本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體地涉及一種制備纖維素酶和/或木聚糖酶的方法及其專(zhuān)用菌株。
背景技術(shù)：
：纖維素酶(cellulose)又稱(chēng)纖維素酶系，是一類(lèi)能夠?qū)⒗w維素降解為葡萄糖的多組分酶系的總稱(chēng)，它們協(xié)同作用，將纖維素降解為寡糖和纖維二糖，最終水解為葡萄糖。纖維素酶主要由外切β-葡聚糖酶、內(nèi)切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等組成。纖維素酶廣泛存在于自然界的生物體中，細(xì)菌、真菌、動(dòng)物體內(nèi)等都能產(chǎn)生纖維素酶。用于生產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌有梭菌屬(clostridium)、纖維單胞菌屬(cellulomonas)、桿菌屬(bacillus)、高溫單胞菌屬(thermomonospora)、瘤胃球菌屬(ruminococcus)、擬桿菌屬(bacteriodes)、歐文氏菌屬(erwinia)、醋弧菌屬(acetovibrio)、小雙孢菌屬(microbispora)和鏈霉菌屬(streptomyces)等。其中，纖維單胞菌(c.fimi)和高溫單胞菌(t.fusca)是被廣泛研究的兩種產(chǎn)生纖維素酶的細(xì)菌。如中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)cn104232522a公開(kāi)了一株從堆肥中分離篩選出來(lái)的能產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌(achromobacterxylosoxidans),保藏編號(hào)為cctccno.m2013365，該菌經(jīng)28h發(fā)酵后纖維素酶活為0.183u/ml。一般用于生產(chǎn)的纖維素酶來(lái)自于真菌，例如白絹菌(sclerotiumrolfsii)、白腐真菌(p.chrysosporium)以及木霉屬(trichoderma)、曲霉屬(aspergillus)、裂殖菌屬(schizophyllum)和青霉屬(penicillium)等種屬中的一些真菌，其中木霉屬是研究最廣泛的纖維素酶產(chǎn)生菌。中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)cn104263658a公開(kāi)了一種里氏木霉菌株(trichodermareesei)cgmccno.9644，該菌蛋白分泌能力強(qiáng)，具有更強(qiáng)的纖維素酶生產(chǎn)能力，其所產(chǎn)濾紙酶活比出發(fā)菌株提高了13～31％。 中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)cn104328057a公開(kāi)了采用空間誘變篩選培育的高產(chǎn)纖維素酶的里氏木霉(trichodermareesei)cgmccno.9537，其濾紙酶活力提高了25.83％～34.49％。目前市場(chǎng)上銷(xiāo)售的纖維素酶約20％來(lái)自木霉屬和曲霉屬。大部分纖維素酶的酶解溫度為40～50℃，但在生產(chǎn)實(shí)踐中，由于很多工業(yè)生產(chǎn)環(huán)境都是高溫環(huán)境(如酒精發(fā)酵)，因此耐高溫酶比常溫酶更具實(shí)用意義。同時(shí)，耐高溫酶還具有以下諸多優(yōu)點(diǎn):(1)高溫反應(yīng)，減少雜菌污染，提高產(chǎn)物純度；(2)室溫貯藏期較長(zhǎng)；(3)一定程度可抗化學(xué)變性(如耐表面活性劑)；(4)可用熱處理去除大量雜蛋白，易于大規(guī)模生產(chǎn)與純化。故，耐高溫酶成為纖維素降解酶研究中的一大熱點(diǎn)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：發(fā)明人通過(guò)不懈努力，從高溫堆肥中篩選出一株具有同時(shí)產(chǎn)纖維素酶和/或木聚糖酶的嗜熱菌，經(jīng)形態(tài)觀察和分子生物學(xué)技術(shù)鑒定，該菌株屬于嗜熱子囊菌(thermoascusaurantiacus)，將其命名為嗜熱子囊菌ujs1412。該菌株能夠用于生產(chǎn)纖維素酶和/或木聚糖酶，該菌株生產(chǎn)的纖維素酶和/或木聚糖酶制劑耐高溫，可以高效降解小麥秸稈、玉米秸稈和水稻秸稈等木質(zhì)纖維素，將其水解為葡萄糖和木糖，可用于生產(chǎn)燃料乙醇、有機(jī)酸等生物產(chǎn)品。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明涉及以下幾個(gè)方面：本發(fā)明的第一方面涉及一種嗜熱子囊菌株(thermoascusaurantiacus)ujs1412，其保藏編號(hào)為cgmccno.11334。該菌株已于2015年09月08日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)cgmcc，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號(hào)為cgmccno.11334，分類(lèi)命名為嗜熱子囊菌株(thermoascusaurantiacus)，菌株名稱(chēng)為ujs1412。本發(fā)明所述的嗜熱子囊菌株(thermoascusaurantiacus)ujs1412的形態(tài)學(xué)特征為：所述嗜熱子囊菌ujs1412在pda平板培養(yǎng)基上于 40～50℃下培養(yǎng)2～3天，菌絲呈乳白色稀疏網(wǎng)狀；3天后漸轉(zhuǎn)為棕黃色至深棕色，培養(yǎng)基背面觀察呈淺黃色(如圖1所示)。顯微觀察發(fā)現(xiàn)，菌絲呈明顯的子囊菌特征，無(wú)色，光滑，具有分枝和隔膜；子囊孢子為卵圓形至橢圓形，壁光滑。本發(fā)明所述的嗜熱子囊菌株(thermoascusaurantiacus)ujs1412能夠用于生產(chǎn)纖維素酶和/或木聚糖酶，該菌生產(chǎn)的纖維素酶和/或木聚糖酶制劑可以高效降解小麥秸稈、玉米秸稈和水稻秸稈等木質(zhì)纖維素，將其水解為葡萄糖和木糖，可用于生產(chǎn)燃料乙醇、有機(jī)酸等生物產(chǎn)品。本發(fā)明的第二方面涉及嗜熱子囊菌株(thermoascusaurantiacus)ujs1412用于生產(chǎn)纖維素酶和/或木聚糖酶的用途。本發(fā)明的第三方面涉及一種制備纖維素酶和/或木聚糖酶的方法，該方法使用本發(fā)明所述的嗜熱子囊菌株(thermoascusaurantiacus)ujs1412制備纖維素酶和/或木聚糖酶。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明第三方面所述的制備維素酶和/或木聚糖酶的方法，包括使用本發(fā)明所述的嗜熱子囊菌株(thermoascusaurantiacus)ujs1412進(jìn)行液體發(fā)酵的步驟。優(yōu)選的液體發(fā)酵的溫度為40～50℃，例如40～45℃。優(yōu)選的發(fā)酵時(shí)間為4～8天，例如4～7天，例如5天、6天或7天。發(fā)酵時(shí)優(yōu)選的初始ph值為4.5～6.0，例如4.8、5.0、5.5或5.8。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明第三方面所述的制備維素酶和/或木聚糖酶的方法中，發(fā)酵所用的碳源選自葡萄糖、麩皮、微晶纖維素、淀粉、羧甲基纖維素(cmc)、果糖、乳糖、蔗糖和麥芽糖，優(yōu)選以麩皮和/或微晶纖維素為碳源；發(fā)酵所用的氮源選自蛋白胨(例如胰蛋白胨、小麥蛋白胨、魚(yú)粉蛋白胨)、牛肉膏、nh4cl、尿素、(nh4)2so4、酵母膏、玉米漿和nano3為氮源，優(yōu)選以蛋白胨為氮源。發(fā)酵時(shí)，將碳源和碳源加水配制成液體，另外添加kh2po4、cacl2、mgso4、吐溫-80等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明第三方面所述的制備纖維素酶和/或木聚糖酶的方法，該方法以麩皮和/或微晶纖維素為碳源，以蛋白胨為 氮源，將其加水配制成濃度分別為3～30g/l，5～50g/l和0.5～5g/l的液體，另外添加kh2po40.3～3g/l，cacl20.1～0.5g/l、mgso40.1～0.8g/l，吐溫-800.1～1％(v/v)。優(yōu)選將配置好的液體培養(yǎng)液置于250～500ml搖瓶或5～30l生物反應(yīng)器中，40～50℃發(fā)酵4～7d。采用本發(fā)明所述的制備方法制備得到的纖維素酶和/或木聚糖酶，相對(duì)于現(xiàn)有的纖維素酶，更耐高溫，其酶解溫度為40℃～80℃(例如40℃～70℃，40℃～65℃，40℃～60℃,45℃～60℃,48℃～60℃，50℃～60℃,51℃～60℃，52℃～60℃，53℃～60℃，54℃～60℃或55℃～60℃)，特別是溫度為45℃～60℃時(shí)，還能保持較高的酶活性；其酶解ph為4～5.5(例如4～5，4～5.1，4～5.2，4～5.3或4～5.4)。本發(fā)明所述的制備方法制備得到的纖維素酶和/或木聚糖酶的濾紙酶活為2～12u/ml，cmc酶活為12～25u/ml，木聚糖酶活為50～280u/ml。本發(fā)明的第四方面涉及一種纖維素酶和/或木聚糖酶制劑，該酶制劑由本發(fā)明第三方面任一項(xiàng)所述的制備方法制備得到，其酶解溫度為40℃～80℃(例如40℃～70℃，40℃～65℃，40℃～60℃,45℃～60℃,48℃～60℃，50℃～60℃,51℃～60℃，52℃～60℃，53℃～60℃，54℃～60℃或55℃～60℃)，酶解ph為4～5.5(例如4～5，4～5.1，4～5.2，4～5.3或4～5.4)。該酶制劑的紙酶活為2～12u/ml，cmc酶活為12～25u/ml，木聚糖酶活為50～280u/ml。本發(fā)明的第五方面涉及一種纖維素酶和/或木聚糖酶制劑，該酶制劑的酶解溫度為40℃～80℃(例如40℃～70℃，40℃～65℃，40℃～60℃,45℃～60℃,48℃～60℃，50℃～60℃,51℃～60℃，52℃～60℃，53℃～60℃，54℃～60℃或55℃～60℃)，酶解ph為4～5.5(例如4～5，4～5.1，4～5.2，4～5.3或4～5.4)。該酶制劑的紙酶活為2～12u/ml，cmc酶活為12～25u/ml，木聚糖酶活為50～280u/ml。該酶制劑可以由本發(fā)明第一方面所述的嗜熱子囊菌株(thermoascusaurantiacus)ujs1412經(jīng)液體發(fā)酵制備得到，也可以由本發(fā)明第三方面任一項(xiàng)所述的制備維素酶和/或木聚糖酶的方法制備得到。本發(fā)明的第六方面涉及本發(fā)明第四方面或第五方面所述的纖維素酶 和/或木聚糖酶制劑在降解木質(zhì)纖維素(例如小麥秸稈、玉米秸稈、水稻秸稈等)中的用途。本發(fā)明的第七方面涉及一種降解木質(zhì)纖維素(例如小麥秸稈、玉米秸稈、水稻秸稈等)的方法，該方法采用本發(fā)明第四方面或第五方面所述的纖維素酶和/或木聚糖酶制劑催化降解木質(zhì)纖維素。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明第七方面所述的降解木質(zhì)纖維素的方法，包括以下步驟：1)預(yù)處理：用naoh溶液(例如0.8～1.5mol/l，優(yōu)選為1mol/l)預(yù)處理木質(zhì)纖維素(例如小麥秸稈、玉米秸稈、水稻秸稈等)，洗滌至中性烘干；2)將預(yù)處理后的木質(zhì)纖維素配制成溶液(優(yōu)選濃度為10～50g/l)，，加入所述的纖維素酶和/或木聚糖酶制劑進(jìn)行酶解反應(yīng)，優(yōu)選地，所述的纖維素酶和/或木聚糖酶制劑添加量為0.1～1ml酶液/g秸稈；優(yōu)選地，酶解溫度為40℃～80℃(例如40℃～70℃，40℃～65℃，40℃～60℃,45℃～60℃,48℃～60℃，50℃～60℃,51℃～60℃，52℃～60℃，53℃～60℃，54℃～60℃或55℃～60℃)；優(yōu)選地，酶解ph為4.0～5.5(例如4～5，4～5.1，4～5.2，4～5.3或4～5.4)；優(yōu)選地，酶解時(shí)間為6～24小時(shí)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明第七方面所述的降解木質(zhì)纖維素的方法，包括以下步驟：將木質(zhì)纖維素(例如小麥秸稈、玉米秸稈、水稻秸稈等)經(jīng)的naoh溶液(例如0.8～1.5mol/l，優(yōu)選為1mol/l)預(yù)處理后洗滌至中性，烘干后配制成溶液(優(yōu)選濃度為10～50g/l)，添加本發(fā)明第四方面或第五方面所述的纖維素酶和/或木聚糖酶制劑，添加量?jī)?yōu)選為0.1～1ml酶液/g秸稈，酶解溫度40℃～80℃(例如40℃～70℃，40℃～65℃，40℃～60℃,45℃～60℃,48℃～60℃，50℃～60℃,51℃～60℃，52℃～60℃，53℃～60℃，54℃～60℃或55℃～60℃)，ph為4.0～5.5(例如4～5，4～5.1，4～5.2，4～5.3或4～5.4)，酶解時(shí)間優(yōu)選為6～24小時(shí)。該方法酶解所得的葡萄糖和木糖對(duì)原料中葡萄糖和木糖的得率分別為50～90％和 30～70％。發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供的嗜熱子囊菌(thermoascusaurantiacus)ujs1412能夠用于生產(chǎn)纖維素酶和/或木聚糖酶，該菌生產(chǎn)的纖維素酶和/或木聚糖酶制劑相對(duì)于現(xiàn)有的纖維素酶更耐高溫，其酶解溫度為40℃～80℃，特別是溫度達(dá)到55℃～60℃時(shí)，還能保持較高的酶活性，可以高效降解小麥秸稈、玉米秸稈和水稻秸稈等木質(zhì)纖維素，將其水解為葡萄糖和木糖，可用于生產(chǎn)燃料乙醇、有機(jī)酸等生物產(chǎn)品。附圖說(shuō)明圖1：嗜熱子囊菌(thermoascusaurantiacus)ujs1412在平板上的形態(tài)；圖2：不同碳源對(duì)嗜熱子囊菌(thermoascusaurantiacus)ujs1412產(chǎn)酶能力的影響；圖3：不同氮源對(duì)嗜熱子囊菌(thermoascusaurantiacus)ujs1412產(chǎn)酶能力的影響；圖4：溫度對(duì)嗜熱子囊菌(thermoascusaurantiacus)ujs1412產(chǎn)纖維素酶/木聚糖酶活的影響；圖5：ph對(duì)嗜熱子囊菌(thermoascusaurantiacus)ujs1412產(chǎn)纖維素酶/木聚糖酶活的影響。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實(shí)施例1菌株篩選、分離與鑒定1.1菌株篩選與分離高溫堆肥樣品采自江蘇省句容市郊，采樣時(shí)間為2014年8月10日。將采集高溫堆肥樣品用無(wú)菌水振蕩，取適量涂布秸稈分離篩選瓊脂平板(篩選瓊脂平板由1mol/lnaoh預(yù)處理的小麥秸稈10g/l，瓊脂15g/l制成)。挑取透明水解圈較大的菌落至培養(yǎng)液中(培養(yǎng)液由1mol/lnaoh預(yù)處理的小麥秸稈20g/l，蛋白胨5g/l，k2hpo40.5g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，kcl0.5g/l配制而成，自然ph)，40℃200rpm搖瓶培養(yǎng)36小時(shí)，測(cè)定發(fā)酵液中木聚糖酶及纖維素酶酶活，最后篩選得到1株同時(shí)產(chǎn)纖維素酶和木聚糖酶的高產(chǎn)菌株，命名為ujs1412，斜面和冷凍干燥保藏。將篩選獲得的菌株，接種于pda培養(yǎng)基平板上，分別置于40℃，45℃和50℃下培養(yǎng)，觀察菌絲呈乳白色發(fā)散狀生長(zhǎng)，菌絲之間呈稀疏網(wǎng)狀；3天后漸轉(zhuǎn)為棕黃色至深棕色，培養(yǎng)基背面觀察呈淺黃色(如圖1所示)。玻片培養(yǎng)，顯微鏡下對(duì)菌絲、分生孢子梗、分生孢子等形態(tài)特征進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)菌絲呈明顯的子囊菌特征，為無(wú)色，光滑，具分枝和隔膜；子囊孢子呈卵圓形至橢圓形、壁光滑。1.2基于18srdna序列的分子鑒定一、儀器與試劑1、儀器儀器名稱(chēng)儀器來(lái)源型號(hào)測(cè)序儀appliedbiosystems3730xldna電泳槽北京六一儀器廠dycp-31dn穩(wěn)壓電泳儀北京六一儀器廠dyy-5電熱恒溫水槽上海一恒科學(xué)儀器有限公司dk-8d凝膠成像儀上海復(fù)日科技儀器有限公司fr980恒溫培養(yǎng)箱太倉(cāng)市科教器材廠dhp-9162恒溫?fù)u床太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠th2-cpcr儀appliedbiosystems2720thermalcycler冷凍高速離心機(jī)bbihc-2518rsurf系列精密單道可調(diào)移液器生工sp10-10002、試劑二、實(shí)驗(yàn)過(guò)程1、基因組dna提取采用ezup柱式真菌基因組dna抽提試劑盒(購(gòu)自生工生物工程(上海)有限公司)提取菌株ujs1412的基因組dna，具體的提取步驟參見(jiàn)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。2、pcr擴(kuò)增采用真菌通用引物its1(5’-tccgtaggtgaacctgcgg-3’(seqidno：1))及its4(5’-tcctccgcttattgatatgc-3’(seqidno：2)擴(kuò)增菌株整個(gè)its序列(內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，internaltranscriberspacer)序列。pcr反應(yīng)體系：pcr循環(huán)條件：3、凝膠電泳1％瓊脂糖電泳，150v、100ma20min電泳觀察(見(jiàn)電泳圖dnaladdermixmake)。4、純化回收pcr產(chǎn)物電泳條帶切割所需dna目的條帶，純化方式見(jiàn)sk8131說(shuō)明書(shū)。5、連接將pcr產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化、過(guò)pcr柱純化，與pgem-t連接，具體步驟按18-tvector連接試劑盒操作。6、感受態(tài)細(xì)胞(e.colijm109)的制備：(氯化鈣法)6.1從于37℃培養(yǎng)16小時(shí)的新鮮平板中挑取一個(gè)單菌落，轉(zhuǎn)到一個(gè)含有100mllb培養(yǎng)基的1l燒瓶中。于37℃劇烈振搖培養(yǎng)3小時(shí)(旋轉(zhuǎn)搖床，300轉(zhuǎn)/分)。6.2在無(wú)菌條件下將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個(gè)無(wú)菌、一次性使用的、用冰預(yù)冷的50ml聚丙烯管中，在冰上放置10分鐘，使培養(yǎng)物冷卻至0℃。6.3于4℃,以4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，回收細(xì)胞。6.4倒出培養(yǎng)液，將管倒置1分鐘，使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。6.5以10ml用冰預(yù)冷的0.1mol/lcacl2重懸每份沉淀，放置于冰浴上。6.6于4℃，以4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，回收細(xì)胞。6.7倒出培養(yǎng)液，將管倒置1分鐘，使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。6.8每50ml初始培養(yǎng)物用2ml用冰預(yù)冷的0.1mol/lcacl2(含20％甘油)重懸每份細(xì)胞沉淀。6.9將細(xì)胞分裝成小份(100μl/支)，放于-70℃凍存。7、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化7.1取100μl感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上，完全解凍后輕輕將細(xì)胞均勻懸浮。7.2加入10μl連接液，輕輕混勻。冰上放置30分鐘。7.342℃水浴熱激90秒。冰上放置15～20分鐘。7.4加400μllb培養(yǎng)基，37℃200～250rpm振蕩培養(yǎng)1小時(shí)。7.5用槍頭吸取200μl培養(yǎng)菌液，涂布在預(yù)先用20μl100mmiptg和100l20mg/mlx-gal涂布的氨芐青霉素平板上。7.6平板在37℃下正向放置1小時(shí)以吸收過(guò)多的液體，然后倒置培養(yǎng)過(guò)夜。8、藍(lán)白斑篩選當(dāng)外源dna片段插入到puc57中后，由于外源dna的核酸序列存在改變了lacz基因的編碼，從而影響了其產(chǎn)物β-半乳糖苷酶α-片段的活性，因此重組克隆在x-gal/iptg平板上呈現(xiàn)為白色，而非重組克隆呈藍(lán)色，選擇在iptg/x-gal平板上生長(zhǎng)的白色菌落。9、質(zhì)粒提取與測(cè)序選擇陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒并純化。用m13+/-引物擴(kuò)增(體系如上)。m13+/-引物測(cè)序。上述菌種鑒定實(shí)驗(yàn)過(guò)程及測(cè)序工作由生工生物工程(上海)有限公司完成，所得的序列如seqidno：3序列所示。菌株ujs1412的18srdna序列測(cè)序結(jié)果用ncbi的blast2.0進(jìn)行同源分析，通過(guò)與genbank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比后，發(fā)現(xiàn)其與thermoascusaurantiacusatcc204492有95％左右的相似度，確定該菌株為嗜熱子囊菌(thermoascusaurantiacus)。seqidno：3：acctgcggaaggatcattaaagagttggggtccttcggggcccgatctcccaccctttgttgtcgcgaatttgttgcctcggcgggtttgcctttatggcagacgggctccggcccacccgccgcaggaccattcaaactctgctttaacaatgcagtttgagaagattt aataataaatcaaaactttcaacaacggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgccccttggtattccgaggggcatgcctgttcgagcgtcatttcaccaatcaagctacgcttggtattgggcgcgcggcttttccttgcgaaaggcccgcccgaaatgcatcggcgaggaaaccgacccccggcgtgttagatttctgaacgtcaggagcaccggtgccctccgccgtacaatctttttttctaaggttgacctcggatcaggtaggaatac。證明本發(fā)明菌株屬于嗜熱子囊菌株(thermoascusaurantiacus)。該菌株已于2015年09月08日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)cgmcc，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號(hào)為cgmccno.11334，分類(lèi)命名為嗜熱子囊菌株(thermoascusaurantiacus)，菌株名稱(chēng)為ujs1412。實(shí)施例2嗜熱子囊菌株(thermoascusaurantiacus)ujs1412產(chǎn)纖維素酶/木聚糖酶的條件篩選將保藏的菌株接入pda斜面培養(yǎng)基(配制方法為：將200g馬鈴薯沸水中煮20min后，8層紗布過(guò)濾，取濾液，加入20g葡萄糖和20g瓊脂，補(bǔ)加水至1l，ph自然。121℃條件下滅菌30min)，40℃培養(yǎng)7天進(jìn)行活化。將活化的菌株接入液體種子培養(yǎng)基(玉米淀粉15g/l、蛋白胨4g/l、k2hpo41g/l、na2hpo41g/l、mgso40.51ml/l的微量元素，ph自然。裝液量100ml/250ml)中，40℃培養(yǎng)3天，制得種子液。產(chǎn)酶液體培養(yǎng)基的配方：碳源10g/l、蛋白胨1g/l、酵母膏1g/l、kh2po42g/l、cacl20.3g/l、(nh4)2so41.4g/l、mgso40.3g/l、吐溫-801ml/l，微量元素(feso4·7h2o5g/l、mnso4·h2o1.6g/l、znso4.·7h2o1.4g/l、cocl2·6h2o3.7g/l)1ml/l，ph6.5。分別添加葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、淀粉、微晶纖維素、cmc和麩皮 等作為產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的碳源，篩選其最適的碳源。按10％(v/v)的接種量，28℃培養(yǎng)7天，分別測(cè)定濾紙酶活、cmc酶活以及木聚糖酶活，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1和圖2。表1碳源對(duì)酶活的影響注：微晶纖維素1購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；微晶纖維素2購(gòu)自上?？笊锛夹g(shù)有限公司分別采用酵母膏、胰蛋白胨、小麥蛋白胨、魚(yú)肉蛋白胨、牛肉膏、尿素、(nh4)2so4、nano3、nh4cl等作為上述產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的氮源，篩選其最適的氮源。按10％的接種量，28℃培養(yǎng)7天，分別測(cè)定濾紙酶活、cmc以及木聚糖酶活，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2和圖3。表2氮源對(duì)酶活的影響其中，濾紙酶活的測(cè)定方法為：將待測(cè)酶液用0.05mol/l，ph4.8的乙酸-乙酸鈉緩沖液稀釋適當(dāng)倍數(shù)。實(shí)驗(yàn)組(加入1.0mlph4.8的乙酸-乙酸鈉緩沖液，50mg濾紙條、0.5ml酶液)，再取3支試管分別是空白 管(加入1.5ml緩沖液)、酶對(duì)照組(1.0ml緩沖液、0.5ml酶液)、底物對(duì)照組(1.5ml緩沖液+濾紙條)。放入50℃水浴60分鐘，水浴結(jié)束后，立即加入3.0ml二硝基水楊酸(dns)混合終止酶反應(yīng)，沸水中水浴5min，然后移至冰水中冷卻。取0.2ml反應(yīng)物加2.5ml水稀釋?zhuān)缓笤?40nm處測(cè)吸光度，用空白組調(diào)零。通過(guò)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程求出葡萄糖的含量。cmc酶活的測(cè)定：將待測(cè)酶液用0.05mol/l，ph4.8的乙酸-乙酸鈉緩沖液稀釋適當(dāng)倍數(shù)。實(shí)驗(yàn)組(加入1.0ml1％(w/v)cmc溶液、0.5ml酶液)，再取3支試管分別為空白管(加入1.5ml緩沖液)、酶對(duì)照組(1.0ml緩沖液、0.5ml酶液)、底物對(duì)照組(0.5ml緩沖液、1％(w/v)cmc溶液)。將試管放入50℃水浴鍋中水浴30分鐘，水浴后，加入3.0mldns混勻，沸水浴5min，然后移至冰水中冷卻。取0.2ml混合物加2.5ml水稀釋?zhuān)缓笤?40nm處測(cè)吸光度，用空白管調(diào)零。通過(guò)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程求出葡萄糖的含量。濾紙酶活/cmc酶活計(jì)算公式：x—纖維素酶(u/ml)；w—葡萄糖生成量(mg)；v—反應(yīng)液中酶液加入量；5.56—1mg的葡萄糖的μmol數(shù)(1000/180＝5.56)；n—樣品稀釋倍數(shù)；t—反應(yīng)時(shí)間；木聚糖酶活的測(cè)定:將待測(cè)酶液用0.05mol/l，ph5.3的乙酸緩沖液稀釋適當(dāng)倍數(shù)。實(shí)驗(yàn)組(加入1.0ml1％(w/v)木聚糖溶液、1.0ml酶液)，再取3支試管分別為空白管(加入2.0ml緩沖液)、酶對(duì)照組(1.0ml緩沖液、1.0ml酶液)、底物對(duì)照組(1.0ml緩沖液、1.0ml1％(w/v)木聚糖溶液)。置于40℃條件下反應(yīng)30min，取出。迅速、準(zhǔn)確地向三支試管中加入dns試劑3.0ml，于空白管中準(zhǔn)確加入稀釋好的待測(cè)酶液1.0ml，將三支試管同時(shí)置于沸水浴中，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，煮沸5min后取出，迅速冷卻至室溫，用水定容至25ml。以空白管在分光光度計(jì)540nm下較零，分別測(cè)量二支試管中樣品的吸光度，取平均值，通過(guò)木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回 歸方程求出木糖的含量。木聚糖酶活計(jì)算公式：x—木聚糖酶(u/ml)；w—木糖生成量(mg)；v—反應(yīng)液中酶液加入量；6.67—1mg的木聚糖的μmol數(shù)(1000/150＝6.67)；n—樣品稀釋倍數(shù)；t—反應(yīng)時(shí)間。根據(jù)表1和表2以及圖2和圖3所示，菌株ujs1412最適碳源為麩皮和結(jié)晶纖維素，最適氮源為蛋白胨。當(dāng)配置發(fā)酵培養(yǎng)基為：麩皮3g/l,微晶纖維素5g/l，蛋白胨0.5g/l，kh2po40.3g/l，cacl20.1g/l，mgso40.1g/l，吐溫-800.1％(v/v)，40℃，初始ph為4.5，發(fā)酵7天，發(fā)酵醪經(jīng)離心去除菌體后既得酶制劑，檢測(cè)結(jié)果顯示：此時(shí)嗜熱子囊菌株(thermoascusaurantiacus)ujs1412所產(chǎn)的酶制劑，其濾紙酶活為2u/ml，cmc酶活為12u/ml，木聚糖酶活為50u/ml。當(dāng)配置發(fā)酵培養(yǎng)基為：麩皮10g/l,微晶纖維素15g/l，蛋白胨2g/l，kh2po40.5g/l，cacl20.3g/l，mgso40.4g/l，吐溫-800.5％(v/v)，45℃，初始ph為6.0，發(fā)酵7天，發(fā)酵醪經(jīng)離心去除菌體后既得酶制劑，檢測(cè)結(jié)果顯示：此時(shí)嗜熱子囊菌株(thermoascusaurantiacus)ujs1412所產(chǎn)的酶制劑，其濾紙酶活為9u/ml，cmc酶活為17u/ml，木聚糖酶活為200u/ml。當(dāng)配置發(fā)酵培養(yǎng)基為：麩皮30g/l,微晶纖維素50g/l，蛋白胨5g/l，kh2po43g/l，cacl20.5g/l，mgso40.8g/l，吐溫-801％(v/v)，40℃，初始ph為6.0，發(fā)酵7天，發(fā)酵醪經(jīng)離心去除菌體后既得酶制劑，檢測(cè)結(jié)果顯示：此時(shí)嗜熱子囊菌株(thermoascusaurantiacus)ujs1412所產(chǎn)的酶制劑，其濾紙酶活為12u/ml，cmc酶活為25u/ml，木聚糖酶活為280u/ml。實(shí)施例3嗜熱子囊菌株(thermoascusaurantiacus)ujs1412所產(chǎn)纖維素酶/木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)取實(shí)施例2制備的嗜熱子囊菌株(thermoascusaurantiacus)ujs1412 所產(chǎn)酶制劑，分別加入1.0ml1％(w/v)cmc(用0.05mol/l，ph4.8的乙酸-乙酸鈉緩沖液配制)、50±5mg濾紙條和1.0ml1％(w/v)木聚糖溶液(用0.05mol/l，ph5.3的乙酸緩沖液配制)，將反應(yīng)體系分別置于30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80℃反應(yīng)30min后分別測(cè)定濾紙酶活、cmc酶活和木聚糖酶活。以最高酶活值為100％，其余以此折算為最高活力的百分?jǐn)?shù)為相對(duì)酶活，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3及圖4。由表3及圖4可以看出，本發(fā)明的嗜熱子囊菌株(thermoascusaurantiacus)ujs1412所產(chǎn)酶制劑在溫度為40℃～80℃范圍內(nèi)具有活性，在40℃～65℃(優(yōu)選45℃～60℃)范圍內(nèi)具有比較高的活性，特別是溫度為60℃時(shí)，濾紙酶活，cmc酶活和木聚糖酶還能夠保持較高的催化活力，相對(duì)酶活分別為100％，90％和88％。表3不同溫度條件下纖維素酶/木聚糖酶活力取實(shí)施例2制備的嗜熱子囊菌株(thermoascusaurantiacus)ujs1412所產(chǎn)酶制劑，分別加入1.0ml1％(w/v)cmc(用0.05mol/l，ph4.8的乙酸-乙酸鈉緩沖液配制)、50±5mg濾紙條和1.0ml1％(w/v)木聚糖溶液(用0.05mol/l，ph5.3的乙酸緩沖液配制)，別溶于ph2、3、4、5、6、7、8、9、10的緩沖液中，配成所需濃度的溶液。于60℃反應(yīng)30min后分別測(cè)定濾紙酶活，cmc酶活和木聚糖酶活。以最高酶活值為100％，其余以此折算為最高活力的百分?jǐn)?shù)為相對(duì)酶活，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4及圖5。由表4及圖5可以看出，嗜熱子囊菌株(thermoascusaurantiacus) ujs1412所產(chǎn)酶制劑在ph值為4.0～5.5范圍內(nèi)具有較高活性，當(dāng)ph值為5.0時(shí)，濾紙酶活，cmc酶活和木聚糖酶還能夠保持較高的催化活力，相對(duì)酶活分別為100％，80％和100％。表4不同ph值下纖維素/木聚糖酶活力實(shí)施例4嗜熱子囊菌株(thermoascusaurantiacus)ujs1412所產(chǎn)纖維素酶/木聚糖酶的應(yīng)用取粉碎的水稻秸稈100g，加入1mol/l的naoh溶液浸泡24h，水洗至中性后烘干，經(jīng)hplc法(色譜條件：shodexsugersh1011(8.0mmi.d×300mm)；流動(dòng)相：0.005mol/l的稀硫酸溶液；流速：0.6ml/min；檢測(cè)器：示差檢測(cè)器；柱溫：50oc；進(jìn)樣量：10μl)測(cè)定，葡萄糖和木糖在原料中的含量分別為76％和12％。取經(jīng)前述獲得的經(jīng)naoh預(yù)處理24小時(shí)后的玉米秸稈，加水配制成50g/l濃度，加入實(shí)施例2制備的嗜熱子囊菌株(thermoascusaurantiacus)ujs1412所產(chǎn)酶制劑0.1ml酶液/g秸稈，酶解溫度45℃，ph為4.5，酶解6小時(shí)后取樣測(cè)定。經(jīng)hplc分析，酶解液中葡萄糖和木糖對(duì)原料中葡萄糖和木糖的得率分別為50％和30％。取粉碎的玉米秸稈100g，加入1mol/l的naoh溶液浸泡24h，水洗至中性后烘干，經(jīng)hplc法(色譜條件：shodexsugersh1011(8.0mmi.d×300mm)；流動(dòng)相：0.005mol/l的稀硫酸溶液；流速：0.6ml/min；檢測(cè)器：示差檢測(cè)器；柱溫：50oc；進(jìn)樣量：10μl)測(cè)定，葡萄糖和木糖在原料中的含量分別為72％和18％。取經(jīng)前述獲得的經(jīng)naoh預(yù)處 理24小時(shí)后的玉米秸稈，加水配制成50g/l濃度，加入實(shí)施例2制備的嗜熱子囊菌株(thermoascusaurantiacus)ujs1412所產(chǎn)酶制劑0.8ml酶液/g秸稈，酶解溫度55℃，ph為5.5，酶解24小時(shí)后取樣測(cè)定。經(jīng)hplc分析，酶解液中葡萄糖和木糖對(duì)原料中葡萄糖和木糖的得率分別為85％和57％。取粉碎的小麥秸稈100g，加入1mol/l的naoh溶液浸泡24h，水洗至中性后烘干，經(jīng)hplc法(色譜條件：shodexsugersh1011(8.0mmi.d×300mm)；流動(dòng)相：0.005mol/l的稀硫酸溶液；流速：0.6ml/min；檢測(cè)器：示差檢測(cè)器；柱溫：50oc；進(jìn)樣量：10μl)測(cè)定，葡萄糖和木糖在原料中的含量分別為68％和24％。取經(jīng)前述獲得的經(jīng)naoh預(yù)處理24小時(shí)后的小麥秸稈，加水配制成50g/l濃度，加入實(shí)施例2制備的嗜熱子囊菌株(thermoascusaurantiacus)ujs1412所產(chǎn)酶制劑1ml酶液/g秸稈，酶解溫度60℃，ph為5.0，酶解12小時(shí)后取樣測(cè)定。經(jīng)hplc分析，酶解液中葡萄糖和木糖對(duì)原料中葡萄糖和木糖的得率分別為90％和70％。當(dāng)前第1頁(yè)12