本發(fā)明涉及一株索羅金小球藻(chlorellasorokiniana)及其培養(yǎng)方法和該小球藻在制備生物柴油、營(yíng)養(yǎng)保健品中的應(yīng)用。技術(shù)背景對(duì)石油能源與日俱增的需求導(dǎo)致其儲(chǔ)藏量快速下降，使得尋求可替代能源成為各國(guó)迫在眉睫的首要任務(wù)?？稍偕纳镔|(zhì)能源被廣泛認(rèn)為是最具潛力的、可持續(xù)的、環(huán)境友好型的替代能源。用于產(chǎn)生能源的第一代生物質(zhì)為油料作物、廢食用油、動(dòng)物脂肪酸等，第二代生物質(zhì)為秸稈、雜草、木材等，發(fā)展至今，已聚焦在以微藻類為主的第三代生物質(zhì)上。目前使用微藻生產(chǎn)油料的缺點(diǎn)在于成本過(guò)高，可通過(guò)選育優(yōu)良藻種、改進(jìn)培養(yǎng)方式、優(yōu)化生產(chǎn)工藝等途徑來(lái)降低原料成本，而選育優(yōu)良藻種從而改進(jìn)微藻的產(chǎn)油能力是從根本上解決此問(wèn)題，因此需要生物量高及油脂含量高的優(yōu)良藻株。小球藻是最早應(yīng)用于商業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)，同時(shí)也是目前開發(fā)較多的藻種之一，其具有易于培養(yǎng)，細(xì)胞內(nèi)富含油脂如包含不飽和脂肪酸的油脂，及蛋白質(zhì)，在生物材料、營(yíng)養(yǎng)食品及保健品領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用前景。小球藻的培養(yǎng)方法包括自養(yǎng)培養(yǎng)和異養(yǎng)培養(yǎng)?，F(xiàn)有的小球藻藻種無(wú)論自養(yǎng)還是異養(yǎng)，其生物質(zhì)增殖速率都較低，生長(zhǎng)周期大約在8天甚至更長(zhǎng)時(shí)間。并且，有報(bào)道的最大的培養(yǎng)物干重僅為約100g/l，當(dāng)小球藻異養(yǎng)培養(yǎng)一段時(shí)間達(dá)到一定干重后，即使再延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，其生物量干重依然沒(méi)有實(shí)質(zhì)增加甚至?xí)p少。因此，很難進(jìn)一步增加生物質(zhì)干重。究其原因，可能是由于現(xiàn)有的這些小球藻的異養(yǎng)培養(yǎng)至一定密度后，會(huì)產(chǎn)生相互抑制的代謝產(chǎn)物。此外，現(xiàn)有小球藻耐酸性差，導(dǎo)致很難在酸性環(huán)境下正常生長(zhǎng)，故使小球藻的培養(yǎng)方式受到限制，難以適應(yīng)異養(yǎng)培養(yǎng)的環(huán)境。再者，現(xiàn)有的小球藻藻種在異養(yǎng)條件下培養(yǎng)后(培養(yǎng)結(jié)束后)，均可在培養(yǎng)液中檢測(cè)到大量殘余的糖。由此可見，現(xiàn)有小球藻在異養(yǎng)培養(yǎng)時(shí)糖利用率低，應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)會(huì)增加成本。而且，培養(yǎng)基中殘余的糖也增加了染菌的幾率，這是進(jìn)行異養(yǎng)培養(yǎng)所不希望發(fā)生的狀況。再一個(gè)問(wèn)題是，目前小球藻品種經(jīng)培養(yǎng)后總油脂含量低，開發(fā)價(jià)值有限。因此，需要篩選可高效率地獲得高生物量和含油量的優(yōu)良藻株。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供索羅金小球藻藻株gt-1，以保藏號(hào)cgmccno.11801保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。本發(fā)明還提供一種以自養(yǎng)方式培養(yǎng)索羅金小球藻的方法，包括將本發(fā)明的藻株以置于培養(yǎng)基中，并在20-30℃，連續(xù)光照強(qiáng)度為150-200μmolm-2s-1，ph值5-8，以及通入co2的條件下培養(yǎng)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)基為bg11培養(yǎng)基。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)在ph值6-7的條件下進(jìn)行。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)進(jìn)行6-12天。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述連續(xù)光照強(qiáng)度為165μmolm-2s-1。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種以異養(yǎng)方式培養(yǎng)索羅金小球藻的方法，包括將本發(fā)明的藻株置于異養(yǎng)培養(yǎng)基中，并在25-35℃，ph值5-8，以及溶氧濃度20-100％的條件下進(jìn)行連續(xù)補(bǔ)料培養(yǎng)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)基為改良的endo培養(yǎng)基。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)在ph值6-7的條件下進(jìn)行。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)在30℃進(jìn)行。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述溶氧濃度為40-60％，更優(yōu)選40％。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)進(jìn)行6-12天。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，其中所述藻株以od750＝1-16的接種量置于異養(yǎng)培養(yǎng)基中。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述接種量為od750＝3-9。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述接種量為od750＝5-7。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括預(yù)培養(yǎng)的步驟。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的自養(yǎng)和異養(yǎng)培養(yǎng)方法進(jìn)一步包括收集細(xì)胞并從所收集的細(xì)胞分離蛋白質(zhì)或油脂的步驟。本發(fā)明還提供一種對(duì)索羅金小球藻進(jìn)行培養(yǎng)的方法，包括：(i)將本發(fā)明的藻株進(jìn)行增殖；(ii)將所增殖的細(xì)胞加入到反應(yīng)器中的缺氮培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)；以及任選地，(iii)收集所培養(yǎng)的細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，步驟(i)的增殖使用本發(fā)明的培養(yǎng)方法進(jìn)行。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所缺氮培養(yǎng)基是缺氮的bg11或缺氮的改良的endo培養(yǎng)基。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，步驟(ii)中將所述細(xì)胞以od750＝0.1-0.5的接種量置于缺氮培養(yǎng)基中，并在20-30℃，連續(xù)光照強(qiáng)度為50μmolm-2s-1，ph值5-8，以及通入co2的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，其中培養(yǎng)0-2天后，光照強(qiáng)度改為150μmolm-2s-1。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，步驟(ii)中的ph值為6-7。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，步驟(ii)中的培養(yǎng)進(jìn)行12天。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，步驟(ii)中的培養(yǎng)在25℃進(jìn)行。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，在步驟(i)和(ii)之間進(jìn)一步包括收集增殖的細(xì)胞，并用缺氮培養(yǎng)基進(jìn)行清洗的步驟。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括收集所培養(yǎng)的細(xì)胞的步驟，并從所收集的細(xì)胞分離油脂的步驟。還提供本發(fā)明的藻株在制備油脂或生物柴油、制備不飽和脂肪酸或營(yíng)養(yǎng)保健品以及制備蛋白質(zhì)中的用途。本發(fā)明還提供包含本發(fā)明的索羅金小球藻藻株的細(xì)胞和/或細(xì)胞提取物的藥物組合物、食品組合物、營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑或飼料添加物。附圖說(shuō)明圖1為gt-1在光學(xué)顯微鏡下的形態(tài)特征照片。圖2為gt-1的18srdna核酸序列在ncbi中blast結(jié)果。圖3為gt-1的18srdna的系統(tǒng)發(fā)育樹。圖4為gt-1的its1和5.8srdna的系統(tǒng)發(fā)育樹。圖5為gt-1的its2的系統(tǒng)發(fā)育樹。圖6為gt-1的its核酸序列在ncbi中blast結(jié)果。圖7為gt-1在自養(yǎng)培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)曲線。圖8為gt-1在異養(yǎng)培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)曲線。圖9為gt-1在異養(yǎng)轉(zhuǎn)為自養(yǎng)缺氮條件下的生長(zhǎng)曲線。圖10顯示培養(yǎng)基中氮源對(duì)gt-1碳水化合物組成的影響。圖11顯示培養(yǎng)基中氮源對(duì)gt-1蛋白質(zhì)含量的影響。圖12顯示培養(yǎng)基中氮源對(duì)gt-1總油脂含量的影響。圖13顯示培養(yǎng)基中氮源對(duì)gt-1脂肪酸組成的影響。圖14是索羅金小球藻gt-1在bg11培養(yǎng)基中生長(zhǎng)3日后的sem顯微照片。a：顯示蛋白核、細(xì)胞核以及淀粉粒；b顯示蛋白核和淀粉粒；c：顯示詳細(xì)的蛋白核；d：顯示淀粉粒和油滴；e：顯示細(xì)胞復(fù)制過(guò)程中的葉綠體、細(xì)胞核以及淀粉粒；f：顯示細(xì)胞群。其中標(biāo)尺為500nm。圖15是索羅金小球藻gt-1在無(wú)氮的bg11培養(yǎng)基中生長(zhǎng)6日后的sem顯微照片。a：顯示油滴和淀粉粒；b：顯示蛋白核、油滴和淀粉粒；c：顯示油滴和淀粉粒；d：顯示細(xì)胞復(fù)制過(guò)程中的油滴和淀粉粒。其中標(biāo)尺為500nm。發(fā)明詳述索羅金小球藻(chlorellasorokiniana)屬于綠藻門(chlorophyta)，綠藻綱(chlorophyceae)，綠球藻目(chlorococcales)，小球藻科(chlorellaceae)，小球藻屬(chlorella)。本發(fā)明從自然水體中分離出一種單細(xì)胞藻類，經(jīng)形態(tài)學(xué)分析初步鑒定為小球藻屬，命名為gt-1。通過(guò)18srdna序列分析，進(jìn)一步鑒定為索羅金小球藻。此外，通過(guò)rrna編碼區(qū)間隔序列(internaltranscribedsequence，its)分析，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)所分離到的索羅金小球藻不同于已知的索羅金小球藻藻株。因此，在第一方面，本發(fā)明提供一種索羅金小球藻藻株gt-1，以分類命名小球藻chlorellasp.，保藏號(hào)cgmccno.11801于2015年12月2日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(cgmcc)(北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)。在第二方面，本發(fā)明還提供用于培養(yǎng)本發(fā)明的索羅金小球藻藻株的方法。可以將本發(fā)明的索羅金小球藻藻株以自養(yǎng)的方式進(jìn)行培養(yǎng)。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的索羅金小球藻藻株置于培養(yǎng)基中，并在20-30℃，連續(xù)光照強(qiáng)度為150-200μmolm-2s-1，ph值5-8，以及通入co2的條件下培養(yǎng)，其中od750是750nm的吸光度。優(yōu)選地，所述培養(yǎng)在ph值6-7的條件下進(jìn)行。優(yōu)選地，所述培養(yǎng)在25℃進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)進(jìn)行1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12天或更長(zhǎng)時(shí)間。優(yōu)選地，所述培養(yǎng)進(jìn)行6-12天。優(yōu)選地，所述連續(xù)光照強(qiáng)度為165μmolm-2s-1。在一些實(shí)施方式中，培養(yǎng)過(guò)程中通入含有1-2％co2的空氣。在一些實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)使用bg11培養(yǎng)基。在一些實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)在柱狀反應(yīng)器中進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，培養(yǎng)結(jié)束后收集細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，從所收集的細(xì)胞分離油脂。在一些實(shí)施方式中，從所收集的細(xì)胞分離蛋白質(zhì)。還可以將本發(fā)明的索羅金小球藻藻株以異養(yǎng)的方式進(jìn)行培養(yǎng)。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的索羅金小球藻藻株置于異養(yǎng)培養(yǎng)基中，并在25-35℃，ph值5-8，以及溶氧濃度20-100％的條件下進(jìn)行連續(xù)補(bǔ)料培養(yǎng)。優(yōu)選地，所述培養(yǎng)使用改良的endo培養(yǎng)基。優(yōu)選地，所述培養(yǎng)在ph值6-7的條件下進(jìn)行。優(yōu)選地，所述培養(yǎng)在30℃進(jìn)行。優(yōu)選地，所述溶氧濃度為40-60％，更優(yōu)選40％。在一些實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)進(jìn)行1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12天或更長(zhǎng)時(shí)間。優(yōu)選地，所述培養(yǎng)進(jìn)行6-12天。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述藻株以od750＝1-16，優(yōu)選od750＝2-12，更優(yōu)選od750＝3-9，進(jìn)一步優(yōu)選od750＝5-7的接種量置于異養(yǎng)培養(yǎng)基中。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括預(yù)培養(yǎng)的步驟。在本發(fā)明中，“溶氧濃度”是指培養(yǎng)基中所溶解的氧的量相對(duì)于培養(yǎng)條件下培養(yǎng)基中氧的飽和溶解度的百分比。溶氧濃度控制方法是溶氧轉(zhuǎn)速、氧氣偶聯(lián)。具體而言，溶氧轉(zhuǎn)速、氧氣偶聯(lián)的控制方法是：當(dāng)培養(yǎng)物中的溶氧值低于設(shè)定值時(shí)通過(guò)自動(dòng)增加攪拌轉(zhuǎn)速，來(lái)提高通入氣體中氧氣在培養(yǎng)物中的溶解，當(dāng)轉(zhuǎn)速增加至設(shè)定最大值而溶氧濃度仍低于設(shè)定值時(shí)，再通過(guò)增加通氣(空氣和氧氣的混合氣體)中氧氣的比例，來(lái)增加溶氧；當(dāng)培養(yǎng)物中的溶氧濃度高于設(shè)定值時(shí)通過(guò)自動(dòng)降低通氣中氧氣的比例，來(lái)降低溶氧；當(dāng)氧氣比例降至0，通100％空氣時(shí)，溶氧濃度仍高于設(shè)定值時(shí)，再通過(guò)自動(dòng)降低攪拌轉(zhuǎn)速方式進(jìn)一步降低溶氧濃度，直至降至設(shè)定值。在本發(fā)明中，連續(xù)補(bǔ)料培養(yǎng)是指在培養(yǎng)的過(guò)程中監(jiān)測(cè)培養(yǎng)基中還原糖的含量，當(dāng)還原糖降至5g/l時(shí)，通過(guò)補(bǔ)加基礎(chǔ)培養(yǎng)基的濃縮液，例如補(bǔ)加25×的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的濃縮液，以維持藻細(xì)胞不斷生長(zhǎng)。在一些實(shí)施方式中，培養(yǎng)過(guò)程中保持?jǐn)嚢铇?00-600rpm的速度攪拌。在一些實(shí)施方式中，培養(yǎng)結(jié)束后收集細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，從所收集的細(xì)胞分離油脂。在一些實(shí)施方式中，從所收集的細(xì)胞分離蛋白質(zhì)。在第三方面，本發(fā)明提供對(duì)本發(fā)明的索羅金小球藻藻株進(jìn)行培養(yǎng)的方法，包括：(i)將本發(fā)明的藻株進(jìn)行增殖；(ii)將所增殖的細(xì)胞加入到反應(yīng)器中的缺氮培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)；以及任選地，(iii)收集所培養(yǎng)的細(xì)胞。本發(fā)明中，缺氮培養(yǎng)基是指不添加氮源的培養(yǎng)基。在一些實(shí)施方式中，步驟(i)的增殖使用本發(fā)明前述的培養(yǎng)方法進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，在步驟(i)中，所述培養(yǎng)使用改良的endo培養(yǎng)基。在一些實(shí)施方式中，步驟(ii)中所述缺氮的培養(yǎng)基是缺氮的bg11培養(yǎng)基。在一些實(shí)施方式中，步驟(ii)中所述缺氮的培養(yǎng)基是缺氮的改良的endo培養(yǎng)基。在一些實(shí)施方式中，上述方法包括：(i)將本發(fā)明的藻株以od750＝1-16的接種量置于改良的endo培養(yǎng)基中，并在25-35℃，ph值5-8，以及溶氧濃度20-100％的條件下連續(xù)補(bǔ)料培養(yǎng)；(ii)將所增殖的索羅金小球藻細(xì)胞以od750＝0.2-0.5的接種量加入到反應(yīng)器中的缺氮的bg11培養(yǎng)基中，在20-30℃，連續(xù)光照強(qiáng)度為50μmolm-2s-1，ph值5-8，以及通入1-2％co2的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，其中培養(yǎng)0-2天后，光照強(qiáng)度改為150μmolm-2s-1；以及任選地，(iii)收集所培養(yǎng)的細(xì)胞。在步驟(i)中，優(yōu)選地，所述培養(yǎng)在ph值6-7的條件下進(jìn)行。優(yōu)選地，所述培養(yǎng)在30℃進(jìn)行。優(yōu)選地，所述溶氧濃度為40-60％，更優(yōu)選40％。在一些實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)進(jìn)行1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天或更長(zhǎng)時(shí)間。優(yōu)選地，所述培養(yǎng)進(jìn)行6-7天。優(yōu)選地，所述接種量為od750＝8或16。在步驟(ii)中，優(yōu)選地，ph值為6-7。優(yōu)選地，所述誘導(dǎo)進(jìn)行12天。優(yōu)選地，所述誘導(dǎo)在25℃進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，培養(yǎng)過(guò)程中通入含有1-2％co2的空氣。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，在步驟(i)和(ii)之間進(jìn)一步包括收集增殖的細(xì)胞，并用缺氮培養(yǎng)基進(jìn)行清洗的步驟。在一些實(shí)施方式中，步驟(ii)的培養(yǎng)結(jié)束后收集細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，從所收集的細(xì)胞分離油脂。與本領(lǐng)域已知的小球藻相比，本發(fā)明的藻株具有很多優(yōu)點(diǎn)。首先，無(wú)論以自養(yǎng)還是異養(yǎng)方式培養(yǎng)，本發(fā)明所分離的索羅金小球藻藻株與已知的索羅金小球藻藻株相比，生長(zhǎng)迅速，并且能達(dá)到更高的生物量(如表1和2所示)。此外，本發(fā)明的索羅金小球藻藻株在異養(yǎng)條件下培養(yǎng)的糖利用率高，培養(yǎng)結(jié)束后無(wú)殘?zhí)牵阎男∏蛟逶谂囵B(yǎng)結(jié)束后通常有大量殘醣(如表2所示)。表1、自養(yǎng)培養(yǎng)小球藻的生長(zhǎng)速率與細(xì)胞密度比較：表2、異養(yǎng)培養(yǎng)生長(zhǎng)速率、細(xì)胞密度與殘?zhí)菍?duì)比：藻株名稱細(xì)胞密度(g/l)平均生長(zhǎng)速率(g/l·h)培養(yǎng)結(jié)束后殘?zhí)?g/l)原始小球藻(fachb-2)54.60.379.36普通小球藻(fachb-8)41.20.3511.52蛋白核小球藻(fachb-9)66.40.468.19橢圓小球藻(fachb-40)600.362.61索羅金小球藻(gt-1)125.80.870其次，本發(fā)明的索羅金小球藻藻株能在ph5的條件下生長(zhǎng)?，F(xiàn)有的對(duì)小球藻生長(zhǎng)條件的研究中所采用的ph通常為6.0以上(如表3所示)，可見本發(fā)明的索羅金小球藻gt-1具有更好的耐酸特性。表3、小球藻培養(yǎng)的ph值：此外，在優(yōu)化的培養(yǎng)條件下，如對(duì)溫度、ph、光照強(qiáng)度、培養(yǎng)基中的氮源或者微量元素等條件的優(yōu)化，已知的小球藻細(xì)胞的油脂含量達(dá)到細(xì)胞干重的30％左右。而本發(fā)明的索羅金小球藻gt-1在異養(yǎng)培養(yǎng)條件下，藻細(xì)胞總油脂含量達(dá)到25.3％，而經(jīng)過(guò)異養(yǎng)培養(yǎng)+自養(yǎng)缺氮培養(yǎng)后，藻細(xì)胞總油脂含量達(dá)到51.9％。如表4所示。表4、小球藻中的油脂含量：種名及編號(hào)油脂含量(％干重)文獻(xiàn)出處chlorellasp.28～32firozalametal.,2015chlorellaprotothecoidessag211-7b24.8～37.5izabelakrzeminskaetal.,2015chlorellasorokiniana20～27juntiladjetal.,2015chlorellasp.39.3崔靜和劉建國(guó)，2012chlorellasorokiniana13zhengetal.,2012chlorellaminutissimautex22194～4.8tangetal.,2012chlorellazofingiensisatcc3041215liuetal.,2011chlorellapyrenoidosasjtu24tangetal.,2011chlorellasp.mp-128.82mayurmpetal.,2011chlorellasp.xq-20041917.9-41.0張桂艷等，2011chlorellavulgarisutex25938liangetal.,2009gt-125.3～51.9本發(fā)明綜上所述，本發(fā)明的索羅金小球藻藻株生長(zhǎng)迅速，最高生物量可達(dá)接近130g/l，并且適應(yīng)性強(qiáng)，糖利用率高。因此，將本發(fā)明的索羅金小球藻藻株用于工業(yè)生產(chǎn)可以降低能耗和成本，并且有利于防止污染。同時(shí)，本發(fā)明的索羅金小球藻藻株含油量高，適合于生產(chǎn)油脂。發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)缺氮誘導(dǎo)后，在總油脂中，c16:3和c18:3的含量顯著升高，并且c18:2也是總油脂的主要成分，c16和c18占總油脂的80％以上。本領(lǐng)域已知，c18:2，即十八碳二烯酸(即，亞油酸)和c18:3，即十八碳三烯酸(即，亞麻酸)具有多種生理功能：亞油酸能影響血壓，具有降血壓的作用；γ-亞麻酸在臨床上的試驗(yàn)結(jié)果表明有降血脂作用，可防止血栓形成，還具有防治糖尿病的作用及抗癌活性。亞麻酸主要用于醫(yī)藥、保健食品和功能性飲料領(lǐng)域(黃寶璽等，2009)。另外，γ-亞麻酸具有營(yíng)養(yǎng)保護(hù)作用，可應(yīng)用于一些洗滌化妝品領(lǐng)域(王萍等,2008)。此外，十六碳脂肪酸和十八碳脂肪酸是合成其它不飽和脂肪酸的前體(孫翔宇等，2012)。因此，在第四方面，還提供本發(fā)明的索羅金小球藻藻株在制備油脂或生物柴油中的用途，本發(fā)明的索羅金小球藻藻株在制備不飽和脂肪酸或營(yíng)養(yǎng)保健品中的用途，以及本發(fā)明的索羅金小球藻藻株在制備化合物，如蛋白質(zhì)，中的用途。本發(fā)明還提供包含本發(fā)明的索羅金小球藻藻株的細(xì)胞和/或細(xì)胞提取物的藥物組合物、食品組合物、營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑或飼料添加物。本發(fā)明中使用了如下的培養(yǎng)基和溶液：bg11，含有硝酸鈉1.5g/l、磷酸二氫鉀0.04g/l、七水硫酸鎂0.075g/l、二水氯化鈣0.036g/l、檸檬酸0.006g/l、檸檬酸鐵銨0.006g/l、edta二鈉0.001g/l、碳酸鈉0.02g/l和微量金屬元素混合溶液1ml/l，ph7；改良的endo培養(yǎng)基i，含有葡萄糖20g/l、硝酸鉀2g/l、磷酸二氫鉀1g/l、七水硫酸鎂1g/l、七水硫酸亞鐵5mg/l、氯化鈣0.01g/l、a5溶液1ml/l、edta二鈉3.7mg/l和瓊脂15g/l，ph6.5；改良的endo培養(yǎng)基ii，含有葡萄糖30g/l、硝酸鉀3g/l、磷酸二氫鉀1g/l、七水硫酸鎂1g/l、七水硫酸亞鐵5mg/l、氯化鈣0.01g/l、a5溶液1ml/l和edta二鈉3.7mg/l，ph6.5；改良的endo培養(yǎng)基iii，含有葡萄糖30g/l、硝酸鉀5g/l、磷酸二氫鉀1g/l、七水硫酸鎂1g/l、七水硫酸亞鐵5mg/l、氯化鈣0.01g/l、a5溶液1ml/l和edta二鈉3.7mg/l，ph6.5；培養(yǎng)基bg11中的微量金屬元素混合溶液，含有硼酸2.86g/l、七水硫酸鋅0.22g/l、四水氯化錳1.86g/l、二水鉬酸鈉0.39g/l、五水硫酸銅0.08g/l和硝酸鈷0.05g/l；以及改良的endo培養(yǎng)基i、ii、iii中的a5溶液，含有硼酸2.86g/l、七水硫酸鋅0.222g/l、四水氯化錳1.81g/l、鉬酸鈉0.021g/l和二水硫酸銅0.07g/l。實(shí)施例以下的實(shí)施例是為了便于更好地闡釋本發(fā)明，并非意在限定本發(fā)明的范圍。如無(wú)特殊說(shuō)明，下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法均為常規(guī)方法。如無(wú)特殊說(shuō)明，下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到。實(shí)施例1.索羅金小球藻藻株gt-1的分離和形態(tài)學(xué)鑒定收集來(lái)自河北省三河市鮑邱河的夏季水樣，通過(guò)多次劃平板(改良的endo培養(yǎng)基i)的方式進(jìn)行純化，最終獲得純系藻株。在顯微鏡下觀察，該藻為單細(xì)胞，細(xì)胞為圓形或橢圓形，大小在2～6微米之間，色素體周生，杯狀，每個(gè)色素體具有1個(gè)蛋白核(如圖1a左側(cè)的p所示)。因此，所分離的藻株鑒定為小球藻屬的藻類，命名為gt-1。實(shí)施例2.索羅金小球藻藻株gt-1的分子生物學(xué)鑒定取一定量的對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)狀態(tài)良好的gt-1培養(yǎng)物，通過(guò)離心得到藻細(xì)胞沉淀，用于提取總dna?？俤na提取方法按照dneasyplantminikit試劑盒所要求的步驟進(jìn)行?？俤na樣品設(shè)有2個(gè)平行，提取完成后，用nanodrop8000測(cè)定dna模板的濃度分別為53.59ng/μl和50.70ng/μl。隨后，擴(kuò)增gt-1的18srdna和核糖體rrna編碼區(qū)間隔序列(internaltranscribedsequence，its)并進(jìn)行測(cè)序和序列分析。a.18srdna采用如下真核生物18srdna擴(kuò)增通用引物擴(kuò)增完整的gt-1的18srdna序列：正向引物：5′-aacctggttatcctgccagt-3′(seqidno:1)；和反向引物：5′-tgatccttctgcaggttcacctacg-3′(seqidno:2)。pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系為20μl，取2μl總dna為模板。擴(kuò)增條件如下：94℃預(yù)變性10min；94℃變性1min，50℃退火1.5min，72℃延伸2.5min，5個(gè)循環(huán)；94℃變性1min，56℃退火1.5min，72℃延伸2.5min，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其擴(kuò)增產(chǎn)物，電泳條件：電壓100v，時(shí)間25min。將凝膠電泳檢測(cè)到的目的條帶進(jìn)行切割回收，然后與載體連接，在感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，最后將混合產(chǎn)物均勻涂在lb培養(yǎng)基的平板上，在37℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)。選取至少5個(gè)單克隆進(jìn)行測(cè)序，所得序列如seqidno:3所示，共1795bp。經(jīng)比對(duì)，其中前面21個(gè)堿基為正向引物(與正向引物相比在第10個(gè)位點(diǎn)插入了g)，后面25個(gè)堿基為反向引物，中間為18srdna序列。將獲得的gt-1的18srrna序列在ncbi中進(jìn)行blast，發(fā)現(xiàn)與索羅金小球藻praga14(序列號(hào)：x74001)的相似度最高，為99％(如圖2所示)。利用clcsequencerviewer7.5軟件對(duì)gt-1和praga14的18srrna序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)前者有3個(gè)位點(diǎn)缺失(具體為779位點(diǎn)、903位點(diǎn)和1797位點(diǎn)在gt-1中有缺失)，2個(gè)位點(diǎn)差異(分別是1361位點(diǎn)和1694位點(diǎn))，即共有5個(gè)位點(diǎn)不同，相似度為99.72％。將ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)中索羅金小球藻全部藻株的18srdna序列進(jìn)行比對(duì)，去掉差異較大藻株序列。以尖細(xì)柵藻(scenedesmusacuminatus)ab037088的18srdna序列為種外群來(lái)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。具體而言，利用mega5.1軟件，采用clustalw軟件包對(duì)所有序列進(jìn)行多序列比對(duì)，比對(duì)參數(shù)為默認(rèn)值。然后根據(jù)鄰接法(neighbor-joining)，testofphylogeny選用分支法，各分支的重復(fù)數(shù)為1000，核苷酸替換模式為maximumcompositelikelihood，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。從進(jìn)化樹上得知目標(biāo)藻株gt-1與索羅金小球藻praga14和索羅金小球藻sag211-31親緣關(guān)系最近(如圖3所示)。由此可見，目標(biāo)藻株屬于索羅金小球藻。b.its序列的擴(kuò)增及序列分析索羅金小球藻gt-1的its序列的擴(kuò)增引物如下：正向引物：5′-ggaagtaaaagtcgtaacaagg-3′(seqidno:4)；和反向引物：5′-tcctccgcttattgatatgc-3′(seqidno:5)。pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系為40μl，取4μl總dna作為模板。擴(kuò)增條件如下：94℃預(yù)變性6min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其擴(kuò)增產(chǎn)物，電泳條件：電壓170v，時(shí)間20min。選取電泳檢測(cè)后清晰的條帶進(jìn)行測(cè)序，所得序列如seqidno:6所示，共710bp。通過(guò)與genbank中其他索羅金小球藻藻株utex246(id:kp645223)和utex1230(id：kp645225)的完整its序列進(jìn)行比對(duì)，確定目標(biāo)藻株gt-1的its序列各個(gè)部分的組成。its序列包括its1(內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1)、5.8srdna和its2(內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2)，各部分均為完整序列，詳細(xì)信息如下：1-14位點(diǎn)為18srdna；15-268位點(diǎn)為its1；269-427位點(diǎn)為5.8srdna；428-661位點(diǎn)為its2；662-710位點(diǎn)為28srdna。ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)中索羅金小球藻全部藻株的its序列有35條。其中部分藻株只包含its1或its2序列。利用clcsequenceviewer7軟件對(duì)全部藻株的its序列進(jìn)行比對(duì)。首先，去掉4條缺少its1序列(id分別為kr905186，kc416207，ay323463和ay323464)的藻株，基于剩余31條的its1和5.8s序列，選用蛋白核小球藻(chlorellapyrenoidosa)y8-1kj855064的its序列作為種外群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。利用mega5.1軟件，采用clustalw軟件包對(duì)所有序列進(jìn)行多序列比對(duì)，比對(duì)參數(shù)為默認(rèn)值。然后根據(jù)鄰接法，testofphylogeny選用分支法，各分支的重復(fù)數(shù)為1000，核苷酸替換模式為maximumcompositelikelihood，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(如圖4所示)。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示gt-1與索羅金小球藻utex261親緣關(guān)系最近，因此將兩株的its全部的序列(its1+5.8s+its2)做比對(duì)。通過(guò)clcsequencerviewer7.5軟件比對(duì)得知兩者有35個(gè)位點(diǎn)缺失，99個(gè)位點(diǎn)差異，相似度為79.97％。再者，去掉6條缺少its2序列的序列(id分別為km061457、km061455、km061454、km061453、kp347612和kp347611)，基于剩余29條序列的its2序列，選用蛋白核小球藻y8-1kj855064的its序列作為種外群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。利用mega5.1軟件，采用clustalw軟件包對(duì)所有序列進(jìn)行多序列比對(duì)，比對(duì)參數(shù)為默認(rèn)值。然后根據(jù)鄰接法，testofphylogeny選用分支法，各分支的重復(fù)數(shù)為1000，核苷酸替換模式為maximumcompositelikelihood，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，各分支的重復(fù)數(shù)均為1000。詳細(xì)系統(tǒng)進(jìn)化樹(如圖5所示)。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示gt-1與索羅金小球藻ccalapraga14親緣關(guān)系最近，因此將兩株的its2序列做比對(duì)。通過(guò)clcsequencerviewer7.5軟件比對(duì)得知兩者有31個(gè)位點(diǎn)缺失，43個(gè)位點(diǎn)差異，相似度為71.65％。將gt-1的its序列，提交至ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行blast比對(duì)，結(jié)果顯示gt-1與chlorellasp.zju0201的相似度最高(如圖6所示)。通過(guò)clcsequencerviewer7.5軟件將兩者進(jìn)行比對(duì)，有1個(gè)位點(diǎn)堿基有差異，相似度為99.84％。但chlorellasp.zju0201小球藻只鑒定到屬，并未鑒定到種。也就是說(shuō)，并不能確定chlorellasp.zju0201也為索羅金小球藻，因此，表明本發(fā)明中的gt-1藻株的its序列具有特異性。通過(guò)以上分析可知本發(fā)明的索羅金小球藻its具有特異性，與已報(bào)道的其他索羅金小球藻藻株存在顯著差異。由此可見，gt-1是一株新的索羅金小球藻藻株。實(shí)施例3.索羅金小球藻gt-1的培養(yǎng)方法a.索羅金小球藻gt-1的自養(yǎng)培養(yǎng)使用bg11培養(yǎng)基進(jìn)行自養(yǎng)培養(yǎng)。索羅金小球藻gt-1可保藏于250ml三角瓶中，保藏的溫度為20-30℃，連續(xù)光照強(qiáng)度為5μmolm-2s-1，將ph值調(diào)節(jié)至7。首先將保藏的gt-1接種至柱狀反應(yīng)器內(nèi)(內(nèi)徑44mm，培養(yǎng)體積0.6l)培養(yǎng)，接種量為光密度od750＝0.4；培養(yǎng)過(guò)程中從底部通入含1-2％co2的空氣攪拌藻液，連續(xù)光照強(qiáng)度165μmolm-2s-1，培養(yǎng)溫度25℃，設(shè)置兩個(gè)平行。在培養(yǎng)過(guò)程中測(cè)定培養(yǎng)物中的細(xì)胞干重和培養(yǎng)物的od750。干重測(cè)定方法：每天取樣約30ml用于測(cè)定細(xì)胞干重和細(xì)胞數(shù)量。每天取5-10ml藻液進(jìn)行真空膜過(guò)濾(glassmicrofibrefilter,696,vwr)，再用相同體積的碳酸氫銨(0.5mol/l)溶液沖洗膜兩次后把膜放入烘箱(100℃)烘干至恒重，濾膜的增量即為細(xì)胞干重。gt-1在柱狀反應(yīng)器(5cm)中的生長(zhǎng)曲線(如圖7所示)。od750測(cè)定方法：每日從微藻培養(yǎng)液中取約3ml藻液，使用dr-6000(hach)分光光度計(jì)測(cè)定750nm處od值。通過(guò)以上測(cè)定方法得知索羅金小球藻gt-1在如上所述的自養(yǎng)條件下柱狀反應(yīng)器中培養(yǎng)至第11天時(shí)，干重可達(dá)到3.52g/l，od750值達(dá)到7.83。b.索羅金小球gt-1的異養(yǎng)培養(yǎng)將改良的endo培養(yǎng)基i上保藏的gt-1接種于改良的endo培養(yǎng)基ii中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)；將預(yù)培養(yǎng)物接種于改良的endo培養(yǎng)基iii進(jìn)行培養(yǎng)。首先進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。具體而言，用接種環(huán)從平板上挑取1個(gè)單克隆或從液體保藏的gt-1挑取1接種環(huán)藻細(xì)胞接入15ml改良的endo培養(yǎng)基ii(50ml搖瓶)；放在搖床上黑暗培養(yǎng)，溫度25℃，轉(zhuǎn)速180rpm，培養(yǎng)5天；按1％接種量轉(zhuǎn)入100ml培養(yǎng)基(250ml搖瓶)，培養(yǎng)4天；再按1％接種量轉(zhuǎn)入300ml培養(yǎng)基(1000ml搖瓶)中培養(yǎng)4天，獲得od750＝20-25的預(yù)培養(yǎng)物。然后用發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)。具體而言，利用7.5l發(fā)酵罐(bioflo310，newbrunswickscientific，us)對(duì)索羅金小球藻進(jìn)行培養(yǎng)，將預(yù)培養(yǎng)物調(diào)整濃度后取300ml，接入裝有2.5l改良的endo培養(yǎng)基iii的發(fā)酵罐，接種后初始o(jì)d750為2(生物量0.8～0.9g/l)。培養(yǎng)參數(shù)具體為：溫度25℃，ph為7.0±0.1，溶氧為40％，溶氧控制模式為溶氧與轉(zhuǎn)速偶聯(lián)，轉(zhuǎn)速為200～600rpm，通氣量為2.8l/min。當(dāng)還原糖降至5g/l時(shí)，通過(guò)補(bǔ)加25×基礎(chǔ)培養(yǎng)基(即改良的endo培養(yǎng)基iii)的濃縮液，維持藻細(xì)胞不斷生長(zhǎng)，葡萄糖控制在0～30g/l的范圍內(nèi)。培養(yǎng)過(guò)程中用1mhcl和1mnaoh調(diào)節(jié)ph。培養(yǎng)過(guò)程中的還原糖和生物量通過(guò)以下方法進(jìn)行檢測(cè)。(1)還原糖：還原糖檢測(cè)試劑盒(儀器：三諾安穩(wěn)血糖儀；試紙條：三諾安穩(wěn)c06)。培養(yǎng)物離心取上清，稀釋0～10倍(2)生物量：gf/c膜抽濾法。對(duì)于不同樣品而言，具體操作如下。接種后的樣品：取5ml抽濾；生物量≦50g/l的樣品：取1ml抽濾；50g/l<生物量≦100g/l的樣品：取1ml稀釋至5倍再取1ml稀釋后的培養(yǎng)物抽濾；生物量>100g/l的樣品：取1ml稀釋至10倍再取1ml稀釋后的培養(yǎng)物抽濾。洗液為0.5m碳酸氫銨，用量為50ml/膜。結(jié)果顯示，在培養(yǎng)至第6天時(shí)可達(dá)到最高生物量為125.8g/l，其生長(zhǎng)曲線如圖8所示。該生物量比目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道的同種小球藻高出很多。此外，還對(duì)索羅金小球藻gt-1的耐酸性進(jìn)行了初步研究，發(fā)現(xiàn)其在ph5.0培養(yǎng)條件下仍能存活，并能較好生長(zhǎng)，異養(yǎng)培養(yǎng)144h(6天)其細(xì)胞密度可達(dá)42.6g/l。實(shí)施例4.在缺氮培養(yǎng)基中培養(yǎng)索羅金小球藻gt-1gt-1細(xì)胞先進(jìn)行異養(yǎng)培養(yǎng)然后在缺氮培養(yǎng)基中進(jìn)行自養(yǎng)培養(yǎng)，獲得的培養(yǎng)物用于生化組成分析。具體培養(yǎng)條件為：取異養(yǎng)培養(yǎng)中后期的培養(yǎng)物15ml至50ml離心管中，3000×g離心5min，棄上清，用無(wú)氮源bg11培養(yǎng)基懸浮清洗3次，最后用無(wú)氮bg11培養(yǎng)基再次懸浮并測(cè)定其光密度(od750)。取od750＝0.5的gt-1懸浮液，接種到柱式反應(yīng)器中(內(nèi)徑44mm，培養(yǎng)體積0.8l)，培養(yǎng)基為缺氮bg11，在缺氮培養(yǎng)基中培養(yǎng)12天時(shí)收獲，收獲的od750＝1.6。培養(yǎng)過(guò)程中溫度為25℃，通入1-2％的co2培養(yǎng)，起始階段，為避免突然換到強(qiáng)光環(huán)境導(dǎo)致藻死亡，光照強(qiáng)度起初為50μmolm-2s-1，待培養(yǎng)0-2天，藻適應(yīng)后，將光照強(qiáng)度調(diào)整為150μmolm-2s-1繼續(xù)進(jìn)行光照培養(yǎng)。gt-1在該條件下在第3天達(dá)到最大生物量為0.8g/l，之后慢慢下降，具體的生長(zhǎng)曲線(如圖9所示)。實(shí)施例5.索羅金小球藻gt-1細(xì)胞中的化合物含量分析收獲實(shí)施例3和4中所培養(yǎng)的gt-1細(xì)胞并進(jìn)行真空冷凍干燥，然后進(jìn)行如下分析。a.碳水化合物組成分析取真空冷凍干燥的gt-1細(xì)胞，加入冰乙酸，80℃水浴20分鐘，加入丙酮，1,000g離心10分鐘，棄上清，向沉淀中加入4m的三氟乙酸，沸水浴4小時(shí)。10,000g離心3min，取上清液與硫酸苯酚顯色劑混勻，沸水浴中20分鐘，測(cè)490nm處的吸光值。用葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算gt-1細(xì)胞中總碳水化合物的含量在異養(yǎng)培養(yǎng)時(shí)為17.1％，在自養(yǎng)缺氮培養(yǎng)后，含量高達(dá)36.5％(如圖10所示)。b.蛋白質(zhì)組成分析取真空冷凍干燥的gt-1細(xì)胞，加入1m的naoh，于80℃水浴10分鐘。在4℃下12000g離心30分鐘。將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管內(nèi)，重復(fù)naoh提取步驟兩次，合并所有提取的上清液。按g-biosciences蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明書，測(cè)得異養(yǎng)培養(yǎng)的藻細(xì)胞蛋白質(zhì)含量為21.9％，而自養(yǎng)缺氮誘導(dǎo)的藻細(xì)胞蛋白質(zhì)含量只有8.7％(如圖11所示)。c.脂肪酸組成分析取真空冷凍干燥的gt-1細(xì)胞，依次加入氯仿:甲醇(2:1，v/v)、5％hcl和十三酸，混勻后85℃甲酯化一小時(shí)，轉(zhuǎn)甲酯完成后，給每個(gè)樣品中加入1ml的正己烷混勻，靜置分層。取上層相到gc上樣瓶中，加入十五烷做內(nèi)標(biāo)，混勻上樣。外標(biāo)物為37種脂肪酸混標(biāo)(sigmaaldrich，#18919-1amp)。所用儀器是安捷倫的7890b-5977a，柱子為hp-8860mx0.25mmidx0.2μmft。上樣量為1μl，分流比為20：1，進(jìn)樣口溫度為250℃，流速為1ml/min。柱溫50℃，2min；25℃/min升為175℃保持5min；7℃/min升至210℃后保持2min；2℃/min升為230℃保持1min。質(zhì)譜檢測(cè)器：離子源溫度為230℃，四級(jí)桿溫度為150℃，掃描范圍30～400。異養(yǎng)培養(yǎng)和自養(yǎng)缺氮培養(yǎng)的藻細(xì)胞總脂含量分別為25.3％和51.9％(如圖12所示)。gt-1在異養(yǎng)培養(yǎng)時(shí)，可檢測(cè)到8種脂肪酸，在自養(yǎng)缺氮時(shí)，除了異養(yǎng)條件下檢測(cè)到的8種脂肪酸，還檢測(cè)到c16:1和c18:1-cis這兩種脂肪酸。在兩種培養(yǎng)條件下，c16:3、c18:1-trans、c18:2和c18:3這四種脂肪酸均為最主要的脂肪酸組分，可占到總脂肪酸含量的80％以上。在自養(yǎng)缺氮后，c16:3和c18:3含量較自養(yǎng)培養(yǎng)時(shí)顯著增多(如圖13所示)。實(shí)施例6.在缺氮條件下培養(yǎng)的索羅金小球藻gt-1的形態(tài)學(xué)分析上述各實(shí)施例的結(jié)果顯示索羅金小球藻gt-1的細(xì)胞具有生長(zhǎng)速度快且生物量高的特點(diǎn)，其油脂含量可達(dá)細(xì)胞干重的50％以上。在自養(yǎng)缺氮誘導(dǎo)的條件下，細(xì)胞內(nèi)的淀粉含量降低而油脂含量明顯升高。為了驗(yàn)證以上結(jié)論，將索羅金小球藻gt-1細(xì)胞分別在bg11培養(yǎng)基和缺氮的bg11培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，分別在第4天和第7天取樣，利用透射電鏡方法對(duì)樣品細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。以期從細(xì)胞內(nèi)部的超微結(jié)構(gòu)，主要是淀粉和油滴的形態(tài)和數(shù)量上，對(duì)假設(shè)進(jìn)行驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)方法：(1)擴(kuò)種方法：配制bg11液體培養(yǎng)基，將藻種轉(zhuǎn)接于250ml錐形瓶中，具體為80ml新鮮培養(yǎng)基加入1ml的藻液，3個(gè)平行，培養(yǎng)溫度為21℃，光照強(qiáng)度為50μmolm-2s-1，培養(yǎng)7天后作為藻種。(2)柱狀反應(yīng)器中培養(yǎng)方法：配制bg11和缺氮的bg11液體培養(yǎng)基，將藻種接種至柱狀反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)，具體為150ml新鮮培養(yǎng)基加入50ml的藻液，每種培養(yǎng)基設(shè)有2個(gè)平行。培養(yǎng)溫度為24℃，光照強(qiáng)度為150μmolm-2s-1。用bg11培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞，在第4天進(jìn)行取樣，2個(gè)平行；用缺氮的bg11培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞，在第7天進(jìn)行取樣，2個(gè)平行。在取樣后均用4％戊二醛對(duì)樣品進(jìn)行固定，保存在4℃冰箱中，最后進(jìn)行透射電鏡成像。(3)透射電鏡方法：a)取材與前固定：取新鮮樣品，用戊二醛固定液固定1-4h，戊二醛固定液濃度為2.5％，ph為7.0；b)漂洗與后固定：用0.1mol/lpbs緩沖液漂洗3次，每次15min，然后用1％鋨酸固定液(0.1mol/lpbs緩沖液配制，ph7.0)在室溫下固定3-4h，再用緩沖液漂洗3次，每次15min；c)脫水：30％，50％，70％，80％，90％，100％乙醇各30min，100％乙醇：100％丙酮(1:3,1:1,3:1)各30min，100％丙酮兩次，每次30min；d)包埋劑的滲透與聚合：所用包埋劑為epon812環(huán)氧樹脂，脫水后的樣品再經(jīng)以下溶劑滲透：丙酮：包埋劑＝1:1滲透1h，丙酮：包埋劑＝1:3滲透1h，純包埋劑滲透24h或過(guò)夜，然后將滲透好的樣品轉(zhuǎn)入膠囊中進(jìn)行包埋，在60℃聚合器中聚合48h后便得到包埋塊；e)切片：用萊卡u7超薄切片機(jī)切片，切片厚度為70納米；f)雙染色：用醋酸鈾(2％)與檸檬酸鉛雙染色；以及g)電鏡觀察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：用bg11培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞的透射電鏡結(jié)果如圖14所示。從a、b、d和f可看出細(xì)胞形態(tài)為圓形或橢圓形。a顯示細(xì)胞的內(nèi)部的蛋白核、淀粉粒和細(xì)胞核；b顯示細(xì)胞內(nèi)淀粉粒數(shù)量明顯增多及由淀粉粒包裹的蛋白核；c顯示細(xì)胞內(nèi)詳細(xì)的蛋白核結(jié)構(gòu)，是由兩個(gè)半月形的結(jié)構(gòu)組成；d顯示細(xì)胞內(nèi)較多的淀粉粒和少量油滴；e為正在分裂的細(xì)胞，顯示細(xì)胞內(nèi)部的色素體(葉綠體)、淀粉粒及細(xì)胞核，淀粉粒鑲嵌在色素體中；f顯示細(xì)胞的群體形態(tài)。從圖14可以看出，索羅金小球藻gt-1細(xì)胞在bg11培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天后細(xì)胞內(nèi)淀粉粒的數(shù)量較多，有時(shí)可占滿整個(gè)細(xì)胞，淀粉粒一般鑲嵌在色素體內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)部一般有1個(gè)蛋白核，其是由兩個(gè)半月形的結(jié)構(gòu)組成。有的細(xì)胞內(nèi)有少量的油滴。對(duì)于新分裂的細(xì)胞，細(xì)胞核所占比例較大，色素體清晰可見，并且其中含有少量的淀粉粒。用缺氮的bg11培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞的透射電鏡結(jié)果如圖15所示。a顯示細(xì)胞為圓形，含有較多的油滴和淀粉粒；b顯示細(xì)胞內(nèi)部的蛋白核、淀粉粒和油滴；c顯示細(xì)胞內(nèi)含有大量的油滴和極少的淀粉粒；d顯示剛分裂的細(xì)胞內(nèi)同樣含有淀粉粒和較多的油滴。從圖15可以看出，索羅金小球藻gt-1細(xì)胞在缺氮的bg11培養(yǎng)基中培養(yǎng)6天后細(xì)胞內(nèi)部的油滴數(shù)量明顯增多，有的細(xì)胞內(nèi)部絕大部分都是油滴(如圖15的c)。細(xì)胞內(nèi)淀粉粒的數(shù)量有的細(xì)胞內(nèi)較多，有的細(xì)胞內(nèi)較少，但相比正常bg11培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞，淀粉粒數(shù)量總體在降低。另外，對(duì)于剛分裂的細(xì)胞內(nèi)同樣可觀察到較多的油滴(如d)。通過(guò)對(duì)索羅金小球藻gt-1細(xì)胞在bg11培養(yǎng)基和缺氮的bg11培養(yǎng)基培養(yǎng)后所獲得的透射電鏡結(jié)果對(duì)比分析可知，在bg11培養(yǎng)基中，細(xì)胞內(nèi)淀粉粒的數(shù)量相對(duì)較多，有的細(xì)胞內(nèi)含有少量的油滴；在缺氮的bg11培養(yǎng)基中，雖然有的細(xì)胞內(nèi)淀粉粒的數(shù)量仍較多，但細(xì)胞內(nèi)油滴的含量顯著增多，即使是在剛分裂的細(xì)胞內(nèi)也可看到明顯的油滴。上述實(shí)驗(yàn)及電鏡圖像，從細(xì)胞內(nèi)部的超微結(jié)構(gòu)證明了，本發(fā)明索羅金小球藻gt-1細(xì)胞在缺氮條件下培養(yǎng)后，其中的油脂大量積累。參考文獻(xiàn)：1.firoza,salehm,harunc.thirdgenerationbiofuelfromalgae.2015,procediaengineering,105:763-768.2.mayurm.phukana,rahuls.chutiab,bkkonwara,rkataki.microalgaechlorellaasapotentialbio-energyfeedstock.2011,appliedenergy88:3307-3312.3.izabelak,agatap,arturn,dianas,jacekw.alterationsofthelipidcontentandfattyacidprofileofchlorellaprotothecoidesunderdifferentlightintensities.2015,bioresourcetechnology,196:72-77.4.liangy,sarkanyn,cuiy.biomassandlipidproductivitiesofchlorellavulgarisunderautotrophic,heterotrophicandmixotrophicgrowthconditions.2009,biotechnol.lett.31:1043–1049.5.zhengy,chiz,luckerb,chens.two-stageheterotrophicandphototrophicculturestrategyforalgalbiomassandlipidproduction.2012,bioresour.technol.,103:484–488.6.liuj,huangj,sunz,zhongy,jiangy,chenf.differentiallipidandfattyacidprofilesofphotoautotrophicandheterotrophicchlorellazofingiensis:assessmentofalgaloilsforbiodieselproduction.2011,bioresour.technol.,102:106–110.7.tangd,hanw,lip,miaox,zhongj.co2biofixationandfattyacidcompositionofscenedesmusobliquusandchlorellapyrenoidosainresponsetodifferentco2levels.2011,bioresour.technol.102:3071–3076.8.tangh,chenm,ngky,salleyso.continuousmicroalgaecultivationinaphotobioreactor.2012,biotechnol.bioeng.109:2468–2474.9.mayurmp,rahulsc,bkkonwar,rkataki.microalgaechlorellaasapotentialbio-energyfeedstock.2011,appliedenergy,88:3307-3312.10.juntiladj,bautistama,monotillaw.biomassandlipidproductionofalocalisolatechlorellasorokinianaundermixotrophicgrowthconditions.2015,bioresour.technol.,http://dx.doi.org/10.1016/j.biortech.2015.03.098。11.張桂艷，溫小斌，梁芳，歐陽(yáng)崢嶸，耿亞紅，梅洪，李夜光。重要理化因子對(duì)小球藻生長(zhǎng)和油脂產(chǎn)量的影響?！渡鷳B(tài)學(xué)報(bào)》2011，31(8)：2076-2085。12.崔靜，劉建國(guó)。產(chǎn)油微藻的篩選評(píng)價(jià)與誘導(dǎo)油脂積累研究。2012，中國(guó)科學(xué)院研究生院(海洋研究所)，碩士畢業(yè)論文。13.黃寶璽，王大為，王金鳳。多不飽和脂肪酸的研究進(jìn)展?！掇r(nóng)產(chǎn)品加工業(yè)》2009，8：26-30。14.王萍，張銀波，江木蘭。多不飽和脂肪酸的研究進(jìn)展?！吨袊?guó)油脂》2008，12：42-46。15.孫翔宇，高貴田，段愛(ài)莉，顧浩峰，李冰，薛騫。多不飽和脂肪酸的研究進(jìn)展?！妒称饭I(yè)科技》2012，7：418-423。當(dāng)前第1頁(yè)12