本申請(qǐng)要求2014年3月28日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列No.61/971,855的優(yōu)先權(quán)，所述申請(qǐng)以引用的方式整體并入本申請(qǐng)。

序列表的并入

含有計(jì)算機(jī)可讀形式的序列表的名稱為“38_21_59428_ST25.txt”的文件創(chuàng)建于2015年3月23日。此文件是135,562字節(jié)(如在操作系統(tǒng)中所測(cè)量)，同時(shí)通過(guò)電子提交方式提交(使用美國(guó)專利局EFS-Web提交系統(tǒng))并且以引用的方式整體并入本申請(qǐng)。

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明總體上涉及昆蟲抑制性毒素蛋白的領(lǐng)域。公開了展現(xiàn)針對(duì)農(nóng)作物和種子的農(nóng)業(yè)相關(guān)害蟲的昆蟲抑制活性的一類新穎的蛋白質(zhì)。具體地說(shuō)，所公開類別的蛋白質(zhì)具有針對(duì)農(nóng)作物和種子的農(nóng)業(yè)相關(guān)害蟲、具體地鞘翅目昆蟲害蟲的殺蟲活性。提供含有編碼所述毒素蛋白中的一種或多種的多核苷酸構(gòu)建體的植物、植物部分和種子。

發(fā)明背景

蘇云金芽孢桿菌(“Bt”)菌株是昆蟲抑制性毒素蛋白的豐富來(lái)源。這些蛋白質(zhì)可用于通過(guò)將含有這些蛋白質(zhì)的制劑噴灑到植物上或通過(guò)在植物和種子中表達(dá)這些蛋白質(zhì)來(lái)控制農(nóng)作物的農(nóng)業(yè)相關(guān)害蟲。值得注意的是，目前僅一些毒性蛋白在商業(yè)上用于控制鞘翅目昆蟲，如玉米根蟲。這類當(dāng)前利用的毒性蛋白包括Cry3Bb1(一種修飾的Cry3A)、eCry3.1Ab和二元毒素Cry34Ab1/Cry35Ab1(需要針對(duì)毒性活性的兩種不同的蛋白質(zhì))。這些蛋白質(zhì)有效用于控制侵?jǐn)_玉米根的葉甲(Diabrotica)屬，不論是單一利用還是呈不同組合以降低發(fā)展抗性的可能性。雖然這些蛋白質(zhì)已成功地在轉(zhuǎn)基因作物中利用為昆蟲控制劑，但是可能發(fā)展對(duì)其作用的抗性。

對(duì)所利用的毒素(無(wú)論是化學(xué)品還是蛋白質(zhì))的抗性更可能在增強(qiáng)抗性發(fā)展的多種情況下發(fā)展。一般來(lái)說(shuō)，抗性的發(fā)展直接依賴于毒素被利用至環(huán)境中的時(shí)間長(zhǎng)度?？剐园l(fā)展還更可能在毒素的劑量不足以確保消耗含有所述毒素的組織的單次叮咬的害蟲的死亡率的情況下增加。因此，關(guān)鍵的是在每次叮咬遞送致死劑量的毒素，否則發(fā)展對(duì)特定毒素的抗體更可能發(fā)生。在共同地理區(qū)域內(nèi)或在對(duì)共同地理區(qū)域內(nèi)的相同或類似害蟲敏感的多種植物物種之上或之中重復(fù)使用同一毒素更可能引起對(duì)所述毒素的抗性的快速發(fā)展，特別是在在單個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)內(nèi)存在特定目標(biāo)害蟲的多個(gè)傳代的氣候中。更靠近赤道的地理區(qū)域傾向于具有有助于植物生長(zhǎng)和栽培的較長(zhǎng)和更一致的光周期和氣候，并且這些區(qū)域中的害蟲傾向于比在暴露于減少在類似時(shí)間段遭遇的繁殖周期的數(shù)目的更劇烈氣候變化的其他位置中更短的時(shí)間段內(nèi)具有多個(gè)傳代。出于所有前述原因，對(duì)有限數(shù)目的毒性蛋白或毒性化學(xué)品的依賴可導(dǎo)致發(fā)展對(duì)這些害蟲控制劑的抗性。

在本領(lǐng)域中公開的聲稱展示對(duì)玉米根蟲的毒性作用的其他蛋白質(zhì)包括馬鈴薯糖蛋白、TIC100/101二元毒素、ET33/34二元毒素、TIC863、ET80/76二元毒素、ET70、Cry3Bb(美國(guó)專利No.6,501,009)、Cry1C變體、Cry3A變體、Cry3、Cry3B、Cry34/35、5307、Axmi184、Axmi205、AxmiR1、TIC901、TIC1201、TIC407、TIC417、TIC431、TIC807、TIC853、TIC3131、DIG-10、eHIP(美國(guó)專利申請(qǐng)公布No.2010/0017914)以及ω-Hexatoxin-Hv1a(美國(guó)專利申請(qǐng)公布US2014-0366227A1)。這些蛋白質(zhì)可在后續(xù)商業(yè)實(shí)施方案中單獨(dú)提供或與其他毒性劑組合提供以確保根蟲抗性產(chǎn)物的持久性且降低抗性發(fā)展的可能性。然而，這些另外蛋白質(zhì)中沒(méi)有一種已被觀察到提供當(dāng)前利用的商業(yè)毒素蛋白所展示的針對(duì)玉米根蟲的低劑量毒性作用，并且因此尚未被認(rèn)為是商業(yè)上有用的。

因此，在本領(lǐng)域中需要發(fā)現(xiàn)、研發(fā)且商業(yè)利用新的毒性劑，特別是當(dāng)單獨(dú)使用或以與一種或多種補(bǔ)充毒性劑的各種組合使用時(shí)具有針對(duì)廣泛昆蟲害蟲物種(特別是已被觀察到發(fā)展對(duì)當(dāng)前利用的毒素的抗性的那些害蟲物種-如鞘翅目物種)的活性的環(huán)境友好的、高度選擇性的和特異性的毒素蛋白或化學(xué)品。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本文提供昆蟲抑制性毒素蛋白(即，TIC2463相關(guān)毒素蛋白)，所述毒素蛋白源自各種芽孢桿菌(Bacillus)物種，包括源自蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)(“Bt”)，所述毒素蛋白展示針對(duì)一種或多種鞘翅目植物害蟲(包括但不限于科羅拉多馬鈴薯甲蟲和玉米根蟲幼蟲)的出人意料的低劑量功效。本發(fā)明的毒素蛋白各自展示與彼此的實(shí)質(zhì)性氨基酸序列百分比同一性并且可各自單獨(dú)使用或在待施加至植物和種子表面的各種制劑中與所命名的蛋白質(zhì)毒素屬的其他蛋白質(zhì)組合使用或通過(guò)在植物和種子中表達(dá)這些蛋白質(zhì)來(lái)使用以控制目標(biāo)鞘翅目害蟲。

TIC2463相關(guān)毒素蛋白可從被設(shè)計(jì)用于在植物中表達(dá)的重組DNA構(gòu)建體在植物中(in planta)表達(dá)以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生，所述轉(zhuǎn)基因植物由于在所述轉(zhuǎn)基因植物的相關(guān)細(xì)胞和組織內(nèi)表達(dá)殺蟲有效量的本文公開的毒素蛋白而體現(xiàn)抵抗鞘翅目昆蟲害蟲侵?jǐn)_的能力。這些蛋白質(zhì)可單獨(dú)或彼此結(jié)合或與其他毒性蛋白和毒性劑組合用于制劑和植物中，從而提供當(dāng)前用于農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中的已知鞘翅目毒性蛋白和殺蟲劑化學(xué)品的替代物。

提供用于表達(dá)本文公開的TIC2463相關(guān)毒素蛋白的重組核酸分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供包含(即，含有至少)可操作地連接至多核苷酸區(qū)段的異源啟動(dòng)子的重組核酸分子，所述多核苷酸區(qū)段具有編碼至少一種TIC2463相關(guān)蛋白毒性部分的核苷酸序列。編碼本文公開的TIC2463相關(guān)蛋白毒性部分的核苷酸序列包括在以下SEQ ID號(hào)的每個(gè)中列出的那些：SEQ ID NO:1從位置100-945、SEQ ID NO:3從位置100-939、SEQ ID NO:5從位置85-1011、SEQ ID NO:7從位置94-948、SEQ ID NO:9從位置79-978、SEQ ID NO:11從位置100-942、SEQ ID NO:13從位置100-939、SEQ ID NO:15從位置100-939、SEQ ID NO:17從位置85-1011、SEQ ID NO:19從位置85-1011、SEQ ID NO:21從位置79-978、SEQ ID NO:23從位置79-978、SEQ ID NO:25從位置100-963、SEQ ID NO:27從位置100-963、SEQ ID NO:29從位置100-963、SEQ ID NO:31從位置1-846、SEQ ID NO:33從位置1-843、SEQ ID NO:35從位置226-1065、SEQ ID NO:37從位置187-1023、SEQ ID NO:39從位置1-846、SEQ ID NO:41從位置100-939且具有占據(jù)位置781-783的除TAA、TAG或TGA以外的任何密碼子、SEQ ID NO:43從位置100-945、SEQ ID NO:44從位置100-939、SEQ ID NO:45從位置85-1011、SEQ ID NO:46從位置94-948、SEQ ID NO:47從位置79-978、SEQ ID NO:48從位置1-852、SEQ ID NO:50從位置1-852、SEQ ID NO:52從位置1-852、SEQ ID NO:54從位置1-933、SEQ ID NO:56從位置100-939、SEQ ID NO:58從位置100-939以及SEQ ID NO:60從位置100-939。

用于表達(dá)每種此類TIC2463相關(guān)毒素蛋白的構(gòu)建體通常將包含至少可操作地連接至編碼殺蟲多肽的多核苷酸區(qū)段的異源啟動(dòng)子。在某些構(gòu)建體中，所述殺蟲多肽將具有對(duì)應(yīng)于用于將TIC2463相關(guān)蛋白的毒素部分分泌至亞細(xì)胞區(qū)室(例如，輸入植物細(xì)胞器如葉綠體、質(zhì)體、線粒體或造粉體)中的適用信號(hào)肽或可替代地適用于用于從細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)中分泌出且進(jìn)入周質(zhì)(在革蘭氏陰性細(xì)菌的情況下)或進(jìn)入細(xì)胞外空間中的細(xì)菌系統(tǒng)的信號(hào)肽的氨基酸的氨基末端區(qū)段。由本文所述的核苷酸序列表達(dá)的殺蟲多肽將包含至少在以下中的每個(gè)中列出的成熟氨基酸序列：如在SEQ ID NO:2從氨基酸位置34-315、SEQ ID NO:4從氨基酸位置34-313、SEQ ID NO:6從氨基酸位置29-337、SEQ ID NO:8從氨基酸位置34-316、SEQ ID NO:10從氨基酸位置27-326、SEQ ID NO:12從氨基酸位置34-314、SEQ ID NO:14從氨基酸位置34-313、SEQ ID NO:16從氨基酸位置34-313、SEQ ID NO:18從氨基酸位置29-337、SEQ ID NO:20從氨基酸位置29-337、SEQ ID NO:22從氨基酸位置27-326、SEQ ID NO:24從氨基酸位置27-326、SEQ ID NO:26從氨基酸位置34-321、SEQ ID NO:28從氨基酸位置34-321、SEQ ID NO:30從氨基酸位置34-321；SEQ ID NO:32從氨基酸位置1-282；SEQ ID NO:34從氨基酸位置1-281；SEQ ID NO:36從氨基酸位置76-355；SEQ ID NO:38從氨基酸位置62-341；SEQ ID NO:49從氨基酸位置1-283；SEQ ID NO:51從氨基酸位置1-283；SEQ ID NO:53從氨基酸位置1-283；SEQ ID NO:55從氨基酸位置1-310；SEQ ID NO:57從氨基酸位置34-313；SEQ ID NO:59從氨基酸位置34-313以及SEQ ID NO:61從氨基酸位置34-313中列出的氨基酸序列。提及成熟氨基酸序列意圖指所述蛋白質(zhì)是從編碼前體蛋白質(zhì)的核苷酸序列表達(dá)的，即包含成熟區(qū)段以及展示長(zhǎng)度為約25至約35個(gè)氨基酸(在細(xì)菌或酵母表達(dá)系統(tǒng)的情況下)或長(zhǎng)度為約25至約80個(gè)氨基酸(在植物或酵母表達(dá)系統(tǒng)的情況下)的可操作地連接的N末端氨基酸區(qū)段的蛋白質(zhì)。所述N末端區(qū)段是使相關(guān)蛋白質(zhì)的成熟毒素部分靶向至周質(zhì)或細(xì)胞外空間(參考細(xì)菌或酵母表達(dá)系統(tǒng))或至亞細(xì)胞區(qū)室如線粒體、葉綠體、質(zhì)體、液泡或造粉體(在植物或酵母表達(dá)系統(tǒng)的情況下，如適用的情況下)所需的。

本文所述的蛋白質(zhì)將從包含至少可操作地連接至編碼殺蟲多肽的多核苷酸區(qū)段的異源啟動(dòng)子(不與天然毒素編碼序列天然相關(guān)的啟動(dòng)子)的構(gòu)建體表達(dá)。所述殺蟲多肽將包含與如在SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、49、51、53、55、57、59和61中的任一個(gè)中列出的氨基酸序列具有至少44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或約100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。異源啟動(dòng)子可以是從本發(fā)明的開放閱讀框(“ORF”)中的任一個(gè)的5’端獲得的用于在芽孢桿菌宿主細(xì)胞中表達(dá)的天然Bt啟動(dòng)子。

本文所述的編碼TIC2463相關(guān)毒素的多核苷酸區(qū)段將雜交至編碼任何其他TIC2463相關(guān)毒素的任何其他多核苷酸區(qū)段。使用本文所述的多核苷酸序列的雜交方法適用于檢測(cè)具有TIC2463相關(guān)毒素編碼序列的細(xì)菌菌株且適用于檢測(cè)包含編碼TIC2463相關(guān)毒素蛋白的開放閱讀框的全部或一部分的克隆的DNA區(qū)段。雜交(Hybridization)或雜交(hybridize)意圖指在嚴(yán)格雜交條件下，通過(guò)反向補(bǔ)體比對(duì)進(jìn)行的兩個(gè)不同多核苷酸分子(無(wú)論是DNA與DNA、RNA與RNA或DNA與RNA)的非共價(jià)鍵合。彼此雜交的兩個(gè)多核苷酸分子將各自具有沿雜交部分的長(zhǎng)度展示與彼此的至少約50％同一性的核苷酸序列。本文所述的對(duì)應(yīng)于芽孢桿菌序列的分子特別適用于檢測(cè)和鑒別其他緊密相關(guān)或遠(yuǎn)緣相關(guān)的TIC2463相關(guān)毒素蛋白家族成員。特別有用的雜交條件包括在50％甲酰胺、1M NaCl和1％SDS中在約37℃下雜交4至12小時(shí)，以及在0.1x SSC中在約60℃至約65℃的溫度下洗滌。

本文所述的重組核酸分子可具有核苷酸序列，所述核苷酸序列任選地：

a)為已被設(shè)計(jì)用于在植物中表達(dá)的合成序列；

b)選自由以下組成的組：SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、

19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、43、44、45、46、47、48、50、52、54、56、58和60；

c)在植物細(xì)胞中表達(dá)；或

d)還包含編碼異源多肽的核苷酸序列。

本文所述的重組核酸分子可存在于宿主細(xì)胞內(nèi)(轉(zhuǎn)基因、重組或轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，即不天然地包含這種重組核酸分子的細(xì)胞)。所述宿主細(xì)胞意圖包括但不限于細(xì)菌宿主細(xì)胞、真菌宿主細(xì)胞和植物宿主細(xì)胞。所述植物宿主細(xì)胞通常存在于植物、植物組織如木質(zhì)部、韌皮部、葉、莖、花或花部分(包括雌蕊、雄蕊、花瓣、雌性配子或花粉或其等效物)、根或種子。所述植物、植物組織或種子意圖包括但不限于玉米、高粱、小麥、卷心菜、向日葵、番茄、十字花科植物、辣椒、土豆、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、煙草、大麥、任何水果或蔬菜、任何產(chǎn)種子或堅(jiān)果植物以及油菜(oilseed rape)(油菜(canola))。

TIC2463相關(guān)多肽將展示殺蟲活性。所述多肽將優(yōu)選地展示如在SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、49、51、53、55、57、59和61的序列中的每個(gè)中列出的成熟氨基酸序列或?qū)⒄故九c這些代表性氨基酸序列中的任一個(gè)至少約44％至約99％或甚至約100％氨基酸序列同一性。氨基酸的成熟區(qū)段在以下區(qū)段中例示：SEQ ID NO:2從氨基酸位置34-315、SEQ ID NO:4從氨基酸位置34-313、SEQ ID NO:6從氨基酸位置29-337、SEQ ID NO:8從氨基酸位置34-316、SEQ ID NO:10從氨基酸位置27-326、SEQ ID NO:12從氨基酸位置34-314、SEQ ID NO:14從氨基酸位置34-313、SEQ ID NO:16從氨基酸位置34-313、SEQ ID NO:18從氨基酸位置29-337、SEQ ID NO:20從氨基酸位置29-337、SEQ ID NO:22從氨基酸位置27-326、SEQ ID NO:24從氨基酸位置27-326、SEQ ID NO:26從氨基酸位置34-321、SEQ ID NO:28從氨基酸位置34-321、SEQ ID NO:30從氨基酸位置34-321；SEQ ID NO:32從氨基酸位置1-282；SEQ ID NO:34從氨基酸位置1-281；SEQ ID NO:36從氨基酸位置76-355；SEQ ID NO:38從氨基酸位置62-341、SEQ ID NO:49從氨基酸位置1-283、SEQ ID NO:51從氨基酸位置1-283、SEQ ID NO:53從氨基酸位置1-283、SEQ ID NO:55從氨基酸位置1-310、SEQ ID NO:57從氨基酸位置34-313、SEQ ID NO:59從氨基酸位置34-313以及SEQ ID NO:61從氨基酸位置34-313。

重組TIC2463相關(guān)多肽可包含異源氨基酸序列，即，不天然存在于TIC2463相關(guān)蛋白內(nèi)的序列。例如，TIC2463相關(guān)毒素蛋白可進(jìn)行修飾以包含相對(duì)于天然存在于所述蛋白質(zhì)序列內(nèi)的氨基酸位置保守的氨基酸。熟練的技術(shù)人員將了解所允許的取代并且能夠針對(duì)特定蛋白質(zhì)耐受這類取代而不損害TIC2463相關(guān)毒素蛋白的毒性特性的能力進(jìn)行測(cè)試。多種TIC2463相關(guān)毒素蛋白可取得且比對(duì)以構(gòu)建由兩種或更多種不同的TIC2463相關(guān)毒素蛋白的部分組成的嵌合體。例如，TIC2463(SEQ ID NO:4)的一部分可被TIC1825(SEQ ID NO:2)的相應(yīng)部分取代，如通過(guò)兩種不同蛋白質(zhì)的比對(duì)所測(cè)定，從而產(chǎn)生展示相對(duì)于所述部分所源自的原始蛋白質(zhì)相同或改進(jìn)的毒性特性的嵌合蛋白質(zhì)。

考慮了包含TIC2463相關(guān)毒素蛋白或其變體的組合物。所述組合物可被配制成粉末、粉塵、球粒、顆粒、噴霧、乳液、膠體或溶液，各自呈農(nóng)業(yè)上可接受的制劑形式以用于局部施加至植物、植物部分、土壤或用作種子包衣或種子處理。所述組合物可通過(guò)表達(dá)重組TIC2463或相關(guān)蛋白的細(xì)菌細(xì)胞的培養(yǎng)物的干燥、凍干、均質(zhì)化、萃取、過(guò)濾、離心、沉降或濃縮來(lái)制備。這類細(xì)菌細(xì)胞包括但可不限于根定殖細(xì)菌如土壤桿菌屬(Agrobacterium)或根瘤菌屬(Rhizobium)、各種芽孢桿菌屬包括蘇云金芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌等、大腸桿菌等。還可以可能的是在酵母或昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)物系統(tǒng)如巴斯德畢赤酵母(Pichia pastorus)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisea)或草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)中產(chǎn)生這類組合物。所述組合物將包含約1重量％至約99重量％的TIC2463相關(guān)毒素蛋白。

提供用于使用TIC2463相關(guān)毒素蛋白控制鞘翅目害蟲群體的方法。每種此類方法依賴于使靶向鞘翅目害蟲與殺蟲/殺蟲有效量的毒素蛋白相接觸。通常，所述接觸步驟將在提供至害蟲的飼料中提供有效量的毒素蛋白，所述飼料呈所述毒素蛋白已覆蓋或所述毒素蛋白已與其相互混合的人工飼料的形式?；蛘?，所述飼料可以是表達(dá)殺蟲有效量的毒素蛋白的植物。所述植物的細(xì)胞將被目標(biāo)害蟲攝取。優(yōu)選地，所述飼料的單次叮咬將足以引起目標(biāo)害蟲的發(fā)病、死亡、繁殖力下降(fecundicity)或萎縮。

提供用于產(chǎn)生TIC2463相關(guān)毒素蛋白的方法。通常，獲得并且在有助于表達(dá)和累積足夠量的毒素蛋白的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化成包含編碼前體TIC2463或相關(guān)蛋白的構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。所述毒素蛋白可在宿主細(xì)胞中累積或可分泌至圍繞宿主細(xì)胞的細(xì)胞外空間中。在任何情況下，如此產(chǎn)生的毒素蛋白可使用本領(lǐng)域中已知的方法捕獲且配制(按原樣)或從宿主細(xì)胞或從培養(yǎng)基純化。所述純化的毒素蛋白或前體然后可用作各種飼料組合物中的樣品且與其他毒素蛋白或毒性劑相比以各種濃度使用，以用于與其他TIC2463相關(guān)毒性蛋白比較，并且尤其用于產(chǎn)生用于特異性結(jié)合的抗體或類似試劑(如抗體、抗體結(jié)合片段(f-Ab’s)、凝集素、脂質(zhì)運(yùn)載蛋白、半胱氨酸結(jié)蛋白、α體等)。

提供轉(zhuǎn)基因或重組植物，所述轉(zhuǎn)基因或重組植物具有編碼本發(fā)明的一種或多種TIC2463相關(guān)毒素蛋白的穩(wěn)定地并入植物基因組或并入植物葉綠體基因組的DNA構(gòu)建體。所述植物展示鞘翅目害蟲抗性的性狀。來(lái)自所述植物的種子可增加，只要所述種子也包含編碼TIC2463或相關(guān)毒素蛋白的特定DNA構(gòu)建體，并且所述增加的種子可用于育種計(jì)劃中以使鞘翅目抗性性狀基因滲入類似植物的其他品種/種質(zhì)，通過(guò)將所述植物和種子與同一品種的含有其他重組性狀如另外鞘翅目抗性性狀(例如，對(duì)玉米根蟲或科羅拉多馬鈴薯甲蟲、跳甲、象甲蟲、金針蟲等的抗性)、鱗翅目抗性性狀、半翅目和同翅目抗性性狀、線蟲綱抗性性狀、真菌抗性性狀、除草劑耐受性性狀(如對(duì)麥草畏、草甘膦、保試達(dá)(basta)、草銨膦、2,4-D等的耐受性)，以及產(chǎn)率和應(yīng)力、水利用、氮利用效率，以及本領(lǐng)域中已知的其他轉(zhuǎn)基因性狀的其他轉(zhuǎn)基因植物一起培育來(lái)雜交。

所述植物被保護(hù)免于鞘翅目昆蟲害蟲侵?jǐn)_并且可通過(guò)與含有其他性狀的不同轉(zhuǎn)基因事件一起培育而組合?；蛘?，其他性狀可作為另外的DNA構(gòu)建體包含于連接至含有TIC2463相關(guān)毒素蛋白編碼區(qū)段的構(gòu)建體的載體中(載體堆疊或相關(guān)性狀)，從而有助于出于育種目的降低成本且增加效率。

不同于TIC2463相關(guān)毒性蛋白的對(duì)鞘翅目物種毒性的化學(xué)劑和蛋白質(zhì)毒性劑可以與本文所述的蛋白質(zhì)的各種組合采用(植物內(nèi)和植物離體)?；瘜W(xué)劑可選自由以下組成的組：有機(jī)氯化物、有機(jī)磷酸酯、氨基甲酸酯、擬除蟲菊酯、新煙堿、萊恩堿(ryanoid)以及靶向在被靶向以用于控制的植物害蟲中抑制的特異性基因的dsRNA分子。蛋白質(zhì)毒性劑可選自由以下組成的組：馬鈴薯糖蛋白、TIC100/101二元毒素、ET33/34二元毒素、TIC863、ET80/76二元毒素、ET70、Cry3Bb(美國(guó)專利No.6,501,009)、Cry1C變體、Cry3A變體、Cry3、Cry3B、Cry34/35、5307、Axmi184、Axmi205、AxmiR1、TIC901、TIC1201、TIC407、TIC417、TIC431、TIC807、TIC853、TIC3131、DIG-10、eHIP以及ω-Hexatoxin-Hv1a毒素蛋白和用于控制鱗翅目或半翅目植物害蟲的Cry蛋白毒素。

在本文具體涵蓋用于增加從植物產(chǎn)生的種子、水果、漿果、堅(jiān)果、蔬菜、油或棉絨作物的產(chǎn)率的方法。任何這種方法包括至少在田地中種植植物。一般來(lái)說(shuō)，所述植物包含穩(wěn)定地并入所述植物的細(xì)胞的基因組中的DNA構(gòu)建體。所述構(gòu)建體編碼殺蟲蛋白，所述殺蟲蛋白包含至少選自由以下組成的組的氨基酸序列：如在SEQ ID NO:2從氨基酸位置34-315、SEQ ID NO:4從氨基酸位置34-313、SEQ ID NO:6從氨基酸位置29-337、SEQ ID NO:8從氨基酸位置34-316、SEQ ID NO:10從氨基酸位置27-326、SEQ ID NO:12從氨基酸位置34-314、SEQ ID NO:14從氨基酸位置34-313、SEQ ID NO:16從氨基酸位置34-313、SEQ ID NO:18從氨基酸位置29-337、SEQ ID NO:20從氨基酸位置29-337、SEQ ID NO:22從氨基酸位置27-326、SEQ ID NO:24從氨基酸位置27-326、SEQ ID NO:26從氨基酸位置34-321、SEQ ID NO:28從氨基酸位置34-321、SEQ ID NO:30從氨基酸位置34-321、SEQ ID NO:32從氨基酸位置1-282、SEQ ID NO:34從氨基酸位置1-281、SEQ ID NO:36從氨基酸位置76-355、SEQ ID NO:38從氨基酸位置62-341、SEQ ID NO:49從氨基酸位置1-283、SEQ ID NO:51從氨基酸位置1-283、SEQ ID NO:53從氨基酸位置1-283、SEQ ID NO:55從氨基酸位置1-310、SEQ ID NO:57從氨基酸位置34-313、SEQ ID NO:59從氨基酸位置34-313以及SEQ ID NO:61從氨基酸位置34-313中列出的氨基酸序列。所述TIC2463相關(guān)毒素蛋白展示與在SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、49、51、53、55、57、59和61中列出的成熟毒素蛋白中的任一個(gè)至少約44％至約100％氨基酸序列同一性。在這類條件下生長(zhǎng)的植物理想地暴露于受害蟲侵?jǐn)_的田地，所述TIC2463相關(guān)毒素蛋白具有針對(duì)所述害蟲的殺蟲活性并且所述植物被保護(hù)免于侵?jǐn)_。

本文還提供重組殺蟲多肽，所述殺蟲多肽包含與SEQ ID NO:4的至少50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％、97％或99％同一性，并且還包含在飼料生物測(cè)定中與以下相比高至少約1.5、2、3、4、5、6、10、15、25或50倍的殺蟲活性：TIC2463、馬鈴薯糖蛋白、TIC100/101二元毒素、ET33/34二元毒素、TIC863、ET80/76二元毒素、ET70、Cry3Bb、Cry1C變體、Cry3A變體、Cry3、Cry3B、Cry34/35、5307、Axmi184、Axmi205、AxmiR1、TIC901、TIC1201、TIC407、TIC417、TIC431、TIC807、TIC853、TIC3131、DIG-10、eHIP或ω-Hexatoxin-Hv1a。在一些方面，這些重組殺蟲多肽包含針對(duì)鞘翅目物種的殺蟲活性。在一些方面，這些重組殺蟲多肽的殺蟲活性通過(guò)被稱為在飼料生物測(cè)定中引起目標(biāo)昆蟲的50％死亡率的殺蟲多肽致死濃度的LC₅₀進(jìn)行測(cè)量。在其他方面，這些重組殺蟲多肽的殺蟲活性通過(guò)被稱為在飼料生物測(cè)定中引起目標(biāo)昆蟲蛻皮的50％抑制的殺蟲多肽濃度的MIC₅₀進(jìn)行測(cè)量。

本文還提供重組殺蟲多肽，所述殺蟲多肽包含與SEQ ID NO:4的至少50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％、97％或99％同一性，并且還包含等于或高于以下的植物中殺蟲活性的植物中殺蟲活性：TIC2463、馬鈴薯糖蛋白、TIC100/101二元毒素、ET33/34二元毒素、TIC863、ET80/76二元毒素、ET70、Cry3Bb、Cry1C變體、Cry3A變體、Cry3、Cry3B、Cry34/35、5307、Axmi184、Axmi205、AxmiR1、TIC901、TIC1201、TIC407、TIC417、TIC431、TIC807、TIC853、TIC3131、DIG-10、eHIP或ω-Hexatoxin-Hv1a。本文還提供包含前述重組殺蟲多肽中的任何一種或多種的殺蟲組合物。

本文還提供重組核酸分子，所述重組核酸分子包含可操作地連接至編碼第一殺蟲多肽的異源啟動(dòng)子，所述第一殺蟲多肽包含與SEQ ID NO:4的至少50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％、97％或99％同一性，并且還包含在飼料生物測(cè)定中與以下相比高至少約1.5、2、3、4、5、6、10、15、25或50倍的殺蟲活性：TIC2463、馬鈴薯糖蛋白、TIC100/101二元毒素、ET33/34二元毒素、TIC863、ET80/76二元毒素、ET70、Cry3Bb、Cry1C變體、Cry3A變體、Cry3、Cry3B、Cry34/35、5307、Axmi184、Axmi205、AxmiR1、TIC901、TIC1201、TIC407、TIC417、TIC431、TIC807、TIC853、TIC3131、DIG-10、eHIP或ω-Hexatoxin-Hv1a。在一些方面，這些重組核酸分子針對(duì)植物中表達(dá)進(jìn)行密碼子優(yōu)化。還提供包含一種或多種前述重組核酸分子的植物或其部分。在一些方面，殺蟲多肽靶向這些植物的葉綠體。在其他方面，這些植物或其部分包含兩種或更多種具有不同作用模式的殺蟲多肽或還包含能夠抑制鞘翅目物種中的必需基因的dsRNA。一方面，本文公開的包含于植物中的殺蟲多肽和dsRNA對(duì)相同鞘翅目物種具有毒性。另一方面，本文公開的包含于植物中的殺蟲多肽和dsRNA對(duì)不同鞘翅目物種具有毒性。

附圖簡(jiǎn)述

圖1示出TIC2463相關(guān)蛋白的氨基酸序列比對(duì)，使SEQ ID NO和蛋白質(zhì)名稱與每個(gè)特異性氨基酸序列相關(guān)，并且在圖1D中以粗體字示出在實(shí)施例3中提及的氨基酸。

序列簡(jiǎn)述

SEQ ID NO:1是從蘇云金芽孢桿菌物種獲得的重組多核苷酸序列，所述重組多核苷酸序列編碼來(lái)自在核苷酸位置1-945處的開放閱讀框和翻譯終止密碼子的TIC1825蛋白。

SEQ ID NO:2是來(lái)自如在SEQ ID NO:1中列出的開放閱讀框的TIC1825蛋白的氨基酸序列翻譯。

SEQ ID NO:3是從蘇云金芽孢桿菌物種獲得的重組多核苷酸序列，所述重組多核苷酸序列編碼來(lái)自在核苷酸位置1-939處的開放閱讀框和翻譯終止密碼子的TIC2463蛋白。

SEQ ID NO:4是來(lái)自如在SEQ ID NO:3中列出的開放閱讀框的TIC2463蛋白的氨基酸序列翻譯。

SEQ ID NO:5是從蘇云金芽孢桿菌物種獲得的重組多核苷酸序列，所述重組多核苷酸序列編碼來(lái)自在核苷酸位置1-1011處的開放閱讀框和翻譯終止密碼子的TIC2461蛋白。

SEQ ID NO:6是來(lái)自如在SEQ ID NO:5中列出的開放閱讀框的TIC2461蛋白的氨基酸序列翻譯。

SEQ ID NO:7是從蘇云金芽孢桿菌物種獲得的重組多核苷酸序列，所述重組多核苷酸序列編碼來(lái)自在核苷酸位置1-948處的開放閱讀框和翻譯終止密碼子的TIC3037蛋白。

SEQ ID NO:8是來(lái)自如在SEQ ID NO:7中列出的開放閱讀框的TIC3037蛋白的氨基酸序列翻譯。

SEQ ID NO:9是從蘇云金芽孢桿菌物種獲得的重組多核苷酸序列，所述重組多核苷酸序列編碼來(lái)自在核苷酸位置1-978處的開放閱讀框和翻譯終止密碼子的TIC2228蛋白。

SEQ ID NO:10是來(lái)自如在SEQ ID NO:9中列出的開放閱讀框的TIC2228蛋白的氨基酸序列翻譯。

SEQ ID NO:11是從蘇云金芽孢桿菌物種獲得的重組多核苷酸序列，所述重組多核苷酸序列編碼來(lái)自在核苷酸位置1-942處的開放閱讀框和翻譯終止密碼子的TIC3005蛋白。

SEQ ID NO:12是來(lái)自如在SEQ ID NO:11中列出的開放閱讀框的TIC3005蛋白的氨基酸序列翻譯。

SEQ ID NO:13是從蘇云金芽孢桿菌物種獲得的重組多核苷酸序列，所述重組多核苷酸序列編碼來(lái)自在核苷酸位置1-939處的開放閱讀框和翻譯終止密碼子的TIC2593蛋白。

SEQ ID NO:14是來(lái)自如在SEQ ID NO:13中列出的開放閱讀框的TIC2593蛋白的氨基酸序列翻譯。

SEQ ID NO:15是從蘇云金芽孢桿菌物種獲得的重組多核苷酸序列，所述重組多核苷酸序列編碼來(lái)自在核苷酸位置1-939處的開放閱讀框和翻譯終止密碼子的TIC2598蛋白。

SEQ ID NO:16是來(lái)自如在SEQ ID NO:15中列出的開放閱讀框的TIC2598蛋白的氨基酸序列翻譯。

SEQ ID NO:17是從蘇云金芽孢桿菌物種獲得的重組多核苷酸序列，所述重組多核苷酸序列編碼來(lái)自在核苷酸位置1-1011處的開放閱讀框和翻譯終止密碼子的TIC3891蛋白。

SEQ ID NO:18是來(lái)自如在SEQ ID NO:17中列出的開放閱讀框的TIC3891蛋白的氨基酸序列翻譯。

SEQ ID NO:19是從蘇云金芽孢桿菌物種獲得的重組多核苷酸序列，所述重組多核苷酸序列編碼來(lái)自在核苷酸位置1-1011處的開放閱讀框和翻譯終止密碼子的TIC3090蛋白。

SEQ ID NO:20是來(lái)自如在SEQ ID NO:19中列出的開放閱讀框的TIC3090蛋白的氨基酸序列翻譯。

SEQ ID NO:21是從蘇云金芽孢桿菌物種獲得的重組多核苷酸序列，所述重組多核苷酸序列編碼來(lái)自在核苷酸位置1-978處的開放閱讀框和翻譯終止密碼子的TIC3626蛋白。

SEQ ID NO:22是來(lái)自如在SEQ ID NO:21中列出的開放閱讀框的TIC3626蛋白的氨基酸序列翻譯。

SEQ ID NO:23是從蘇云金芽孢桿菌物種獲得的重組多核苷酸序列，所述重組多核苷酸序列編碼來(lái)自在核苷酸位置1-978處的開放閱讀框和翻譯終止密碼子的TIC2081蛋白。

SEQ ID NO:24是來(lái)自如在SEQ ID NO:23中列出的開放閱讀框的TIC2081蛋白的氨基酸序列翻譯。

SEQ ID NO:25是編碼在SEQ ID NO:2中列出的TIC1825氨基酸序列的氨基酸序列變體的多核苷酸序列。

SEQ ID NO:26是來(lái)自如在SEQ ID NO:25中列出的開放閱讀框的TIC1825變體蛋白的氨基酸序列翻譯。

SEQ ID NO:27是編碼在SEQ ID NO:2中列出的TIC1825氨基酸序列的氨基酸序列變體的多核苷酸序列。

SEQ ID NO:28是來(lái)自如在SEQ ID NO:27中列出的開放閱讀框的TIC1825變體蛋白的氨基酸序列翻譯。

SEQ ID NO:29是編碼在SEQ ID NO:2中列出的TIC1825氨基酸序列的氨基酸序列變體的多核苷酸序列。

SEQ ID NO:30是來(lái)自如在SEQ ID NO:29中列出的開放閱讀框的TIC1825變體蛋白的氨基酸序列翻譯。

SEQ ID NO:31是編碼在SEQ ID NO:4中列出的TIC2463氨基酸序列的氨基酸序列變體的多核苷酸序列。

SEQ ID NO:32是來(lái)自如在SEQ ID NO:31中列出的開放閱讀框的TIC2463變體蛋白的氨基酸序列翻譯。

SEQ ID NO:33是編碼在SEQ ID NO:4中列出的TIC2463氨基酸序列的氨基酸序列變體的多核苷酸序列。

SEQ ID NO:34是來(lái)自如在SEQ ID NO:33中列出的開放閱讀框的TIC2463變體蛋白的氨基酸序列翻譯。

SEQ ID NO:35是編碼來(lái)自在核苷酸位置1-225處的開放閱讀框的造粉體靶肽的多核苷酸序列，以及編碼在核苷酸位置226-1065處的開放閱讀框的TIC2463蛋白的合成核苷酸序列。

SEQ ID NO:36是來(lái)自如在SEQ ID NO:35中列出的開放閱讀框的靶肽和TIC2463蛋白的氨基酸序列翻譯。

SEQ ID NO:37是編碼來(lái)自在核苷酸位置1-183處的開放閱讀框的葉綠體靶肽的多核苷酸序列，以及編碼在核苷酸位置184-1023處的開放閱讀框的TIC2463蛋白的合成核苷酸序列。

SEQ ID NO:38是來(lái)自如在SEQ ID NO:37中列出的開放閱讀框的靶肽和TIC2463蛋白的氨基酸序列翻譯。

SEQ ID NO:39是從蘇云金芽孢桿菌物種獲得的重組多核苷酸序列，所述重組多核苷酸序列編碼在核苷酸位置1-846處的開放閱讀框和翻譯終止密碼子的TIC1373蛋白。

SEQ ID NO:40是來(lái)自如在SEQ ID NO:39中列出的開放閱讀框的TIC1373蛋白的氨基酸序列翻譯。

SEQ ID NO:41是從蠟樣芽孢桿菌物種獲得的重組多核苷酸序列，所述重組多核苷酸序列編碼在核苷酸位置1-780處的開放閱讀框和翻譯終止密碼子的WP_000699779蛋白。

SEQ ID NO:42是來(lái)自如在SEQ ID NO:41中列出的開放閱讀框的WP_000699779蛋白的氨基酸序列翻譯。

SEQ ID NO:43是編碼TIC1825蛋白的合成核苷酸序列。

SEQ ID NO:44是編碼TIC2463蛋白的合成核苷酸序列。

SEQ ID NO:45是編碼TIC2461蛋白的合成核苷酸序列。

SEQ ID NO:46是編碼TIC3037蛋白的合成核苷酸序列。

SEQ ID NO:47是編碼TIC2228蛋白的合成核苷酸序列。

SEQ ID NO:48是編碼在SEQ ID NO:2中列出的TIC1825氨基酸序列的氨基酸序列變體的合成多核苷酸序列。

SEQ ID NO:49是來(lái)自如在SEQ ID NO:48中列出的開放閱讀框的TIC1825變體蛋白的氨基酸序列翻譯。

SEQ ID NO:50是編碼在SEQ ID NO:2中列出的TIC1825氨基酸序列的氨基酸序列變體的合成多核苷酸序列。

SEQ ID NO:51是來(lái)自如在SEQ ID NO:50中列出的開放閱讀框的TIC1825變體蛋白的氨基酸序列翻譯。

SEQ ID NO:52是編碼在SEQ ID NO:2中列出的TIC1825氨基酸序列的氨基酸序列變體的合成多核苷酸序列。

SEQ ID NO:53是來(lái)自如在SEQ ID NO:52中列出的開放閱讀框的TIC1825變體蛋白的氨基酸序列翻譯。

SEQ ID NO:54是編碼在SEQ ID NO:6中列出的TIC2461氨基酸序列的氨基酸序列變體的合成多核苷酸序列。

SEQ ID NO:55是來(lái)自如在SEQ ID NO:54中列出的開放閱讀框的TIC2461變體蛋白的氨基酸序列翻譯。

SEQ ID NO:56是編碼在SEQ ID NO:4中列出的TIC2463氨基酸序列的氨基酸序列變體的合成多核苷酸序列。

SEQ ID NO:57是來(lái)自如在SEQ ID NO:56中列出的開放閱讀框的TIC2463變體蛋白的氨基酸序列翻譯。

SEQ ID NO:58是編碼在SEQ ID NO:4中列出的TIC2463氨基酸序列的氨基酸序列變體的合成多核苷酸序列。

SEQ ID NO:59是來(lái)自如在SEQ ID NO:58中列出的開放閱讀框的TIC2463變體蛋白的氨基酸序列翻譯。

SEQ ID NO:60是編碼在SEQ ID NO:4中列出的TIC2463氨基酸序列的氨基酸序列變體的合成多核苷酸序列。

SEQ ID NO:61是來(lái)自如在SEQ ID NO:60中列出的開放閱讀框的TIC2463變體蛋白的氨基酸序列翻譯。

具體實(shí)施方式

農(nóng)業(yè)害蟲控制領(lǐng)域中的問(wèn)題的特點(diǎn)是需要新的毒素蛋白，所述毒素蛋白是針對(duì)目標(biāo)害蟲有效的、展示針對(duì)目標(biāo)害蟲物種的廣譜毒性、能夠在植物中表達(dá)而不會(huì)引起不希望的農(nóng)藝學(xué)問(wèn)題，并且提供與在植物中商業(yè)上使用的當(dāng)前毒素相比的替代作用模式。由TIC2463例示的新穎殺蟲蛋白在本申請(qǐng)中公開并且解決了這些需求中的每種，特別是針對(duì)廣泛鞘翅目昆蟲害蟲，并且更具體地針對(duì)玉米根蟲害蟲物種。

本申請(qǐng)中公開和要求保護(hù)的蛋白質(zhì)家族是從展示殺蟲活性的細(xì)菌菌株鑒別的。所述細(xì)菌菌株的基因組文庫(kù)是在載體中產(chǎn)生的，從所述載體中鑒別了當(dāng)引入蘇云金芽孢桿菌的無(wú)晶體(acrystalliferous)菌株中時(shí)恢復(fù)在天然存在的細(xì)菌菌株中觀察到的殺蟲活性的克隆。對(duì)此類克隆的DNA進(jìn)行測(cè)序且用于鑒別編碼疑似殺蟲蛋白的一個(gè)或多個(gè)開放閱讀框(ORF)。此類ORF的來(lái)自其他細(xì)菌來(lái)源的DNA序列用于探測(cè)其他細(xì)菌菌株中類似ORF的存在。類似ORF的鑒別導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)編碼也展示鞘翅目毒性活性的類似蛋白的另外DNA序列。

如在本申請(qǐng)中進(jìn)一步描述，鑒別了展示殺蟲活性的蘇云金芽孢桿菌(Bt)菌株，菌株EG3957。從所述菌株的基因組構(gòu)建的文庫(kù)產(chǎn)生了包含編碼新穎Bt蛋白TIC1373(SEQ ID:40)的ORF的克隆的鑒別。所述TIC1373氨基酸序列展示與被稱為Cry60和Cry15Aa1的已知Bt殺蟲毒素(已知展示僅殺蚊活性的蛋白質(zhì))的遠(yuǎn)緣關(guān)系(小于29％氨基酸序列同一性)。假設(shè)TIC1373(SEQ ID NO:40)與Cry60和Cry15pfam的這種遠(yuǎn)緣關(guān)系表明可從自質(zhì)粒表達(dá)TIC1373肽觀察到殺蟲活性，所述質(zhì)粒含有指導(dǎo)蘇云金芽孢桿菌的無(wú)晶體菌株中的TIC1373開放閱讀框的表達(dá)的Bt孢子形成啟動(dòng)子。

當(dāng)針對(duì)一連串植物害蟲在生物測(cè)定中進(jìn)行測(cè)試時(shí)，所得到的重組菌株未能展示任何殺蟲活性，并且對(duì)應(yīng)于預(yù)測(cè)的TIC1373的質(zhì)量的蛋白質(zhì)未在培養(yǎng)上清液或孢子/細(xì)胞沉淀中檢測(cè)到。TIC1373的預(yù)測(cè)氨基酸序列與現(xiàn)有技術(shù)中作為NCBI WP_003308447已知的未表征的蛋白質(zhì)基本上相同，其在2009年首次公布在NCBI網(wǎng)站上且在Zwick等人(Genome Res.22:1512-1524(2012))中提及。

TIC1373蛋白質(zhì)序列與ETX/MTX型毒素Cry60的遠(yuǎn)緣關(guān)系表明所述TIC1373蛋白可展示一些異常的或難以表征的殺蟲活性。然而，如以上所解釋，TIC1373肽未展示針對(duì)在一連串昆蟲生物測(cè)定中測(cè)試的任何昆蟲的殺蟲活性，所述測(cè)試包括針對(duì)鞘翅目、鱗翅目和半翅目害蟲物種的測(cè)試。假設(shè)與TIC1373肽相關(guān)的蛋白質(zhì)可存在于其他微生物菌株中并且相關(guān)蛋白質(zhì)的氨基酸序列內(nèi)存在的變異可能產(chǎn)生毒素活性。因此，TIC1373蛋白編碼序列被用于鑒別包含與預(yù)測(cè)的TIC1373蛋白同源的相關(guān)序列的其他微生物菌株。對(duì)此類同源物進(jìn)行克隆和測(cè)序，并且鑒別編碼與TIC1373蛋白相似的蛋白質(zhì)的ORF。

所鑒別的一種另外的同源蛋白質(zhì)在SEQ ID NO:2中列出，其在本文被指定為TIC1825。如在SEQ ID NO:1中列出的編碼TIC1825的序列是從Bt菌株EG5015獲得的。所預(yù)測(cè)的TIC1825蛋白氨基酸序列展示與TIC1373的實(shí)質(zhì)同一性(跨TIC1373蛋白的長(zhǎng)度77％同一性)。出人意料地，與TIC1373蛋白相比，TIC1825包含額外的31個(gè)N末端氨基酸。來(lái)自蘇云金芽孢桿菌的無(wú)晶體菌株的TIC1825蛋白的表達(dá)出人意料地在細(xì)胞沉淀以及培養(yǎng)上清液中展示鞘翅目殺蟲活性，從而表明所述蛋白質(zhì)毒素可被分泌至培養(yǎng)基中。

從培養(yǎng)上清液收集TIC1825蛋白并且所述蛋白質(zhì)的N-末端氨基酸序列分析指示從TIC1825基因ORF預(yù)測(cè)的TIC1825蛋白是包含在蘇云金芽孢桿菌的無(wú)晶體菌株中表達(dá)時(shí)可能負(fù)責(zé)靶向新生TIC1825蛋白以分泌至培養(yǎng)上清液中的33個(gè)氨基酸的信號(hào)肽的前體蛋白。據(jù)確定全長(zhǎng)TIC1825開放閱讀框(SEQ ID NO:1從核苷酸位置1-945)編碼加工成由核苷酸100-945編碼的成熟毒素蛋白的毒素前體蛋白。分泌的蛋白質(zhì)氨基末端序列信息與ORF編碼在所述蛋白質(zhì)的分泌形式中不存在的N-末端肽區(qū)段的事實(shí)相結(jié)合，表明預(yù)測(cè)的氨基末端肽區(qū)段是由如在SEQ ID NO:1中列出的核苷酸1-99編碼的三十三(33)個(gè)氨基酸的分泌信號(hào)肽。

基于所述TIC1825數(shù)據(jù)，由從其鑒別TIC1373的Bt菌株EG3957獲得另外的序列信息。據(jù)確定另外的序列信息存在于原始TIC1373克隆的上游，所述克隆包含編碼類似于由TIC1825編碼序列編碼的N-末端信號(hào)肽區(qū)段的N-末端氨基酸區(qū)段的序列。包含TIC1825的核苷酸1-99的人工編碼序列的組件框內(nèi)可操作地連接至產(chǎn)生編碼TIC2463的ORF(SEQ ID NO：4)的TIC1373編碼序列。出人意料地，含有編碼TIC2463的ORF(SEQ ID NO:3從核苷酸位置1至939)的克隆的表達(dá)產(chǎn)生對(duì)鞘翅目物種毒性的殺蟲活性，存在于培養(yǎng)上清液以及部分地保留在無(wú)晶體Bt培養(yǎng)物的細(xì)胞沉淀中。

分泌信號(hào)可能需要以用于回收這類蛋白質(zhì)毒素的生物活性的信息允許針對(duì)編碼與TIC1825以及TIC2463同源的蛋白質(zhì)的另外DNA區(qū)段的存在進(jìn)行的更廣泛的芽孢桿菌菌株搜索。通過(guò)用TIC2463和TIC1825編碼序列探測(cè)其相應(yīng)基因組鑒別了包含這類同源序列的Bt菌株，并且獲得了對(duì)應(yīng)于這些同源序列的克隆DNA區(qū)段。對(duì)這些另外克隆中的每一個(gè)進(jìn)行測(cè)序以確定開放閱讀框的存在，并且從這些開放閱讀框預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)翻譯鑒別了展示與TIC1825和TIC2463蛋白的結(jié)構(gòu)特征類似的結(jié)構(gòu)特征的蛋白質(zhì)。因此發(fā)現(xiàn)了蛋白質(zhì)的鞘翅目毒素家族，包括TIC1825(SEQ ID NO:2)、TIC2463(SEQ ID NO:4)、TIC2461(SEQ ID NO:6)、TIC3037(SEQ ID NO:8)、TIC2228(SEQ ID NO:10)、TIC3005(SEQ ID NO:12)、TIC2593(SEQ ID NO:14)、TIC2598(SEQ ID NO:16)、TIC3891(SEQ ID NO:18)、TIC3090(SEQ ID NO:20)、TIC3626(SEQ ID NO:22)以及TIC2081(SEQ ID NO:24)。這些蛋白質(zhì)中的每種展示針對(duì)一種或多種鞘翅目害蟲的鞘翅目毒性活性。

包含這些蛋白質(zhì)、由這些蛋白質(zhì)組成、與這些蛋白質(zhì)基因上同源、類似于這些蛋白質(zhì)或源自這些蛋白質(zhì)的任何新穎的殺蟲蛋白或昆蟲抑制蛋白在本文中統(tǒng)稱為TIC2463相關(guān)毒性蛋白，并且或者被稱為TIC2463相關(guān)蛋白毒素類別或家族、TIC2463相關(guān)毒素蛋白、TIC2463相關(guān)蛋白質(zhì)屬、與TIC2463毒素蛋白相關(guān)的毒素蛋白、與TIC2463相關(guān)的蛋白質(zhì)、TIC2463相關(guān)毒素多肽、TIC2463相關(guān)殺蟲蛋白等；每個(gè)提及具有基本上相同的含義。TIC2463相關(guān)蛋白毒素類別包括TIC1825(SED ID NO:2)、TIC2463(SEQ ID NO:4)、TIC2461(SEQ ID NO:6)、TIC3037(SEQ ID NO:8)、TIC2228(SEQ ID NO:10)、TIC3005(SEQ ID NO:12)、TIC2593(SEQ ID NO:14)、TIC2598(SEQ ID NO:16)、TIC3891(SEQ ID NO:18)、TIC3090(SEQ ID NO:20)、TIC3626(SEQ ID NO:22)以及TIC2081(SEQ ID NO:24)、賦予針對(duì)鞘翅目害蟲的活性的其殺蟲或昆蟲抑制區(qū)段、其組合或其變體(如在本申請(qǐng)中公開的變體)，包括展示殺蟲或昆蟲抑制活性的任何蛋白質(zhì)(當(dāng)與所述TIC2463相關(guān)蛋白中的任一種相比時(shí)，如果所述蛋白質(zhì)與TIC2463相關(guān)蛋白的比對(duì)產(chǎn)生約34％至約100％百分比的任何分?jǐn)?shù)百分比的氨基酸序列同一性)。所述TIC2463相關(guān)蛋白包括前體形式以及所述蛋白質(zhì)的成熟長(zhǎng)度形式。本文所公開的新穎蛋白質(zhì)總結(jié)在實(shí)施例1以及表1(1-A和1-B)和表2中。

這些不同毒素蛋白家族成員與本領(lǐng)域中已知的蛋白質(zhì)的氨基酸序列的比較僅鑒別了從公開的核苷酸序列信息預(yù)測(cè)的兩種未表征的氨基酸區(qū)段。第一區(qū)段是以上提及的未表征的NCBI蛋白質(zhì)WP_003308447，其與TIC1373(SEQ ID NO:40)基本上相同并且由在SEQ ID NO:39中列出的DNA區(qū)段編碼。如本申請(qǐng)中所公開，對(duì)從可操作地連接至在蘇云金芽孢桿菌的無(wú)晶體菌株的芽孢桿菌中起作用的異源啟動(dòng)子的構(gòu)建體表達(dá)編碼如在SEQ ID NO:39中列出的位置1-846的氨基酸區(qū)段(SEQ ID NO:40，TIC1373)的嘗試未檢測(cè)到從所述開放閱讀框表達(dá)的任何蛋白質(zhì)，并且在體外生物測(cè)定中在培養(yǎng)物上清液或在細(xì)胞/孢子沉淀中未檢測(cè)到針對(duì)鞘翅目物種如科羅拉多馬鈴薯甲蟲或玉米根蟲幼蟲的殺蟲活性。然而，產(chǎn)生將來(lái)自如在SEQ ID NO:39中列出的核苷酸位置7-846的TIC1373閱讀框連接至編碼源自本文所述的TIC2463相關(guān)毒素蛋白(例如，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:15從核苷酸位置1-99；SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:19從核苷酸位置1-84；SEQ ID NO:7從核苷酸位置1-93；以及SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:23從核苷酸位置1-78)中的任一種的信號(hào)肽的DNA區(qū)段的構(gòu)建體以及在蘇云金芽孢桿菌的無(wú)晶體菌株中表達(dá)所述構(gòu)建體出人意料地產(chǎn)生如在SEQ ID NO:40從氨基酸位置3至氨基酸位置282中列出的TIC1373蛋白區(qū)段的殺蟲生物活性。所述肽區(qū)段與如在SEQ ID NO:4(TIC2463)中列出的對(duì)應(yīng)區(qū)段相同。在實(shí)施例中描述的數(shù)據(jù)表明該蛋白質(zhì)家族的毒素部分的分泌是強(qiáng)制性的，以便使毒素蛋白的成熟分泌形式展示殺蟲活性，無(wú)論所述蛋白質(zhì)是在植物中還是在細(xì)菌宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。

第二未表征的氨基酸區(qū)段(SEQ ID NO:42)是由如在SEQ ID NO:41中列出的開放閱讀框預(yù)測(cè)的。如在SEQ ID NO:42中列出的氨基酸的預(yù)測(cè)區(qū)段源自蠟樣芽孢桿菌細(xì)菌，并且由包含如在SEQ ID NO:41中列出的核苷酸位置781-783處的終止密碼子(TAA)的隱蔽序列編碼，這預(yù)測(cè)所述編碼的蛋白質(zhì)將包含與在SEQ ID NO:4(TIC2463)從氨基酸位置1至260中列出的序列相同的氨基酸序列。然而，從在SEQ ID NO:41從核苷酸位置1-780中列出的開放閱讀框翻譯的、在SEQ ID NO:42處列出的氨基酸區(qū)段未能編碼如在SEQ ID NO:4(TIC2463)中列出的氨基酸261至313。因此該預(yù)測(cè)的截短/隱蔽蛋白質(zhì)不太可能展示任何殺蟲活性。

在本申請(qǐng)中描述的蛋白質(zhì)通過(guò)以下各項(xiàng)彼此相關(guān)：(a)來(lái)源或起源(即，來(lái)自細(xì)菌的芽孢桿菌物種，并且特別是細(xì)菌的Bt菌株)；(b)表征為針對(duì)鞘翅目昆蟲害蟲物種的殺蟲活性的生物活性；(c)在可用作用于鑒別所述屬的其他成員的查詢序列的本領(lǐng)域中的其他蛋白質(zhì)中不存在的結(jié)構(gòu)特征；(d)氨基酸序列長(zhǎng)度；(e)至少充當(dāng)信號(hào)多肽的N-末端氨基酸區(qū)段的存在，所述信號(hào)多肽用于新生氨基酸鏈中以用于使毒素區(qū)段分泌至細(xì)胞外空間或至芽孢桿菌的表面(在本文分別稱為信號(hào)氨基酸序列、信號(hào)序列、信號(hào)肽或信號(hào)多肽，每個(gè)術(shù)語(yǔ)是指基本上相同或相似的或相關(guān)的結(jié)構(gòu))；以及(f)成熟多肽(在本文不同地稱為成熟多肽氨基酸序列、成熟毒素區(qū)段、成熟多肽或成熟蛋白質(zhì)；每個(gè)術(shù)語(yǔ)基本上是指相同或相似的或相關(guān)的結(jié)構(gòu))的存在，從而當(dāng)分泌至孢桿菌的表面或圍繞芽孢桿菌的周圍細(xì)胞外空間時(shí)充當(dāng)毒素的活性形式。

TIC2463相關(guān)蛋白毒素類別的全長(zhǎng)和成熟蛋白質(zhì)也可通過(guò)一級(jí)結(jié)構(gòu)(保守氨基酸基序)、長(zhǎng)度(對(duì)于成熟蛋白質(zhì)約295個(gè)氨基酸且對(duì)于全長(zhǎng)蛋白質(zhì)約320個(gè)氨基酸)和其他特征相關(guān)。來(lái)自本發(fā)明的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)具有約35k道爾頓的質(zhì)量，成熟蛋白質(zhì)具有約32k道爾頓的質(zhì)量。TIC2463相關(guān)蛋白毒素類別的全長(zhǎng)和成熟形式的特征在表1-A和1-B中報(bào)告。

表1-A–全長(zhǎng)蛋白質(zhì)的特征

表1-B–成熟蛋白質(zhì)的特征

在本申請(qǐng)中應(yīng)注意編碼TIC2463或相關(guān)毒素蛋白的僅成熟毒素區(qū)段的核苷酸區(qū)段尚未發(fā)現(xiàn)適用于產(chǎn)生殺蟲有效量的毒素組分。殺蟲有效量的毒素僅在所述成熟毒素區(qū)段可操作地連接至分泌信號(hào)肽且被靶向以用于分泌(在細(xì)菌系統(tǒng)中)或當(dāng)在植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)被靶向以用于插入亞細(xì)胞區(qū)室中(例如，使用葉綠體或質(zhì)體靶向肽靶向葉綠體或質(zhì)體結(jié)構(gòu)，或使所述成熟毒素區(qū)段靶向另一個(gè)亞細(xì)胞區(qū)室如造粉體或線粒體結(jié)構(gòu))時(shí)產(chǎn)生。從編碼連接至所述成熟毒素區(qū)段且與所述成熟毒素區(qū)段同框的信號(hào)肽(出于細(xì)菌表達(dá)目的)或靶向肽(出于植物亞細(xì)胞區(qū)室定位目的)的核苷酸區(qū)段表達(dá)本發(fā)明的任何毒素區(qū)段提供殺蟲有效量的毒素組分。

基于在本申請(qǐng)中呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)，并且不受任何理論限制，TIC2463相關(guān)毒素可能需要從提供前體或前形式多肽的基因或DNA構(gòu)建體表達(dá)，所述前體或前形式多肽隨后進(jìn)行加工以從蛋白質(zhì)的前體形式釋放毒素區(qū)段。在特定宿主細(xì)胞內(nèi)將可能存在用于通過(guò)從成熟毒素區(qū)段裂解信號(hào)肽區(qū)段來(lái)引起這種釋放的蛋白酶。在一些實(shí)施方案中，可能需要在成熟毒素區(qū)段與靶向肽之間提供工程化的裂解位點(diǎn)。在本發(fā)明的特定毒素的前體形式被提供至害蟲的意義上，可能需要目標(biāo)害蟲中的蛋白酶來(lái)在工程化的裂解位點(diǎn)處裂解前體形式，從而釋放活化的毒素區(qū)段。在其他實(shí)施方案中，所述前體形式將在特定宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，并且所述宿主細(xì)胞內(nèi)的一種或多種酶將在從成熟毒素區(qū)段裂解N末端氨基酸區(qū)段方面活性的。在每種情況下，從N末端分泌或靶向區(qū)段釋放成熟毒素區(qū)段將活化所述成熟毒素區(qū)段，從而產(chǎn)生展示鞘翅目害蟲抑制活性的完全功能性毒素蛋白。

信號(hào)序列的裂解可通過(guò)包括但不限于化學(xué)試劑和蛋白水解酶的試劑來(lái)介導(dǎo)。這些酶中的一些可存在于目標(biāo)害蟲消化系統(tǒng)中，例如存在于宿主細(xì)胞內(nèi)的在從所述宿主細(xì)胞內(nèi)的mRNA翻譯新生前體時(shí)或在促進(jìn)毒素蛋白的成熟形式的分泌時(shí)在所述前體正被易位跨過(guò)所述宿主細(xì)胞內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)膜時(shí)裂解前體蛋白的酶。

在本申請(qǐng)中提及術(shù)語(yǔ)“活性的”或“活性”、“殺蟲活性(pesticidal activity)”或“殺蟲的(pesticidal)”或“殺蟲活性(insecticidal activity)”、“昆蟲抑制”或“殺蟲的(insecticidal)”是指毒性劑如蛋白質(zhì)毒素在抑制(抑制生長(zhǎng)、攝食、繁殖力或存活力)、遏制(遏制生長(zhǎng)、攝食、繁殖力或存活力)、控制(控制害蟲侵?jǐn)_、控制含有有效量的TIC2463相關(guān)蛋白的特定作物上的害蟲攝食活動(dòng))或殺死害蟲(引起害蟲的發(fā)病、死亡或繁殖力降低)。這些術(shù)語(yǔ)意圖包括將殺蟲有效量的毒性蛋白提供至害蟲的結(jié)果，其中使所述害蟲暴露于所述毒性蛋白導(dǎo)致發(fā)病、死亡、繁殖力降低或萎縮。這些術(shù)語(yǔ)還包括作為將殺蟲有效量的毒性蛋白提供在植物之上或之中的結(jié)果來(lái)將害蟲從植物、植物的組織、植物部分、種子、植物細(xì)胞或從所述植物可能生長(zhǎng)的特定地理位置中排斥出。一般來(lái)說(shuō)，殺蟲活性是指毒性蛋白有效于抑制以特定目標(biāo)害蟲的所述蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段、蛋白質(zhì)區(qū)段或多核苷酸為食的昆蟲(包括但不限于鞘翅目昆蟲)的生長(zhǎng)、發(fā)育、存活力、攝食行為、交配行為、繁殖力或由其引起的不良作用的任何可測(cè)量的降低的能力。所述毒性蛋白可由植物產(chǎn)生或可被施加至所述植物或施加至所述植物所位于的位置內(nèi)的環(huán)境。術(shù)語(yǔ)“生物活性”、“有效的(effective)”、“有效的(efficacious)”或其變化形式也是在本申請(qǐng)可互換使用的術(shù)語(yǔ)以描述本發(fā)明的蛋白質(zhì)對(duì)目標(biāo)昆蟲害蟲的作用。

當(dāng)提供至目標(biāo)害蟲時(shí)，殺蟲有效量的毒性劑在所述毒性劑接觸所述害蟲時(shí)展示殺蟲活性。毒性劑可以是殺蟲蛋白或本領(lǐng)域中已知的一種或多種化學(xué)試劑。殺蟲化學(xué)試劑和殺蟲蛋白試劑可單獨(dú)使用或與彼此組合使用。化學(xué)試劑包括但不限于有機(jī)氯化物、有機(jī)磷酸酯和氨基甲酸酯、擬除蟲菊酯、新煙堿、萊恩堿以及靶向用于在目標(biāo)害蟲中抑制的特異性基因的dsRNA分子。殺蟲蛋白質(zhì)試劑包括在本申請(qǐng)中列出的蛋白質(zhì)毒素，以及與TIC2463相關(guān)毒素蛋白靶向相同害蟲的其他蛋白質(zhì)毒性劑。這類其他蛋白質(zhì)毒性劑包括但不限于馬鈴薯糖蛋白、TIC100/101二元毒素、ET33/34二元毒素、TIC863、ET80/76二元毒素、ET70、Cry3Bb(美國(guó)專利No.6,501,009)、Cry1C變體、Cry3A變體、Cry3、Cry3B、Cry34/35、5307、Axmi184、Axmi205、AxmiR1、TIC901、TIC1201、TIC407、TIC417、TIC431、TIC807、TIC853、TIC3131、DIG-10、eHIP以及ω-Hexatoxin-Hv1a毒素蛋白。

意圖提及害蟲，特別是作物植物的害蟲意指作物植物的昆蟲害蟲，特別是通過(guò)來(lái)自TIC2463相關(guān)蛋白質(zhì)毒素類別的蛋白質(zhì)控制的那些，但當(dāng)靶向這些害蟲的毒性劑與TIC2463相關(guān)毒素蛋白或同TIC2463相關(guān)毒素蛋白約34％至100％同一性的蛋白質(zhì)毒素一起共定位或存在時(shí)，也可包括其他害蟲如植物的鱗翅目、半翅目、同翅目或纓翅目昆蟲害蟲以及線蟲和真菌。

此外，在本申請(qǐng)中提及“分離的DNA分子”或等效術(shù)語(yǔ)或短語(yǔ)意圖指所述DNA分子是單獨(dú)或與其他組合物組合存在、但不存在于其天然環(huán)境中的一種DNA分子。例如，在生物體的基因組的DNA內(nèi)天然發(fā)現(xiàn)的核酸元件如編碼序列、內(nèi)含子序列、非翻譯前導(dǎo)序列、啟動(dòng)子序列、轉(zhuǎn)錄終止序列等不被認(rèn)為是“分離的”，只要所述元件在所述生物體的基因組內(nèi)且在天然發(fā)現(xiàn)其的基因組內(nèi)的位置處。然而，這些元件中的每種和這些元件的子部分將在本公開的范圍內(nèi)是“分離的”，只要所述元件不在所述生物體的基因組內(nèi)或在天然發(fā)現(xiàn)其的基因組內(nèi)的位置處。類似地，編碼殺蟲蛋白或所述蛋白質(zhì)的任何天然存在的殺蟲變體的核苷酸序列將是分離的核苷酸序列，只要所述核苷酸序列不在從其天然發(fā)現(xiàn)編碼所述蛋白質(zhì)的序列的細(xì)菌的DNA內(nèi)。編碼天然存在的殺蟲蛋白的氨基酸序列的合成核苷酸序列將出于本公開的目的被認(rèn)為是分離的。出于本公開的目的，任何轉(zhuǎn)基因核苷酸序列，即插入植物或細(xì)菌的細(xì)胞的基因組中或存在于染色體外載體中的DNA的核苷酸序列將被認(rèn)為是分離的核苷酸序列，無(wú)論其存在于質(zhì)粒內(nèi)還是用于轉(zhuǎn)化所述細(xì)胞的類似結(jié)構(gòu)內(nèi)、所述植物或細(xì)菌的基因組內(nèi)、或以可檢測(cè)的量存在于源自所述植物或細(xì)菌的組織、子代、生物樣品或商品產(chǎn)品中。

所述TIC2463相關(guān)蛋白和多肽通過(guò)一級(jí)結(jié)構(gòu)相關(guān)，包括但不限于沿形成特定蛋白質(zhì)區(qū)段的連接的氨基酸的特定長(zhǎng)度氨基酸同一性的數(shù)字、第一蛋白質(zhì)區(qū)段(主題)相對(duì)于第二蛋白質(zhì)區(qū)段的氨基酸序列(查詢)的氨基酸序列同一性百分比、相對(duì)于第二蛋白質(zhì)區(qū)段的氨基酸的長(zhǎng)度特定第一蛋白質(zhì)區(qū)段的氨基酸的長(zhǎng)度或其任何組合。

術(shù)語(yǔ)“區(qū)段”或“片段”在本申請(qǐng)中用于描述比描述TIC2463相關(guān)蛋白的完整氨基酸或核酸序列短的連續(xù)氨基酸或核酸序列。展示昆蟲抑制活性的區(qū)段或片段也在本申請(qǐng)中公開，如果所述區(qū)段或片段與TIC2463相關(guān)蛋白的相應(yīng)部分的比對(duì)在所述區(qū)段或片段與所述TIC2463相關(guān)蛋白的相應(yīng)部分之間產(chǎn)生約34％至約100％的任何分?jǐn)?shù)百分比的氨基酸序列同一性。

與TIC2463相關(guān)蛋白類似的蛋白質(zhì)可通過(guò)使用本領(lǐng)域中已知的基于計(jì)算機(jī)的算法彼此比較來(lái)鑒別。在本申請(qǐng)中報(bào)告的氨基酸同一性時(shí)使用以下這些默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行Clustal W比對(duì)的結(jié)果：權(quán)重矩陣：blosum；空位開放罰分：10.0；空位延伸罰分：0.05；親水性空位：On；親水性殘基：GPSNDQERK；殘基特異性空位罰分：On(Thompson等人(1994)Nucleic Acids Research,22:4673-4680)。通過(guò)測(cè)定作為將表示查詢與主題蛋白質(zhì)之間的氨基酸同一性的數(shù)字除以主題蛋白質(zhì)的長(zhǎng)度的結(jié)果獲得的商、然后將如此獲得的商乘以100來(lái)進(jìn)一步計(jì)算氨基酸同一性百分比。應(yīng)了解這種算法的使用不是限制性的并且還考慮本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的替代比對(duì)算法。

意圖展示針對(duì)鞘翅目昆蟲物種的昆蟲抑制活性的蛋白質(zhì)與TIC2463相關(guān)蛋白相關(guān)，如果所述蛋白質(zhì)用于查詢、例如Clustal W比對(duì)中，并且本發(fā)明的蛋白質(zhì)中的至少一種在這種比對(duì)中被鑒別為命中，其中所述查詢蛋白質(zhì)沿TIC2463相關(guān)蛋白的長(zhǎng)度展示約34％、35％、40％、50％、60％、70％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、或此范圍中的任何分?jǐn)?shù)百分比的氨基酸同一性。

在本申請(qǐng)中描述的蛋白質(zhì)與彼此的比對(duì)產(chǎn)生產(chǎn)生針對(duì)每一對(duì)的氨基酸同一性，如由表2中所示的矩陣所表示。表2的左側(cè)上的豎直列和跨所述表的頂部的行通過(guò)SEQ ID NO和TIC數(shù)目?jī)烧吡谐鰡为?dú)蛋白質(zhì)。兩種不同蛋白質(zhì)之間的相對(duì)氨基酸序列同一性百分比反映在相應(yīng)行和列交叉的方框中。這種表示示出TIC2463家族成員通過(guò)低至44％同一性至高達(dá)99％-100％同一性范圍內(nèi)的百分比同一性彼此相關(guān)。這些百分比同一性相對(duì)于此家族組內(nèi)的其他全長(zhǎng)蛋白質(zhì)示出。一般來(lái)說(shuō)，蛋白質(zhì)之間的同一性百分比在僅比對(duì)相應(yīng)蛋白質(zhì)的毒素部分時(shí)增加。

TIC2463相關(guān)毒素蛋白家族成員還通過(guò)展示由長(zhǎng)度為約27或28個(gè)氨基酸至約33至35個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽序列、一級(jí)結(jié)構(gòu)(保守氨基酸基序)、長(zhǎng)度(蛋白質(zhì)的毒素部分展示約269個(gè)氨基酸至約315個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度；這些家族成員的信號(hào)肽展示與彼此的約65％至約100％氨基酸序列同一性)以及其他特征相關(guān)。

如先前在本申請(qǐng)中所指示，TIC2463相關(guān)毒素蛋白的天然信號(hào)序列可彼此取代而不犧牲前體蛋白(無(wú)論是天然的還是嵌合的)在細(xì)菌的芽孢桿菌菌株中表達(dá)式起作用的能力。此外，與TIC2463相關(guān)毒素蛋白中的任一種相關(guān)的天然信號(hào)序列可被有助于輸入植物宿主細(xì)胞內(nèi)的葉綠體或造粉體中的非天然序列取代。能夠使蛋白質(zhì)靶向特異性細(xì)胞內(nèi)區(qū)室或?qū)崿F(xiàn)分泌或插入膜或?qū)崿F(xiàn)在翻譯后加工中的修飾的信號(hào)肽的實(shí)例是本領(lǐng)域中已知的。在一個(gè)實(shí)施方案中，TIC2463的天然信號(hào)肽被其他信號(hào)肽序列取代。如在SEQ ID NO:36(從氨基酸位置1-75)中所列出，靶向肽的植物造粉體共價(jià)連接至由氨基酸位置76至355(SEQ ID NO:36)組成的成熟TIC2463毒素區(qū)段。如在SEQ ID NO:38中所列出，靶向來(lái)自氨基酸位置1-61的肽的植物葉綠體或質(zhì)體共價(jià)連接至來(lái)自氨基酸位置62至341的成熟TIC2463氨基酸序列。這些嵌合前體中的每種在植物宿主細(xì)胞、植物、植物部分和種子中有效表達(dá)，并且成熟蛋白質(zhì)定位至相應(yīng)亞細(xì)胞區(qū)室。

TIC2463相關(guān)毒素蛋白通過(guò)共同功能相關(guān)并且展示針對(duì)鞘翅目昆蟲害蟲(包括成蟲、蛹、幼蟲和新生體)的昆蟲抑制活性。鞘翅目昆蟲包括但不限于，地老虎屬(Agrotis spp.)、花象屬(Anthonomus spp.)、甜菜隱食甲(Atomaria linearis)、甜菜脛跳甲(Chaetocnema tibialis)、根頸象屬(Cosmopolites spp.)、象甲屬(Curculio spp.)、皮蠹屬(Dermestes spp.)、葉甲屬(Diabrotica spp.)、食植瓢蟲屬(Epilachna spp.)、Eremnus屬、馬鈴薯甲蟲(Leptinotarsa decemlineata)、稻水象甲屬(Lissorhoptrus spp.)、鰓金龜屬(Melolontha spp.)、鋸谷盜屬(Orycaephilus spp.)、耳象屬(Otiorhynchus spp.)、斑象屬(Phlyctinus spp.)、弧麗金龜屬(Popillia spp.)、蚤跳甲屬(Psylliodes spp.)、蛀長(zhǎng)蠹屬(Rhizopertha spp.)、金龜子科(Scarabaeidae)、米象屬(Sitophilus spp.)、麥蛾屬(Sitotroga spp.)、粉甲蟲屬(Tenebrio spp.)、擬谷盜屬(Tribolium spp.)和斑皮蠹屬(Trogoderma spp.)，特別是當(dāng)害蟲是玉米根螢葉甲(Diabrotica virgifera virgifera)(西部玉米根蟲(Western Corn Rootworm)，WCR)、北美玉米根葉甲(Diabrotica barberi)(北部玉米根蟲(Northern Corn Rootworm)，NCR)、Diabrotica virgifera zeae(墨西哥玉米根蟲，MCR)、黃瓜條葉甲(Diabrotica balteata)、(巴西玉米根蟲，BZR)、十一星葉甲食根亞種(Diabrotica undecimpunctata howardii)(南部玉米根蟲，SCR)以及由Diabrotica viridula和南美葉甲(Diabrotica speciosa)組成的巴西玉米根蟲復(fù)合物(BCR)。

考慮在本申請(qǐng)中描述的蛋白質(zhì)可展示針對(duì)除了鞘翅目昆蟲以外的昆蟲物種的毒性、昆蟲害蟲控制特性。例如，鱗翅目、半翅目、同翅目、纓翅目等中的昆蟲是植物害蟲并且可對(duì)這些毒素蛋白、特別是進(jìn)行修飾以展示擴(kuò)大的宿主范圍的TIC2463相關(guān)蛋白敏感。這類修飾可包括缺失或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸、氨基酸取代以及使用來(lái)自TIC2463相關(guān)蛋白家族的一個(gè)成員的一個(gè)或多個(gè)區(qū)段與來(lái)自所述TIC2463相關(guān)蛋白家族的一個(gè)或多個(gè)其他成員中的任一個(gè)的一個(gè)或多個(gè)適用區(qū)段的組合、或與來(lái)自本領(lǐng)域中已知的任何其他毒素蛋白的一個(gè)或多個(gè)適用區(qū)段組合來(lái)構(gòu)建嵌合蛋白一站式害蟲控制特性(例如像，展示殺蟲生物活性的任何Cry或Cyt蛋白質(zhì)家族成員，如在用于蘇云金芽孢桿菌毒素命名法的蘇塞克斯大學(xué)生命科學(xué)網(wǎng)站(Sussex University’s life sciences website for Bacillus thuringiensis toxin nomenclature)Sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/toxins2.html上所敘述)。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可在組合物(包括植物)中與一種或多種不同的毒性劑如dsRNA或不同的鞘翅目昆蟲毒性蛋白組合以控制玉米根蟲或科羅拉多馬鈴薯甲蟲，并且與除鞘翅目昆蟲毒性蛋白以外的蛋白質(zhì)組合以控制來(lái)自其他昆蟲目的一種或多種害蟲，包括蛋白質(zhì)如Cry1’s、Cry2’s、Cry9’s、TIC807或其衍生物、TIC1415及相關(guān)蛋白等，并且與編碼對(duì)除草劑如麥草畏、草甘膦、草銨膦、2,4-D等的耐受性的基因及其衍生物等組合。

本公開還考慮使用本領(lǐng)域中已知的分子方法來(lái)工程化和克隆包含來(lái)自殺蟲蛋白的蛋白質(zhì)的嵌合體的商業(yè)上有用的蛋白質(zhì)，例如所述嵌合體可從TIC2463相關(guān)蛋白的區(qū)段組裝以獲得另外有用的實(shí)施方案，包括將TIC2463相關(guān)蛋白的區(qū)段與不同于TIC2463相關(guān)蛋白的多種蛋白質(zhì)的區(qū)段組裝。TIC2463蛋白質(zhì)家族可經(jīng)受與彼此以及與其他Bt殺蟲蛋白的比對(duì)(無(wú)論這些是系統(tǒng)發(fā)生上密切相關(guān)的還是遠(yuǎn)緣相關(guān)的)，并且可鑒別可適用于取代的每種此類蛋白質(zhì)的區(qū)段，從而產(chǎn)生嵌合蛋白的構(gòu)建。所述嵌合蛋白可經(jīng)受害蟲生物測(cè)定分析并且針對(duì)與相比嵌合體中的每種此類區(qū)段所源自的親本蛋白質(zhì)增加的生物活性或擴(kuò)大的目標(biāo)害蟲范圍的存在進(jìn)行表征。所述多肽的殺蟲活性可通過(guò)與其他蛋白質(zhì)交換結(jié)構(gòu)域或區(qū)段、通過(guò)氨基酸取代、缺失或添加或通過(guò)使用本領(lǐng)域中已知的定向進(jìn)化方法來(lái)針對(duì)對(duì)特定害蟲或?qū)Ω鼜V泛范圍的害蟲的改進(jìn)的活性進(jìn)行進(jìn)一步工程化。

生物功能上等效的蛋白質(zhì)毒素時(shí)展示與一種或多種TIC2463相關(guān)蛋白質(zhì)毒素的實(shí)質(zhì)性氨基酸序列同一性且展示與與其進(jìn)行這種比較的一種或多種蛋白質(zhì)基本上相同或相同或甚至更大殺蟲活性的那些。這類功能上等效的蛋白質(zhì)包括具有保守氨基酸取代且不展示相對(duì)于比較蛋白質(zhì)的功能損失的那些。熟練的技術(shù)人員將容易地理解術(shù)語(yǔ)“保守氨基酸?！笨扇菁{取代的氨基酸、氨基酸的區(qū)段(如取代的信號(hào)肽序列)、或N-或C-末端缺失以獲得生物等效物的蛋白質(zhì)的實(shí)例包括但不限于如在以下中的任一項(xiàng)中列出的蛋白質(zhì)序列：SEQ I D NO:2(TIC1825)、SEQ ID NO:4(TIC2463)、SEQ ID NO:6(TIC2461)、S EQ ID NO:8(TIC3037)、SEQ ID NO:10(TIC2228)、SEQ ID NO:12(TIC3005)、SEQ ID NO:14(TIC2593)、SEQ ID NO:16(TIC2598)、SEQ ID NO:18(TIC3891)、SEQ ID NO:20(TIC3090)、SEQ ID NO:22(TIC3626)、SE Q ID NO:24(TIC2081)、SEQ ID NO:26(TIC1825_G233A，還被稱為TIC1825v1)、SEQ ID NO:28(TIC1825_P234A，還被稱為TIC1825v2)、SEQ ID NO:30(TIC1825_K224T_D226N_G233A_P234A_L246T_T248V，還被稱為TI C1825v3)、SEQ ID NO:32(TIC2463_3)、SEQ ID NO:34(TIC2463_4)、SE Q ID NO:49(TIC1825_12)、SEQ ID NO:51(TIC1825_13)、SEQ ID NO:53(TIC1825_15)、SEQ ID NO:55(TIC2461_5)、SEQ ID NO:57(TIC2463_8)、SEQ ID NO:59(TIC2463_9)、SEQ ID NO:61(TIC2463_10)。

提供用于發(fā)現(xiàn)TIC2463相關(guān)蛋白類別的新成員的方法?？色@得任何細(xì)菌基因組的DNA序列并且將數(shù)據(jù)組裝成序列信息的連續(xù)區(qū)段。基因組重疊群內(nèi)的DNA序列可被鑒別為包含編碼預(yù)期蛋白質(zhì)序列的預(yù)測(cè)的ORF?？蓪㈩A(yù)期編碼的蛋白質(zhì)序列與在本申請(qǐng)中作為TIC2463相關(guān)毒素蛋白公開的蛋白質(zhì)進(jìn)行比較，并且編碼這類預(yù)期蛋白質(zhì)的序列可進(jìn)行克隆且在任何數(shù)目的細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，并且可將從所述克隆表達(dá)的所得蛋白質(zhì)針對(duì)殺蟲活性進(jìn)行測(cè)試。展示殺蟲活性且展示與本申請(qǐng)中公開的一種或多種蛋白質(zhì)的至少約44％至約100％氨基酸序列同一性的預(yù)期蛋白質(zhì)被認(rèn)為在TIC2463相關(guān)毒素蛋白類別的范圍內(nèi)?；蛘撸蓪?duì)應(yīng)于本文在SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21和23中的任一個(gè)中列出的序列的約20至約900個(gè)核苷酸組成的DNA區(qū)段可用作探針或引物以用于檢測(cè)或擴(kuò)增(視情況而定)來(lái)自多種細(xì)菌物種(包括芽孢桿菌物種)的DNA序列。檢測(cè)與這類探針雜交的DNA序列或在適用的熱擴(kuò)增反應(yīng)中使用這類引物擴(kuò)增DNA區(qū)段為熟練的技術(shù)人員提供用于捕獲DNA的可組裝成編碼氨基酸序列的連續(xù)核苷酸序列的必要區(qū)段的材料，所述氮基酸序列可與本申請(qǐng)中描述的蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行比較?？蓽y(cè)試以此方式發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)的殺蟲活性。展示殺蟲活性且展示與本申請(qǐng)中公開的TIC2463相關(guān)蛋白質(zhì)毒素中的任一種的約44％或更大氨基酸序列同一性的蛋白質(zhì)是TIC2463相關(guān)蛋白質(zhì)毒素成員。

產(chǎn)生特異性地結(jié)合本申請(qǐng)中描述的一種或多種蛋白質(zhì)的試劑(例如像，抗體、α體、脂質(zhì)運(yùn)載蛋白、抗運(yùn)載蛋白等)在本領(lǐng)域的技能之內(nèi)。特異性地結(jié)合的這類試劑可用于篩選或發(fā)現(xiàn)TIC2463屬的其他成員。所述結(jié)合試劑可用于特異性地結(jié)合可充當(dāng)本申請(qǐng)中公開的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)的表位的一種或多種TIC2463相關(guān)蛋白或肽片段。所述抗體、脂質(zhì)運(yùn)載蛋白、抗運(yùn)載蛋白、α體等的結(jié)合可通過(guò)使用與ELISA類似的方法來(lái)檢測(cè)。

本發(fā)明的實(shí)施方案包括編碼TIC2463相關(guān)蛋白的重組多核苷酸組合物。例如，所述TIC2463相關(guān)蛋白可從重組DNA構(gòu)建體表達(dá)，其中具有編碼所述蛋白質(zhì)的ORF的多核苷酸分子可操作地連接至元件如啟動(dòng)子和用于在所述構(gòu)建體所意圖用于的系統(tǒng)或宿主細(xì)胞類型中表達(dá)的任何其他必要的調(diào)控元件。具體地考慮被設(shè)計(jì)用于在含有可操作地連接至編碼TIC2463相關(guān)蛋白的多核苷酸區(qū)段的植物功能性啟動(dòng)子的植物中表達(dá)的構(gòu)建體?？稍谟糜谠谥参镏惺褂玫拇祟悩?gòu)建體中有用的其他元件包括增強(qiáng)子、內(nèi)含子、非翻譯前導(dǎo)序列、編碼的蛋白質(zhì)固定標(biāo)簽(HIS-標(biāo)簽)、編碼的亞細(xì)胞易位肽(即，質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽、信號(hào)肽)、翻譯后修飾酶的編碼的多肽位點(diǎn)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)以及RNAi靶位點(diǎn)，其各自可操作地連接至每種此類構(gòu)建體中的適用調(diào)控或表達(dá)元件。

提及“被設(shè)計(jì)用于在植物中表達(dá)”意圖從細(xì)菌系統(tǒng)或其他宿主系統(tǒng)獲得的可編碼TIC2463或相關(guān)蛋白的核苷酸序列可展示已顯示降低植物細(xì)胞中意圖蛋白質(zhì)的表達(dá)水平的某些有害序列。用于設(shè)計(jì)基因以避免這類問(wèn)題序列的這類實(shí)施方案和方式在美國(guó)專利5,500,365中列出。雖然設(shè)計(jì)避免這類問(wèn)題序列的基因在本領(lǐng)域的技能之內(nèi)但當(dāng)查閱‘365專利時(shí)，數(shù)百或數(shù)千或甚至數(shù)百萬(wàn)個(gè)滿足在‘365專利中列出的標(biāo)準(zhǔn)的不同的序列是可能的，并且意圖這些實(shí)施方案中的每個(gè)包括在關(guān)于編碼被設(shè)計(jì)用于在植物中表達(dá)的TIC2463或相關(guān)蛋白的本申請(qǐng)的范圍之內(nèi)。

包含TIC2463相關(guān)蛋白編碼序列的重組DNA構(gòu)建體還可包含DNA的編碼一種或多種昆蟲抑制劑的區(qū)域，所述區(qū)域可被配置成同時(shí)表達(dá)或共表達(dá)編碼TIC2463相關(guān)蛋白的DNA序列、昆蟲抑制性dsRNA分子或輔助蛋白。輔助蛋白包括但不限于用于例如通過(guò)幫助昆蟲抑制劑的表達(dá)、影響其在植物中的穩(wěn)定性、優(yōu)化低聚的自由能、增強(qiáng)其毒性以及增加其活性范圍來(lái)幫助其有效性的輔因子、酶、結(jié)合配偶體或其他試劑。輔助蛋白可促進(jìn)一種或多種昆蟲抑制劑的攝取，例如或增強(qiáng)毒性劑的毒性作用。

可組裝重組DNA構(gòu)建體以使得所有蛋白質(zhì)或RNA分子從單個(gè)啟動(dòng)子表達(dá)或每種蛋白質(zhì)或dsRNA分子在單獨(dú)的啟動(dòng)子或其一些組合的控制下。本申請(qǐng)的蛋白質(zhì)可從多基因表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)，其中一種或多種TIC2463相關(guān)蛋白從共同核苷酸區(qū)段表達(dá)，所述核苷酸區(qū)段還包含其他ORF和啟動(dòng)子，這取決于所選擇的表達(dá)系統(tǒng)的類型。例如，細(xì)菌多基因表達(dá)系統(tǒng)可利用單個(gè)啟動(dòng)子來(lái)驅(qū)動(dòng)從單個(gè)操縱子內(nèi)表達(dá)多重連接的/串聯(lián)ORF。在另一個(gè)實(shí)例中，植物多基因表達(dá)系統(tǒng)可利用多重連接的表達(dá)盒，各表達(dá)盒表達(dá)不同的蛋白質(zhì)或其他試劑如一種或多種dsRNA分子。

含有編碼TIC2463相關(guān)蛋白的核苷酸序列的重組多核苷酸或重組DNA構(gòu)建體可通過(guò)載體例如質(zhì)粒、桿狀病毒、人工染色體、病毒粒子、粘粒、噬菌粒、噬菌體或細(xì)菌噬菌體或病毒載體遞送至宿主細(xì)胞。所述載體可用于實(shí)現(xiàn)TIC2463相關(guān)蛋白的穩(wěn)定或瞬時(shí)表達(dá)。引入宿主細(xì)胞中的任何這種DNA構(gòu)建體被稱為“轉(zhuǎn)基因”并且所述構(gòu)建體的宿主細(xì)胞受體是“轉(zhuǎn)基因細(xì)胞”或“轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞”。

在本申請(qǐng)中具體地考慮包含被設(shè)計(jì)用于表達(dá)TIC2463相關(guān)蛋白的任何重組多核苷酸的轉(zhuǎn)基因細(xì)菌、植物細(xì)胞、植物和植物部分，包括花和花器以及種子。術(shù)語(yǔ)“細(xì)菌細(xì)胞”或“細(xì)菌”意圖包括但不限于土壤桿菌屬、芽孢桿菌屬、埃希氏桿菌屬、沙門氏菌屬、假單胞菌屬或根瘤菌屬細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“植物細(xì)胞”或“植物”可包括但不限于苜蓿、香蕉、大麥、豆、花椰菜、卷心菜、蕓苔、胡蘿卜、木薯、蓖麻、菜花、芹菜、鷹嘴豆、大白菜、柑橘、椰子、咖啡、玉米、三葉草、棉花、葫蘆、黃瓜、花旗松、茄子、桉樹、亞麻、大蒜、葡萄、啤酒花、韭蔥、萵苣、火炬松、粟、甜瓜、堅(jiān)果、燕麥、橄欖、洋蔥、觀賞植物、棕櫚樹、牧草、豌豆、花生、胡椒、木豆、松樹、馬鈴薯、白楊樹、南瓜、輻射松、蘿卜、油菜籽(加拿大低酸油菜籽)、稻、根莖、黑麥、紅花、灌木、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、糖甜菜、甘蔗、向日葵、甜玉米、香楓、甘薯、柳枝稷、茶、煙草、番茄、小黑麥、草坪草、西瓜以及小麥植物細(xì)胞或植物。特別感興趣的是具有針對(duì)鞘翅目的一種或多種昆蟲的增強(qiáng)的殺蟲抗性的棉花、苜蓿、玉米、大豆或甘蔗植物。提供含有表達(dá)TIC2463相關(guān)毒素蛋白的多核苷酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物和從轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞再生的轉(zhuǎn)基因植物部分。轉(zhuǎn)基因植物可通過(guò)繁殖、插枝、折斷、研磨或以其他方式解離來(lái)自所述植物的細(xì)胞、部分或組織來(lái)從轉(zhuǎn)基因種子獲得。所述植物部分可以是種子、圓莢、葉、花或花器、莖、根、穗絲、胚芽或其任何部分，或轉(zhuǎn)基因植物部分的非再生部分。如在這種背景下使用，轉(zhuǎn)基因植物部分“非再生”部分是不能誘導(dǎo)來(lái)形成完整植物或不能誘導(dǎo)來(lái)形成能夠有性和/或無(wú)性繁殖的完整植物的部分。在某些實(shí)施方案中，植物部分的非再生部分是轉(zhuǎn)基因種子、圓莢、葉、花、莖或根的一部分。

在本申請(qǐng)中提供用于制備包含昆蟲或鞘翅目昆蟲抑制量的TIC2463相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)基因植物的方法。這類植物可通過(guò)將編碼任何TIC2463相關(guān)蛋白的重組多核苷酸引入植物細(xì)胞并且選擇源自所轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞的表達(dá)昆蟲或鞘翅目昆蟲抑制量的TIC2463相關(guān)殺蟲蛋白的植物來(lái)制備。植物可通過(guò)再生、種子、花粉或分生組織轉(zhuǎn)化技術(shù)自所述植物細(xì)胞獲得。用于轉(zhuǎn)化植物的方法是本領(lǐng)域中已知的(例如，用于將轉(zhuǎn)基因DNA引入組織中的土壤桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、基因槍法和浸泡或吸脹方法)。在某些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因植物可具有使用本領(lǐng)域中已知的位點(diǎn)特異性整合方法獨(dú)立地引入植物基因組內(nèi)的基本上同一位置中的兩種或更多種構(gòu)建體。表達(dá)本發(fā)明的一種或多種TIC2463或相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)基因植物可通過(guò)常規(guī)育種或通過(guò)將定點(diǎn)插入在先前存在的轉(zhuǎn)基因事件附近引入表達(dá)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的構(gòu)建體中來(lái)與本領(lǐng)域中已知的任何轉(zhuǎn)基因玉米植物組合，所述先前存在的轉(zhuǎn)基因事件包括但不限于事件176、事件4114、事件BT11、MIR162、MIR604、事件CBH-351、事件DAS-06275-8、事件DAS-59122-7、事件DBT418、事件MIR162、事件MIR604、事件MON810、事件MON863、事件MON88017、事件MON89034以及事件TC1507或其適用組合。

還提供加工的植物產(chǎn)物，所述植物產(chǎn)物包含可檢測(cè)量的本文所述的一種或多種多核苷酸或蛋白質(zhì)、昆蟲抑制區(qū)段或其片段、或其任何顯著部分。所述加工的產(chǎn)物選自由以下組成的組：植物生物質(zhì)、油、膳食、動(dòng)物飼料、面粉、薄片、糠、棉絨、外殼以及加工的種子，并且所述產(chǎn)物可以是非再生的。其顯著部分可包括如在SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24中的任一項(xiàng)中列出的至少10、20、30、50、100、200或甚至250個(gè)連續(xù)氨基酸的任何一種或多種多肽。

還在本申請(qǐng)中考慮加工的植物產(chǎn)物(還被稱為商品)，其中所述加工的產(chǎn)物包含可檢測(cè)量的TIC2463相關(guān)蛋白、其區(qū)段、其昆蟲抑制片段或其任何顯著部分。在某些實(shí)施方案中，所述加工的產(chǎn)物選自由以下組成的組：植物生物質(zhì)、油、膳食、糖、動(dòng)物飼料、面粉、薄片、糠、棉絨、外殼、加工的種子以及種子。所述植物產(chǎn)物可包含源自轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物部分的商品或其他商業(yè)產(chǎn)物，其中所述商品或其他產(chǎn)物可通過(guò)檢測(cè)編碼或包含TIC2463相關(guān)蛋白的顯著部分的核苷酸區(qū)段或表達(dá)的RNA或其他蛋白質(zhì)來(lái)通過(guò)商業(yè)追蹤?！坝衩咨唐贰蓖ǔＪ怯衩字参锏谋惶峁┯糜诔N子以外的商業(yè)的任何部分以及谷物或植物的副產(chǎn)物。玉米商品包括但不限于植物物質(zhì)、谷物或谷物的任何分裂片。實(shí)例可包括但不限于全谷物、帶有可溶物的干燥谷物酒槽(“DDGS”)、青貯飼料、用于例如寢具、燃料或飼料的秸稈、玉米糖、玉米淀粉、乙醇以及本領(lǐng)域中已知的其他非種子玉米產(chǎn)物和副產(chǎn)物。

還在本申請(qǐng)中提供表達(dá)昆蟲或鞘翅目昆蟲抑制量的本文所述的一種或多種殺蟲蛋白的轉(zhuǎn)基因植物控制昆蟲或鞘翅目昆蟲侵?jǐn)_的用途。任何上述轉(zhuǎn)基因植物可用于用以保護(hù)植物免于昆蟲或鞘翅目昆蟲侵?jǐn)_的方法中。獲得表達(dá)鞘翅目昆蟲活性蛋白如TIC2463相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)基因植物的方法是本領(lǐng)域中已知的。

包含編碼和表達(dá)在本申請(qǐng)中描述的一種或多種TIC2463相關(guān)毒素蛋白的重組多核苷酸序列的轉(zhuǎn)基因植物(i)展示與對(duì)照植物相比增強(qiáng)的性狀；并且(ii)產(chǎn)生含有所述重組多核苷酸序列的轉(zhuǎn)基因種子和單倍體花粉。通過(guò)選擇具有增強(qiáng)的性狀的轉(zhuǎn)化的植物或子代種子來(lái)鑒別具有增強(qiáng)的性狀的這類植物。為了效率，選擇方法被設(shè)計(jì)成評(píng)價(jià)包含重組DNA的多種轉(zhuǎn)基因植物(事件)(例如，2至20或更多種轉(zhuǎn)基因事件的多種植物)。從本申請(qǐng)中提供的轉(zhuǎn)基因種子生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因植物展現(xiàn)增強(qiáng)的性狀。提及“增強(qiáng)的性狀”意圖指特定轉(zhuǎn)基因植物展示有助于增加的殺蟲耐受性或增加的收獲產(chǎn)率(例如，與缺乏重組多核苷酸序列的植物相比，增加量的收獲作物、油、碳水化合物、蛋白質(zhì)、水果、漿果、堅(jiān)果、谷物、種子或棉絨)或者提供增加的植物價(jià)值(包括例如，改進(jìn)的種子、胚芽、油、碳水化合物、蛋白質(zhì)或商品質(zhì)量)的其他性狀的農(nóng)藝性狀特征的改進(jìn)。

提供用于從包含編碼對(duì)應(yīng)于本申請(qǐng)中提供的TIC2463相關(guān)毒素蛋白的殺蟲多肽的重組多核苷酸分子的種子產(chǎn)生植物和收獲作物的方法。所述方法包括以下步驟：通過(guò)將含有用于表達(dá)TIC2463相關(guān)蛋白的構(gòu)建體的昆蟲抗性第一植物與缺乏任何這種構(gòu)建體的第二植物一起育種來(lái)進(jìn)行雜交，獲得源自所述雜交的至少一種子代植物，并且選擇表達(dá)必需毒素蛋白的子代。所述子代是針對(duì)對(duì)TIC2463相關(guān)毒素蛋白敏感的一種或多種目標(biāo)昆蟲抗性的。種植種子以產(chǎn)生來(lái)自從所述種子種植的植物的作物并且收獲所述作物(谷物、水果、漿果、蔬菜、碳水化合物、蛋白質(zhì)、油、棉絨等)的步驟包括于所述方法中。在任何這種作物中收獲的至少約50％的谷物意圖包含所述重組多核苷酸分子。

還在本申請(qǐng)中公開了用TIC2463相關(guān)蛋白控制昆蟲、特別是對(duì)作物植物有害的鞘翅目昆蟲的方法。一種方法包括生長(zhǎng)含有昆蟲或鞘翅目昆蟲抑制量的TIC2463相關(guān)蛋白的植物且將所述植物提供于目標(biāo)昆蟲的飼料中。在某些實(shí)施方案中，所述方法還可包括以下中的任何一個(gè)或多個(gè)：(i)將包含或編碼TIC2463相關(guān)蛋白的任何組合物施加至所述植物或產(chǎn)生所述植物的種子；以及(ii)用編碼TIC2463相關(guān)蛋白的多核苷酸轉(zhuǎn)化所述植物或產(chǎn)生所述植物的植物細(xì)胞。所述植物可以是瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物，所述植物包含表達(dá)昆蟲或鞘翅目昆蟲抑制量的TIC2463相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)基因。所述植物還可以是包含TIC2463相關(guān)蛋白的組合物已施加至其的非轉(zhuǎn)基因植物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物是玉米并且所述害蟲物種是鞘翅目物種，特別是玉米根螢葉甲或相關(guān)物種。

在某些實(shí)施方案中，TIC2463相關(guān)蛋白的重組核酸分子是通過(guò)培養(yǎng)在適合于表達(dá)TIC2463相關(guān)毒素蛋白的條件下轉(zhuǎn)化以表達(dá)所述TIC2463相關(guān)毒素蛋白的重組芽孢桿菌或任何其他重組細(xì)菌細(xì)胞而制備的昆蟲抑制組合物的殺蟲活性成分。所述方法可包括通過(guò)表達(dá)和產(chǎn)生重組多肽的重組蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞的培養(yǎng)物的干燥、凍干、均質(zhì)化、萃取、過(guò)濾、離心、沉降或濃縮來(lái)制備。所述方法可產(chǎn)生蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞提取物、細(xì)胞懸浮液、細(xì)胞勻漿、細(xì)胞溶解產(chǎn)物、細(xì)胞上清液、細(xì)胞濾液或細(xì)胞沉淀。通過(guò)獲得如此產(chǎn)生的重組多肽和蛋白質(zhì)，包含所述重組多肽和蛋白質(zhì)的組合物可包括細(xì)菌細(xì)胞、細(xì)菌孢子和芽孢樣包涵體并且可被配制用于各種用途，包括農(nóng)業(yè)殺蟲噴霧產(chǎn)品或作為飼料生物測(cè)定中的昆蟲抑制制劑。

在一個(gè)實(shí)施方案中，為了降低抗性發(fā)展的可能性，包含TIC2463相關(guān)蛋白的昆蟲抑制組合物還可包含至少一種另外的多肽，所述多肽展示針對(duì)相同鞘翅目昆蟲物種的昆蟲抑制活性但不同于所述TIC2463相關(guān)毒素蛋白。用于這種組合物的可能的另外多肽包括昆蟲抑制性蛋白和昆蟲抑制性dsRNA分子。使用這類核糖核苷酸序列來(lái)控制昆蟲害蟲的一個(gè)實(shí)例描述于Baum等人(美國(guó)專利公布2006/0021087A1)中。用于控制鞘翅目害蟲的這種另外多肽可選自由以下組成的組：昆蟲抑制性蛋白如但不限于馬鈴薯糖蛋白、TIC100/101二元毒素、ET33/34二元毒素、TIC863、ET80/76二元毒素、ET70、Cry3Bb(美國(guó)專利No.6,501,009)、Cry1C變體、Cry3A變體、Cry3、Cry3B、Cry34/35、5307、Axmi184、Axmi205、AxmiR1、TIC901、TIC1201、TIC407、TIC417、TIC431、TIC807、TIC853、TIC3131、DIG-10、eHIP以及ω-Hexatoxin-Hv1a。

在其他實(shí)施方案中，這種組合物/制劑還可包含展示對(duì)不受本發(fā)明的另外昆蟲抑制性蛋白抑制的昆蟲的昆蟲抑制活性的至少一種另外的多肽以擴(kuò)大所獲得的昆蟲抑制的范圍。例如，為了控制鱗翅目害蟲，本發(fā)明的昆蟲抑制性蛋白的組合可與用于控制鱗翅目害蟲的另外多肽一起使用，但不限于如Cry1A(美國(guó)專利No.5,880,275)、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1A.105、Cry1Ae、Cry1B(美國(guó)專利公布No.10/525,318)、Cry1C(美國(guó)專利No.6,033,874)、Cry1D、Cry1Da及其變體、Cry1E、Cry1F、及Cry1A/F嵌合體(美國(guó)專利No.7,070,982；6,962,705；和6,713,063)、Cry1G、Cry1H、Cry1I、Cry1J、Cry1K、Cry1L、Cry1型嵌合體(如但不限于TIC836、TIC860、TIC867、TIC869和TIC1100、Cry2A、Cry2Ab(美國(guó)專利No.7,064,249)、Cry2Ae、Cry4B、Cry6、Cry7、Cry8、Cry9)、Cry15、Cry43A、Cry43B、Cry51Aa1、ET66、TIC400、TIC400、TIC800、TIC834、TIC1415、TIC3242、Vip3A、VIP3Ab、VIP3B、AXMI-184、AXMI-196、DIG-3、DIG-4、DIG-5、DIG-11、AfIP-1A及其衍生物(美國(guó)專利公布2014-0033361A1)、AfIP-1B及其衍生物(美國(guó)專利公布2014-0033361A1)、PIP-1APIP-1B(美國(guó)專利公布2014-0007292A1)、PSEEN3174(美國(guó)專利公布2014-0007292A1)、AECFG-592740(美國(guó)專利公布2014-0007292A1)、Pput_1063(美國(guó)專利公布2014-0007292A1)、Pput_1064(美國(guó)專利公布2014-0007292A1)、GS-135及其衍生物(美國(guó)專利公布2012-0233726A1)、GS153及其衍生物(美國(guó)專利公布2012-0192310A1)、GS154及其衍生物(美國(guó)專利公布2012-0192310A1)、GS155及其衍生物(美國(guó)專利公布2012-0192310A1)、如描述于美國(guó)專利公布2012-0167259A1中的SEQ ID NO:2及其衍生物、如描述于美國(guó)專利公布2012-0047606A1中的SEQ ID NO:2及其衍生物、如描述于美國(guó)專利公布2011-0154536A1中的SEQ ID NO:2及其衍生物、如描述于美國(guó)專利公布2011-0112013A1中的SEQ ID NO:2及其衍生物、如描述于美國(guó)專利公布2010-0192256A1中的SEQ ID NO:2和4及其衍生物、如描述于美國(guó)專利公布2010-0077507A1中的SEQ ID NO:2及其衍生物、如描述于美國(guó)專利公布2010-0077508A1中的SEQ ID NO:2及其衍生物、如描述于美國(guó)專利公布2009-0313721A1中的SEQ ID NO:2及其衍生物、如描述于美國(guó)專利公布2010-0269221A1中的SEQ ID NO:2或4及其衍生物、如描述于美國(guó)專利No.7,772,465(B2)中的SEQ ID NO:2及其衍生物、如描述于WO2014/008054A2中的CF161_0085及其衍生物、如描述于美國(guó)專利公布US2008-0172762A1、US2011-0055968A1和US2012-0117690A1中的鱗翅目毒性蛋白及其衍生物；如描述于US7510878(B2)中的SEQ ID NO:2及其衍生物、如描述于美國(guó)專利No.7812129(B1)中的SEQ ID NO:2及其衍生物等。此外，為了控制半翅目害蟲，本發(fā)明的昆蟲抑制性蛋白的組合可與半翅目活性蛋白如TIC1415(美國(guó)專利申請(qǐng)公布No.2013/0097735)、TIC807(美國(guó)專利No.8609936)和TIC834(美國(guó)專利申請(qǐng)公布No.2013/0269060)一起使用。用于控制鞘翅目、鱗翅目和半翅目昆蟲害蟲的另外多肽可在Neil Crickmore維護(hù)的蘇云金芽孢桿菌毒素命名法網(wǎng)站上找到(萬(wàn)維網(wǎng)btnomenclature.info)。

一種昆蟲抗性管理策略是采用表達(dá)通過(guò)不同作用模式操作的兩種不同昆蟲抑制劑的轉(zhuǎn)基因作物。已在本領(lǐng)域中記錄了昆蟲發(fā)展對(duì)某些殺蟲劑的抗性的可能性。因此，具有對(duì)所述昆蟲抑制劑中的任一種的抗性的任何昆蟲可通過(guò)另一種昆蟲抑制劑進(jìn)行控制。另一種昆蟲抗性管理策略采用未針對(duì)靶向鞘翅目害蟲物種進(jìn)行保護(hù)以提供針對(duì)此類未保護(hù)的植物的防護(hù)的植物的使用。一個(gè)具體實(shí)例描述于美國(guó)專利No.6,551,962中，所述專利以引用的方式整體并入。

被設(shè)計(jì)用于控制也受本文公開的蛋白質(zhì)控制的害蟲的待與種子處理中的蛋白質(zhì)、噴涂、浸涂或涂擦制劑一起使用的其他實(shí)施方案如局部施加的殺蟲化學(xué)品可直接施加至土壤(土壤澆灌)、施加至表達(dá)本文公開的蛋白質(zhì)的生長(zhǎng)中植物或被配制成施加至含有編碼所公開的一種或多種蛋白質(zhì)的一種或多種轉(zhuǎn)基因的種子。用于在種子處理中使用的這類制劑可用本領(lǐng)域中已知的各種粘附劑和增粘劑來(lái)施加。所述制劑可包含在作用模式上與所公開的蛋白質(zhì)協(xié)同作用的殺蟲劑，以使得制劑殺蟲劑通過(guò)不同的作用模式起作用來(lái)控制可通過(guò)所公開的蛋白質(zhì)控制的相同或類似的害蟲，或以使得所述殺蟲劑用于控制未通過(guò)TIC2463相關(guān)殺蟲蛋白質(zhì)有效控制的更廣泛的宿主范圍或植物害蟲物種。

包含重組多肽和蛋白質(zhì)的害蟲抑制性組合物或制劑可進(jìn)一步與農(nóng)業(yè)上可接受的載體(如粉末、粉塵、球粒、顆粒、噴霧、乳液、膠體或溶液)、芽孢桿菌孢子/晶體制劑、經(jīng)轉(zhuǎn)化以表達(dá)一種或多種所述蛋白質(zhì)的種子處理、重組植物細(xì)胞/植物組織/種子/植物、或經(jīng)轉(zhuǎn)化以表達(dá)一種或多種所述蛋白質(zhì)的細(xì)菌組合。取決于重組多肽中固有的殺蟲或除蟲抑制的水平以及待施加至植物或飼料測(cè)定的制劑的水平，所述組合物或制劑可包含各種按重量計(jì)量的重組多肽，例如，0.0001重量％至0.001重量％至0.01重量％至1重量％至99重量％的重組多肽分子。

還在本申請(qǐng)中提供用于檢測(cè)對(duì)應(yīng)于TIC2463相關(guān)蛋白或其顯著昆蟲抑制片段或區(qū)段的DNA、RNA或蛋白質(zhì)實(shí)施方案的方法或試劑盒，用于鑒別在本申請(qǐng)中描述的蛋白質(zhì)屬的另外成員的方法，用于鑒別與屬家族成員相關(guān)的新穎蛋白質(zhì)的方法，用于測(cè)試?yán)ハx生長(zhǎng)或侵?jǐn)_的控制的方法以及用于提供對(duì)植物和其他受體宿主的所述控制的方法。

如上文所提及，TIC2463相關(guān)蛋白可用于產(chǎn)生特異性地結(jié)合這種類別/屬的蛋白質(zhì)的抗體(或類似的特異性結(jié)合劑如抗運(yùn)載蛋白、脂質(zhì)運(yùn)載蛋白和/或α體)，并且這些抗體可用于篩選且發(fā)現(xiàn)所述屬的其他成員。在本文中提及詞語(yǔ)“抗體”意圖指可通過(guò)任何方式進(jìn)行修飾以實(shí)現(xiàn)與靶分子的抗原或表位的特異性結(jié)合的任何類別的蛋白質(zhì)，包括動(dòng)物抗體(包括IgA、IgE、IgG和IgM型抗體)以及植物和細(xì)菌蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)如抗運(yùn)載蛋白、脂質(zhì)運(yùn)載蛋白和α體以及凝集素)。具體地考慮了與本文公開的一種或多種重組多肽的表位特異性地結(jié)合作為TIC2463相關(guān)毒素蛋白或其部分的單獨(dú)或呈抗體混合物的抗體。還考慮了使用單獨(dú)或呈抗體混合物的這種抗體檢測(cè)或定量共享本文公開的蛋白質(zhì)的表位的蛋白質(zhì)的方法。這種檢測(cè)或定量方法可包括以下步驟：使樣品與所述抗體相接觸并且使用本領(lǐng)域中熟知的檢測(cè)裝置來(lái)檢測(cè)抗體與所述樣品中的多肽靶標(biāo)的結(jié)合。在考慮一種或多種表位且其組合用于這種方法的情況下，識(shí)別不同表位的抗體或抗體混合物的結(jié)合可鑒別展示與本文描述的重組多肽的同源性的多肽。

提供了用于檢測(cè)疑似含有TIC2463或相關(guān)多肽靶標(biāo)的樣品中的多肽靶標(biāo)的存在的試劑盒。所述試劑盒將包括用于表位檢測(cè)的一種或多種試劑以及一種或多種對(duì)照試劑以顯示所述檢測(cè)在統(tǒng)計(jì)方差內(nèi)操作?？紤]可包括于所述試劑盒中的試劑儲(chǔ)存、檢測(cè)裝置和試劑的用途的說(shuō)明書以及另外的部件和工具。

提供測(cè)試方法來(lái)測(cè)試本文描述的TIC2463相關(guān)多肽的殺蟲活性。所述方法在本文單獨(dú)地稱為“生物測(cè)定(bioassay)”并且多個(gè)測(cè)試稱為“生物測(cè)定(bioassays)”。本文描述測(cè)量生長(zhǎng)抑制、死亡率或兩者的組合的定性昆蟲生物測(cè)定。在以下實(shí)施例中測(cè)試的昆蟲目包括鞘翅目。飼料配方和制備、測(cè)試樣品和對(duì)照樣品的制備、昆蟲準(zhǔn)備以及用于進(jìn)行測(cè)定的程序通常依賴于經(jīng)受任何特定評(píng)價(jià)的昆蟲和/或害蟲的類型和大小。

根據(jù)上述內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，在不脫離本文所述的實(shí)施方案的精神和范圍的情況下可在已公開并仍獲得類似或相似結(jié)果的特定方面中做出改變。因此，在以下描述的實(shí)驗(yàn)實(shí)施例中公開的具體細(xì)節(jié)不意圖是限制性的，也不應(yīng)被解釋為限制性的。

實(shí)施例

根據(jù)上述內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可在已公開并仍獲得類似或相似結(jié)果的特定方面中做出改變。因此，本文公開的具體結(jié)構(gòu)和功能細(xì)節(jié)不應(yīng)被解釋為限制性的。應(yīng)了解本文引用的每個(gè)參考文獻(xiàn)的完整公開內(nèi)容并入本申請(qǐng)的公開內(nèi)容。

實(shí)施例1

TIC2463相關(guān)殺蟲蛋白的發(fā)現(xiàn)、克隆和表達(dá)

鑒別了展示獨(dú)特屬性、特別是殺蟲活性的蘇云金芽孢桿菌(“Bt”)菌株，并且針對(duì)每種菌株構(gòu)建了基因組文庫(kù)。所述細(xì)菌菌株的基因組文庫(kù)是在載體中產(chǎn)生的，從所述載體鑒別了包含編碼假設(shè)展示殺蟲活性的氨基酸序列的開發(fā)閱讀框(“ORF”)的克隆。

發(fā)現(xiàn)一種Bt菌株EG3957展示鞘翅目殺蟲活性。從所述菌株的基因組構(gòu)建的文庫(kù)產(chǎn)生了似乎包含編碼新穎Bt蛋白TIC1373(SEQ ID:40)的ORF的克隆的鑒別。所述TIC1373氨基酸序列似乎展示與被稱為Cry60的已知Bt殺蟲毒素的遠(yuǎn)緣關(guān)系(小于29％氨基酸序列同一性)。Cry60蛋白包含為梭菌屬ε毒素ETX家族成員以及滅蚊毒素MTX家族成員(pfam03318)的特征的肽元件。Cry60蛋白還與Cry15Aa1蛋白相關(guān)，因?yàn)镃ry60和Cry15Aa1兩者包含ETX/MTX pfam特征。尚不了解Cry60和Cry15蛋白是殺蟲的，對(duì)蚊幼蟲可能例外。因此，這種明顯新穎的Bt蛋白TIC1373(SEQ ID NO:40)與Cry60和Cry15pfam的遠(yuǎn)緣關(guān)系暗示殺蟲活性可從自質(zhì)粒表達(dá)TIC1373肽觀察到，所述質(zhì)粒含有指導(dǎo)蘇云金芽孢桿菌的無(wú)晶體菌株中的TIC1373ORF的表達(dá)的Bt孢子形成啟動(dòng)子。當(dāng)針對(duì)一連串植物害蟲在生物測(cè)定中進(jìn)行測(cè)試時(shí)，所得到的重組菌株未能展示任何殺蟲活性，并且對(duì)應(yīng)于預(yù)測(cè)的TIC1373的質(zhì)量的蛋白質(zhì)未在培養(yǎng)上清液或孢子/細(xì)胞沉淀中檢測(cè)到。

TIC1373蛋白質(zhì)序列與ETX/MTX型毒素Cry60的遠(yuǎn)緣關(guān)系表明所述TIC1373蛋白可展示一些異常的或難以表征的殺蟲活性。然而，如先前所解釋，TIC1373肽未展示針對(duì)在一連串昆蟲生物測(cè)定中測(cè)試的任何昆蟲的殺蟲活性，所述測(cè)試包括針對(duì)鞘翅目、鱗翅目和半翅目害蟲物種的測(cè)試。假設(shè)與TIC1373肽相關(guān)的蛋白質(zhì)可存在于其他微生物菌株中并且相關(guān)蛋白質(zhì)的氨基酸序列內(nèi)存在的變異可能產(chǎn)生毒素活性。因此，TIC1373蛋白編碼序列被用于鑒別包含與預(yù)測(cè)的TIC1373蛋白同源的相關(guān)序列的其他微生物菌株。對(duì)這類同源序列進(jìn)行克隆和測(cè)序，并且鑒別了與TIC1373開放閱讀框類似的開放閱讀框。

所鑒別的一種另外的同源蛋白質(zhì)在SEQ ID NO:2中列出，其在本申請(qǐng)中被指定為TIC1825。如在SEQ ID NO:1中列出的編碼TIC1825的序列是從Bt菌株EG5015獲得的。所預(yù)測(cè)的TIC1825蛋白氨基酸序列展示與TIC1373的實(shí)質(zhì)同一性(跨TIC1373蛋白的長(zhǎng)度77％同一性)。出人意料地，與TIC1373蛋白相比，TIC1825包含額外的31個(gè)N末端氨基酸。來(lái)自Bt的無(wú)晶體菌株的TIC1825蛋白的表達(dá)出人意料地在細(xì)胞沉淀以及培養(yǎng)上清液中展示鞘翅目殺蟲活性，從而表明所述蛋白質(zhì)毒素可被分泌至培養(yǎng)基中。

從培養(yǎng)上清液收集TIC1825蛋白并且所述蛋白質(zhì)的N-末端氨基酸序列分析指示從TIC1825基因ORF預(yù)測(cè)的TIC1825蛋白是包含在蘇云金芽孢桿菌的無(wú)晶體菌株中表達(dá)時(shí)可能負(fù)責(zé)靶向新生TIC1825蛋白以分泌至培養(yǎng)上清液中的33個(gè)氨基酸的信號(hào)肽的前體蛋白。據(jù)確定全長(zhǎng)TIC1825開放閱讀框(SEQ ID NO:1從核苷酸位置1-945)編碼加工成由核苷酸100-945編碼的成熟毒素蛋白的毒素前體蛋白。分泌的蛋白質(zhì)氨基末端序列信息與ORF編碼在所述蛋白質(zhì)的分泌形式中不存在的N-末端肽區(qū)段的事實(shí)相結(jié)合，表明預(yù)測(cè)的氨基末端肽區(qū)段是由如在SEQ ID NO:1中列出的核苷酸1-99編碼的分泌信號(hào)肽。

基于所述TIC1825數(shù)據(jù)，從Bt菌株EG3957獲得了另外的序列信息，已最初總所述菌株獲得了TIC1373數(shù)據(jù)。據(jù)確定另外的序列信息存在于原始TIC1373克隆的上游，所述克隆包含編碼類似于由TIC1825編碼序列編碼的N-末端信號(hào)肽區(qū)段的N-末端氨基酸區(qū)段的序列。將所述另外信息與TIC1373序列信息組裝在一起產(chǎn)生編碼TIC2463(SEQ ID NO:4)的ORF。出人意料地，含有編碼TIC2463的ORF(來(lái)自核苷酸位置1至939的SEQ ID NO:3)的克隆的表達(dá)產(chǎn)生對(duì)鞘翅目物種毒性的殺蟲活性，存在于培養(yǎng)上清液以及部分地保留在培養(yǎng)物的細(xì)胞沉淀中。

針對(duì)TIC2463相關(guān)毒素蛋白的存在篩選展示鞘翅目毒性活性的另外Bt菌株。表3總結(jié)所發(fā)現(xiàn)的Bt菌株和毒素。

表3Bt菌株、與TIC2463相關(guān)的蛋白質(zhì)和SEQ ID NO

實(shí)施例2

TIC2463相關(guān)蛋白在昆蟲生物測(cè)定中展示鞘翅目活性

TIC2463相關(guān)殺蟲蛋白在Bt中表達(dá)且針對(duì)對(duì)不同鞘翅目物種的毒性進(jìn)行測(cè)定。將來(lái)自Bt的每種毒素的制劑針對(duì)鞘翅目物種馬鈴薯甲蟲(科羅拉多馬鈴薯甲蟲，CPB)、玉米根螢葉甲(西部玉米根蟲，WCR)和十一星葉甲食根亞種(南部玉米根蟲，SCR)進(jìn)行測(cè)定。

如在實(shí)施例1中所描述發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)是從用編碼相應(yīng)TIC2463相關(guān)蛋白的載體轉(zhuǎn)化的重組無(wú)晶體Bt菌株產(chǎn)生的。蛋白質(zhì)是從重組細(xì)菌發(fā)酵提取的且用于飼料生物測(cè)定中。

用于飼料生物測(cè)定的蛋白質(zhì)樣品被提供為孢子晶體蛋白質(zhì)懸浮液或用過(guò)的細(xì)菌生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的可溶性蛋白。在Tris-HCl(10mM,pH＝8)、EDTA(0.1mM)、Triton-X 100(0.005％v/v)和benzonase(0.001％w/v)的緩沖液中制備蛋白質(zhì)的晶體孢子蛋白質(zhì)懸浮液。測(cè)定蛋白質(zhì)濃度且使用懸浮緩沖液稀釋為適當(dāng)。

將蛋白質(zhì)的測(cè)試樣品覆蓋至單獨(dú)生物測(cè)定區(qū)室的飼料表面上。通過(guò)將等份的懸浮緩沖液或用過(guò)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基(在適當(dāng)?shù)那闆r下)覆蓋至飼料表面上來(lái)制備對(duì)照樣品。將每個(gè)區(qū)室用單一昆蟲物種侵?jǐn)_，孵育且針對(duì)死亡率和萎縮評(píng)分。

對(duì)于CPB測(cè)定，將每個(gè)樣品孔用八個(gè)新生體侵?jǐn)_。將樣品區(qū)室置于25C和70％相對(duì)濕度下的無(wú)光照的受控環(huán)境中持續(xù)五天時(shí)間段。對(duì)于WCR測(cè)定，將每個(gè)樣品孔用八個(gè)新生體侵?jǐn)_。將樣品區(qū)室在25C和70％相對(duì)濕度下的無(wú)光照的受控環(huán)境中孵育六天時(shí)間段。對(duì)于SCR測(cè)定，將五至七個(gè)洗滌多的卵置于每個(gè)樣品區(qū)室的飼料表面上。將所述板儲(chǔ)存在25C和70％相對(duì)濕度下的無(wú)光照的受控環(huán)境中持續(xù)約二十四小時(shí)的時(shí)間段且針對(duì)孵化進(jìn)行監(jiān)測(cè)。在孵化后六天對(duì)所述測(cè)定評(píng)分。

通過(guò)針對(duì)死亡計(jì)數(shù)(僅基于受侵?jǐn)_的孔)和萎縮水平對(duì)樣品進(jìn)行評(píng)分來(lái)測(cè)量CPB和WCR測(cè)定中的殺蟲活性。對(duì)于SCR測(cè)定，昆蟲死亡率僅基于被觀察到已孵化的卵的數(shù)目。對(duì)萎縮(表示針對(duì)未處理的標(biāo)本的大小，存活昆蟲的相對(duì)大小)進(jìn)行視覺(jué)估計(jì)。

將TIC1825(SEQ ID NO:2)和TIC2463(SEQ ID NO:4)在如所描述的飼料生物測(cè)定中針對(duì)抗CPB功效進(jìn)行測(cè)試。TIC1825被提供為晶體孢子懸浮液。在至少0.008微克蛋白質(zhì)/毫升飼料的蛋白質(zhì)濃度下觀察到死亡。在所測(cè)試的所有濃度下觀察到萎縮。在緩沖液對(duì)照樣品情況下未觀察到萎縮或死亡。TIC2463被提供為晶體孢子制劑和用作的培養(yǎng)基中的可溶性蛋白。所述晶體孢子制劑以及用過(guò)的培養(yǎng)基均展示顯著死亡。所述晶體孢子制劑在低至0.162微克蛋白質(zhì)/毫升飼料的濃度下展示死亡。用過(guò)的培養(yǎng)基在低至0.600微克/毫升飼料的濃度下展示死亡。在緩沖液對(duì)照樣品情況下未觀察到萎縮或死亡。TIC2463和TIC1825兩者均展現(xiàn)針對(duì)CPB的殺蟲活性。

制備了另外的TIC2463相關(guān)毒素且針對(duì)抗CPB和WCR功效進(jìn)行了測(cè)試。這些生物測(cè)定實(shí)驗(yàn)的結(jié)果報(bào)告在表4中。除TIC1825和TIC2463之外，TIC3891(SEQ ID NO:18)、TIC2461(SEQ ID NO:6)、TIC3626(SEQ ID NO:22)、TIC3037(SEQ ID NO:8)、TIC1825v1(SEQ ID NO:26)、TIC1825v2(SEQ ID NO:28)和TIC1825v3(SEQ ID NO:30)也展示殺蟲活性。

表4.TIC2463家族蛋白質(zhì)的殺蟲活性

僅CPB和WCR飼料測(cè)定

M–在所測(cè)試的濃度下觀察到的死亡率(對(duì)比緩沖液對(duì)照)

S–在所測(cè)試的濃度下萎縮的幸存者(對(duì)比緩沖液對(duì)照)

NA–如所測(cè)試無(wú)活性

NT–未測(cè)試

+-有效結(jié)果

實(shí)施例3

TIC1825氨基酸序列變體

此實(shí)施例示出某些TIC1825氨基酸序列變體在生物測(cè)定中與天然TIC1825蛋白相比展示針對(duì)玉米根蟲的改進(jìn)的殺蟲活性。

對(duì)應(yīng)于TIC2463相關(guān)毒素蛋白家族成員中的每種的毒性部分的氨基酸區(qū)段的比對(duì)顯示所述家族成員之間的氨基酸序列差異。采用如在圖1中列出的比對(duì)數(shù)據(jù)連同如在以上表4中列出的毒性概況數(shù)據(jù)，觀察到在對(duì)應(yīng)于如在TIC2463的SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列位置233的位置處包含丙氨酸的TIC2463相關(guān)蛋白當(dāng)針對(duì)CPB和玉米根蟲進(jìn)行測(cè)試時(shí)展示毒性。這表明如果在TIC1825中的氨基酸位置233處或附近的氨基酸更密切地類似在TIC2463中的對(duì)應(yīng)位置處的氨基酸，則展示針對(duì)CPB但不針對(duì)CRW的毒性活性的蛋白質(zhì)如TIC1825可展示更廣泛的宿主范圍和可能更大的毒性作用。

為了測(cè)試這種假設(shè)，產(chǎn)生了含有與TIC2463內(nèi)的類似位置一致的各種氨基酸取代的TIC1825蛋白并且包括于針對(duì)玉米根蟲和CPB的生物測(cè)定中。使TIC1825編碼序列(SEQ ID NO:1)經(jīng)受修飾，所述修飾導(dǎo)致編碼在位置233處的氨基酸甘氨酸(G)的密碼子改變?yōu)楸彼?A)并且編碼在位置234處的氨基酸脯氨酸(P)的密碼子改變?yōu)楸彼帷＿@些修飾中的每種引起TIC1825蛋白在這些位置處更密切地類似TIC2463。TIC1825_G233A變體(TIC1825v1，SEQ ID NO:26)被構(gòu)建為僅包含在位置233處的G至A改變(由SEQ ID NO:25編碼)。TIC1825_P234A變體(TIC1825v2，SEQ ID NO:28)被構(gòu)建為僅包含在位置233處的P至A改變(由SEQ ID NO:27編碼)。構(gòu)建了第三變體(TIC1825v3，SEQ ID NO:30，由SEQ ID NO:29編碼)，其中在位置233和234處引入丙氨酸取代，連同在位置224處蘇氨酸(T)取代賴氨酸(K)，在位置226處天冬酰胺(N)取代天冬氨酸(D)，在位置246處蘇氨酸(T)取代亮氨酸(L)，以及在位置248處纈氨酸(V)取代蘇氨酸(T)。這些變化由圖1D中對(duì)應(yīng)于TIC1825_V1、_V2和_V3的行上的粗體指明的存在反映。

編碼這些氨基酸序列變體的構(gòu)建體在蘇云金芽孢桿菌的無(wú)晶體菌株中表達(dá)。將對(duì)應(yīng)于從這些重組菌株的發(fā)酵產(chǎn)生的TIC1825變體的蛋白質(zhì)分離以用于在針對(duì)玉米根蟲以及其他葉甲屬物種的飼料生物測(cè)定中隨后測(cè)試。所述變體被觀察到展示玉米根蟲生物活性，并且所述結(jié)果在表4的最后三行中示出。

可使用類似的取代和針對(duì)玉米根蟲的生物活性的確認(rèn)來(lái)測(cè)試在對(duì)應(yīng)氨基酸位置233處不包含丙氨酸且不展示玉米根蟲生物活性的TIC2463相關(guān)毒素蛋白家族成員。預(yù)計(jì)將其他TIC2463相關(guān)毒素蛋白家族成員修飾為在氨基酸位置233處包含丙氨酸將產(chǎn)生針對(duì)玉米根蟲的殺蟲活性。

實(shí)施例4

當(dāng)在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的玉米植株中表達(dá)時(shí)，TIC2463相關(guān)蛋白展現(xiàn)針對(duì)鞘翅目害蟲的活性

此實(shí)施例證明當(dāng)在植物中表達(dá)時(shí)，也展示實(shí)施例2中所示的TIC2463相關(guān)毒素蛋白和實(shí)施例3中列出的TIC1825變體的體外生物活性。當(dāng)被鞘翅目害蟲物種如玉米根蟲侵?jǐn)_時(shí)，表達(dá)這些蛋白質(zhì)的玉米植株顯示顯著減少的根損傷。

編碼源自芽孢桿菌細(xì)菌系統(tǒng)的蛋白質(zhì)的多核苷酸序列對(duì)于在植物中表達(dá)來(lái)說(shuō)是無(wú)效的(U.S.5,500,365)。已經(jīng)構(gòu)建了包含被設(shè)計(jì)用于在植物中使用的編碼TIC2463相關(guān)蛋白毒素的人工多核苷酸序列的表達(dá)盒。在本文提供如在SEQ ID NO 33、35、43、44、45、46和47中列出的多核苷酸序列。這些多核苷酸序列中的每種編碼TIC2463相關(guān)蛋白毒素，并且各自可被引入含有至少可操作地連接至編碼所述毒素蛋白的多核苷酸序列的植物功能啟動(dòng)子的DNA構(gòu)建體中。編碼所述TIC2463相關(guān)毒素蛋白的多核苷酸序列還將在所述毒素編碼序列的3’端處包含翻譯終止密碼子(TAA、TAG或TGA)，其之后是且可操作地連接至對(duì)應(yīng)于植物功能性3’轉(zhuǎn)錄終止和多腺苷酸化序列的DNA區(qū)段。所述表達(dá)盒可通過(guò)微粒轟擊法、輸注或本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的其他轉(zhuǎn)化方法直接引入植物細(xì)胞中。所述表達(dá)盒可通過(guò)微粒轟擊法、輸注或本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的其他轉(zhuǎn)化方法直接引入植物細(xì)胞中。在任一情況下，將所述構(gòu)建體穩(wěn)定且可遺傳的引入植物基因組中允許選擇一種或多種轉(zhuǎn)基因事件，可針對(duì)TIC2463相關(guān)毒素蛋白的殺蟲有效量的表達(dá)對(duì)所述轉(zhuǎn)基因事件進(jìn)行測(cè)試。在所述植物中表達(dá)的TIC2463相關(guān)毒素蛋白可被設(shè)計(jì)成表達(dá)天然信號(hào)肽或異源信號(hào)肽或靶向肽。所述異源信號(hào)肽可以是源自不同TIC2463相關(guān)毒素蛋白的信號(hào)肽、芽孢桿菌物種中功能性的其他細(xì)菌信號(hào)肽、植物功能性信號(hào)肽或靶向肽。對(duì)于適用宿主細(xì)胞，這些信號(hào)/靶向肽將通過(guò)將TIC2463相關(guān)毒素蛋白的成熟毒素區(qū)段分泌至亞細(xì)胞細(xì)胞器或區(qū)室如葉綠體、質(zhì)體、線粒體、液泡或造粉體中來(lái)插入。

將表達(dá)Cry3Bb的F1轉(zhuǎn)基因玉米植株用作陽(yáng)性對(duì)照。陰性對(duì)照不包含編碼殺蟲毒素蛋白的轉(zhuǎn)基因。將轉(zhuǎn)化為包含表達(dá)TIC2463相關(guān)蛋白的構(gòu)建體的F1玉米植株與陰性對(duì)照和Cry3Bb轉(zhuǎn)基因事件進(jìn)行比較。將所述F1植株轉(zhuǎn)移至籠形盆中的土壤，每盆用六十個(gè)WCR新生體侵?jǐn)_，并且在受控的溫室條件下生長(zhǎng)十三天。在六十天之后將植株針對(duì)根損傷進(jìn)行評(píng)價(jià)并且使用由Oleson等人(Journal of Economic Entomology(2005)98(1):1-8)描述的評(píng)定量表進(jìn)行評(píng)分。得分零與無(wú)損傷一致，得分三與三個(gè)或更多個(gè)接點(diǎn)已被修剪至桿的1.5英寸內(nèi)的觀察結(jié)果一致。通過(guò)計(jì)數(shù)在評(píng)價(jià)周期結(jié)束時(shí)仍存在的3齡幼蟲的數(shù)目來(lái)評(píng)定昆蟲死亡率。

針對(duì)單獨(dú)事件計(jì)算F1測(cè)定結(jié)果。所測(cè)試的表達(dá)TIC2463的八個(gè)不同轉(zhuǎn)基因事件中的三個(gè)展示與陰性對(duì)照相比顯著減少的根損傷。表達(dá)TIC1825的九個(gè)單獨(dú)事件各自展示比在陰性對(duì)照中觀察到的損傷一樣或更壞的損傷。

還獲得了重組/轉(zhuǎn)基因植物，所述植物分別從如在SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:37中列出的編碼序列表達(dá)靶向造粉體(SEQ ID NO:36)或葉綠體(SEQ ID NO:38)的TIC2463。將轉(zhuǎn)基因植物事件針對(duì)對(duì)玉米根蟲侵?jǐn)_的抗性進(jìn)行測(cè)試。當(dāng)與缺乏TIC2463蛋白的植株進(jìn)行比較時(shí)，所述轉(zhuǎn)基因植物被觀察到對(duì)根蟲侵?jǐn)_具有抗性。

類似地，將玉米植株進(jìn)行轉(zhuǎn)化并且獲得了表達(dá)以下TIC2463相關(guān)蛋白變體的轉(zhuǎn)基因植株：TIC1825_12(SEQ ID NO:49)、TIC1825_13(SEQ ID NO:51)、TIC1825_15(SEQ ID NO:53)、TIC2461_5(SEQ ID NO:55)、TIC2463_3(SEQ ID NO:32)、TIC2463_4(SEQ ID NO:34)、TIC2463_8(SEQ ID NO:57)、TIC2463_9(SEQ ID NO:59)和TIC2463_10(SEQ ID NO:61)。在測(cè)試時(shí)，當(dāng)與缺乏TIC2463相關(guān)蛋白的植株進(jìn)行比較時(shí)，這些轉(zhuǎn)基因植物被發(fā)現(xiàn)對(duì)玉米根蟲損傷具有抗性。

獲得了表達(dá)具有如在SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:30中列出的氨基酸序列的TIC1825氨基酸序列變體的轉(zhuǎn)基因事件并且將所述轉(zhuǎn)基因事件與表達(dá)靶向葉綠體的TIC1825天然毒素區(qū)段或靶向葉綠體的TIC2463毒素進(jìn)行比較。轉(zhuǎn)化為包含TIC1825氨基酸序列變體的植株將展示與表達(dá)天然TIC1825毒素蛋白的植物相比顯著改進(jìn)的玉米根蟲抗性。

本公開因此特別地考慮表達(dá)TIC2463相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)基因事件(用被設(shè)計(jì)用于表達(dá)TIC2463相關(guān)蛋白的多核苷酸轉(zhuǎn)化的玉米植株)。所述植株可具有表達(dá)TIC2463相關(guān)蛋白的直接連接至至少一種另外構(gòu)建體的構(gòu)建體，所述至少一種另外的構(gòu)建體被設(shè)計(jì)用于表達(dá)另外的毒性劑，如被設(shè)計(jì)用于特異性地靶向抑制鞘翅目害蟲中的關(guān)鍵基因的dsRNA(所述鞘翅目害蟲可與靶向通過(guò)TIC2463相關(guān)毒素蛋白控制的害蟲相同或不同的害蟲)?；蛘?，被設(shè)計(jì)用于表達(dá)另外的毒性劑的連接的另外構(gòu)建體可編碼一種或多種另外的毒素蛋白，并且至少一種殼與TIC2463相關(guān)毒素互補(bǔ)，從而提供將降低靶向鞘翅目害蟲對(duì)由所述植株產(chǎn)生的鞘翅目特異性毒素中的任一種的抗性發(fā)展的可能性的另外作用模式。所述一種或多種另外的毒素蛋白還可包含針對(duì)不同物種如鱗翅目、半翅目、同翅目或纓翅目害蟲物種的害蟲或植物病原性線蟲或真菌植物病原體具有活性的毒素。轉(zhuǎn)化為表達(dá)所述TIC2463相關(guān)毒素的植株還可通過(guò)與其他性狀一起培育來(lái)進(jìn)行組合，所述性狀包括但不限于與TIC2463相關(guān)毒素作用模式互補(bǔ)的鞘翅目特異性性狀、鱗翅目性狀、對(duì)增加產(chǎn)率具有特異性的性狀、降低對(duì)干旱的敏感性、增加氮利用等的效率以及本領(lǐng)域中已知的提供對(duì)除草劑施加的耐受性的性狀。具體地考慮補(bǔ)充TIC2463相關(guān)毒素作用模式的毒性活性的種子處理和局部施加的制劑，以及用于控制植物中的基因(具體地說(shuō)dsRNA施加)或用于控制如上所述的其他害蟲物種的化學(xué)品。

實(shí)施例5

TIC2463的最小活性核心

此實(shí)施例說(shuō)明TIC2463殺蟲活性的最小活性核心序列。

設(shè)計(jì)、克隆且表達(dá)了TIC2463相關(guān)蛋白缺失突變體以測(cè)定針對(duì)西部玉米根蟲(WCR)的活性所需的最小蛋白質(zhì)序列。為了研究TIC2463的活性核心，選擇了在蛋白質(zhì)的六個(gè)區(qū)域中具有缺失的突變體以用于WCR生物測(cè)定測(cè)試。將表達(dá)蛋白質(zhì)的缺失突變體純化且標(biāo)準(zhǔn)化至50ppm且在WCR飼料生物測(cè)定中進(jìn)行測(cè)試，其中TIC2463(SEQ ID NO:4)作為比較者。生物測(cè)定萎縮數(shù)據(jù)表明推定分泌信號(hào)位點(diǎn)和C末端的缺失維持針對(duì)WCR的活性。這些缺失突變體蛋白的萎縮得分是2-3，而野生型是3。此外，在氨基酸40處的缺失不顯示活性，從而指示氨基酸40對(duì)于活性來(lái)說(shuō)是關(guān)鍵的。在序列的中部和朝向蛋白質(zhì)的N末端的環(huán)附近的缺失導(dǎo)致活性喪失。這些缺失突變體蛋白的萎縮得分是0-1，而野生型是3。

基于此生物測(cè)定數(shù)據(jù)，從氨基酸殘基40至309的中心序列似乎是TIC2463的具有殺蟲活性的最小核心。