本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種感受態(tài)細(xì)胞的制備方法及其轉(zhuǎn)化方法。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)化是將外源dna分子引入受體細(xì)菌，使之獲得新的遺傳性狀。這是現(xiàn)代分子生物學(xué)最基本的操作技術(shù)。轉(zhuǎn)化效率直接影響前后試驗(yàn)的進(jìn)展和工作效率，而感受態(tài)細(xì)胞的狀態(tài)是影響轉(zhuǎn)化效率最直接、關(guān)鍵的因素之一。通常有兩種方法獲得感受態(tài)細(xì)胞，一種是購于商業(yè)公司，這種感受態(tài)通常有較高的轉(zhuǎn)化效率，每微克質(zhì)粒dna產(chǎn)生108個(gè)轉(zhuǎn)化克隆的轉(zhuǎn)化效率，但價(jià)格比較昂貴。另一種方法是實(shí)驗(yàn)室自己制備。目前常用的感受態(tài)細(xì)胞制備方法有cacl2和rbcl/kcl法。rbcl/kcl法的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率較高，但需要特殊的試劑rbcl，cacl2法簡便易行，但轉(zhuǎn)化效率較低。除上述兩種方法外，還有制備超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞的inoue法和電穿孔法，inoue法細(xì)菌的培養(yǎng)條件是18℃，一般的實(shí)驗(yàn)室很難達(dá)到。電穿孔法要求電穿孔儀，一般實(shí)驗(yàn)室不具有該設(shè)備。因而，研究一種轉(zhuǎn)化效率高，重復(fù)性好，操作簡單適用于普通實(shí)驗(yàn)室的感受態(tài)制備方法對(duì)與分子生物學(xué)的研究尤為必要，對(duì)分子克隆實(shí)驗(yàn)具有重要意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對(duì)上述問題，本發(fā)明旨在提供一種轉(zhuǎn)化效率高的感受態(tài)細(xì)胞的制備方法。
一種感受態(tài)細(xì)胞的制備方法，包括如下步驟：
（1）挑取大腸桿菌單菌落，在裝有5mllb液體培養(yǎng)基的試管中37℃200rpm振蕩培養(yǎng)過夜；將培養(yǎng)的5ml菌體全部倒入裝有100mllb液體培養(yǎng)基的1000ml三角瓶中，37℃振蕩培養(yǎng)2h，至od600值為0.5；
（2）將培養(yǎng)好的菌液轉(zhuǎn)至冰預(yù)冷的50ml離心管中，在冰上放置30min；
（3）4℃，4000rpm離心10min，棄上清，倒置1min使溶液流盡，回收菌體；
（4）每個(gè)50ml離心管中加入原菌液1/10倍體積的預(yù)冷0.1mcacl2，槍頭吹打重懸菌體；冰浴10min，4℃，4000rpm離心10min，回收菌體；
（5）重復(fù)步驟4一次；
（6）每50ml培養(yǎng)液用2ml冰預(yù)冷的0.1mcacl2重懸，加入甘油終濃度為15%-20%；
（7）分裝1.5mlep管中，每管50μl，液氮凍存后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>
上述感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化方法，包括如下步驟：
（1）取50μl感受態(tài)細(xì)胞，加5μl連接產(chǎn)物，輕輕混勻，冰上放置30min；
（2）42℃熱激90s，冰上放置2min；
（3）加800μllb培養(yǎng)基，37℃200rpm振蕩培養(yǎng)1h；
（4）室溫4000rpm離心5min，吸出部分上清，用剩余培養(yǎng)基懸浮菌體；
（5）將細(xì)菌涂布于含有氨芐的固體lb培養(yǎng)基平板上；
（6）將平板在37℃正向放置1h吸收多余液體，倒置培養(yǎng)過夜。
本發(fā)明的感受態(tài)細(xì)胞制備方法簡單、成本低，且轉(zhuǎn)化率高。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。
一種感受態(tài)細(xì)胞的制備方法，包括如下步驟：
（1）挑取大腸桿菌單菌落，在裝有5mllb液體培養(yǎng)基的試管中37℃200rpm振蕩培養(yǎng)過夜；將培養(yǎng)的5ml菌體全部倒入裝有100mllb液體培養(yǎng)基的1000ml三角瓶中，37℃振蕩培養(yǎng)2h，至od600值為0.5；
（2）將培養(yǎng)好的菌液轉(zhuǎn)至冰預(yù)冷的50ml離心管中，在冰上放置30min；
（3）4℃，4000rpm離心10min，棄上清，倒置1min使溶液流盡，回收菌體；
（4）每個(gè)50ml離心管中加入原菌液1/10倍體積的預(yù)冷0.1mcacl2，槍頭吹打重懸菌體；冰浴10min，4℃，4000rpm離心10min，回收菌體；
（5）重復(fù)步驟4一次；
（6）每50ml培養(yǎng)液用2ml冰預(yù)冷的0.1mcacl2重懸，加入甘油終濃度為15%-20%；
（7）分裝1.5mlep管中，每管50μl，液氮凍存后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>
上述感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化方法，包括如下步驟：
（1）取50μl感受態(tài)細(xì)胞，加5μl連接產(chǎn)物，輕輕混勻，冰上放置30min；
（2）42℃熱激90s，冰上放置2min；
（3）加800μllb培養(yǎng)基，37℃200rpm振蕩培養(yǎng)1h；
（4）室溫4000rpm離心5min，吸出部分上清，用剩余培養(yǎng)基懸浮菌體；
（5）將細(xì)菌涂布于含有氨芐的固體lb培養(yǎng)基平板上；
（6）將平板在37℃正向放置1h吸收多余液體，倒置培養(yǎng)過夜。