凍的細(xì)胞；并使用酸性溶液，并且尤其是使用0.1M檸檬酸(pH 4)處理。

本發(fā)明篩選文庫的方法還可包括獲得以單個細(xì)胞單位回收的細(xì)胞中存在的融合蛋白，以及分離和擴(kuò)增編碼融合蛋白的基因。蛋白回收或者基因的分離和擴(kuò)增可通過本領(lǐng)域廣泛使用的任意方法實施。

上述本發(fā)明的方法可代替?zhèn)鹘y(tǒng)的文庫篩選方法，例如核糖體展示、噬菌體展示和細(xì)胞表面展示。本發(fā)明的方法是用于測定相互作用的方法，能夠通過直接檢測外源靶蛋白與包涵體上展示的結(jié)合蛋白在活性包涵體中共定位的現(xiàn)象容易地檢測相互作用，其中含有結(jié)合蛋白的活性蛋白顆粒即CBD蛋白標(biāo)簽在細(xì)胞中形成在包涵體中，以用作IT細(xì)胞。特別地，本發(fā)明方法的優(yōu)點在于其以高濃度(≒3×10⁵蛋白/細(xì)胞,cf)將細(xì)胞內(nèi)結(jié)合蛋白過表達(dá)到包涵體中，并且敏感標(biāo)記與酵母表面表達(dá)系統(tǒng)相互作用的靶物質(zhì)(3×10⁴蛋白/細(xì)胞)，因此由于與傳統(tǒng)篩選方法相比可顯著提高信噪比而可提供更高的篩選效率，并且適用于多種結(jié)合親和力。此外，本發(fā)明方法的優(yōu)點在于即使使用痕量的靶物質(zhì)也可產(chǎn)生高信號強(qiáng)度，因此可證實與低表達(dá)率靶物質(zhì)的相互作用，并且其是一種高通量的篩選系統(tǒng)，其能夠基于共軛到靶物質(zhì)的熒光使用流式細(xì)胞儀分析在靶物質(zhì)和結(jié)合蛋白之間具有相互作用的細(xì)胞并且能夠通過簡單實驗和簡單方法篩選文庫，因為其是基于大腸桿菌的系統(tǒng)。

發(fā)明人證實了來自纖維單胞菌(Cellulomonas fimi)的II型纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)可在大腸桿菌(E.coli)中自聚集形成包涵體，并開發(fā)了用于檢測細(xì)胞內(nèi)生物分子之間相互作用的方法，這通過在真核細(xì)胞和細(xì)菌細(xì)胞中都可以表達(dá)的蛋白都可以聚集形成包涵體顆粒的現(xiàn)象(韓國專利申請公開No.10-2013-0023057)。

因此，在上述專利申請中發(fā)明人形成了IT細(xì)胞，其中使用能夠通過活性包涵體陷俘相互作用的CBD蛋白展示了具有實質(zhì)特征的結(jié)合蛋白(抗體、抗體模擬物、相互作用蛋白、配體結(jié)合蛋白、藥物靶蛋白等)。本發(fā)明人還開發(fā)了蛋白文庫篩選系統(tǒng)，其可利用本發(fā)明開發(fā)的增加細(xì)胞透性的優(yōu)化方法通過將外界靶物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)來直接檢測熒光共軛的靶物質(zhì)(例如蛋白、核酸或低分子量物質(zhì))和展示在包涵體上的結(jié)合蛋白之間的相互作用，并且還能夠通過高通量檢測單細(xì)胞水平的分子相互作用而選擇性地回收與靶物質(zhì)相互作用的結(jié)合蛋白(圖1)。

具體地，本發(fā)明開發(fā)的可作為特定特征的增加細(xì)胞透性的方法特征在于能夠在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定地保持結(jié)合蛋白的遺傳信息而并不丟失其中大部分，同時可穩(wěn)定地保持細(xì)胞內(nèi)在活性包涵體上展示的結(jié)合蛋白的活性及表達(dá)。

一般地，增加細(xì)胞透性的方法是用于通過化學(xué)/物理方法或者通過完全地移除細(xì)胞壁/膜使體內(nèi)生物分子胞外分泌的方法來增加細(xì)胞壁/膜透性的方法。也就是說，其可以是通過滲透作用、超聲波破碎機(jī)等完全破壞細(xì)胞的方法或者是使用甲苯等用于胞外分泌細(xì)胞內(nèi)蛋白及遺傳信息同時保留細(xì)胞形狀的方法(Hansruedi Felix.,1982.Permeabilized cells.Analytical Biochemistry 120；211-34)。

本發(fā)明開發(fā)的增加細(xì)胞透性的方法特征在于，即使將細(xì)胞透性增加到允許自由移動的程度，細(xì)胞內(nèi)/細(xì)胞外蛋白也不會將活性包涵體上展示的結(jié)合蛋白及遺傳信息丟失到細(xì)胞外，并且保持細(xì)胞形狀。

此外，在本發(fā)明的一個示例性實施方案中，證實活性包涵體的存在能夠影響結(jié)合蛋白中遺傳信息的存在，該結(jié)果與之前報道的在包涵體中發(fā)現(xiàn)了核糖體RNA、RNA聚合酶等一致(Ursula Rinas and James E.Bailey.,1992.Protein compositional analysis of inclusion bodies produced in recombinant Escherichia coli,Applied Microbiology and Biotechnology 37；609-14)。

也就是說，本發(fā)明通過在細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)結(jié)合蛋白已克服了現(xiàn)有表面表達(dá)系統(tǒng)的局限性(可展示蛋白的大小和數(shù)量以及細(xì)胞表面分泌的問題)，并且在包涵體中高濃度展示的結(jié)合蛋白的優(yōu)點在于其能夠敏感地標(biāo)記與結(jié)合蛋白相互作用的靶物質(zhì)，因而能夠顯示的信號強(qiáng)度比通過現(xiàn)有細(xì)胞表面表達(dá)獲得的信號強(qiáng)度高數(shù)百到數(shù)十萬倍，因此具有比現(xiàn)有篩選方法顯著提高的信噪比，從而使得能夠容易地測定生物材料之間的相互作用(圖18)。

此外，本發(fā)明不僅可保留結(jié)合蛋白的內(nèi)源活性，而且即使使用本發(fā)明開發(fā)的增加細(xì)胞透性的優(yōu)化方法之后，結(jié)合蛋白的遺傳信息也很少丟失，因為結(jié)合蛋白是展示在活性包涵體上的。

本文中，術(shù)語“融合蛋白”是指將兩種或更多種蛋白融合產(chǎn)生的蛋白，特別地融合蛋白包含結(jié)合蛋白和CBD蛋白。此外，可通過遺傳重組方法產(chǎn)生本發(fā)明的融合蛋白，具體地，結(jié)合蛋白的表達(dá)可通過將構(gòu)建轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞的方法來證實。此外，融合蛋白還可包含熒光蛋白。

本發(fā)明的構(gòu)建是重組載體，其可操作地連接了編碼本發(fā)明融合蛋白組成成分的多核苷酸。本文中，術(shù)語“可操作地連接”是指連接了表達(dá)控制序列以能夠控制編碼融合蛋白組成成分的多核苷酸的轉(zhuǎn)錄和翻譯，并且其還包括保留精確的翻譯框以使得由多核苷酸序列編碼的融合蛋白組成成分能夠通過所述多核苷酸在表達(dá)控制序列(包括啟動子)的控制下表達(dá)產(chǎn)生。

本文中，術(shù)語“結(jié)合蛋白”是指能夠與靶物質(zhì)相互作用的蛋白。結(jié)合蛋白可包括需要大規(guī)模生產(chǎn)用于商業(yè)應(yīng)用的蛋白，也可指選自抗體、抗體模擬物、相互作用蛋白、配體結(jié)合蛋白、藥物靶向蛋白等的結(jié)合蛋白，其可作為與靶物質(zhì)相互作用的受體，但不限于此。此外，結(jié)合蛋白不僅可以指能夠與靶蛋白相互作用的天然蛋白，也可以指負(fù)責(zé)結(jié)合功能的結(jié)構(gòu)域或多肽，但不限于此。

具體地，編碼結(jié)合蛋白的多核苷酸可以是來自包含編碼多種蛋白的基因的文庫的多核苷酸。其可從生物器官的全基因組獲得，例如全基因組DNA和cDNA文庫。此外，編碼結(jié)合蛋白和靶物質(zhì)的多核苷酸可從全基因組的子集例如扣除文庫或縮減文庫(sized library)中獲得。例如，結(jié)合蛋白可以是In-VLR5-c或In-VLR5c-D3E8，其是人工抗體蛋白，其中internaline B(InB)蛋白的N-末端、經(jīng)過修飾的可變淋巴細(xì)胞受體(VLR)蛋白重復(fù)單元、和VLR蛋白的C-末端共軛在一起(韓國專利No.10-1255682)。

本文中，術(shù)語“活性包涵體”是指蛋白質(zhì)，其具有能夠展示結(jié)合蛋白同時保持包涵體中表達(dá)的結(jié)合蛋白的內(nèi)源活性的特性，包括例如纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)蛋白、PhaC蛋白(來自Cupriavidus necator的聚羥基丁酸酯合成酶；Bjorn Steinmann,Andreas Christmann,Tim Heiseler,Janine Fritz,Harald Kolmar.,2010.In Vivo Enzyme Immobilization by Inclusion Body Display.Appl.Environ.Microbiol.76；5563-69)、口蹄疫病毒(FMDV)VP1衣殼蛋白(Antonio Villaverd et al.,2005.Aggregation as bacterial inclusion bodies does not imply inactivation of enzymes and fluorescent proteins.Microbial Cell Factories 4；1-6)等。

本文中，術(shù)語“纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)蛋白”是指來自纖維單胞菌的能夠結(jié)合纖維素的II型蛋白。根據(jù)本發(fā)明的一個示例性實施方式，CBD蛋白可包括那些能夠在大腸桿菌中形成包涵體的蛋白、能夠形成細(xì)胞內(nèi)活性顆粒且不影響與其共軛內(nèi)源蛋白的活性或特征的蛋白、以及能夠形成所有活性包涵體的蛋白而不限于CBD蛋白。

根據(jù)本發(fā)明的示例性實施方式，將富亮氨酸重復(fù)(LRR)蛋白InB-VLR的變體D3E8(韓國專利No.10-1255682)用作結(jié)合蛋白。D3E8是一種與IL6(即，一種靶物質(zhì))的結(jié)合親和力為2nM的蛋白，共軛到結(jié)合蛋白的蛋白設(shè)計如下。為產(chǎn)生只含InVLR5c(一種與IL6無結(jié)合親和力的蛋白)、mRFP(熒光蛋白)和II型CBD的融合蛋白，通過遺傳重組方式制備了pInVLR5c-mRFP-CBD質(zhì)粒載體。為產(chǎn)生含InVLR5c-D3E8(一種與IL6有結(jié)合親和力的結(jié)合蛋白)、mRFP(熒光蛋白)和II型CBD的融合蛋白，通過遺傳重組方式制備了pD3E8-mRFP-CBD質(zhì)粒載體。這些載體被轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌宿主并用作產(chǎn)生融合蛋白的因子(實施例2)。

本文中，術(shù)語“細(xì)胞”是指所有生物器官的基本功能、結(jié)構(gòu)單位。細(xì)胞可以是動物、植物、酵母或者細(xì)菌的細(xì)胞，且可以是細(xì)菌例如大腸桿菌、鏈霉菌及鼠傷寒沙門菌的細(xì)胞；酵母例如畢赤酵母的細(xì)胞；真菌的細(xì)胞；昆蟲例如果蠅的細(xì)胞及夜蛾Sf9細(xì)胞；動物例如中國倉鼠卵巢(CHO)、COS、NSO、293的細(xì)胞、弓形黑色素瘤細(xì)胞，但不限于此，特別地，是細(xì)菌細(xì)胞更特別地是大腸桿菌細(xì)胞。具體地，本發(fā)明的細(xì)胞可以是細(xì)菌細(xì)胞，其中通過過表達(dá)CBD蛋白形成活性包涵體，并且所述活性包涵體可用作IT細(xì)胞。

本文中，術(shù)語“IT細(xì)胞”是指一種細(xì)胞，其中將使用能夠表達(dá)結(jié)合蛋白和CBD蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞過表達(dá)以使得CBD蛋白形成包涵體同時使包涵體中表達(dá)的結(jié)合蛋白以高濃度展示且具有結(jié)合蛋白的內(nèi)源活性。IT細(xì)胞具體地是當(dāng)將外源靶物質(zhì)導(dǎo)入IT細(xì)胞內(nèi)時，能夠與在包涵體上展示的結(jié)合蛋白相互作用的細(xì)胞。

本文中，術(shù)語“靶物質(zhì)”是指能夠與結(jié)合蛋白相互作用的物質(zhì)。此外，靶物質(zhì)可不僅包括能夠與結(jié)合蛋白相互作用的天然蛋白，而且包括具有功能的部分結(jié)構(gòu)域或多肽，以及體內(nèi)不存在的化合物。特別地，靶物質(zhì)可以是可用于生物技術(shù)、醫(yī)學(xué)、藥理學(xué)等的有用候選物質(zhì)，或者是可產(chǎn)生體內(nèi)作用的物質(zhì)，具體地是蛋白質(zhì)、核酸或者化合物例如IL6。為了本發(fā)明的目標(biāo)，靶物質(zhì)的特征在于，其與結(jié)合蛋白不在一個細(xì)胞中同時表達(dá)，而是從外界導(dǎo)入的。也就是說，包涵體蛋白可用作IT細(xì)胞，其能夠展示結(jié)合蛋白并且靶物質(zhì)是從外界導(dǎo)入的。

本文中，術(shù)語“導(dǎo)入細(xì)胞”是指通過物理或化學(xué)方法將細(xì)胞外的物質(zhì)輸送到細(xì)胞內(nèi)。將外界物質(zhì)輸送進(jìn)入細(xì)胞時，所述物質(zhì)是靶物質(zhì)并且輸送包括增加細(xì)胞膜或細(xì)胞壁的透性以用于將靶物質(zhì)輸送進(jìn)入細(xì)胞的過程。有多種物理或化學(xué)方法能夠暫時地增加細(xì)胞膜或細(xì)胞壁透性(HANSRUEDI FELIX.,1982.Permeabilized Cells.Anal.Biochem.120；211-34)，例如超聲破碎、滲透作用、熱處理、冷凍、融化、酸溶液處理或其組合。根據(jù)發(fā)明的示例性實施方案，通過在-20℃下冷凍大腸桿菌細(xì)胞、在37℃下融化以及通過酸性溶液處理增加細(xì)胞膜或細(xì)胞壁的透性，將外源靶物質(zhì)通過有縫隙的膜導(dǎo)入細(xì)胞，同時保留了細(xì)胞中包涵體上展示的結(jié)合蛋白的活性和遺傳信息(實施例5)。

本文中，術(shù)語“熒光物質(zhì)”是指能夠反應(yīng)到一定的能量水平或自發(fā)地發(fā)出熒光的物質(zhì)，在本發(fā)明中其可指熒光蛋白和熒光化合物。本文中，術(shù)語“熒光蛋白”可指能夠反應(yīng)到一定的能量水平或自發(fā)地發(fā)出熒光的多肽，可選自：由綠色熒光蛋白(GFP)、增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)、修飾的綠色熒光蛋白(mGFP)、紅色熒光蛋白(RFP)、單體紅色熒光蛋白(mRFP)、增強(qiáng)型紅色熒光蛋白(ERFP)、Discosoma sp.紅色熒光蛋白(DsRed)、藍(lán)色熒光蛋白(BFP)、增強(qiáng)型藍(lán)色熒光蛋白(EBFP)、青色熒光蛋白(CFP)、青綠色熒光蛋白(CGFP)、增強(qiáng)型青色熒光蛋白(ECFP)、黃色熒光蛋白(YFP)、增強(qiáng)型黃色熒光蛋白(EYFP)、薊綠(AzG)、Heteractis crispa紅色熒光蛋白(HcRed)、和藍(lán)色熒光蛋白(BFP)所組成的組，但不限于此。此外，熒光化合物可指熒光團(tuán)，其能夠修飾靶物質(zhì)，并且可選自：由熒光蛋白、氧雜蒽衍生物(熒光素、羅丹明、俄勒岡綠、曙紅和德克薩斯紅)、青色素衍生物(青色素、吲哚羰花青、氧雜羰花青、硫雜羰花青和部花青)、萘衍生物(丹磺酰和氟硅酸鈉衍生物)、香豆素衍生物、惡二唑衍生物(吡啶惡二唑、硝基苯并惡二唑、苯并惡二唑)、芘衍生物(級聯(lián)藍(lán))、惡嗪衍生物(尼羅紅、尼羅藍(lán)、甲酚紫、惡嗪170)、吖啶衍生物(二氨基吖啶、吖啶橙和吖啶黃)、芳基次甲基衍生物(金胺、結(jié)晶紫和孔雀綠)和四吡咯衍生物(卟吩、酞菁和膽紅素)所組成的組，但不限于此。

本發(fā)明中，與結(jié)合蛋白形成融合蛋白的熒光蛋白以及修飾靶物質(zhì)的熒光物質(zhì)可產(chǎn)生不同波長的熒光。具體地，每種物質(zhì)發(fā)出熒光信號的波長可不同，使得熒光信號檢測器可基于其差異區(qū)別每種信號。

本發(fā)明中，結(jié)合蛋白可包含或不包含熒光蛋白，但是，靶物質(zhì)必須包含熒光蛋白或熒光物質(zhì)。

一個示例性實施方案中，編碼結(jié)合蛋白的質(zhì)粒pInVLR5c-mRFP-CBD和pD3E8-mRFP-CBD包含RFP作為熒光蛋白，在靶蛋白IL6的情況下，其包含GFP作為熒光蛋白。

本文中，術(shù)語“熒光信號”是指熒光蛋白或熒光物質(zhì)產(chǎn)生能量的波長，其可通過熒光信號檢測器用數(shù)值表示。

細(xì)胞內(nèi)熒光信號的測定可使用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀完成。一個示例性實施方案中，GFP和RFP的熒光是使用流式細(xì)胞儀FACS Calibur(BD Biosciences,CA,USA)分別通過檢測FL1(530/30nm)和FL2(585/42nm)PMT測定的。通過可增加細(xì)胞透性的優(yōu)化方法，將可結(jié)合GFP的IL6蛋白分別導(dǎo)入可表達(dá)對IL6(靶物質(zhì))有結(jié)合親和力的pD3E8-mRFP-CBD的包涵體細(xì)胞(PPI+)和可表達(dá)對IL6(靶物質(zhì))無結(jié)合親和力的pInVLR5c-mRFP-CBD的包涵體細(xì)胞(PPI-)中，通過GFP熒光可確定對IL6結(jié)合親和力的差異(圖11)。與通過現(xiàn)有技術(shù)方法共表達(dá)誘餌蛋白和結(jié)合物質(zhì)的細(xì)胞中獲得的結(jié)果(韓國專利申請公開No.10-2013-0023057)比較，現(xiàn)有技術(shù)方法是通過共軛到細(xì)胞內(nèi)包涵體上的結(jié)合物質(zhì)的熒光信號定位及分布的差異，依據(jù)是否存在與誘餌蛋白和結(jié)合物質(zhì)相互作用來測定蛋白之間的相互作用，而本發(fā)明的方法是測定靶物質(zhì)熒光信號的強(qiáng)度，靶物質(zhì)被通過可增加細(xì)胞透性的優(yōu)化方法從外界導(dǎo)入細(xì)胞后可通過相互作用結(jié)合到結(jié)合蛋白。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的方法得到顯著的結(jié)果，具有450倍或更高差異的信噪比，而現(xiàn)有技術(shù)的方法只具有微小差異，約2倍的信噪比(圖13)。

本發(fā)明的一個示例性實施方案中，將D3E8和InVLR5c用作結(jié)合蛋白，來自Cellulomonas fimi的II型CBD蛋白作為活性包涵體，IL6作為靶蛋白。但是，本發(fā)明不限于此，對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的是任意類型的結(jié)合蛋白、靶物質(zhì)和活性包涵體可用于測定結(jié)合蛋白和靶物質(zhì)之間的相互作用。

本發(fā)明的方法還可包括(e)基于上述步驟(d)后測定的熒光強(qiáng)度以單個細(xì)胞單位回收細(xì)胞，還可包括回收存在于回收的細(xì)胞中的融合蛋白或者分離和擴(kuò)增編碼融合蛋白的基因。回收蛋白及分離和擴(kuò)增基因可通過本領(lǐng)域廣泛使用的方法實現(xiàn)。

本文中，術(shù)語“回收”是指測定共軛到靶物質(zhì)的熒光物質(zhì)的熒光信號后從含有結(jié)合蛋白的細(xì)胞文庫中選擇僅經(jīng)證實在結(jié)合蛋白和靶物質(zhì)之間存在相互作用的那些細(xì)胞的過程。流式細(xì)胞儀可以是能夠測定細(xì)胞大小、細(xì)胞內(nèi)組合物和熒光強(qiáng)度的裝置，特別是由實驗人員依據(jù)所需的細(xì)胞大小、細(xì)胞內(nèi)組合物及熒光強(qiáng)度能夠分離和回收單個細(xì)胞的裝置。

本文中，術(shù)語“分離”是指從含有結(jié)合蛋白的細(xì)胞文庫中回收經(jīng)證實存在結(jié)合蛋白和靶物質(zhì)之間相互作用的細(xì)胞后，從細(xì)胞中隔離編碼結(jié)合蛋白的多核苷酸的過程。分離可以是指從細(xì)胞中分離DNA。DNA分離可通過本領(lǐng)域已知的任意方法實施，只要其與將編碼結(jié)合蛋白的多核苷酸分離的受試者不相抵觸即可。

本文中，術(shù)語“擴(kuò)增”是指通過本領(lǐng)域公知的一般的多核苷酸擴(kuò)增方法使上述分離的編碼結(jié)合蛋白的多核苷酸大量增加的過程。依據(jù)所擴(kuò)增的多核苷酸的用途可選擇擴(kuò)增方法，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地進(jìn)行該選擇。

本發(fā)明的一個示例性實施方案中，檢測了是否存在結(jié)合親和力的差異可依據(jù)在包涵體上展示的結(jié)合蛋白和靶物質(zhì)之間的相互作用通過共軛到靶物質(zhì)的GFP熒光強(qiáng)度差異使用高通量流式細(xì)胞儀測定；將IT細(xì)胞(其中將與IL6結(jié)合親和力約2nM的LRR蛋白D3E8(PPI+)展示在包涵體上)、IT細(xì)胞(其中將與IL6結(jié)合親和力約117nM的LRR蛋白F11(PPI+)展示在包涵體上)和IT細(xì)胞(其中將InVLR5c(PPI-)展示在包涵體上)分別以1:10:10000的比率混合形成類似文庫的環(huán)境；并使用流式細(xì)胞儀(FACSaria)從樣品中回收10,000個對IL6具有高親和力的大腸桿菌細(xì)胞，其將用于增加透性及導(dǎo)入蛋白相互作用。從回收的細(xì)胞中純粹提取質(zhì)粒，然后將其轉(zhuǎn)化進(jìn)入DH5α大腸桿菌細(xì)胞。將形成的菌落用于PCR擴(kuò)增，并基于表型(D3E8-mRFP-CBD蛋白)檢測回收的細(xì)胞中是否存在基因回收產(chǎn)物(圖14)。

由于本發(fā)明的方法使用在細(xì)胞中過表達(dá)并共軛到包涵體中的結(jié)合蛋白，信號強(qiáng)度水平比通過現(xiàn)有細(xì)胞表面表達(dá)所獲得的熒光信號高數(shù)百到數(shù)十萬倍，因此基于該結(jié)果本發(fā)明的方法可用于多種蛋白質(zhì)工程包括蛋白文庫篩選，其包括分類形成單個細(xì)胞單位。

另一方面，本發(fā)明提供了測定結(jié)合蛋白和靶物質(zhì)之間相互作用的方法，包括(a)提供包含構(gòu)建的細(xì)胞文庫，所述構(gòu)建包含編碼含結(jié)合蛋白和活性包涵體蛋白的融合蛋白的多核苷酸；(b)在細(xì)胞文庫中表達(dá)融合蛋白，以此形成相互作用陷阱(IT)細(xì)胞，其中將結(jié)合蛋白展示在包涵體上；(c)通過增加細(xì)胞透性，依據(jù)步驟(b)將熒光物質(zhì)共軛的靶物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞中；以及(d)基于共軛到靶物質(zhì)的熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度測定結(jié)合蛋白和靶物質(zhì)之間的相互作用。

步驟(c)中增加細(xì)胞透性的方法可通過本領(lǐng)域常用的任意方法實施，不受限制，只要該方法不影響細(xì)胞內(nèi)包涵體上展示的結(jié)合蛋白的活性和遺傳信息并允許將靶物質(zhì)通過有縫隙的細(xì)胞導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)即可。具體地，還可包含冷凍步驟、融化步驟以及使用酸性溶液處理步驟，例如(i)在-80℃到-10℃下冷凍細(xì)胞；(ii)在室溫到37℃下融化冷凍的細(xì)胞；和(iii)使用酸性溶液處理融化的細(xì)胞。酸性溶液的種類及pH不受限制，例如酸性溶液的pH可以是4到6。因此，方法可以是細(xì)胞透性的優(yōu)化過程，由于外源靶物質(zhì)的導(dǎo)入可穩(wěn)定保持細(xì)胞中的結(jié)合蛋白和遺傳信息以及結(jié)合蛋白和靶物質(zhì)之間的相互作用。

本發(fā)明一個示例性的實施方案中，增加細(xì)胞透性的方法的實施通過包括以下的方法：在步驟(b)中將其中表達(dá)了結(jié)合蛋白的細(xì)胞離心形成沉淀，然后在-20℃下冷凍，在37℃下融化沉淀并用酸性溶液(具體地使用0.1M檸檬酸(pH4))處理。

本文中，術(shù)語“微生物”是指能夠表達(dá)包含本發(fā)明的結(jié)合蛋白和活性包涵體蛋白的融合蛋白從而將融合蛋白展示在細(xì)胞內(nèi)包涵體中的所有種類細(xì)胞。微生物可以是真核細(xì)胞或原核細(xì)胞，但不限于此，其可以是例如大腸桿菌。

增加細(xì)胞透性的現(xiàn)有技術(shù)是針對細(xì)胞透性本身以通過將細(xì)胞內(nèi)蛋白和遺傳信息釋放到細(xì)胞外來獲得蛋白和遺傳信息的技術(shù)，因此其意圖通過增加細(xì)胞透性完全釋放細(xì)胞內(nèi)蛋白和遺傳信息。但是，本發(fā)明人意圖建立能夠平和地將靶物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)而不影響展示在活性包涵體上的結(jié)合蛋白的活性和遺傳信息的增加細(xì)胞透性方法，從而建立了本發(fā)明可增加細(xì)胞透性的方法。

因此，根據(jù)本發(fā)明的增加微生物膜的細(xì)胞透性的方法具有突出的效果，其能夠穩(wěn)定地保持微生物細(xì)胞內(nèi)包涵體上展示的結(jié)合蛋白的活性和遺傳信息，并且在保持細(xì)胞形狀的同時將外源靶物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。

在本發(fā)明的一個示例性實施方案中，增加細(xì)胞透性的實施通過方法包括：將微生物(大腸桿菌)離心形成沉淀，然后在-20℃下冷凍，在37℃下融化沉淀并用酸性溶液處理，具體地使用0.1M檸檬酸(pH 4)處理。因此，外源靶蛋白組成IT細(xì)胞，其相應(yīng)于細(xì)胞透性而增加，使得可將外源靶物質(zhì)自由導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，并且經(jīng)證實使用IT細(xì)胞使得對蛋白之間相互作用的測量具有高靈敏度，以此使其可獲得遺傳信息。

另一方面，本發(fā)明提供了包含構(gòu)建的細(xì)胞，所述構(gòu)建包含編碼含有結(jié)合蛋白和活性包涵體蛋白的融合蛋白的多核苷酸。

結(jié)合蛋白、活性包涵體蛋白、融合蛋白和細(xì)胞如上文所述。

在本發(fā)明一個示例性實施方案中，LRR蛋白用作結(jié)合蛋白、CBD蛋白用作活性包涵體蛋白、IL6蛋白用作靶物質(zhì)，并且IT細(xì)胞是通過將編碼結(jié)合蛋白和CBD蛋白之間的融合蛋白轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞而形成的。

又一方面，本發(fā)明提供了包含構(gòu)建的細(xì)胞文庫，其包括編碼含結(jié)合蛋白和活性包涵體蛋白的融合蛋白的多核苷酸。所述文庫可以是DNA文庫或DNA文庫轉(zhuǎn)化所得的細(xì)胞文庫。

結(jié)合蛋白、活性包涵體蛋白、融合蛋白和細(xì)胞如上文所述。

本文中，術(shù)語“細(xì)胞文庫”是指由包含編碼與靶物質(zhì)相互作用的結(jié)合蛋白的質(zhì)粒的細(xì)胞組成的文庫，具體地可指由結(jié)合蛋白穩(wěn)定地展示在包涵體中并且可將靶物質(zhì)導(dǎo)入其中的細(xì)胞組成的文庫。細(xì)胞文庫具體地可包含大腸桿菌細(xì)胞，但不限于此。

在本發(fā)明的一個示例性實施方案中，使用通過將分別展示在包涵體上的D3E8(PPI+)[與IL6(即靶物質(zhì))的親和力約2nM的LRR蛋白]細(xì)胞、F11(PPI+)[與IL6的親和力約117nM的LRR蛋白]細(xì)胞和InVLR5c(PPI-)[與IL6沒有親和力的LRR蛋白]細(xì)胞以1:10:10000的比率混合制備的操作型模擬物文庫。在本發(fā)明另一個示例性實施方案中，構(gòu)建了關(guān)于repebody(LRR蛋白)的隨機(jī)文庫用于通過細(xì)胞內(nèi)顆粒展示系統(tǒng)進(jìn)行篩選，并用作有效的文庫。

又一方面，本發(fā)明提供了IT細(xì)胞，其中表達(dá)包含結(jié)合蛋白和活性包涵體蛋白的融合蛋白并且結(jié)合蛋白展示在包涵體上，以及相關(guān)的細(xì)胞文庫。

結(jié)合蛋白、活性包涵體蛋白、融合蛋白、細(xì)胞和細(xì)胞文庫如上文所述。

實施例

下文中，將通過實施例對本發(fā)明詳細(xì)描述。但是，文中公開的實施例僅用作說明目的，而不應(yīng)被理解為限定本發(fā)明的范圍。

實施例1—基因和酶的獲得

使用從韓國典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC)獲得的Cellulomonas fimi KCTC9143株系的外切葡聚糖酶基因克隆II型纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)基因。改良修飾的綠色熒光蛋白(GFP)基因從商業(yè)載體pEGFP(Clontech,CA,USA)獲得，且含mRFP1(單體紅色熒光蛋白1)基因的質(zhì)粒載體pRFP由韓國科學(xué)與技術(shù)高等研究院(KAIST)(Daejeon,Korea)提供。使用了對IL6無結(jié)合親和力的可變淋巴細(xì)胞受體(VLR)蛋白In-VLR5-c(韓國專利申請公開No.10-2010-0086055)，和repebody(InB-VLR)家族當(dāng)中對IL6有結(jié)合親和力的In-VLR5c-D3E8(KD＝2nM)、In-VLR5c-F11(KD＝117nM)，其為人工蛋白，其中internaline B(InB)蛋白的N-末端，經(jīng)過修飾的重復(fù)單元，和VLR蛋白的C-末端共軛在一起。人白細(xì)胞介素-6(hIL6)是其中克隆了hIL6基因的載體。上述所有基因由KAIST(Daejeon,韓國)提供，本發(fā)明使用的所有酶均購自New England Biolabs(NEB,英格蘭)。

實施例2—重組載體構(gòu)建

本發(fā)明使用的所有引物由Bioneer Corporation(Daejeon,韓國)合成。引物見下表1所示。表1中限制性位點例如NdeI和KpnI用粗體顯示。本發(fā)明中使用的所有基因使用表1中所示各自的引物擴(kuò)增，通過重疊延伸PCR共軛，插入pET21a載體的NdeI和HindIII限制性位點，并使用大腸桿菌DH5α細(xì)胞重組。由此制備的質(zhì)粒載體分別命名為pInVLR5c-mRFP-CBD、pD3E8-mRFP-CBD、pF11-mRFP-CBD、pGFP-IL6。此外，將pInVLR5c-mRFP-CBD質(zhì)粒使用限制性酶NdeI和HindIII處理后插入用NdeI和HindIII處理的pET21a載體中，并使用大腸桿菌DH5α細(xì)胞重組。由此制備的質(zhì)粒載體命名為pInVLR5c-mRFP。

表1

In-VLR5c-D3E8和In-VLR5c-F11基因擴(kuò)增使用引物1(SEQ ID NO:1)和引物2(SEQ ID NO:2)，且In-VLR5c基因擴(kuò)增使用引物1(SEQ ID NO:1)和引物7(SEQ ID NO:7)，分別從克隆了In-VLR5c-D3E8、In-VLR5c-F11和In-VLR5c基因的載體擴(kuò)增。mRFP1基因是使用引物3(SEQ ID NO:3)和引物4(SEQ ID NO:4)從克隆了mRFP1基因的載體擴(kuò)增的，且GFP基因是使用引物8(SEQ ID NO:8)和引物9(SEQ ID NO:9)從pEGFP基因擴(kuò)增的。CBD基因是使用引物5(SEQ ID NO:5)和引物6(SEQ ID NO:6)從CBD擴(kuò)增的(見J Microbiol Biotechnol.2008Mar；18(3):443-8)，且hIL6基因是使用引物10(SEQ ID NO:10)和引物11(SEQ ID NO:11)從克隆了hIL6基因的載體擴(kuò)增的。

實施例3—質(zhì)粒提取

將實施例2中制備的質(zhì)粒pInVLR5c-mRFP-CBD、pD3E8-mRFP-CBD、pF11-mRFP-CBD和pInVLR5c-mRFP轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌DH5α，接種到含氨芐西林(50μg/mL)的LB培養(yǎng)基(1％細(xì)菌培養(yǎng)用蛋白胨、0.5％酵母提取物和1％NaCl)中，在37℃下震蕩水浴孵育24小時。使用離心機(jī)(Universal 320R,Hettich)將培養(yǎng)的細(xì)胞懸液4,470×g離心5分鐘，使用spin miniprep kit從棄去上清液的沉淀中提取質(zhì)粒，通過電泳在1％瓊脂糖凝膠中驗證提取的質(zhì)粒。

此外，將實施例2中制備的pGFP-IL6質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌DH5α，接種到含氨芐西林(50μg/mL)的LB培養(yǎng)基(1％細(xì)菌培養(yǎng)用蛋白胨、0.5％酵母提取物和1％NaCl)中，在37℃震蕩水浴孵育24小時。使用離心機(jī)(Universal 320R,Hettich)將培養(yǎng)的細(xì)胞懸液4,470×g離心5分鐘，使用spin miniprep kit從棄去上清液的沉淀中提取質(zhì)粒，所分離質(zhì)粒的大小及核苷酸序列通過1％瓊脂糖凝膠電泳然后序列分析驗證。

實施例4—蛋白表達(dá)及純化

將實施例2中制備的質(zhì)粒pD3E8-mRFP-CBD、pInVLR5c-mRFP-CBD和pInVLR5c-mRFP轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌BL21(DE3)，接種到含氨芐西林(50μg/mL)的LB培養(yǎng)基(1％細(xì)菌培養(yǎng)用蛋白胨、0.5％酵母提取物和1％NaCl)中，在37℃震蕩水浴孵育。當(dāng)600nm的光密度(OD)達(dá)到0.5時，向培養(yǎng)物中加入異丙基-1-硫代β-D-半乳糖苷(IPTG；200μM)誘導(dǎo)CBD包涵體，并在30℃培養(yǎng)5小時。使用熒光顯微鏡(ZEISS)驗證培養(yǎng)的細(xì)胞中存在的蛋白和蛋白包涵體(圖3)。

將pGFP-IL6質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌OrigamiB(DE3)，接種到含氨芐西林(50μg/mL)的LB培養(yǎng)基(1％細(xì)菌培養(yǎng)用蛋白胨、0.5％酵母提取物和1％NaCl)中，在37℃震蕩水浴孵育。當(dāng)600nm的OD達(dá)到0.5時，向培養(yǎng)物中加入異丙基-1-硫代β-D-半乳糖苷(IPTG；200μM)以表達(dá)hIL6蛋白，并在30℃培養(yǎng)5小時。使用熒光顯微鏡驗證培養(yǎng)的細(xì)胞中表達(dá)的GFP-hIL6蛋白。將經(jīng)過證實表達(dá)了融合蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)物在冰上超聲破碎以破碎細(xì)胞膜，通過20,000×g離心20分鐘再次分離裂解的細(xì)胞以除去沉淀，使用0.2μm過濾器將上清液過濾并經(jīng)歷隨后的純化過程。通過連接到快速高效液相色譜(FPLC)的親和層析柱HiTrapTM Q HP(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)使用GFP-hIL6的N-末端表達(dá)的6×His-tag純化蛋白，用PBS緩沖液(pH 7.4)脫鹽，使用離心過濾器(SartoriusStedim Biotech)濃縮至40mg/mL的濃度，并在-20℃儲存用于以下實施例。通過SDS-PAGE分析純化的GFP-hIL6蛋白。

實施例5—增加IT細(xì)胞的透性

為將外源靶物質(zhì)導(dǎo)入實施例4中培養(yǎng)的pD3E8-mRFP-CBD細(xì)胞或pInVLR5c-mRFP-CBD細(xì)胞，使用了本發(fā)明開發(fā)的增加細(xì)胞透性的優(yōu)化方法。將大腸桿菌細(xì)胞培養(yǎng)物在2,480×g離心5分鐘，將沉淀于-20℃下冷凍。使用PBS緩沖液(pH 7.4)在37℃下融化冷凍的大腸桿菌細(xì)胞，2,480×g離心5分鐘，并去除上清液。將所得的大腸桿菌細(xì)胞用0.1M檸檬酸(pH 4)處理，離心去除上清液，并使用PBS緩沖液(pH 7.4)重懸浮。

實施例6—依據(jù)包涵體展示的存在測定有縫隙細(xì)胞的基因

將實施例4中培養(yǎng)的pInVLR5c-mRFP-CBD細(xì)胞的透性以與實施例5中相同的方式增加，使用離心機(jī)(Universal 320R,Hettich)4,470×g離心5分鐘，并分為細(xì)胞上清液和沉淀。以與細(xì)胞上清液相等的量，使用PBS緩沖液(pH 7.4)將沉淀重懸浮。將細(xì)胞上清液和沉淀重懸液分別與iQTMGreen supermix(Bio-rad)以1:1比率混合，分別用10pmol引物13(SEQ ID NO:13)和引物14(SEQ ID NO:14)處理，使用定量PCR裝置CFX96(Bio-rad)測定DNA的量。

實施例7—構(gòu)建基于蛋白結(jié)構(gòu)的結(jié)合蛋白文庫

為構(gòu)建repebody文庫，將LRR蛋白用作模型結(jié)合蛋白，以相同的方式使用韓國專利No.10-1356075中所用的方法。使用repebody選擇兩種突變單元(LRRV單元1和2)凹陷區(qū)91、93、94、115、117和118位點的6種氨基酸殘基。然后將選擇的氨基酸用NNK簡并密碼子替換，以此合成的突變引物用于文庫構(gòu)建。然后，使用所述引物對所述兩種單元進(jìn)行重疊PCR以獲得文庫DNA，并將文庫基因取代并插入重組載體pInVLR5c-mRFP-CBD中的InVLR5c基因位點，以此固定連接到mRFP-CBD基因的文庫質(zhì)粒。將以此方式固定的文庫通過電穿孔導(dǎo)入大腸桿菌DH5α中獲得轉(zhuǎn)化子，從而構(gòu)建1×10⁷變異水平的文庫。

實施例8—構(gòu)建在活性包涵體上展示的表達(dá)文庫

使用儲存緩沖液(2×TY培養(yǎng)基、50％甘油、20％葡萄糖)回收實施例7中制備的文庫菌落，并4,470×g離心5分鐘。棄去上清后，使用Spin Miniprep Kit分離沉淀中的文庫質(zhì)粒。通過電穿孔將提取的文庫質(zhì)粒(1μg)轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌BL21(DE3)，從而構(gòu)建具有1×10⁷變異水平的表達(dá)文庫。使用儲存緩沖液回收表達(dá)文庫菌落，在OD₆₀₀為0.05時收集細(xì)胞并接種到含氨芐西林(50μg/mL)的LB培養(yǎng)基(1％細(xì)菌培養(yǎng)用蛋白胨、0.5％酵母提取物和1％NaCl)中，在37℃下震蕩水浴孵育。當(dāng)OD₆₀₀值達(dá)到0.5時，用200μM IPTG處理培養(yǎng)物以誘導(dǎo)CBD包涵體，并在30℃下培養(yǎng)3小時。將培養(yǎng)的細(xì)胞離心并棄去上清，將沉淀于-20℃下冷凍。

實施例9：使用流式細(xì)胞儀測定蛋白之間的相互作用

將經(jīng)過增加細(xì)胞透性處理的pD3E8-mRFP-CBD(PPI+)或pInVLR5c-mRFP-CBD(PPI-)表達(dá)的IT細(xì)胞懸液分別用實施例4中純化和分離的GFP-IL6蛋白(10μM)處理，攪拌30分鐘以將外源靶物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞，以此誘導(dǎo)蛋白之間的相互作用。30分鐘后，使用PBST、PBS緩沖液(pH 7.4)洗滌細(xì)胞，并使用熒光顯微鏡(圖13A)或流式細(xì)胞儀(圖13B)測定結(jié)合蛋白和靶物質(zhì)之間的相互作用。

使用FACS Calibur(BD Biosciences,CA,USA)實施流式細(xì)胞術(shù)，并依據(jù)SSC和FSC參數(shù)設(shè)定測定閾值。分別使用FL1(530/30nm)和FL2(585/42nm)PMT檢測GFP和RFP熒光，以比率(FL1-FL2:FL2-FL1＝16％:16％)設(shè)定補(bǔ)償，每種樣本計數(shù)10,000個事件。使用BD CellQuest Pro(version 4.0.2,145BD Biosciences)軟件收集數(shù)據(jù)，并使用Flowjo software(version 10)分析。

實施例10—通過細(xì)胞內(nèi)顆粒展示篩選文庫

通過實施例5的方法增加在實施例8中制備的冷凍沉淀的細(xì)胞透性后，將共軛到GFP的多種靶(mGFP-IL6、sfGFP.熒光素和葡聚糖-FITC)誘導(dǎo)以分別產(chǎn)生與其中展示了結(jié)合蛋白文庫的包涵體的相互作用，并收集相互作用細(xì)胞。使用FACSaria^TM III(BD Biosciences,CA,USA)分揀相互作用細(xì)胞，并基于SSC和FSC參數(shù)設(shè)定測定閾值。分別使用FL1(530/30nm)和FL2(585/42nm)PMT檢測GFP和RFP熒光，以比率(PE-FITC:FITC-PE＝28.62:4.29)設(shè)定補(bǔ)償，每種樣本計數(shù)10,000個事件。使用BD FACS Diva(version 7.0BD Biosciences)軟件收集數(shù)據(jù)，并使用Flowjo software(version 10)分析。

實施例11—電子顯微鏡(SEM、TEM)測定

將經(jīng)過實施例5處理的大腸桿菌細(xì)胞在多聚甲醛-戊二醛固定劑(4℃,磷酸鹽緩沖液,pH 7.2)中預(yù)固定2小時，用磷酸鹽緩沖液(0.1M,pH 7.2)洗滌3次，每次10分鐘，在1％的OsO4(25℃,0.1M磷酸鹽緩沖液,pH 7.2)中后固定2小時。完成固定后，使用相同的緩沖液洗滌物質(zhì)數(shù)次，用增加濃度的乙醇脫水，用醋酸異戊酯取代，使用臨界點干燥器干燥，使用SC502濺射鍍膜機(jī)覆膜至20nm厚度，并使用安裝于韓國科學(xué)與技術(shù)研究院(KRIBB)的FEI Quanta 250FEG(FEI,USA)掃描電子顯微鏡(SEM)在10kV下觀察。

為通過透射電子顯微鏡觀察，將選取的部分在多聚甲醛-戊二醛固定劑(4℃,磷酸鹽緩沖液,pH 7.2)中預(yù)固定2小時，用磷酸鹽緩沖液(0.1M,pH 7.2)洗滌3次，每次10分鐘，并在1％的OsO4(25℃,0.1M磷酸鹽緩沖液,pH 7.2)中后固定2小時。完成固定后，使用相同的緩沖液洗滌物質(zhì)數(shù)次，用增加濃度的乙醇脫水，用環(huán)氧丙烷取代，使用臨界點干燥器干燥，使用SC502濺射鍍膜機(jī)覆膜至20nm厚度，植入Epon-812，并在60℃爐中聚合36小時。使用超薄切片機(jī)(ULTRACUT E,Leica Microsystems,Australia)將包埋的組織制備成超薄切片，用醋酸鈾酰和檸檬酸鉛雙染，并使用透射電子顯微鏡(TEM,CM 20,Philips,the Netherlands)在10kV下觀察。

實施例12—在包涵體上展示結(jié)合蛋白

為證實CBD包涵體是能夠穩(wěn)定保持展示的結(jié)合蛋白的活性及表達(dá)的活性包涵體，將結(jié)合蛋白VLR(InVLR5c)和熒光蛋白mRFP共軛到CBD標(biāo)簽并在大腸桿菌中過表達(dá)，從而形成包涵體細(xì)胞。通過超聲破碎分離包涵體，并通過熒光顯微鏡檢測。在包涵體的位置檢測到熒光蛋白mRFP的熒光，從而證實了結(jié)合蛋白例如VLR和mRFP已展示在CBD包涵體上。在超聲破碎分離的包涵體中也檢測到mRFP的熒光，從而證實CBD包涵體能夠穩(wěn)定展示結(jié)合蛋白同時保持結(jié)合蛋白的活性(圖3)。

實施例13—增加細(xì)胞透性對細(xì)胞內(nèi)/外的影響

為證實本發(fā)明開發(fā)的增加細(xì)胞透性的方法對細(xì)胞的影響，使用VLR-mRFP-CBD細(xì)胞(其中結(jié)合蛋白和RFP蛋白展示在包涵體上)和VLR-mRFP細(xì)胞(其中結(jié)合蛋白和RFP熔合蛋白未展示)進(jìn)行實驗。使用VLR-mRFP-CBD細(xì)胞(其中結(jié)合蛋白展示在活性包涵體上)和VLR-mRFP細(xì)胞(無包涵體)實施增加細(xì)胞透性的兩步方法(冷凍/融化和酸性溶液處理)，使用流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡檢測兩種不同細(xì)胞之間的差異。

增加細(xì)胞透性處理過程中，冷凍和融化后存在/不存在包涵體的細(xì)胞內(nèi)變化使用流式細(xì)胞儀和熒光影像測定(圖4)。結(jié)果證實，當(dāng)結(jié)合蛋白展示在活性包涵體上時，即使冷凍/融化步驟后結(jié)合蛋白也可穩(wěn)定地保持其在細(xì)胞中的表達(dá)；但是當(dāng)結(jié)合蛋白未展示在包涵體上時，細(xì)胞中大多數(shù)結(jié)合蛋白會失去。該結(jié)果顯示，冷凍/融化步驟可增加細(xì)胞壁的細(xì)胞透性以此將細(xì)胞內(nèi)的分子釋放到細(xì)胞外，或者由于結(jié)合蛋白被穩(wěn)定地展示在包涵體上，其保留在細(xì)胞內(nèi)而未流失到細(xì)胞外。

另外，對于將外源靶物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)證實雖然細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入不能通過冷凍/融化步驟單獨實現(xiàn)(圖5)，但是當(dāng)使用酸性溶液或EDTA螯合劑處理經(jīng)過冷凍/融化處理的包涵體細(xì)胞時可能會產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入(圖6)。如圖6所示，經(jīng)證實細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入外源靶物質(zhì)最有效的方法是用0.1M檸檬酸(pH 4)處理，以此實現(xiàn)優(yōu)化的膜處理。

在熒光影像中觀察通過增加細(xì)胞透性的優(yōu)化方法轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)并展示在包涵體上的外源靶物質(zhì)和結(jié)合蛋白之間的相互作用(圖7A)，作為流式細(xì)胞儀的結(jié)果，靶物質(zhì)在短時間內(nèi)(1分鐘)進(jìn)入細(xì)胞并與結(jié)合蛋白相互作用(圖7B)，證實了有縫隙的細(xì)胞膜是靶物質(zhì)能夠容易地移動的狀態(tài)。

圖8的結(jié)果證實了通過增加細(xì)胞透性的優(yōu)化方法導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的外源靶物質(zhì)和包涵體上展示的結(jié)合蛋白之間的相互作用不是非特異性的而是特異性的，其基于對靶物質(zhì)親和力的程度在保持結(jié)合蛋白內(nèi)源活性的狀態(tài)下相互作用。

為通過活性包涵體展示的存在/不存在證實保持結(jié)合蛋白的遺傳信息，通過本發(fā)明開發(fā)的增加細(xì)胞透性的優(yōu)化方法將結(jié)合蛋白展示在包涵體上的VLR-mRFP-CBD細(xì)胞和無包涵體的VLR-mRFP細(xì)胞分離為沉淀和上清液。然后，通過定量PCR(Q-PCR)證實經(jīng)過增加細(xì)胞透性方法的兩種不同細(xì)胞之間存在/不存在包含結(jié)合蛋白遺傳信息的質(zhì)粒。結(jié)果證實，大多數(shù)展示在活性包涵體上的結(jié)合蛋白的遺傳信息可穩(wěn)定地保持，而未展示在活性包涵體上的結(jié)合蛋白的遺傳信息流失到細(xì)胞外(圖10)。

實施例14—驗證細(xì)胞內(nèi)顆粒展示

為驗證通過本發(fā)明開發(fā)的增加細(xì)胞透性的優(yōu)化方法的細(xì)胞內(nèi)顆粒展示技術(shù)，使用模型結(jié)合蛋白和模型靶物質(zhì)進(jìn)行實驗。圖11A數(shù)據(jù)顯示，只有本發(fā)明開發(fā)的增加細(xì)胞透性的兩步方法后外源靶物質(zhì)才能夠?qū)爰?xì)胞中，并且導(dǎo)入的靶物質(zhì)可通過與展示在包涵體上的結(jié)合蛋白之間的相互作用而共定位至包涵體中。

圖11B的實驗用于證實增加細(xì)胞透性過程后可保持細(xì)胞內(nèi)的遺傳信息。具體地，通過本發(fā)明增加細(xì)胞透性的方法將結(jié)合蛋白展示到活性包涵體中的repebody-mRFP-CBD細(xì)胞分別分離為沉淀和上清液，并用等量的PBS緩沖液(pH7.4)將沉淀重懸浮。使用沉淀重懸液和上清，通過定量PCR(Q-PCR)證實存在/不存在包含結(jié)合蛋白遺傳信息的質(zhì)粒。此外，在增加細(xì)胞透性過程之前或其后提取細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒并通過電泳證實。結(jié)果證實，無論是否使用增加細(xì)胞透性的方法，展示在活性包涵體上的結(jié)合蛋白的遺傳信息都會穩(wěn)定地保持在細(xì)胞中。

結(jié)果證實，本發(fā)明是能夠進(jìn)行蛋白文庫篩選的系統(tǒng)，其包括：由于結(jié)合蛋白被展示在細(xì)胞內(nèi)活性包涵體上并且由于增加細(xì)胞透性的方法而保持了結(jié)合蛋白的遺傳信息的特性，通過結(jié)合蛋白與靶物質(zhì)之間的相互作用分級成單個細(xì)胞單位；以及以單個細(xì)胞單位回收遺傳信息。

圖11C示出了通過流式細(xì)胞儀和電子顯微鏡證實的在增加細(xì)胞透性的過程之前或其后細(xì)胞形狀的結(jié)果，其證實了即使在增加細(xì)胞透性的過程之后細(xì)胞形狀也可穩(wěn)定地保持。

也就是說，所述結(jié)果支持了本發(fā)明開發(fā)的增加細(xì)胞透性的方法是不同于其他現(xiàn)有增加細(xì)胞透性的方法的新方法，其可通過增加細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的透性將外源靶物質(zhì)穩(wěn)定地導(dǎo)入細(xì)胞中而不破壞細(xì)胞，同時可穩(wěn)定地保持展示在活性包涵體上的結(jié)合蛋白及其遺傳信息。

圖12示出了證實可通過增加細(xì)胞透性的優(yōu)化方法導(dǎo)入的靶物質(zhì)大小的實驗結(jié)果，使用了相互作用陷阱細(xì)胞，其中C20(PPI+)(使用細(xì)胞內(nèi)顆粒展示系統(tǒng)篩選獲得的葡聚糖-FITC結(jié)合蛋白)和結(jié)合蛋白(負(fù)對照，不結(jié)合葡聚糖-FITC)展示在包涵體上。使用增加細(xì)胞透性的方法處理每種細(xì)胞(PPI+和PPI-)后，將不同大小的葡聚糖-FITC(分子量3,000到5,000；70,000和250,000)導(dǎo)入細(xì)胞中以誘導(dǎo)相互作用。結(jié)果證實，分子量250,000的葡聚糖-FITC可進(jìn)入細(xì)胞，從而可與展示在細(xì)胞內(nèi)包涵體上的結(jié)合蛋白相互作用，并且這證實本發(fā)明增加細(xì)胞透性的方法可容易地將甚至大分子導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，并可使用大分子作為靶來誘導(dǎo)相互作用通過文庫篩選獲得蛋白結(jié)合物。

實施例15—通過細(xì)胞內(nèi)顆粒展示技術(shù)測定蛋白相互作用

為證實使用上述實施例中增加細(xì)胞透性的優(yōu)化方法通過細(xì)胞內(nèi)顆粒展示的蛋白之間的相互作用，將D3E8(Kd＝2nM，對IL6有親和力)和InVLR5c蛋白(對IL6無親和力)用作模型結(jié)合蛋白并分別展示在包涵體上。將pD3E8-mRFP-CBD和pInVLR5c-mRFP-CBD質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，并表達(dá)融合蛋白。通過實施例5的增加細(xì)胞透性的優(yōu)化方法將靶物質(zhì)GFP-IL6蛋白導(dǎo)入細(xì)胞中，然后用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀觀測所述細(xì)胞。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GFP-IL6熒光與細(xì)胞內(nèi)包涵體上展示的RFP熒光以及結(jié)合蛋白在表達(dá)對IL6有親和力的pD3E8-mRFP-CBD的包涵體細(xì)胞(PPI+)中共定位，而在表達(dá)對IL6無親和力的LRR蛋白的pInVLR5c-mRFP-CBD(PPI-)細(xì)胞中，只檢測到結(jié)合蛋白的RFP熒光而未檢測到結(jié)合蛋白的GFP熒光(圖13A)。也就是說，基于通過相互作用結(jié)合到結(jié)合蛋白的靶物質(zhì)熒光強(qiáng)度可明顯證實存在蛋白之間的相互作用。簡言之，所述結(jié)果證實活性包涵體不妨礙適當(dāng)折疊并形成天然形式的展示于其上的蛋白，并且活性包涵體可固定活性形式展示的蛋白。也就是說，所述結(jié)果證明本發(fā)明的方法使得能夠測定蛋白之間的相互作用，但不影響結(jié)合蛋白的實質(zhì)結(jié)構(gòu)及內(nèi)源活性。

此外，流式細(xì)胞儀測定結(jié)果證實，展示了D3E8(一種可與靶物質(zhì)(IL6)相互作用的結(jié)合蛋白)的包涵體細(xì)胞(PPI+)通過與靶物質(zhì)(即通過增加細(xì)胞透性的方法導(dǎo)入細(xì)胞中的IL6蛋白)的相互作用顯示出顯著增強(qiáng)的GFP熒光(紅色實線)，但與對IL6無親和力的結(jié)合蛋白InVLR5c的結(jié)果(灰色實線)相比仍存在顯著差異(PPI-:PPI+＝1×10¹:5.5×10³)，450倍由于存在蛋白之間的相互作用(信噪比)，因此證實了本發(fā)明的方法可清晰地確定蛋白之間相互作用的存在(圖13B)。此外，依據(jù)對結(jié)合蛋白的親和力測定蛋白之間的相互作用的結(jié)果證實了，共軛到靶物質(zhì)的熒光強(qiáng)度隨著結(jié)合蛋白親和力的增加而增加，從而證實了本發(fā)明的方法用于測定蛋白之間的相互作用可定量分析(圖13C)。

上述結(jié)果表明，本發(fā)明的方法可依據(jù)展示在包涵體上的結(jié)合蛋白和靶物質(zhì)之間的親和力和相互作用，使用熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀基于靶物質(zhì)的熒光強(qiáng)度以單個細(xì)胞單位分離和回收包涵體。此外，由于本發(fā)明可依據(jù)共軛到從外界導(dǎo)入的靶物質(zhì)的熒光強(qiáng)度確定相互作用的存在，信噪比的差異是非常顯著的優(yōu)勢。

實施例16—使用細(xì)胞內(nèi)顆粒展示技術(shù)篩選文庫

已證實，使用本發(fā)明開發(fā)的細(xì)胞內(nèi)顆粒展示技術(shù)可進(jìn)行文庫篩選。將其中分別展示了D3E8(Kd＝2nM)和F11(Kd＝117nM)蛋白(即對靶物質(zhì)IL6有親和力的結(jié)合蛋白)的包涵體細(xì)胞和其中展示了InVLR5c(PPI-)蛋白(與IL6無親和力的LRR蛋白)的包涵體細(xì)胞以1:10:10000的比率混合形成類似文庫的環(huán)境，使用流式細(xì)胞儀(FACSaria)從樣品中分揀10,000個對IL6具有高親和力的大腸桿菌細(xì)胞，其通過實施例5的方法經(jīng)過了增加細(xì)胞透性的優(yōu)化過程并且其中誘導(dǎo)了蛋白相互作用。從分揀的細(xì)胞中提取質(zhì)粒，然后將其轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌DH5α細(xì)胞。將形成的菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并基于表型(D3E8(F11)-mRFP-CBD蛋白)檢驗回收的細(xì)胞中的基因回收產(chǎn)物。通過將表1中所示的引物12(SEQ ID NO:12)、引物13(SEQ ID NO:13)和引物14(SEQID NO:14)混合進(jìn)行PCR擴(kuò)增，基于擴(kuò)增后的基因的大小證實其中存在相互作用的細(xì)胞回收產(chǎn)物。

結(jié)果證實，根據(jù)起始混合比率(1/1000)，單次篩選顯示出約30,000倍篩效率(圖14)。該結(jié)果表明，本發(fā)明可使用高通量裝置流式細(xì)胞儀(FACS)從結(jié)合蛋白展示在活性包涵體上的相互作用陷阱細(xì)胞的細(xì)胞文庫中，選擇性地僅將其中存在蛋白之間相互作用的包涵體細(xì)胞分類，并且本發(fā)明可提供文庫篩選系統(tǒng)，其可從選擇性分類的細(xì)胞中有效地回收編碼相互作用蛋白的基因。

基于上述結(jié)果，使用作為模型結(jié)合蛋白的repebody構(gòu)建了實質(zhì)文庫，并且使用該文庫進(jìn)行了尋找多種靶的蛋白結(jié)合物的篩選工作(圖15A到15C)。增加實施例8中制備的表達(dá)文庫的細(xì)胞透性后，將GFP結(jié)合的多種靶(mGFP-IL6、sfGFP、熒光素和葡聚糖-FITC)用相互作用陷阱細(xì)胞的細(xì)胞文庫處理以誘導(dǎo)相互作用，并分揀FACS中具有增加的信號(存在相互作用)的細(xì)胞部分(圖15A)。僅對分揀細(xì)胞的repebody基因部分進(jìn)行PCR，并將文庫基因取代并插入pInVLR5c-mRFP-CBD的InVLR5c基因位點以產(chǎn)生連接到mRFP-CBD基因的質(zhì)粒。通過電穿孔將質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)中獲得轉(zhuǎn)化子，隨機(jī)選擇各自的菌落后通過測序驗證repebody基因的序列。結(jié)果，通過進(jìn)行最多只兩次重復(fù)篩選，可容易地獲得可結(jié)合到各自靶的多種蛋白。具體地，對于靶向sfGFP的文庫篩選，可選擇性地僅回收FACS測定中對靶具有期望的結(jié)合親和力的結(jié)合蛋白細(xì)胞。依據(jù)上述結(jié)果，證明了細(xì)胞內(nèi)顆粒展示技術(shù)是一種可依據(jù)蛋白相互作用快速且容易地獲得蛋白結(jié)合物的文庫篩選系統(tǒng)。

依上文所述，本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，可通過其他具體方式實施本發(fā)明而不改變本發(fā)明的技術(shù)理念或?qū)嵸|(zhì)特征。因此，本文所公開的示例性實施方案僅用于說明目的，不應(yīng)被理解為限定本發(fā)明的范圍。相反地，本發(fā)明不僅意在包括所述示例性實施方案，還可包括落入權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的多種改變、修飾、等同方案及其他實施方案。