本發(fā)明是涉及一種無(wú)脊椎動(dòng)物淋巴細(xì)胞及其純化方法，特別是涉及一種蝦淋巴細(xì)胞及其純化方法與利用蝦淋巴細(xì)胞于體外評(píng)估先天免疫反應(yīng)的方法。

背景技術(shù)：

蝦類(lèi)屬于無(wú)脊椎動(dòng)物，而無(wú)脊椎動(dòng)物的免疫系統(tǒng)一般是運(yùn)用體液凝固機(jī)制(coagulation)，也就是以體液凝集成團(tuán)塊，形成物理屏障，作為其防御病原入侵的第一道防線，防止微生物病原體進(jìn)入到體內(nèi)。

由于蝦僅具有先天性免疫力(innate immunity)，并不具備脊椎動(dòng)物對(duì)病原發(fā)展出的適應(yīng)性免疫力(adaptive immunity)，無(wú)法產(chǎn)生針對(duì)特定病原感染后誘發(fā)的特異性記憶性免疫細(xì)胞，因此無(wú)法發(fā)展出蝦的疫苗。

對(duì)于增加蝦抗病力最有效的策略，就是開(kāi)發(fā)具有促進(jìn)蝦先天性免疫力的免疫調(diào)節(jié)劑。然而，至今尚未建立能維持較長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)的蝦細(xì)胞株。

有鑒于此，亟需開(kāi)發(fā)一種蝦淋巴細(xì)胞初代細(xì)胞，以提供體外(in vitro)篩選平臺(tái)所需。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一方面是提供一種蝦淋巴細(xì)胞的純化方法，其利用含有葡萄糖胺以及低濃度的鈉離子的抗凝集劑對(duì)蝦體液樣本進(jìn)行前處理后，再利用含有低濃度的鈉離子的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)步驟，可獲得細(xì)胞存活率、細(xì)胞產(chǎn)量及細(xì)胞純度皆較高的蝦淋巴細(xì)胞。

本發(fā)明的另一方面提供一種蝦淋巴細(xì)胞的抗凝集劑，其包含葡萄糖胺以及低濃度的鈉離子，藉此抑制蝦淋巴細(xì)胞的細(xì)胞凝集率并提高其體外細(xì)胞存活率。

本發(fā)明的又一方面提供一種蝦淋巴細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)液，包含L-15培養(yǎng) 液、胎牛血清以及低濃度的鈉離子，由此提高蝦淋巴細(xì)胞的細(xì)胞存活率及體外培養(yǎng)的時(shí)間。

本發(fā)明的又另一方面提供一種體外評(píng)估蝦類(lèi)先天免疫反應(yīng)的方法，其包含利用上述方法獲得的蝦淋巴細(xì)胞與待測(cè)樣本共同培養(yǎng)，以評(píng)估待測(cè)樣本是否具有刺激蝦類(lèi)先天免疫反應(yīng)的活性。

根據(jù)本發(fā)明的上述方面，提出一種蝦淋巴細(xì)胞的純化方法。在一實(shí)施例中，首先提供蝦體液樣本，其中蝦體液樣本是源自于白蝦(Litopenaeus vannamei)。接著，進(jìn)行前處理，使蝦體液樣本與抗凝集劑均勻混合，以形成單細(xì)胞懸浮液，其中抗凝集劑可包含例如低于10.0g/L的氯化鈉、5.5g/L的檸檬酸、8.0至10.0g/L的檸檬酸鈉、19.8至20.0g/L的葡萄糖以及21.563g/L的葡萄糖胺，且抗凝集劑具有pH 7.0的酸堿值。然后，進(jìn)行離心步驟，以去除單細(xì)胞懸浮液的上清液并獲得細(xì)胞沉淀物(cell pellet)。之后，進(jìn)行培養(yǎng)步驟，使細(xì)胞沉淀物均勻懸浮并培養(yǎng)于細(xì)胞培養(yǎng)液中，以獲得蝦淋巴細(xì)胞，其中細(xì)胞培養(yǎng)液可包含例如2倍濃度(2X)的L-15培養(yǎng)液、5g/L的氯化鈉、10g/L的葡萄糖、15％(v/v)的胎牛血清且具有pH 7.0的酸堿值。

根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提出一種蝦淋巴細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)液，其中抗凝集劑可包含例如低于10.0g/L的氯化鈉、5.5g/L的檸檬酸、8.0至10.0g/L的檸檬酸鈉、19.8至20.0g/L的葡萄糖以及21.563g/L的葡萄糖胺，且抗凝集劑具有pH 7.0的酸堿值。

依據(jù)本發(fā)明一實(shí)施例，上述抗凝集劑還可包含2.5g/L的乙二胺四乙酸。

根據(jù)本發(fā)明的又另一方面，提出一種種體外評(píng)估蝦類(lèi)先天免疫反應(yīng)的方法。在一實(shí)施例中，首先進(jìn)行共同培養(yǎng)步驟，將上述方法獲得的蝦淋巴細(xì)胞，培養(yǎng)于上述細(xì)胞培養(yǎng)液中30分鐘至72小時(shí)，其中細(xì)胞培養(yǎng)液包含或不包含待測(cè)樣本。接著，檢測(cè)蝦淋巴細(xì)胞的細(xì)胞存活率，其中未與待測(cè)樣本培養(yǎng)的蝦淋巴細(xì)胞的細(xì)胞存活率為參考值，而與待測(cè)樣本培養(yǎng)的蝦淋巴細(xì)胞的細(xì)胞存活率為測(cè)量值。然后，進(jìn)行判斷步驟，若測(cè)量值高于參考值，則判斷待測(cè)樣本具有刺激蝦類(lèi)先天免疫反應(yīng)的活性。

依據(jù)本發(fā)明一實(shí)施例，在上述共同培養(yǎng)步驟之前，還可選擇性進(jìn)行前培養(yǎng)步驟，使蝦淋巴細(xì)胞培養(yǎng)于不含待測(cè)樣本的細(xì)胞培養(yǎng)液中至少24小時(shí)。

應(yīng)用本發(fā)明的蝦淋巴細(xì)胞的純化方法，其利用含有葡萄糖胺以及低濃度 的鈉離子的抗凝集劑對(duì)蝦體液樣本進(jìn)行前處理后，再利用含有低濃度的鈉離子的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)步驟，可有效提高蝦淋巴細(xì)胞的細(xì)胞存活率，提升細(xì)胞產(chǎn)量及細(xì)胞純度。所得的蝦淋巴細(xì)胞可作為體外篩選平臺(tái)，評(píng)估待測(cè)樣本的先天免疫刺激活性。

附圖說(shuō)明

為了使本發(fā)明的上述和其他目的、特征、優(yōu)點(diǎn)與實(shí)施例能更明顯易懂，提供附圖，在附圖中：

圖1繪示根據(jù)本發(fā)明一實(shí)施例的蝦體采集點(diǎn)的示意圖。

圖2繪示根據(jù)本發(fā)明一實(shí)施例以特定角度抽取蝦體液的示意圖。

圖3示出根據(jù)本發(fā)明一實(shí)施例的蝦淋巴細(xì)胞的流式細(xì)胞儀的二維散點(diǎn)圖。

圖4示出根據(jù)本發(fā)明制備例1至5及制備比較例1的抗凝集劑處理蝦淋巴細(xì)胞后的細(xì)胞存活率。

圖5示出根據(jù)本發(fā)明制備例1至5及制備比較例2的抗凝集劑處理蝦淋巴細(xì)胞后的細(xì)胞存活率。

圖6A與圖6B分別示出蝦淋巴細(xì)胞經(jīng)制備比較例3(圖6A)與制備例7(圖6B)的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)120分鐘的光學(xué)顯微鏡照片。

具體實(shí)施方式

承前所述，本發(fā)明提供一種蝦淋巴細(xì)胞的純化方法，其利用含有葡萄糖胺以及低濃度的鈉離子的抗凝集劑對(duì)蝦體液樣本進(jìn)行前處理后，再利用含有低濃度的鈉離子的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)步驟，可獲得較高細(xì)胞存活率、較高細(xì)胞產(chǎn)量及較高細(xì)胞純度的蝦淋巴細(xì)胞。

廣義上，本發(fā)明此處所稱(chēng)的「蝦淋巴細(xì)胞」，可例如由白蝦(Litopenaeus vannamei)體內(nèi)純化的初代培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞，但本發(fā)明適用的蝦科種類(lèi)不限于此處所舉。一般而言，本發(fā)明的蝦淋巴細(xì)胞可包含較高細(xì)胞純度的三群細(xì)胞，分別為顆粒球(granular cells)、半顆粒球(semigranular cells)以及透明球(hyaline cells)，其中顆粒球(granular cells)的比例可分別例如為36％、9％及55％，但上述三群蝦淋巴細(xì)胞的各細(xì)胞比例并不局限上述所舉， 三群體液細(xì)胞的任一群的比例可以更多或更少，視所使用的蝦科種類(lèi)而定。

除了蝦科種類(lèi)會(huì)影響所得的蝦淋巴細(xì)胞之外，不同的采集點(diǎn)也會(huì)影響取得的細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞純度。本發(fā)明由特定的采集點(diǎn)，可取得較多細(xì)胞及較高細(xì)胞純度的蝦淋巴細(xì)胞。同時(shí)參閱圖1與圖2，其中圖1繪示根據(jù)本發(fā)明一實(shí)施例的蝦體采集點(diǎn)的示意圖，圖2繪示根據(jù)本發(fā)明一實(shí)施例以特定角度抽取蝦體液的示意圖。

在圖1中，從采集點(diǎn)103的采集方法，可先將蝦體的胸節(jié)與第一對(duì)腹節(jié)撐開(kāi)，以暴露出蝦頭胸甲與蝦身連接處101。然后，如圖2所示，把蝦子頭部朝下，將針頭(圖未繪示)對(duì)準(zhǔn)連接處101的采集點(diǎn)103，以圖2的小于45度角(如θ)下針，其中夾角θ是定義為蝦體201的腹部表面203與針體205的夾角。針頭前端插入0.3cm至約0.5cm的深度后，緩慢抽出蝦體液(呈透明或些許藍(lán)色)。根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施例，由采集點(diǎn)103可取得約0.4mL的體液。根據(jù)本發(fā)明其他實(shí)施例，由采集點(diǎn)105則僅取得約0.2mL的體液。

另外一項(xiàng)影響因素則在于蝦體液成分具有凝塊因子及蝦循環(huán)血中的酚氧化酶活化系統(tǒng)(prophenoloxidase activating system)，其去顆粒化作用會(huì)引起蝦體液的凝集活性，凝集作用會(huì)造成細(xì)胞聚集成團(tuán)，進(jìn)而造成細(xì)胞于試管內(nèi)快速死亡。過(guò)去在活體內(nèi)(in vivo)研究發(fā)現(xiàn)，蝦體液成分的轉(zhuǎn)氨酶(transglutaminase；TGase)活性，會(huì)誘發(fā)血漿凝固蛋白(plasma clotting protein；CP)產(chǎn)生凝固機(jī)制。轉(zhuǎn)氨酶在作用時(shí)需要有輔因子(例如鈣離子)的存在。倘若蝦的轉(zhuǎn)氨酶基因具有缺失，則其淋巴內(nèi)的細(xì)菌數(shù)相對(duì)會(huì)較高。此外，一些研究結(jié)果也顯示，用于分離哺乳動(dòng)物細(xì)胞的蛋白質(zhì)分解酶(例如胰蛋白酶)，可增加由蝦組織分離出的細(xì)胞產(chǎn)率(yield rate)。

本發(fā)明此處所稱(chēng)的「抗凝集劑」是指包含葡萄糖胺以及低濃度的鈉離子者。在一實(shí)施例中，前述抗凝集劑可包含例如低于10.0g/L的氯化鈉、5.5g/L的檸檬酸、8.0至10.0g/L的檸檬酸鈉、19.8至20.0g/L的葡萄糖以及21.563g/L的葡萄糖胺，且抗凝集劑具有pH 7.0的酸堿值。在一例示中，前述抗凝集劑可包含8.2g/L的氯化鈉、5.5g/L的檸檬酸、8.8g/L的檸檬酸鈉、19.8g/L的葡萄糖以及21.563g/L的葡萄糖胺，且抗凝集劑具有pH 7.0的酸堿值。在另一例示中，前述抗凝集劑還可選擇性包含乙二胺四乙酸，以進(jìn)一步提升蝦淋巴細(xì)胞的細(xì)胞存活率，其中乙二胺四乙酸的濃度可例如為2.5g/L。

在一些實(shí)施例中，經(jīng)上述抗凝集劑處理的蝦淋巴細(xì)胞經(jīng)30分鐘培養(yǎng)后的細(xì)胞存活率可例如為至少90％。在其他實(shí)施例中，經(jīng)上述抗凝集劑處理的蝦淋巴細(xì)胞經(jīng)60分鐘培養(yǎng)后的細(xì)胞存活率可例如為至少85％。在另一些實(shí)施例中，經(jīng)上述抗凝集劑處理的蝦淋巴細(xì)胞經(jīng)120分鐘培養(yǎng)后的細(xì)胞存活率可例如為至少73％。

本發(fā)明此處所稱(chēng)的「細(xì)胞培養(yǎng)液」是指包含L-15培養(yǎng)液、胎牛血清以及低濃度的鈉離子者。在一實(shí)施例中，前述細(xì)胞培養(yǎng)液可包含例如2倍濃度(2X)的L-15培養(yǎng)液、低于10.0g/L的氯化鈉、10g/L的葡萄糖以及15％(v/v)的胎牛血清，且細(xì)胞培養(yǎng)液具有pH 7.0的酸堿值。在一例示中，前述細(xì)胞培養(yǎng)液的氯化鈉的濃度可例如5g/L。在另一例示中，前述細(xì)胞培養(yǎng)液還可包含抗生素，其中抗生素可包含例如鏈霉素(streptomycin)、青霉素(penicillin)以及兩性霉素(amphotericin)。在前述例示中，前述細(xì)胞培養(yǎng)液可選擇性包含100μg/mL的鏈霉素、100I.U./mL的青霉素以及0.25mg/mL的兩性霉素。

在一些實(shí)施例中，前述獲得的蝦淋巴細(xì)胞經(jīng)上述細(xì)胞培養(yǎng)液24小時(shí)培養(yǎng)后，其細(xì)胞存活率可例如為至少90％。

上述方法可獲得細(xì)胞存活率、細(xì)胞產(chǎn)量及細(xì)胞純度皆較高的蝦淋巴細(xì)胞，可進(jìn)一步應(yīng)用于體外評(píng)估蝦類(lèi)先天免疫反應(yīng)。在一實(shí)施例中，前述所稱(chēng)的「體外評(píng)估蝦類(lèi)先天免疫反應(yīng)」，其方法包括進(jìn)行共同培養(yǎng)步驟，將上述所得的蝦淋巴細(xì)胞，培養(yǎng)于上述細(xì)胞培養(yǎng)液中30分鐘至72小時(shí)，其中細(xì)胞培養(yǎng)液包含或不包含待測(cè)樣本。接著，檢測(cè)蝦淋巴細(xì)胞的細(xì)胞存活率，其中未與待測(cè)樣本培養(yǎng)的蝦淋巴細(xì)胞的細(xì)胞存活率為參考值，而與待測(cè)樣本培養(yǎng)的蝦淋巴細(xì)胞的細(xì)胞存活率為測(cè)量值。然后，進(jìn)行判斷步驟，若前述測(cè)量值高于參考值，則判斷前述待測(cè)樣本具有刺激蝦類(lèi)先天免疫反應(yīng)的活性。

在其他實(shí)施例中，前述共同培養(yǎng)步驟之前，還可選擇性進(jìn)行前培養(yǎng)步驟，使蝦淋巴細(xì)胞培養(yǎng)于不含待測(cè)樣本的細(xì)胞培養(yǎng)液中至少24小時(shí)。

以下利用數(shù)個(gè)實(shí)施例以說(shuō)明本發(fā)明的應(yīng)用，然其并非用以限定本發(fā)明，本發(fā)明技術(shù)領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，可作各種的修改與改變。

實(shí)施例1：純化蝦淋巴細(xì)胞

1.制備例1至6與制備比較例1至2

制備例1至6與制備比較例1至2是根據(jù)表1配制抗凝集劑，其中制備比較例1至2為已知配方的抗凝集劑，制備例1至6為根據(jù)本發(fā)明數(shù)個(gè)實(shí)施例的抗凝集劑。上述成分溶解于無(wú)菌水中，并以1N的氫氧化鈉水溶液調(diào)整pH至7.0后，利用孔徑大小為0.22μm的濾膜過(guò)濾去除細(xì)菌，置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

表1

2.制備例7與制備比較例3

制備例7與制備比較例3是根據(jù)表2配制細(xì)胞培養(yǎng)液，其中制備比較例3為已知配方的培養(yǎng)液，制備例7為根據(jù)本發(fā)明一實(shí)施例的細(xì)胞培養(yǎng)液。上述成分溶解于無(wú)菌水中，并以1N的氫氧化鈉水溶液調(diào)整pH至7.0后，利用孔徑大小為0.22μm的濾膜過(guò)濾去除細(xì)菌，置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

表2

制備例7與制備比較例3的細(xì)胞培養(yǎng)液的配方如表2所示。在配制時(shí)，可先將葡萄糖加入800mL的滅菌水并完全溶解后，再加入氯化鈉以及2包Leibovitz’s L-15粉末〔相當(dāng)于2倍濃度(2X)的L-15〕。上述成分完全溶解后，以無(wú)菌水調(diào)整總體積至840mL，以1N HCl調(diào)整pH值至7.0，再加入10mL(1％,v/v)的抗生素，最后再加入150mL(15％,v/v)胎牛血清(fetal bovine serum；FBS)，并無(wú)菌水調(diào)整總體積至1000mL。配制完成后的細(xì)胞培養(yǎng)液使用孔徑大小0.22μm的濾膜過(guò)濾去除細(xì)菌，置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

上述制備例7與制備比較例3的細(xì)胞培養(yǎng)液包含100μg/mL的鏈霉素(streptomycin)、100I.U./mL的青霉素(penicillin)以及0.25mg/mL的兩性霉素(amphotericin)(CORNING)。

3.分離蝦淋巴細(xì)胞

取10只白蝦(Litopenaeus vannamei)，依據(jù)不同采集點(diǎn)，取得蝦體液細(xì)胞。

在分離蝦淋巴細(xì)胞時(shí)，首先，準(zhǔn)備至少二個(gè)打氣泵，以及新鮮海水，隨時(shí)確保蝦子存活。同時(shí)，以不同針筒吸取0.4mL的制備例1至6以及制備比較例1至2的抗凝集劑至個(gè)別針筒(針筒總?cè)莘e為1mL)，置于冰上。

將白蝦移到操作臺(tái)后，靜置1小時(shí)使蝦子穩(wěn)定，隨時(shí)注意打氣情況以及蝦子狀態(tài)，并適時(shí)添加新鮮海水。接著，適當(dāng)固定蝦子后，露出蝦腹部，如圖1所示，分別由如圖號(hào)103、105所示二個(gè)采集點(diǎn)，采集上述蝦體的體液。

同時(shí)參閱圖1與圖2。在圖1中，從采集點(diǎn)103的采集方法，可先將蝦體的胸節(jié)與第一對(duì)腹節(jié)撐開(kāi)，以暴露出蝦頭胸甲與蝦身連接處101。然后，如圖2所示，把蝦子頭部朝下，將針頭〔例如26G x 1/2”(0.45x 13mm)〕(圖未繪示)對(duì)準(zhǔn)連接處101的采集點(diǎn)103，以圖2的小于45度角(如夾角θ)下針，其中夾角θ是定義為蝦身表面延伸線203與針體205的夾角。針頭前端插入0.3cm至約0.5cm的深度后，緩慢抽出蝦體液(呈透明或些許藍(lán)色)。由采集點(diǎn)103可取得約0.4mL的體液。

至于由采集點(diǎn)105的采集方法與上述采集點(diǎn)103的采集方法相同，不同處在于將針頭對(duì)準(zhǔn)連接處101的采集點(diǎn)105，以如圖2小于45度角(如圖號(hào)θ)下針。由采集點(diǎn)105僅能取得約0.2mL的體液。

上述取得的蝦體液，隨即與針筒里的抗凝集劑以1:1的體積比例，均勻混合成混合液。然后，取10μL的混合液，加上90μL的0.5％錐蟲(chóng)藍(lán)(Trypan blue)溶液(Biological Industries)，計(jì)算細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞存活率。上述取得的淋巴細(xì)胞，其平均細(xì)胞數(shù)為1×10⁷細(xì)胞/蝦。之后，隨即利用市售的流式細(xì)胞儀分析其細(xì)胞亞群，其結(jié)果如圖3所示。

參閱圖3，其示出根據(jù)本發(fā)明一實(shí)施例的蝦淋巴細(xì)胞的流式細(xì)胞儀(FACScan flow cytometer)的(FSC/SSC)二維散點(diǎn)圖，其中橫軸代表側(cè)向散射光(forward scatter；FSC)信號(hào)強(qiáng)度(x1,000)，縱軸為側(cè)向散射光(side scatter；SSC)信號(hào)強(qiáng)度(x1,000)。

由圖3的結(jié)果可知，實(shí)施例1取得的蝦體液細(xì)胞含有三群高純度的淋巴細(xì)胞，分別為36％顆粒球(granular cells；G)、9％半顆粒球(semigranular cells；SG)以及55％透明球(hyaline cells；H)。

實(shí)施例2：評(píng)估抗凝集劑對(duì)蝦淋巴細(xì)胞的抗凝集效果

1.評(píng)估抗凝集劑的葡萄糖胺或/及胰蛋白酶對(duì)蝦淋巴細(xì)胞的抗凝集效果

此實(shí)施例以18只白蝦，利用制備例1至5及制備比較例1的抗凝集劑配方，評(píng)估含或不含葡萄糖胺或/及胰蛋白酶對(duì)于蝦淋巴細(xì)胞抗凝集及細(xì)胞存活率的影響。

將由采集點(diǎn)B(如圖1的圖號(hào)103所示)取得的蝦體液細(xì)胞，快速與針筒里的制備例1至5及制備比較例1的抗凝集劑，以1:1的體積比例混合均勻成混合液后，取10μL的混合液，加上90μL的0.5％錐蟲(chóng)藍(lán)溶液，每隔10分鐘計(jì)算細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞存活率，其結(jié)果如下表3以及圖4。

表3

參閱表3及圖4，其分別示出根據(jù)本發(fā)明制備例1至5及制備比較例1的抗 凝集劑處理蝦淋巴細(xì)胞后的細(xì)胞數(shù)(表3)與細(xì)胞存活率(圖4)。圖4的曲線403、曲線405、曲線407、曲線409、曲線411分別代表經(jīng)制備例1至5的抗凝集劑處理后的蝦淋巴細(xì)胞數(shù)，而曲線401則代表經(jīng)制備比較例1的抗凝集劑處理后的蝦淋巴細(xì)胞數(shù)。

由表3及圖4結(jié)果可知，相較于制備比較例1的已知抗凝集劑(曲線401)，經(jīng)制備例1至5的抗凝集劑處理后，其細(xì)胞存活率較高，如圖4的曲線403、曲線405、曲線407、曲線409、曲線411所示。

其次，經(jīng)制備例2的抗凝集劑處理后，經(jīng)培養(yǎng)0至60分鐘后，可以獲得9.38x10⁶細(xì)胞/蝦的平均淋巴細(xì)胞數(shù)，更優(yōu)于制備例1、3至5的效果，如表3所示。再者，經(jīng)制備例2的抗凝集劑處理后，亦可維持較長(zhǎng)時(shí)間的細(xì)胞存活率，在培養(yǎng)20分鐘后的細(xì)胞存活率達(dá)90％，于培養(yǎng)60分鐘后的細(xì)胞存活率達(dá)70％，更優(yōu)于制備例1、3至5的效果，如圖4的曲線405所示。

2.評(píng)估抗凝集劑的葡萄糖胺和/或乙二胺四乙酸對(duì)蝦淋巴細(xì)胞的抗凝集效果

此實(shí)施例以9只白蝦，利用制備例2、6以及制備比較例2的抗凝集劑配方，評(píng)估含或不含葡萄糖胺或/及乙二胺四乙酸(EDTA)對(duì)于蝦淋巴細(xì)胞的抗凝集與細(xì)胞存活率的影響。

將由采集點(diǎn)B(如圖1的圖號(hào)103所示)取得的蝦體液細(xì)胞，快速與針筒里的制備例2、6以及制備比較例2的抗凝集劑，以1:1的體積比例混合均勻成混合液后，取10μL的混合液，加上90μL的0.5％錐蟲(chóng)藍(lán)溶液，每隔10分鐘計(jì)算細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞存活率，其結(jié)果如圖5。

參閱圖5，其示出根據(jù)本發(fā)明制備例1至5及制備比較例2的抗凝集劑處理蝦淋巴細(xì)胞后的細(xì)胞存活率。圖5的曲線501以及曲線503分別代表經(jīng)制備例2及6的抗凝集劑處理后的蝦淋巴細(xì)胞數(shù)，而曲線505則代表經(jīng)制備比較例2的抗凝集劑處理后的蝦淋巴細(xì)胞數(shù)。其中制備例6的抗凝集劑是于制備例2的抗凝集劑中再添加EDTA。

由圖5結(jié)果可知，相較于制備比較例2的已知抗凝集劑，經(jīng)制備例2及6的抗凝集劑處理后，細(xì)胞存活率較高，如曲線503及曲線501所示。其次，經(jīng)制備例6的抗凝集劑處理后的細(xì)胞存活率(曲線501)，又優(yōu)于制備例2的抗凝集劑的效果(曲線503)，其中經(jīng)制備例6的抗凝集劑處理后，經(jīng)培養(yǎng)30分鐘后的 細(xì)胞存活率達(dá)90％，經(jīng)培養(yǎng)60分鐘后的細(xì)胞存活率達(dá)85％，經(jīng)培養(yǎng)120分鐘后的細(xì)胞存活率達(dá)73％。因此，制備例6的抗凝集劑的效果更佳，且可維持細(xì)胞更長(zhǎng)時(shí)間且更高的存活率。

實(shí)施例3：評(píng)估細(xì)胞培養(yǎng)液對(duì)初代培養(yǎng)的蝦淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)效果

此實(shí)施例以20只白蝦，依據(jù)實(shí)施例1的方法，取得蝦淋巴細(xì)胞，并分別于離開(kāi)活體之后10分鐘內(nèi)，立即分別置入兩管內(nèi)含20mL制備例7與制備比較例3的細(xì)胞培養(yǎng)液中，并使細(xì)胞均勻分散。

依據(jù)上述方法計(jì)數(shù)細(xì)胞后，以1×10⁶細(xì)胞/mL的細(xì)胞濃度，取10mL種入10cm皿中，緩慢搖晃至均勻后，放置于室溫25℃下待其貼附。之后，經(jīng)培養(yǎng)24小時(shí)、36小時(shí)以及72小時(shí)后，其結(jié)果如圖6A及圖6B所示。

參閱圖6A及圖6B，其分別示出蝦淋巴細(xì)胞經(jīng)制備比較例3(圖6A)與制備例7(圖6B)的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)120分鐘的光學(xué)顯微鏡照片。由圖6A及圖6B的結(jié)果可知，以制備例7的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)的蝦淋巴細(xì)胞，于24小時(shí)的細(xì)胞存活率仍高達(dá)90％，如圖6B所示。相較的下，以制備比較例3的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)的蝦淋巴細(xì)胞，培養(yǎng)效果較不理想，于24小時(shí)全數(shù)死亡，如圖6A所示。

綜言之，由上述數(shù)個(gè)實(shí)施例證實(shí)，本發(fā)明的蝦淋巴細(xì)胞的純化方法，成功由特定的采集點(diǎn)，利用含有葡萄糖胺以及低濃度的鈉離子的抗凝集劑對(duì)蝦體液樣本進(jìn)行前處理后，再利用含有低濃度的鈉離子的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)步驟，可有效提高蝦淋巴細(xì)胞的細(xì)胞存活率，提升細(xì)胞產(chǎn)量及細(xì)胞純度。所得的蝦淋巴細(xì)胞可進(jìn)一步作為體外篩選平臺(tái)，評(píng)估待測(cè)樣本的先天免疫刺激活性。

舉例而言，上述蝦淋巴細(xì)胞在作為體外篩選平臺(tái)時(shí)，可先進(jìn)行共同培養(yǎng)步驟，將上述獲得的蝦淋巴細(xì)胞，培養(yǎng)于上述細(xì)胞培養(yǎng)液中30分鐘至72小時(shí)，其中細(xì)胞培養(yǎng)液包含或不包含待測(cè)樣本。接著，檢測(cè)蝦淋巴細(xì)胞的細(xì)胞存活率，其中未與待測(cè)樣本培養(yǎng)的蝦淋巴細(xì)胞的細(xì)胞存活率為參考值，而與待測(cè)樣本培養(yǎng)的蝦淋巴細(xì)胞的細(xì)胞存活率為測(cè)量值。然后，進(jìn)行判斷步驟，若測(cè)量值高于參考值，則判斷待測(cè)樣本具有刺激蝦類(lèi)先天免疫反應(yīng)的活性。在其他實(shí)施例，在共同培養(yǎng)步驟之前，還可選擇性進(jìn)行前培養(yǎng)步驟，使蝦淋巴細(xì)胞培養(yǎng)于不含待測(cè)樣本的細(xì)胞培養(yǎng)液中至少24小時(shí)。

需補(bǔ)充的是，本發(fā)明雖以特定的制程、特定配方的試劑、特定的分析方法或特定儀器作為例示，說(shuō)明本發(fā)明的蝦淋巴細(xì)胞及其純化方法與用于體外評(píng)估先天免疫反應(yīng)的方法，但本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域中任何具有通常知識(shí)者可知，本發(fā)明并不限于此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，本發(fā)明的蝦淋巴細(xì)胞及其純化方法與用于體外評(píng)估先天免疫反應(yīng)的方法亦可使用其他制程、其他配方的試劑、其他的分析方法或其他儀器進(jìn)行。

由上述實(shí)施例可知，本發(fā)明的蝦淋巴細(xì)胞及其純化方法與用于體外評(píng)估先天免疫反應(yīng)的方法，其優(yōu)點(diǎn)在于使用豬鏈球菌的溶血素重組蛋白(rSly)作為生物型佐劑，可結(jié)合其他動(dòng)物疾病的抗原制得動(dòng)物用疫苗組成物，以誘發(fā)至少一種受免疫動(dòng)物的體內(nèi)產(chǎn)生抗體，同時(shí)刺激細(xì)胞性及體液性免疫反應(yīng)，以保護(hù)受免疫動(dòng)物免于病原菌感染。

雖然本發(fā)明已以數(shù)個(gè)實(shí)施例揭露如上，然其并非用以限定本發(fā)明，在本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域中任何具有通常知識(shí)者，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，可作各種修改與改變，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍當(dāng)視后附的權(quán)利要求書(shū)所界定者為準(zhǔn)。