本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥及食品領(lǐng)域中功能食品中微生物分離純化技術(shù)，具體涉及一種具有高抗氧化乳酸菌粉劑的制備方法。
背景技術(shù)：
酸奶和干酪是新疆的傳統(tǒng)乳制品，其中含有大量的益生菌。近幾年，越來(lái)越多的研究者開始熱衷研究乳酸菌的抗氧化作用，對(duì)于機(jī)體代謝活動(dòng)來(lái)說(shuō)，氧化作用這一過(guò)程必不可少。雖然，人體自身可以抵御相當(dāng)一部分的免疫損傷，但也并不能對(duì)這些損傷進(jìn)行全部防御，另外還需要對(duì)它們進(jìn)行修復(fù)，以上這些都需要機(jī)體攝入大量抗氧化劑才能保持體內(nèi)代謝活動(dòng)的平衡。然而，人們?cè)跀z入抗氧化劑的同時(shí)，不得不擔(dān)心其安全問(wèn)題，所以對(duì)于研究者們來(lái)說(shuō)對(duì)天然抗氧化劑的深入探索顯得迫在眉睫。
當(dāng)微生物細(xì)胞在低濃度的過(guò)氧化氫或甲萘醌作用下時(shí)，可以誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生一定的適應(yīng)力，從而保護(hù)自身免受到高濃度氧化劑的損害，這種使氧化劑耐受性不斷得到提高的作用機(jī)理主要是因?yàn)檠趸瘎┛梢约ぐl(fā)機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)中的各種酶的活性。過(guò)氧化氫雖然是屬于相對(duì)較弱的一種抗氧化劑，但它的優(yōu)點(diǎn)是高擴(kuò)散性和較長(zhǎng)的作用時(shí)間，因此它能夠直接造成機(jī)體抗氧化損傷或者作為羥自由基的前體物。因而，選取過(guò)氧化氫的耐受能力作為考察乳酸菌菌體抗氧化活性的一項(xiàng)指標(biāo)。
研究表明，乳酸菌具有整腸、抑菌、抗癌、增強(qiáng)機(jī)體免疫力和抗衰老等許多生理功能。因此，無(wú)論從安全性還是營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值方面考慮，乳酸菌作為抗氧化劑將具有很大的市場(chǎng)潛力。乳酸菌一般存在于蔬菜、水果、乳制品、肉制品、水產(chǎn)品，尤其是各類發(fā)酵食品中。如果能從食源角度篩選出具有抗氧化活性的乳酸菌，用于生產(chǎn)功能性發(fā)酵食品、保健品或是開發(fā)為抗衰老藥品，都將對(duì)推動(dòng)我國(guó)益生菌產(chǎn)業(yè)及促進(jìn)人們身體健康具有積極作用，并會(huì)帶來(lái)良好的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明目的之一是以新疆傳統(tǒng)乳制品中分離純化的乳酸菌為研究對(duì)象，采用體外抗氧化篩選及冷凍干燥技術(shù)，提供一種新的高抗氧化乳酸菌粉劑的制備方法。
為實(shí)現(xiàn)此目的，本發(fā)明提供如下的技術(shù)方案：
一種高抗氧化乳酸菌的篩選方法，其特征在于包括如下的步驟：
（1）菌株的選擇：從新疆傳統(tǒng)乳制品中分離出部分乳酸菌；
mrs培養(yǎng)基配方如下：蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、葡萄糖20g、硫酸鎂0.58g、檸檬酸氫二銨2g、磷酸氫二鉀2g、乙酸鈉5g、硫酸錳0.25g、吐溫1ml，去離子水1000ml，ph6.2-6.6，121℃滅菌20min。
（2）抗氧化特性初篩：將分離到的乳酸菌進(jìn)行抗氧化特性初篩，得到雙氧水耐受性較好的乳酸菌；
（3）進(jìn)一步對(duì)乳酸菌進(jìn)行篩選，對(duì)乳酸菌各組提取物中的抗氧化指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，得到一株高抗氧化乳酸菌菌株；
（4）制備菌株發(fā)酵液，并對(duì)其進(jìn)行離心實(shí)驗(yàn)確定離心最終參數(shù)為：溫度4℃、轉(zhuǎn)速5000r/min、時(shí)間20min；
（5）離心后的乳酸菌菌體立即進(jìn)行冷凍干燥，制成發(fā)酵劑。
本發(fā)明所述的方法，其中步驟（2）中所述的過(guò)程為：在液體mrs培養(yǎng)基中分別加入h2o2溶液，使得培養(yǎng)基中h2o2的起始濃度分別達(dá)到0.4、0.7、1.0mmol/l，然后按照2%的體積分?jǐn)?shù)加入事先活化好的乳酸菌各菌株菌懸液，此時(shí)菌懸液的濃度為108ml-1，放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)，期間每隔2h取一次樣液，測(cè)定其od值，記錄各菌株在不同h2o2起始濃度下的生長(zhǎng)曲線，篩選出具有高過(guò)氧化氫耐受性的菌株。
本發(fā)明所述的方法，其中步驟（3）中所述的抗氧化指標(biāo)包括：羥自由基清除能力、dpph自由基清除能力、超氧陰離子清除能力、亞鐵離子螯合能力以及還原能力，最終篩選得到的菌株為l1。
本發(fā)明所述的方法，其中步驟（4）中所述的過(guò)程為：通過(guò)單因素確定乳酸菌離心的溫度、時(shí)間以及離心速度，再根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)確定乳酸菌l1的最佳離心條件；
①離心溫度的確定：離心力和離心時(shí)間不變，即在離心力4000r/min離心時(shí)間20min時(shí)，測(cè)定菌懸液在-4℃、4℃、20℃下離心后上清液、菌泥的活菌數(shù)，確定最佳離心溫度；
②離心力的確定：離心溫度和離心時(shí)間不變，確定最佳離心力，即在4000r/min、5000r/min、6000r/min時(shí)，測(cè)定離心后上清液和菌泥活菌數(shù)，計(jì)算離心損失率、離心存活率；
③離心時(shí)間的確定離心力和離心溫度不變，測(cè)定離心5min、l0min、20min時(shí)上清液和菌泥活菌數(shù)，計(jì)算離心損失率、離心存活率，確定最佳離心時(shí)間；
④根據(jù)單因素確定的最佳離心溫度、離心力、離心時(shí)間，進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)乳酸菌l1細(xì)胞高密度富集培養(yǎng)后的最適離心條件進(jìn)行探索研究。
本發(fā)明所述的方法，其中步驟（5）中所述的過(guò)程為：將菌懸液加入各凍干瓶中，充分混勻，置于-70℃低溫冰箱中急速冷凍24h，確保形成小冰晶且完全凍結(jié)。在真空度約13.3pa條件下于真空冷凍干燥機(jī)中干燥24-72h至凍干完全，密封凍干瓶，測(cè)活菌數(shù)。
需要進(jìn)一步說(shuō)明的是：本發(fā)明所選用的全部乳酸菌來(lái)自新疆中亞食品研發(fā)中心（有限公司）菌種保存庫(kù)，這些乳酸菌的活化、凍干方法不僅僅限于本發(fā)明所述的具體方法，培養(yǎng)基成分也不限于此，其它常規(guī)技術(shù)和方法都適用，只要可以提高菌種活力、并將其制備成凍干粉狀方便使用即可。
本發(fā)明所述的方法，其中步驟（5）中所述的發(fā)酵劑需進(jìn)行活化方可用于實(shí)際生產(chǎn)?；罨^(guò)程中需要加入復(fù)水介質(zhì)，使乳酸菌在短時(shí)間內(nèi)從休眠狀態(tài)變?yōu)檎５募?xì)胞，并且能修復(fù)在冷凍干燥過(guò)程中受到損傷的細(xì)胞。
本發(fā)明的方法所適用的乳酸菌種類范圍較廣，不僅為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)具有高抗氧化性的乳酸菌粉劑奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，而且使發(fā)酵食品產(chǎn)業(yè)更健康、穩(wěn)速的進(jìn)行發(fā)展提供了切實(shí)可行的依據(jù)。高抗氧化乳酸菌具有免疫調(diào)節(jié)作用，它能夠增強(qiáng)機(jī)體特異性與非特異性免疫物質(zhì)，激活吞噬細(xì)胞酶活性，選擇性的殺死腸道致病菌，促進(jìn)有益菌的生長(zhǎng)，對(duì)人體有增強(qiáng)免疫力、抗感染、延緩衰老的功能，賦予發(fā)酵食品更強(qiáng)大的功能性效果。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作更詳細(xì)的描述：
實(shí)施例一
本發(fā)明采用的菌種均為新疆傳統(tǒng)乳制品中分離篩選得到，分別為乳酸片球菌l1、植物乳桿菌l2、植物乳桿菌l3、發(fā)酵乳桿菌l4、魏斯氏菌l5，以下均使用簡(jiǎn)稱。
1.抗氧化特性初篩：在液體mrs培養(yǎng)基中分別加入h2o2溶液，使得培養(yǎng)基中h2o2的起始濃度分別達(dá)到0.4、0.7、1.0mmol/l，然后按照2%的體積分?jǐn)?shù)加入事先活化好的乳酸菌各菌株菌懸液，此時(shí)菌懸液的濃度為108ml-1，放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)，期間每隔2h取一次樣液，測(cè)定其od值，記錄各菌株在不同h2o2起始濃度下的生長(zhǎng)曲線，篩選出具有高過(guò)氧化氫耐受性的菌株，包括l2、l4、l5。
2.測(cè)定以上三株乳酸菌的抗氧化指標(biāo)，包括：羥自由基清除能力、dpph自由基清除能力、超氧陰離子清除能力、亞鐵離子螯合能力以及還原能力，最終篩選得到的菌株為l2。
3.將l2活化后制成菌懸液，離心條件設(shè)置為溫度4℃、轉(zhuǎn)速5000r/min、時(shí)間20min。
4.將菌懸液加入各凍干瓶中，充分混勻，置于-70℃低溫冰箱中急速冷凍24h，確保形成小冰晶且完全凍結(jié)。在真空度約13.3pa條件下于真空冷凍干燥機(jī)中干燥24-72h至凍干完全，密封凍干瓶。
5.將凍干粉劑進(jìn)行活化方可用于實(shí)際生產(chǎn)，活化過(guò)程中需要加入復(fù)水介質(zhì)，使乳酸菌在短時(shí)間內(nèi)從休眠狀態(tài)變?yōu)檎５募?xì)胞，并且能修復(fù)在冷凍干燥過(guò)程中受到損傷的細(xì)胞。