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改善的NGS工藝流程的制作方法

文檔序號:12070530閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.制備DNA文庫的方法,其包括以下步驟:

a)從樣品提取核酸,

b)將所述提取的核酸暴露于包含UDG、DNA聚合酶和任選的反轉(zhuǎn)錄酶以及dUTP的混合物,

c)孵育所述混合物以除去混合物中來源于先前擴(kuò)增反應(yīng)的殘留擴(kuò)增產(chǎn)物的污染,

d)在存在dUTP的情況下,進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng),

其中在相同反應(yīng)混合物中進(jìn)行所述除去污染的反應(yīng),任選地進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和DNA聚合酶-進(jìn)行的擴(kuò)增反應(yīng)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中所述DNA聚合酶為水生棲熱菌(Thermus aquaticus)(Taq)DNA聚合酶或其功能衍生物,其中Taq聚合酶的所述功能衍生物具有至少80%,優(yōu)選地至少90%,更優(yōu)選地至少100%的Taq聚合酶的DNA聚合活性。

3.根據(jù)權(quán)利要求1和2中任一項(xiàng)所述的方法,其中在步驟b)之前使所述提取的核酸片段化。

4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法,其中隨后在下一代測序反應(yīng)中使用所述DNA文庫。

5.試劑組合物,其包含酶混合物,所述酶混合物包含UDG、DNA聚合酶、任選地反轉(zhuǎn)錄酶。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑組合物,其還包含dUTP。

7.包含Taq DNA聚合酶或其功能衍生物的試劑組合物。

8.包含用于反轉(zhuǎn)錄和/或PCR的試劑的試劑組合物。

9.除去用于核酸模板擴(kuò)增的反應(yīng)混合物中污染的方法,所述反應(yīng)混合物包含所述核酸模板、DNA聚合酶、UDG酶和任選地反轉(zhuǎn)錄酶和dUTP,和用于DNA聚合反應(yīng)和任選地反轉(zhuǎn)錄的試劑。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法,其中在足以除去混合物中來源于先前擴(kuò)增反應(yīng)的殘留擴(kuò)增產(chǎn)物的污染的一段時(shí)間之后,使UDG酶失活。

11.根據(jù)權(quán)利要求9和10中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述DNA聚合酶為水生棲熱菌(Thermus aquaticus)(Taq)DNA聚合酶,或其功能衍生物。

12.根據(jù)權(quán)利要求9和11中任一項(xiàng)所述的方法,其中在步驟b)之前使所述提取的核酸片段化。

13.根據(jù)權(quán)利要求9-12中任一項(xiàng)所述的方法,其中隨后在下一代測序反應(yīng)中使用所述DNA文庫。

14.用于DNA文庫制備的方法,其包括以下步驟:

a)從樣品提取核酸,

b)將所述提取的核酸暴露于包含DNA聚合酶和任選地反轉(zhuǎn)錄酶的混合物,

c)在存在dUTP的情況下,進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng),

d)使所獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)化,其中標(biāo)準(zhǔn)化方法包括以下步驟:

(i)將包含堿金屬鹽和溶劑的緩沖液組合物加入到包含擴(kuò)增產(chǎn)物的擴(kuò)增混合物中,

(ii)將載體顆粒加入到包含擴(kuò)增產(chǎn)物的擴(kuò)增混合物中,

(iii)將所述混合物孵育足以使DNA結(jié)合至所述載體顆粒的時(shí)間,

(iv)用乙醇清洗所述混合物,

(v)從所述載體顆粒洗脫標(biāo)準(zhǔn)化PCR產(chǎn)物。

15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法,其中所述堿金屬鹽為NaCl。

16.根據(jù)權(quán)利要求14和15中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述溶劑為聚乙二醇。

17.根據(jù)權(quán)利要求14至16中任一項(xiàng)所述的方法,其中以約2.0至約5.0M NaCl,優(yōu)選地約2.5M NaCl的量加入所述堿金屬鹽。

18.根據(jù)權(quán)利要求14至17中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述溶劑為PEG 8000。

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