本發(fā)明涉及細(xì)胞領(lǐng)域，特別涉及成體干細(xì)胞向誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞(ipsc)的重編程方法。

背景技術(shù)：

脊椎動(dòng)物早期胚胎囊胚期的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)具有多能性，其可以分化為機(jī)體除胎盤(pán)之外三胚層的所有類(lèi)型細(xì)胞，這些已經(jīng)終端分化的細(xì)胞在體內(nèi)一般是不會(huì)改變命運(yùn)的。一些研究表明，通過(guò)核移植，細(xì)胞融合和多能性細(xì)胞提取物共培養(yǎng)的方法可以實(shí)現(xiàn)終端分化的細(xì)胞重新逆分化為多能性的狀態(tài)(yamanakas,blauhm,2010,nuclearreprogrammingtoapluripotentstatebythreeapproaches.nature465:704-712)。但這些方法都依賴(lài)于卵母細(xì)胞這種稀缺的材料，因此在應(yīng)用上受到一定的限制。

2006年，yamanaka利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，將外源性的oct4、sox2、c-myc和klf4四種轉(zhuǎn)錄因子在小鼠成纖維細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，得到了誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞(ipsc，inducedpluripotentstemcells)，其與小鼠胚胎干細(xì)胞(escs，embryonicstemcells)在形態(tài)、基因表達(dá)及分化潛能性等方面均很相似，且可以發(fā)育成完整的個(gè)體(takahashik,yamanakas,2006,inductionofpluripotentstemcellsfrommouseembryonicandadultfibroblastculturesbydefinedfactors.cell126:663-676)。

ipsc技術(shù)是干細(xì)胞研究領(lǐng)域的重大突破。在藥物篩選方面，將病人表皮細(xì)胞誘導(dǎo)為ipsc，再將ipsc誘導(dǎo)為所需要的病體細(xì)胞，該病體細(xì)胞可用于藥物篩選，進(jìn)而用篩選得到的藥物來(lái)治療這種疾病。在細(xì)胞模型方面，ipsc技術(shù)可以為一些難以獲得組織的疾病如神經(jīng)相關(guān)疾病提供病體細(xì)胞(egawanetal,2012,drugscreeningforalsusingpatient-specificinducedpluripotentstemcells.sciencetranslationalmedicine4)。在細(xì)胞治療方面，ipsc由自體的細(xì)胞誘導(dǎo)而來(lái)，用于自身的治療可以減小免疫排斥效應(yīng)，同時(shí)規(guī)避了escs的倫理問(wèn)題(wernigmetal,2008,neuronsderivedfromreprogrammedfibroblastsfunctionallyintegrateintothefetalbrainandimprovesymptomsofratswithparkinson'sdisease.proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica105:5856-5861；xudetal,2009,phenotypiccorrectionofmurinehemophiliaausinganipsccell-basedtherapy.proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica106:808-813)。ipsc用于疾病治療的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可以通過(guò)基因打靶的方法修復(fù)細(xì)胞的基因組，用于治療一些遺傳病。如hanna等利用模型小鼠的尾尖成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)為ipsc，通過(guò)基因打靶的方法將突變的基因校正，進(jìn)而將其分化為造血祖細(xì)胞后注回小鼠體內(nèi)，產(chǎn)生了正常的血細(xì)胞并成功治愈了小鼠。raya等也將fanconi貧血病患者的細(xì)胞誘導(dǎo)為ipsc，對(duì)其進(jìn)行基因校正后進(jìn)一步分化為造血祖細(xì)胞，為該疾病的ipsc治療進(jìn)行了初探(rayaa,2009,disease-correctedhaematopoieticprogenitorsfromfanconianaemiainducedpluripotentstemcells.nature460:53-59.)。

ipsc可作為臨床治療種子細(xì)胞的前提是其具有較低的免疫原性，但是zhao等用逆轉(zhuǎn)錄病毒誘導(dǎo)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mef)重編程得到的ipsc在同基因型的小鼠體內(nèi)無(wú)法形成或者形成了難以檢測(cè)的畸胎瘤，表明以該方法獲得的ipsc具有較高的免疫原性(zhaotetal,2011,immunogenicityofinducedpluripotentstemcells.nature474:212-215)，ipsc的免疫原性始終是目前阻礙其進(jìn)一步進(jìn)入臨床應(yīng)用的主要障礙，但是目前對(duì)于其具有免疫原性的機(jī)理尚不可知。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種更有利于臨床前研究的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的重編程的方法，包括如下步驟：

1、取人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(ucmsc)培養(yǎng)，再以表達(dá)oct4，sox2，c-myc和klf4四種轉(zhuǎn)錄因子的仙臺(tái)病毒感染細(xì)胞；

2、以增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)；

3、再以誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)，在無(wú)飼養(yǎng)層體系中進(jìn)行重編程，待充分重編程后，挑取單克??；

4、繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)并篩選，篩選得到經(jīng)ap染色為陽(yáng)性、且表達(dá)多能性蛋白nanog、ssea-4，tra-1-60與tra-1-81的單克隆，即得到目的ipsc。

優(yōu)選的，所述人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的重編程的方法，包括如下步驟：

1、取人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(ucmsc)培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后，將細(xì)胞接種于六孔板中。

2、細(xì)胞生長(zhǎng)48h后，以表達(dá)klf4、oct4、sox2的kos仙臺(tái)病毒，表達(dá)c-myc和表達(dá)klf4的仙臺(tái)病毒感染細(xì)胞，各病毒的感染復(fù)數(shù)比例是kos:c-myc：klf4＝5:5:3；

3、24h后更換新鮮的增殖培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)6天，每2天換液；

4、將細(xì)胞消化，接種于vtn-n包被的六孔板中，用增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)；

5、接種24h后換為誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)，此后每天換新鮮的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，在無(wú)飼養(yǎng)層體系上進(jìn)行重編程；

6、待充分重編程后，挑取單克隆，繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)并篩選，經(jīng)ap染色為陽(yáng)性，且表達(dá)多能性蛋白nanog、ssea-4、tra-1-60與tra-1-81的即為目的ipsc。

優(yōu)選的，步驟1中的細(xì)胞接種密度在4～8萬(wàn)/孔。

優(yōu)選的，步驟2中所述kos為同一載體上等比例串連klf4，oct4和sox2序列。

優(yōu)選的，步驟4中的ipsc在無(wú)飼養(yǎng)層的體系上進(jìn)行重編程。

優(yōu)選的，步驟6中克隆挑取的時(shí)間為感染仙臺(tái)病毒后21～25天。

更優(yōu)選的，上述所述方法中的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(ucmsc)由如下方法分離和培養(yǎng)得到，包括如下步驟：

(a)取新鮮臍帶，pbs洗滌后，用酒精浸泡，再用pbs洗滌；

(b)去除臍動(dòng)脈和靜脈；

(c)取華通氏膠(wharton’sjelly)，剪碎加增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)，傳代純化并凍存即得到所需的ucmsc。

優(yōu)選的，上述步驟(a)中，用酒精浸泡后，更有利于華通氏膠(wharton’sjelly)的剝離。

優(yōu)選的，純化的具體方法是消化2分鐘后即將消化下來(lái)的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新的皿中繼續(xù)培養(yǎng)。

優(yōu)選的，所述增殖培養(yǎng)基為含有10％(v/v)fbs、100u/ml的青霉素、100μg/ml的鏈霉素，或者含有10％(v/v)fbs、10ng/mlbfgf、50μg/mlvc、100u/ml的青霉素、100μg/ml的鏈霉素的dmem/f12培養(yǎng)基。更優(yōu)選的，所述增殖培養(yǎng)基為含有10％(v/v)fbs、10ng/mlbfgf、50μg/mlvc、100u/ml的青霉素、100μg/ml的鏈霉素的dmem/f12培養(yǎng)基。

采用上述培養(yǎng)方法得到的ucmsc具有更高的增殖活性，能更好的維持間充質(zhì)干細(xì)胞的分子表達(dá)特性；細(xì)胞具有更高的純度；同時(shí)更有利于重編程的發(fā)生。

本發(fā)明誘導(dǎo)重編程方法重編程效率高，得到的ipsc具有低免疫原性，同時(shí)可完消除外源性基因的隨機(jī)整合帶來(lái)的安全性問(wèn)題。

附圖說(shuō)明

圖1：m1增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)的ucmsc(m1ucmsc)與m2增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)的ucmsc(m2ucmsc)的連續(xù)傳代：本圖第一行從左到右依次為m1增殖培養(yǎng)基中第1、3和8代的ucmsc，第二行從左到右依次為m2增殖培養(yǎng)基中第1、3、8和15代的ucmsc。

圖2：第3代與第10代m2增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)的m2ucmsc的增殖曲線(xiàn)，其中橫軸為天數(shù)值。

圖3：m1與m2ucmsc的cd29、cd44與cd105平均熒光強(qiáng)度的比較。

圖4：ipsc的ap染色。

圖5：ipsc的免疫熒光染色。

圖6：ipsc的體外分化檢測(cè),a圖指仙臺(tái)病毒ipsc形成eb后向三胚層分化的pcr檢測(cè)，b圖指慢病毒ipsc形成eb后向三胚層分化的pcr檢測(cè)。

圖7：ucmsc的重編程效率檢測(cè)：其中，s-free-m1指仙臺(tái)病毒感染m1ucmsc在無(wú)飼養(yǎng)層體系上的重編程體系，s-free-m2指仙臺(tái)病毒感染m2ucmsc在無(wú)飼養(yǎng)層體系上的重編程。

圖8：ipsc的外源性基因檢測(cè)：圖a為仙臺(tái)病毒ipsc的外源性基因殘留檢測(cè)，其中以仙臺(tái)病毒感染后5天的ucmsc為陽(yáng)性對(duì)照，水為陰性對(duì)照；圖b為慢病毒ipsc的外源性基因殘留檢測(cè)，其中以質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，水為陰性對(duì)照。

圖9：ipsc的hla-i的表達(dá)水平檢測(cè)。

圖10：ifnγ處理前后ipsc的hla-ii表達(dá)水平檢測(cè)。

圖11：刺激淋巴細(xì)胞增殖能力檢測(cè)。

圖12：小鼠體內(nèi)免疫，接種5天后組織切片he染色圖。

圖13：小鼠體內(nèi)免疫，接種48小時(shí)后組織切片he染色圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：ucmsc的原代分離與培養(yǎng)、鑒定

1、ucmsc的原代分離與培養(yǎng)

取新鮮臍帶，用加100u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的pbs沖去臍帶外圍血塊，將其清理干凈。臍帶兩頭剪去1厘米左右并棄去，并把血管里的血擠出來(lái)，pbs洗滌3遍。將組織塊用75％的酒精浸泡1min，再用pbs洗滌3遍。將臍帶從中間剪成長(zhǎng)約2cm的小段，此時(shí)若還有血塊，也擠出洗凈；縱向剖開(kāi)，用齒鑷將2條臍動(dòng)脈和1條臍靜脈鈍性分離去除。用一支鑷子固定臍帶，再用手術(shù)刀刮取華通氏膠(wharton’sjelly)，直到只剩下接近透明的羊膜。pbs充分沖洗后，將其置于6cm皿中，添加少量的增殖培養(yǎng)基，用剪刀將其充分剪碎至1mm³大小組織塊。將組織塊均勻的鋪至10cm皿中，向其中添加1～2ml的增殖培養(yǎng)基，37度培養(yǎng)箱中正置培養(yǎng)4h，輕柔緩慢地補(bǔ)加增殖培養(yǎng)基至8ml。6天后首次半量換增殖培養(yǎng)基，以后每3天換一次增殖培養(yǎng)基至生長(zhǎng)至80％-90％的匯合度。利用0.25％胰酶進(jìn)行細(xì)胞傳代，將2-3分鐘內(nèi)消化下來(lái)的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿中，未消化下來(lái)的則棄去，如此傳2～3代。

上述實(shí)驗(yàn)分別用兩種增殖培養(yǎng)基同時(shí)進(jìn)行,具體成分分別如下：

m1增殖培養(yǎng)基：含有10％(v/v)fbs、100u/ml的青霉素、100μg/ml的鏈霉素的dmem/f12培養(yǎng)基；

m2增殖培養(yǎng)基：含有10％(v/v)fbs、10ng/mlbfgf、50μg/mlvc、100u/ml的青霉素、100μg/ml的鏈霉素的dmem/f12培養(yǎng)基。

2、ucmsc的鑒定

2.1增殖活性檢測(cè)：連續(xù)傳代m1ucmsc(m1增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)的ucmsc)和m2ucmsc(m2增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)的ucmsc),分別在第1、3、8和15代時(shí)拍照記錄細(xì)胞的狀態(tài)(實(shí)驗(yàn)結(jié)果如附圖1所示)。對(duì)于m2ucmsc，分別對(duì)第3代和第10代的細(xì)胞繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)(實(shí)驗(yàn)結(jié)果如附圖2所示)。

2.2表面分子檢測(cè)：利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其cd29，cd44，cd105，cd34與cd45的表達(dá)情況，分別檢測(cè)其陽(yáng)性率和平均熒光強(qiáng)度指標(biāo)(實(shí)驗(yàn)結(jié)果如附圖3、表1所示)。表1為流式檢測(cè)m1與m2ucmsc表面分子的表達(dá)情況：表中所示為m1ucmsc、m2ucmsc的cd29、cd44、cd105、cd34和cd45細(xì)胞的陽(yáng)性率。

3.鑒定結(jié)果：

從圖1可以看出m1ucmsc連續(xù)傳8代，細(xì)胞即衰老，表現(xiàn)為有較多形態(tài)不規(guī)則的細(xì)胞，如細(xì)胞質(zhì)過(guò)大且鋪開(kāi)，立體感較弱，停止生長(zhǎng)；m2ucmsc連續(xù)傳15代以上依然無(wú)明顯的衰老；在第3代時(shí)，m1ucmsc在4天內(nèi)僅可擴(kuò)增9倍，而m2ucmsc在4天內(nèi)可擴(kuò)增15倍，且傳至第10代依然具有很高的增殖速度(圖2)，因此m2ucmsc具有更高的增殖活性。

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示m1與m2ucmsc均高表達(dá)cd29，cd44和cd105(>99％),不表達(dá)cd34和cd45(<0.5％),因此具有很高的純度(表1)，但m2ucmsccd29、cd105和cd44表達(dá)水平更高(圖3)，說(shuō)明m2培養(yǎng)基能更好的維持間充質(zhì)干細(xì)胞的分子表達(dá)特性。

表1：流式檢測(cè)m1ucmsc與m2ucmsc表面分子的表達(dá)情況

實(shí)施例2：慢病毒誘導(dǎo)ucmsc重編程

1.方法：

1.1病毒包裝：將目的質(zhì)粒(oct4，sox2，c-myc和klf4)分別與pvsvg和pcmv-dr8.91(來(lái)自于上海斯丹賽生物技術(shù)有限公司)載體共轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞，48小時(shí)后包裝產(chǎn)生表達(dá)分別oct4，sox2，c-myc和klf4四種轉(zhuǎn)錄子的病毒，收集各病毒留用。

1.2待實(shí)施例1中ucmsc傳至第3代，利用包裝好的oct4，sox2，c-myc和klf4四種轉(zhuǎn)錄子的慢病毒，分別以感染復(fù)數(shù)為5的比例感染10萬(wàn)m1或m2增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)的ucmsc,并接種于cf-1飼養(yǎng)層上；

1.324小時(shí)后，將m1或m2增殖培養(yǎng)基更換為ipsc誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含有20％(v/v)fbs,1％(v/v)neaa，1％(v/v)glutamax-1,100μmβ-巰基乙醇和4ng/ml的bfgf，2μg/mldox的dmem/f12培養(yǎng)基)，分別添加50μg/ml維生素c(vc)和1mm的丙戊酸(vpa)誘導(dǎo)7天。

1.47天后，撤除vpa繼續(xù)誘導(dǎo)5天，誘導(dǎo)25天后撤出dox，繼續(xù)誘導(dǎo)5天后進(jìn)行ap染色，并挑取ap染色陽(yáng)性單克隆。

2.結(jié)果：感染10萬(wàn)細(xì)胞，m1ucmsc無(wú)法得到ipsc克隆，而m2ucmsc可得到5-10個(gè)ap陽(yáng)性的克隆(陽(yáng)性克隆率0.005％-0.01％)，并將其中兩個(gè)細(xì)胞株(分別命名為l-11與l-13)用于后期進(jìn)一步的檢測(cè)工作。

實(shí)施例3：仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)ucmsc重編程

1.方法:

1.1復(fù)蘇實(shí)施例1中ucmsc，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后，將細(xì)胞接種于六孔板的1孔中，接種密度在4～8萬(wàn)/孔。

1.248小時(shí)后，以表達(dá)klf4、oct4、sox2的kos仙臺(tái)病毒，表達(dá)c-myc和表達(dá)klf4的仙臺(tái)病毒感染細(xì)胞，各病毒的感染復(fù)數(shù)比例是kos:c-myc：klf4＝5:5:3(其中kos為同一載體上等比例串連klf4，oct4和sox2序列)。

1.324h后更換新鮮的增殖培養(yǎng)基(m1或m2)，繼續(xù)培養(yǎng)6天，每2天換液。

1.4將細(xì)胞消化，接種于vtn-n(購(gòu)自lifetechnologies)包被六孔板中，用相應(yīng)的增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)，使其貼壁。

1.524h后換為e8培養(yǎng)基(購(gòu)自lifetechnologies)培養(yǎng)，此后每天換液，即在無(wú)飼養(yǎng)層體系上進(jìn)行重編程。

2.結(jié)果：在無(wú)飼養(yǎng)層的體系上，重編程21天后，挑取形態(tài)類(lèi)似于人胚胎干細(xì)胞的克隆至新的培養(yǎng)皿中，將其中兩個(gè)細(xì)胞株ap陽(yáng)性的ipsc(分別命名為s-15與s-32)用于后期進(jìn)一步的檢測(cè)工作。

實(shí)施例4ipsc鑒定

1.方法：

1.1ipsc的ap染色：各ipsc接種于新的培養(yǎng)皿中生長(zhǎng)3～5天后，利用堿性磷酸酶(ap)試劑盒對(duì)其進(jìn)行染色并拍照(實(shí)驗(yàn)結(jié)果如附圖4所示)。

1.2免疫熒光染色：待各ipsc生長(zhǎng)3天后，4％多聚甲醛室溫固定放置30min；用pbs洗滌1遍后，用抗體稀釋液(0.2％(v/v)bsa和0.1％(v/v)tritonx-100溶于pbs)洗滌兩次；加封閉液(含1％(v/v)bsa+4％(v/v)正常血清+0.4％(v/v)tritonx-100的pbs溶液)室溫封閉細(xì)胞1h后添加一抗，室溫孵育2h；再用含0.1％(v/v)tritonx-100的pbs洗滌細(xì)胞3次,將二抗加到細(xì)胞樣品上，室溫放置1h；pbs洗滌三次后，在終濃度為1μg/ml的dapi溶液中dapi(1mg/mlinpbs)母液以1:1000用pbs稀釋室溫放置5min；用pbs洗滌兩次；鏡下觀察(實(shí)驗(yàn)結(jié)果如附圖5所示)。

1.3ipsc的體外分化檢測(cè)：將各ipsc消化成小團(tuán)塊，接種于分化培養(yǎng)基(含有20％(v/v)ksr、1％(v/v)neaa、1％(v/v)glutamax-1、100umβ-巰基乙醇的dmem/f12培養(yǎng)基)中分化20天，提取總rna并反轉(zhuǎn)錄，以gapdh為內(nèi)參基因，以pcr的方法檢測(cè)三胚層的分化標(biāo)記(內(nèi)胚層：amylase和afp；中胚層：brachyury、msx1、ck7和nppa；外胚層：pax6、map2和neurod1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如附圖6所示)

1.4ipsc的克隆形成效率檢測(cè)：以m1和m2ucmsc為源頭細(xì)胞，參考實(shí)施例3中的方法在無(wú)飼養(yǎng)層的體系上對(duì)其進(jìn)行重編程，21天后進(jìn)行ap染色，統(tǒng)計(jì)其ap陽(yáng)性克隆的形成率(實(shí)驗(yàn)結(jié)果如附圖7所示)。

2.結(jié)果：

分別對(duì)細(xì)胞株l-11、l-13和細(xì)胞株s-15、s-32進(jìn)行ap染色，結(jié)果顯示均為陽(yáng)性(圖4)；該4株ips也表達(dá)了多能性蛋白nanog、ssea-4，tra-1-60與tra-1-81(圖5)；體外可形成擬胚體(eb)，并可向三胚層分化(圖6)，說(shuō)明其符合ipsc的鑒定標(biāo)準(zhǔn)。

分別以m1ucmsc和m2ucmsc為源頭細(xì)胞進(jìn)行重編程，結(jié)果顯示m2ucmsc(0.55％)的ap陽(yáng)性克隆形成率顯著高于m1ucmsc(0.28％，圖7)，說(shuō)明本發(fā)明中得到的以m2ucmsc為源頭細(xì)胞更有利于重編程的發(fā)生。

實(shí)施例5ipsc的外源性基因整合情況

1.實(shí)驗(yàn)方法：分別提取各ipsc的總rna并反轉(zhuǎn)錄為cdna，對(duì)于仙臺(tái)病毒系統(tǒng)得到的ipsc，分別設(shè)計(jì)外源性基因的引物sev，kos，c-myc和klf4；對(duì)于慢病毒系統(tǒng)得到的ipsc，分別設(shè)計(jì)外源性基因的引物oct4，sox2，c-myc和klf4；以各ipsc的cdna為模板進(jìn)行pcr，并電泳檢測(cè)外源性基因的殘留表達(dá)情況(實(shí)驗(yàn)結(jié)果如附圖8所示)。

2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果：對(duì)于仙臺(tái)病毒系統(tǒng)的ipsc，pcr結(jié)果顯示其不表達(dá)外源性的基因sev(仙臺(tái)病毒載體的骨架結(jié)構(gòu))，c-myc，klf4和kos(圖8-a)；對(duì)于慢病毒系統(tǒng)的ipsc，兩株ipsc均殘留表達(dá)oct4和c-myc，不表達(dá)klf4，l-11ipsc表達(dá)sox2，而l-13ipsc不表達(dá)sox2(圖8-b)。說(shuō)明慢病毒系統(tǒng)殘留外源性的基因于細(xì)胞基因組中，而仙臺(tái)病毒系統(tǒng)得到的ipsc在完成重編程后可除去外源性基因，因而具有更高的安全性。

實(shí)施例6ipsc的免疫學(xué)特性

1.實(shí)驗(yàn)方法

1.1hla的表達(dá)水平檢測(cè)

將四株ipsc(l-11,l-13，s-15與s-32)分別傳代至較純的狀態(tài)，其中每株細(xì)胞各取1份用50u/ml的ifnγ處理7天，用etda分別消化各細(xì)胞并計(jì)數(shù)，對(duì)于未用ifnγ處理的細(xì)胞分別取3x10⁶細(xì)胞，分別用hla-ⅰ和hla-ⅱ抗體標(biāo)記；對(duì)于ifnγ處理的細(xì)胞僅用hla-ⅱ抗體處理，避光孵育20min。用dpbs重懸洗滌2遍后，流式檢測(cè)其表達(dá)情況(實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖9和圖10所示)。

1.2刺激淋巴細(xì)胞增殖能力檢測(cè)

培養(yǎng)ipsc(s-15,、s-32、l-11和l-13)至較滿(mǎn)的狀態(tài)，以1:1.5的比例傳至六孔板的3孔中，24h后用10ug/ml的mmc處理3h，pbs洗滌3-4遍后用edta消化至單細(xì)胞，待用。提前一天復(fù)蘇pbmc，計(jì)數(shù)，24h后以ipsc:pbmc＝1:10的比例，取2萬(wàn)ips細(xì)胞與20萬(wàn)pbmc共孵育96h，同時(shí)檢測(cè)了8個(gè)pbmc細(xì)胞株，每個(gè)細(xì)胞株4個(gè)重復(fù)，用含10％(v/v)fbs的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，cck8檢測(cè)pbmc的增殖情況(實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖11所示)。

1.3體內(nèi)免疫原性檢測(cè)

傳代各ipsc(l-11，l-13，s-15和s-32)至較純的狀態(tài)，充分消化至單細(xì)胞，將各細(xì)胞密度調(diào)至1×10⁷個(gè)/ml。小鼠后腿肌肉注射100ul的細(xì)胞懸液，每只100萬(wàn)細(xì)胞；于接種后的第5天取小鼠組織并冰凍切片，用hna抗體進(jìn)行免疫熒光染色，檢測(cè)細(xì)胞的存活情況(實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖12所示)。在接種后48h取組織固定，石蠟包埋并切片進(jìn)行he染色，觀察白細(xì)胞浸潤(rùn)情況(實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖13所示)。其中冰凍切片的染色步驟為切片自然晾干(15-30min左右)，置pbs中浸泡10分鐘，以去除oct。通透液室溫tritonx-100透膜10min，再用pbs洗滌一遍。吸干pbs，添加封閉液封閉1h，血清封閉后添加一抗，避免中間有干片出現(xiàn)。加入50ul一抗4度過(guò)夜。室溫復(fù)溫15分鐘后，pbs洗滌3次。添加二抗，室溫孵育1h(注意避光)后，pbs洗滌3次。添加dapi孵育5min，pbs洗3次。

2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1對(duì)于hla-ⅰ，流式檢測(cè)結(jié)果顯示源頭細(xì)胞ucmsc高表達(dá)hla-i(99.8％)，但重編程之后，l-11(26.9％)、l-13(24.2％)，s-15(34％)與s-32(41.3％)的hlai的表達(dá)水平明顯下降；對(duì)于hla-ii，ucmsc低表達(dá)hla-ii(圖10)，在ifnγ處理前，各ipsc均低表達(dá)hla-ii，處理后依然維持著低表達(dá)水平(圖10)，預(yù)示著各ipsc具有較低的免疫原性。

2.2與ipsc共孵育96小時(shí)后，與各ipsc細(xì)胞株的pbmc僅有著輕微的增殖，預(yù)示著其較低的免疫原性(圖11)

2.3細(xì)胞注射入小鼠體內(nèi)5天后，各ipsc細(xì)胞株均可檢測(cè)到存活的細(xì)胞株(圖12)。而48h后檢測(cè)白細(xì)胞的結(jié)果顯示各組均無(wú)明顯的白細(xì)胞浸潤(rùn)情況(圖13)。由此可見(jiàn)，通過(guò)本專(zhuān)利方法制備的ipsc細(xì)胞株均具有較低的免疫原性。