本發(fā)明涉及高效的不依賴(lài)鋅離子的磷脂酶C突變體，具體地涉及通過(guò)分子生物學(xué)中的突變篩選方法獲得的磷脂酰膽堿特異性磷脂酶C突變體及其用途。

背景技術(shù)：

脫膠是油脂精煉的一個(gè)重要步驟，而傳統(tǒng)的水化脫膠法經(jīng)濟(jì)成本高，物料能耗大，環(huán)境污染重，所以近些年，很多努力致力于將酶法脫膠用于油脂精煉中的脫膠環(huán)節(jié)，并取得了很大的進(jìn)展。同傳統(tǒng)方法相比,酶法脫膠能夠提高經(jīng)濟(jì)效益，做到節(jié)能減排，對(duì)生態(tài)環(huán)境污染少，在環(huán)保、經(jīng)濟(jì)、質(zhì)量等方面具有較大的優(yōu)勢(shì)。油脂脫膠所用的酶即為磷脂酶。磷脂酶具備水解一個(gè)或多個(gè)甘油磷脂酯鍵的能力，它代表著一類(lèi)脂肪酶、?；饷负土姿狨ッ浮Ａ字父鶕?jù)該酶在磷脂分子上作用位點(diǎn)的不同，可以分為磷脂酶A1(PLA1)、磷脂酶A2(PLA2)、磷脂酶C(PLC)和磷脂酶D(PLD)。

磷脂酶C(Phospholipase C，簡(jiǎn)稱(chēng)PLC)，是一種能夠水解甘油磷脂C3位點(diǎn)磷脂酰鍵生成甘油二酯和磷酸膽堿、磷酸肌醇、磷酸乙醇胺等的脂類(lèi)水解酶。磷脂酶C廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中，動(dòng)植物來(lái)源PLC一般位于細(xì)胞膜上，結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，屬于內(nèi)源性磷脂酶C，難以分離。同其他脫膠酶相比，磷脂酶C(PLC)表現(xiàn)出更大的優(yōu)勢(shì)，比如，增加甘二酯(DAG)的得率，以及減少得油量的損失。

微生物來(lái)源的磷脂酶C結(jié)構(gòu)一般較為簡(jiǎn)單，這些酶已經(jīng)從各種微生物中分離得到，細(xì)菌來(lái)源的較多包括產(chǎn)氣莢膜梭菌Clostridium perfringens〔Yun T,Siebel C.Cloning and expression of the PLC gene from Clostridium perfringens and Clostridium bifermentants[J].Infection and immunity,1989,2:468-476〕、雙酶梭菌C.bifermentans、Burkholderia pseudomallei、Bacillus cereus、蕈狀芽孢桿菌Bacillus mycoiddes、蘇云金芽孢桿菌Bacillus thuringiensis、單核細(xì)胞增多 性李斯特氏菌Listeria monocytogenes、銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa、熒光假單胞菌P.fluorescens、葡萄球菌Straphylococus aureus、鮑氏不動(dòng)桿菌Acinetobacter baumannii、鏈霉菌Streptomyces clavuligerus、伯克氏菌屬Burkholderi等等。來(lái)自放線菌的有八丈島鏈霉菌Streptomyces hachijyoensis等。還有來(lái)自酵母菌的白色念珠菌Candia albicans〔Analuz E,Juan-Jose R,Rosario Cueva.Sequencing of a 4.3kbp region of chromosome 2 of Candida albicans reveals the presence of homologues of SHE9from Saccharomyces cerevisiae and of bacterial phosphatidylinostiol-phospholipase C[J].Yeast,2001,18(8):711-721〕、釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae〔Payne W,Fitzgerald-Hayes M.A mutation in PLC1,a candidate phosphoinositide specific phospholipase C gene from Saccharomyces cerevisiae,causes aberrant mitotic chromosome segregation[J].Molecular and Cellular Biology,1993,13:4351-4364〕等。

Bacillus cereus的PC-PLC(BC-PC-PLC)，是研究較早的一種磷脂酶C。BC-PC-PLC全長(zhǎng)為283個(gè)氨基酸，其中包含24個(gè)氨基酸的信號(hào)肽和14個(gè)氨基酸的前導(dǎo)肽，成熟肽為245個(gè)氨基酸(Johansen,T.、Holm,T.、Guddal,P.H.、Sletten,K.、Haugli,F.B.、Little,C，1988，"Cloning and sequencing of the gene encoding the phosphatidylcholine-preferring phospholipase C of Bacillus cereus"，Gene 65(2)：293-304)。BC-PC-PLC的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)被報(bào)道，其由多個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)域組成，催化位點(diǎn)為55位天冬氨酸，并且含有至少三個(gè)Zn²⁺結(jié)合位點(diǎn)(Hough.,E.、Hansen,L.K.、Birknes,B.、Jynge,K.、Hansen,S.、Hordvik,A.、Little,C.、Dodson,E.、Derewenda,Z.，1989，"High-resolution(1.5A)crystal structure of phospholipase C from Bacillus cereus"，Nature，338:357-60)。BC-PC-PLC的異源表達(dá)研究較少目前只在Bacillus subtilis和pichia pastoris中進(jìn)行表達(dá)(Durban,M.A.、Silbersack,J.、Schweder,T.、Schauer,F.、Bornscheuer,U.T.，2007，High level expression of a recombinant phospholipase C from Bacillus cereus in Bacillus subtilis，Appl Microbiol Biotechnol 74(3):634-639；Seo,K.H、Rhee J.I.，2004，High-level expression of recombinant phospholipase C from Bacillus cereus in Pichia pastoris and its characterization，Biotechnol Lett 26(19):1475-1479)。

目前，磷脂酶C主要應(yīng)用于酶法脫膠。在制造大豆、菜籽等食用油時(shí)，未經(jīng)精煉的毛油主要含有甘油三酯、磷脂、甾醇、生育酚、游離脂肪酸、痕量金屬以及其它微量化合物的復(fù)雜混合物。其中磷脂會(huì)造成色澤及口味變差、保質(zhì)期變短并且影響后續(xù)的精煉效果。目前，主要的脫膠方式有水化脫膠、深度脫膠和酶法脫膠。酶法脫膠由于條件溫和、無(wú)污染、油耗低，越來(lái)越受到人們的青睞。

由于磷脂酶C作用于甘油磷脂可以生成甘油二酯，因此，在酶法脫膠過(guò)程中使用磷脂酶C可以顯著提升油脂的得率，從而提高生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)效益。因此，提升磷脂酶C的脫膠性能具有非常重要的生產(chǎn)實(shí)踐意義。

但本領(lǐng)域仍然需要具有更高酶活的BC-PC-PLC。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明人通過(guò)將BC-PC-PLC的三個(gè)糖基化位點(diǎn)即63位，131位和134位天冬酰胺分別突變?yōu)樘於彼?，絲氨酸和天冬氨酸(見(jiàn)SEQ ID NO：2)，在低硫酸鋅條件下其酶活相比于野生型提高16倍。

進(jìn)一步地，本發(fā)明人利用易錯(cuò)PCR(error-pone PCR)得到SEQ ID NO：2的突變體文庫(kù)，將突變體文庫(kù)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母宿主細(xì)胞，通過(guò)平板篩選得到比酶活(U/mg總蛋白)與母本(即SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列)相似以及高1.5倍以上的數(shù)株突變體，這些突變體中氨基酸序列第56位的酪氨酸突變?yōu)楸彼?A)、賴(lài)氨酸(K)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、組氨酸(H)、色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、精氨酸(R)、絲氨酸(S)或蘇氨酸(T)。尤其是第56位為H或W的突變體，其比酶活比母本提高7倍。

本發(fā)明因此提供一種更高效的不依賴(lài)鋅離子的磷脂酶C，可用于油脂精煉、磷脂改性、飼料改良劑、食品工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)等多個(gè)方面，從而完成本發(fā)明。

因此，本發(fā)明第一方面提供一種分離的氨基酸序列，所述氨基酸序列含有：

(1)SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；或

(2)在(1)所述的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，同時(shí)保留SEQ ID NO：7所具備的磷脂酶C活性的由(1)衍生的多肽。

在一個(gè)具體實(shí)施例中，SEQ ID NO：7中第56位的氨基酸Xaa為丙氨酸、 賴(lài)氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、組氨酸、或色氨酸。

在一個(gè)具體實(shí)施例中，SEQ ID NO：7中第56位的氨基酸Xaa為組氨酸或色氨酸。

在一個(gè)具體實(shí)施例中，(2)所述的取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸為第106位的M突變?yōu)閂。

在一個(gè)具體實(shí)施例中，(2)所述的取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸為第20位的R突變?yōu)镠。

在一個(gè)具體實(shí)施例中，(2)所述的取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸為第83位的A突變?yōu)镈。

在一個(gè)具體實(shí)施例中，(2)所述的氨基酸序列56位的氨基酸殘基為組氨酸，106位的氨基酸殘基纈氨酸。

在一個(gè)具體實(shí)施例中，所述氨基酸序列含有前導(dǎo)肽、末端延伸、GST、麥芽糖E結(jié)合蛋白、蛋白A、如6His或Flag的標(biāo)簽、和/或Xa因子或凝血酶或腸激酶的蛋白水解酶位點(diǎn)。

在一個(gè)具體實(shí)施例中，所述氨基酸序列選自SEQ ID NO:2、4和6。

本發(fā)明第二方面提供分離的多核苷酸序列，選自：

(1)編碼本發(fā)明分離的多肽的多核苷酸序列；

(2)(1)所述多核苷酸序列的互補(bǔ)序列；和

(3)(1)或(2)所述序列的長(zhǎng)15－30個(gè)堿基的片段。

在一個(gè)具體實(shí)施例中，所述多核苷酸序列如SEQ ID NO:1、3或5所示。

本發(fā)明第三方面提供一種核酸構(gòu)建體，其特征在于，該核酸構(gòu)建體包含本發(fā)明所述的多核苷酸序列。

在一個(gè)具體實(shí)施例中，所述核酸構(gòu)建體是表達(dá)載體。

本發(fā)明還提供一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞含有本發(fā)明所述的多核苷酸序列或核酸構(gòu)建體。

本發(fā)明還提供一種組合物，所述組合物含有本發(fā)明的多肽和任選的輔料，優(yōu)選的，所述輔料為選自活性炭、氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃的吸附材料。

本發(fā)明還提供本發(fā)明所述氨基酸序列在油脂精煉、磷脂改性、飼料改良劑、 食品工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供一種酶法脫膠方法，所述方法包括在55～75℃的溫度下孵育磷脂酶C，然后將該磷脂酶C加到毛油中，進(jìn)行脫膠。

在一個(gè)具體實(shí)施例中，所述磷脂酶C具有本發(fā)明所述的氨基酸序列。

在一個(gè)具體實(shí)施例中，在60～70℃的溫度下孵育磷脂酶C，尤其是本發(fā)明所述氨基酸序列。

在一個(gè)具體實(shí)施例中，孵育時(shí)間為15～45分鐘。

在一個(gè)具體實(shí)施例中，以毛油重量計(jì)，酶的添加量為50～1000ppm，優(yōu)選為100～500ppm，更優(yōu)選為100～300ppm。

在一個(gè)具體實(shí)施例中，孵育酶的水溶液。

在一個(gè)具體實(shí)施例中，在將酶加入毛油前，先將毛油加熱至50～70℃，優(yōu)選50～60℃。

在一個(gè)具體實(shí)施例中，脫膠包括在50～60℃下攪拌1～3小時(shí)，然后升溫至80～90℃保持1～10分鐘。

本發(fā)明還提供一種提高磷脂酶C脫膠性能的方法，所述方法包括，在55～75℃的溫度下孵育磷脂酶C，然后將該磷脂酶C加到毛油中，進(jìn)行脫膠。

在一個(gè)具體實(shí)施例中，所述磷脂酶C具有本發(fā)明所述的氨基酸序列。

在一個(gè)具體實(shí)施例中，在60～70℃的溫度下孵育磷脂酶C，尤其是所述氨基酸序列。

在一個(gè)具體實(shí)施例中，孵育時(shí)間為15～45分鐘。

在一個(gè)具體實(shí)施例中，以毛油重量計(jì)，酶的添加量為50～1000ppm，優(yōu)選為100～500ppm，更優(yōu)選為100～300ppm。

在一個(gè)具體實(shí)施例中，孵育酶的水溶液。

在一個(gè)具體實(shí)施例中，在將酶加入毛油前，先將毛油加熱至50～70℃，優(yōu)選50～60℃。

在一個(gè)具體實(shí)施例中，脫膠包括在50～60℃下攪拌1～3小時(shí)，然后升溫至80～90℃保持1～10分鐘。

在一個(gè)具體實(shí)施例中，所述毛油包括但不限于：大豆油、葵花籽油、花生油、菜籽油、米糠油、玉米油、橄欖油、棕櫚油、棕櫚仁油、棕櫚軟脂、卡諾 拉油、蓖麻油、椰子油、芫荽油、棉籽油、榛子油、大麻籽油、亞麻籽油、芒果仁油、白芒花油、牛蹄油、紅花油、山茶花油、妥爾油、椿油和其他植物油。

附圖說(shuō)明

圖1顯示PLC-N63DN131SN134D-Y56H，PLC-N63DN131SN134D-M106V和PLC-N63DN131SN134D-Y56HM106V三種突變體在含10uM ZnSO₄的BMM-大豆磷脂篩選平板中的培養(yǎng)結(jié)果。

圖2顯示各個(gè)突變體的比酶活。

圖3顯示N63DN131SN134D和N63DN131SN134D-Y56H的脫膠小試結(jié)果。

圖4顯示各種磷脂酶在磷脂分子上的作用位點(diǎn)。

具體實(shí)施方式

具有磷脂酶C活性的多肽

本發(fā)明提供氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的多肽。本發(fā)明還包括在SEQ ID NO：7的基礎(chǔ)上具有一個(gè)或多個(gè)(通常為1-10個(gè)，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè))氨基酸缺失、插入和/或取代，尤其是在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以?xún)?nèi)，較佳地為10個(gè)以?xún)?nèi)，更佳地為8以?xún)?nèi))氨基酸的多肽。這些變異形式仍然具有本發(fā)明磷脂酶C的活性。作為這類(lèi)突變的一個(gè)例子，本發(fā)明包括SEQ ID NO:7第20位的R突變?yōu)镠、第83位的A突變?yōu)镈和/或第106位的M突變?yōu)閂的磷脂酶C。

優(yōu)選是保守性變異形式。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行保守性取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)或多肽的功能?！靶阅芟嘟蛳嗨频陌被帷卑ɡ?，具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族，這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如賴(lài)氨酸、精氨酸、組氨酸)、具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不帶電荷的極性側(cè)鏈的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支側(cè)鏈的氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳香側(cè)鏈的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此， 在本發(fā)明多肽中用來(lái)自同一側(cè)鏈類(lèi)的另一氨基酸殘基替換一個(gè)或幾個(gè)位點(diǎn)，將不會(huì)在實(shí)質(zhì)上影響其活性。

此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，在基因克隆操作中，常常需要設(shè)計(jì)合適的酶切位點(diǎn)，這勢(shì)必在所表達(dá)的蛋白末端引入了一個(gè)或多個(gè)不相干的殘基，而這并不影響目的蛋白的活性。又如為了構(gòu)建融合蛋白、促進(jìn)重組蛋白的表達(dá)、獲得自動(dòng)分泌到宿主細(xì)胞外的重組蛋白、或利于重組蛋白的純化，常常需要將一些氨基酸添加至重組蛋白的N-末端、C-末端或該蛋白內(nèi)的其它合適區(qū)域內(nèi)，例如，包括但不限于，適合的接頭肽、信號(hào)肽、前導(dǎo)肽、末端延伸、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖E結(jié)合蛋白、蛋白A、如6His或Flag的標(biāo)簽，或Xa因子或凝血酶或腸激酶的蛋白水解酶位點(diǎn)。應(yīng)理解，這些氨基酸序列的存在不會(huì)影響到所得多肽的活性。因此，本發(fā)明也包括在本發(fā)明多肽的C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸(例如前述接頭肽、信號(hào)肽、前導(dǎo)肽、末端延伸、GST、麥芽糖E結(jié)合蛋白、蛋白A、如6His或Flag的標(biāo)簽，或Xa因子或凝血酶或腸激酶的蛋白水解酶位點(diǎn)等)所得的多肽，這些多肽仍具有本文所述的磷脂酶C活性。

根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。

本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生。

多核苷酸

本申請(qǐng)包括編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列。SEQ ID NO：3和5顯示了本發(fā)明多肽的編碼序列例子。所述“編碼序列”包括編碼本發(fā)明所述多肽(尤其是SEQ ID NO：7)的核酸序列。編碼本發(fā)明多肽的序列可以與例如SEQ ID NO：3和5所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡(jiǎn)并的變異體。如本文所用，“簡(jiǎn)并的變異體”在本發(fā)明中是指相同的氨基酸序列，但核苷酸序列有差別的核苷酸序列。

編碼本發(fā)明多肽的序列包括：只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列) 以及非編碼序列。

本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的片段、類(lèi)似物、衍生物和變異形式。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼的蛋白的功能。

本發(fā)明也包括編碼本發(fā)明多肽的核酸序列(如SEQ ID NO：3、5或其互補(bǔ)序列)的片段。如本文所用，“核酸片段”的長(zhǎng)度至少含15個(gè)核苷酸，較好是至少30個(gè)核苷酸，更好是至少50個(gè)核苷酸，最好是至少100個(gè)核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸。因此，在某些實(shí)施例中，核酸片段的長(zhǎng)度在15－30個(gè)堿基?？刹捎矛F(xiàn)有技術(shù)從本發(fā)明的核酸序列中挑選出適當(dāng)?shù)暮怂崞?，用作引物或探針?/p>

本發(fā)明的多肽的編碼序列或其片段通常可以用PCR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開(kāi)的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開(kāi)放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。

核酸構(gòu)建體

本發(fā)明也涉及包括與指導(dǎo)編碼序列在合適宿主細(xì)胞中，在與該調(diào)控序列相適合的條件下表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列可操作連接的本發(fā)明的分離多核苷酸的核酸構(gòu)建體。編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸可以多種方式被操作以保證該多肽的表達(dá)。在其插入載體之前該多核苷酸序列的操作可能根據(jù)該表達(dá)載體而是合乎需要或必需的。利用重組DNA方法來(lái)改變多核苷酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。

調(diào)控序列可以是合適的啟動(dòng)子序列，為用于表達(dá)編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的宿主細(xì)胞識(shí)別的核苷酸序列。啟動(dòng)子序列包含接到多肽表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序 列。啟動(dòng)子可以是在所選擇的宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何核苷酸序列，包括突變的、截短的和雜合啟動(dòng)子，并且可以從編碼與該宿主細(xì)胞同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因獲得。

用于指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體，特別是在細(xì)菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動(dòng)子的實(shí)例是從噬菌體T7啟動(dòng)子、大腸桿菌lac操縱子、天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)瓊脂糖酶基因、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因、解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因等中獲得的啟動(dòng)子序列。

用于指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體在絲狀真菌宿主細(xì)胞正轉(zhuǎn)錄的合適啟動(dòng)子的實(shí)例是從米曲霉TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定的α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉糖化酶(glaA)、里氏木霉纖維二糖水解酶I、氏木霉纖維二糖水解酶II、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶、里氏木霉葡聚糖內(nèi)切酶等基因獲得的啟動(dòng)子及其突變、截短和雜合(hybrid)啟動(dòng)子。

在酵母宿主中，有用的啟動(dòng)子可獲得自釀酒酵母烯醇酶(ENO-1)、釀酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、釀酒酵母乙醇脫氫酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶、釀酒酵母磷酸丙糖異構(gòu)酶、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶的基因、巴斯德畢赤酵母醇氧化酶基因。用于酵母宿主細(xì)胞的其它有用啟動(dòng)子由Romanos et al.，1992，Yeast8:423-488描述。

調(diào)控序列也可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列，為宿主細(xì)胞識(shí)別以終止轉(zhuǎn)錄的序列。終止子序列與編碼該多肽的核苷酸序列的3′末端可操作連接。在選擇的宿主細(xì)胞中有功能的任何終止子都可用于本發(fā)明。

用于細(xì)菌宿主的優(yōu)選終止子可以是來(lái)自T7噬菌體的終止子。

用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子獲得自米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡萄糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡萄糖苷酶的基因。

用于酵母宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子獲得自釀酒酵母烯醇酶、釀酒酵母細(xì)胞色素C、釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶、巴斯德畢赤酵母醇氧化酶基因等。

調(diào)控序列也可以是合適的前導(dǎo)序列，對(duì)宿主細(xì)胞翻譯重要的mRNA的非翻譯區(qū)。簽到序列與編碼該多肽的核苷酸序列的5′末端可操作連接。在選擇的宿 主細(xì)胞中有功能的任何終止子都可用于本發(fā)明。

調(diào)控序列也可以是編碼與多肽的氨基酸末端連接的氨基酸序列并且指導(dǎo)該編碼的多肽進(jìn)入細(xì)胞分泌途徑的信號(hào)肽編碼區(qū)。核苷酸序列編碼序列的5′端可固有地包含天然連接具有編碼分泌多肽的編碼區(qū)節(jié)段的翻譯閱讀框的信號(hào)肽編碼區(qū)。備選地，編碼序列的5′端可包含與該編碼區(qū)外源的信號(hào)肽編碼區(qū)。當(dāng)編碼序列非天然地包含信號(hào)肽編碼區(qū)時(shí)，可能需要外來(lái)的信號(hào)肽編碼區(qū)。備選地，外來(lái)的信號(hào)肽編碼區(qū)可簡(jiǎn)單地替換天然的信號(hào)肽編碼區(qū)以增強(qiáng)多肽的分泌。然而，指導(dǎo)表達(dá)的多肽進(jìn)入選擇的宿主細(xì)胞的分泌途徑的任何信號(hào)肽編碼區(qū)，即分泌進(jìn)入培養(yǎng)基，都可用于本發(fā)明。

表達(dá)載體

本發(fā)明也涉及包括本發(fā)明多核苷酸的重組表達(dá)載體。在此各種核酸和調(diào)控序列可被連接在一起以產(chǎn)生可能包括一個(gè)或多個(gè)容許在這種位點(diǎn)插入或取代該編碼多肽的核苷酸序列的方便限制性位點(diǎn)的重組表達(dá)載體。備選地，本發(fā)明的核苷酸序列可通過(guò)插入核苷酸序列或包括進(jìn)入適當(dāng)表達(dá)載體的序列的核酸構(gòu)建體而被表達(dá)。在制造表達(dá)載體時(shí)，編碼序列位于載體中以使得該編碼序列可操作地連接用于表達(dá)適當(dāng)調(diào)控序列。

重組表達(dá)載體可以使能夠方便地經(jīng)受重組DNA方法并且可導(dǎo)致感興趣的核苷酸序列表達(dá)的任何載體(如質(zhì)?；虿《?。載體的選擇一般取決于載體與其中被導(dǎo)入該載體的宿主細(xì)胞的相容性。該載體可以是線性或閉合的環(huán)形質(zhì)粒。

載體可以是自主復(fù)制的載體，即作為染色體外實(shí)體存在，其復(fù)制不依賴(lài)于染色體復(fù)制的載體，例如質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體或人工染色體。載體可包含用于保證自我復(fù)制的任何方式。備選地，載體可以是當(dāng)被導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)，整合到基因組中并且與其已經(jīng)被整合進(jìn)入的染色體一起復(fù)制的載體。此外，可使用一起包含將被導(dǎo)入宿主細(xì)胞基因組的總DNA的單個(gè)載體或質(zhì)粒或兩個(gè)或多個(gè)載體或質(zhì)粒，或轉(zhuǎn)座子。

本發(fā)明的載體優(yōu)選包含一個(gè)或多個(gè)容許容易選擇轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等細(xì)胞的可選擇標(biāo)記。可選擇的標(biāo)記是基因，其產(chǎn)物提供對(duì)抗生素或病毒的抗性、對(duì) 重金屬的抗性、原養(yǎng)型至營(yíng)養(yǎng)缺陷型等。

本發(fā)明的載體優(yōu)選包含容許該載體整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組或該載體在細(xì)胞中獨(dú)立于基因組自主個(gè)復(fù)制的元件。

一個(gè)以上拷貝的本發(fā)明的多核苷酸可被插入宿主細(xì)胞以增加該基因產(chǎn)物的產(chǎn)量。多核苷酸拷貝數(shù)的增加可通過(guò)將至少一個(gè)附加拷貝的序列整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組或通過(guò)包括可擴(kuò)增的選擇標(biāo)記基因和該多核苷酸來(lái)獲得，其中包含擴(kuò)增拷貝的選擇標(biāo)記基因并且由此包含附加拷貝多核苷酸的細(xì)胞可通過(guò)在存在適當(dāng)?shù)倪x擇劑時(shí)培養(yǎng)該細(xì)胞來(lái)篩選。

本發(fā)明的載體優(yōu)選包含人工合成的一段序列，含有多個(gè)限制內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，能為外源DNA提供多種可插入的位置或插入方案。

本發(fā)明的表達(dá)載體更為優(yōu)選地選擇可用于畢赤酵母中表達(dá)的載體。本發(fā)明的載體優(yōu)選商品化的畢赤酵母中使用的載體如pPIC、pPICZ、pAO、pGAP或pGAPZ等一系列的載體。

宿主細(xì)胞

本發(fā)明也涉及包括被用于重組生產(chǎn)多肽的本發(fā)明多核苷酸的重組宿主細(xì)胞。包括本發(fā)明多核苷酸的載體被導(dǎo)入宿主細(xì)胞以使得該載體如早先說(shuō)明的作為染色體的組成部分或作為染色體外的自我復(fù)制載體來(lái)維持。宿主細(xì)胞的選擇很大程度上取決于編碼多肽的基因及其來(lái)源。

宿主細(xì)胞可以是單細(xì)胞微生物或非單細(xì)胞微生物。單細(xì)胞微生物例如革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，包括但不限于芽孢桿菌細(xì)胞，例如，嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌等；或鏈霉菌細(xì)胞，例如錢(qián)青紫鏈霉菌；或革蘭氏陰性細(xì)菌，例如大腸桿菌和假單胞菌屬。在優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主是枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌和大腸桿菌細(xì)胞。

宿主細(xì)胞也可以是真核生物，例如哺乳動(dòng)物、昆蟲(chóng)、植物、酵母或真菌細(xì)胞。在優(yōu)選的方面，宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如在此使用的“真核”包括子囊菌門(mén)(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)、壺菌門(mén)(Chytridiomycota)、 接合菌門(mén)(Zygomycota)以及卵菌門(mén)等。

在更優(yōu)選的方面，宿主細(xì)胞是子囊菌門(mén)的細(xì)胞如酵母屬(Saccharomyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、耶氏酵母屬(Yarrowia)、假絲酵母屬(Candida)以及Komagataella屬等。

在最優(yōu)選的方面，宿主細(xì)胞是巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)等。在另外最優(yōu)選方面，宿主細(xì)胞是巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)細(xì)胞。

生產(chǎn)方法

在獲得多肽的編碼序列后，可采用如下方法生產(chǎn)本發(fā)明多肽，該方法包括：(a)在有助于生產(chǎn)多肽的條件下培養(yǎng)含表達(dá)該多肽的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞；以及(b)回收該多肽。

本發(fā)明的生產(chǎn)方法中，細(xì)胞可以利用本領(lǐng)域已知的方法在適于生產(chǎn)多肽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。例如，細(xì)胞可通過(guò)在實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中進(jìn)行的搖瓶培養(yǎng)和小規(guī)?；虼笠?guī)模的發(fā)酵(包括連續(xù)的、分批的、分批補(bǔ)料或固態(tài)發(fā)酵)，在合適的培養(yǎng)基和容許該多肽表達(dá)和/或分離的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)發(fā)生在利用本領(lǐng)域已知的方法包括碳源和氮源和無(wú)機(jī)鹽的合適培養(yǎng)基中。合適的培養(yǎng)基可獲得自商業(yè)供應(yīng)者或可根據(jù)公開(kāi)的組合物來(lái)制備。如果該多肽分泌進(jìn)入培養(yǎng)基，該多肽可從培養(yǎng)基直接回收。如果該多肽不分泌進(jìn)入培養(yǎng)基，它可從細(xì)胞裂解物回收。

或者，也可采用本領(lǐng)域已知的化學(xué)合成方法來(lái)合成本發(fā)明的多肽。多肽化學(xué)合成方法包括固相合成法和液相合成法，其中以固相合成法常用。固相合成方法包括但不限于Fmoc和tBoc兩種常用方法。通常，使用樹(shù)脂作為不溶性的固相載體，通常從C端(羧基端)向N端(氨基端)逐個(gè)將氨基酸連接在肽鏈上，每個(gè)氨基酸連接循環(huán)由以下三步反應(yīng)構(gòu)成：1)脫保護(hù)：被保護(hù)的氨基酸必須用一種脫保護(hù)溶劑去除氨基的保護(hù)基團(tuán)；2)活化：待連接的氨基酸的羧基被活化劑所活化；和3)偶聯(lián)：活化的羧基與前一個(gè)氨基酸裸露的氨基反應(yīng)，形成肽鍵。反復(fù)循環(huán)直到肽鏈延伸至所需長(zhǎng)度時(shí)即可完成。最后用切割液切割肽鏈和固相載體之間的連接，就可獲得所需的氨基酸序列?？梢栽诔绦蚩刂频淖詣?dòng)化多肽合 成儀上進(jìn)行上述化學(xué)合成，這類(lèi)儀器包括但不限于Protein Technologies公司推出的Tribute雙通道多肽合成儀、C S Bio公司的UV Online Monitor系統(tǒng)、Aapptec公司推出的Focus XC三通道合成儀等。

本發(fā)明所描述的多肽可利用本領(lǐng)域已知的方法來(lái)回收。例如，多肽可通過(guò)常規(guī)方法，包括但不限于離心、過(guò)濾、超濾、萃取、層析、噴霧干燥、冷凍干燥、蒸發(fā)或沉淀等從培養(yǎng)基回收。

本發(fā)明的多肽可通過(guò)本領(lǐng)域已知的多種方法來(lái)純化，包括但不限于色譜法(如離子交換、親和性、疏水性、色譜聚焦、分子排阻)，電泳法(例如等電聚焦)、差異溶解度(如鹽析沉淀)、SDS-PAGE或萃取法以獲得基本上純的多肽。

多肽的性能及用途

本發(fā)明的多肽具有磷脂酶C活性，可應(yīng)用于油脂精煉、磷脂改性、飼料改良劑、食品工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)等多個(gè)方面，包括但不限于用于烘烤、用于洗滌劑、改善水溶液或糖漿的過(guò)濾性等。

本發(fā)明的多肽可以純的酶制品的形式提供，也可以組合物的形式提供。組合物可以是粉末組合物，也可以是液體組合物，或糊狀組合物。以組合物形式提供時(shí)，根據(jù)該含酶組合物的不同用途，該組合物可含有不同的輔料?？蓪⒈绢I(lǐng)域已知的輔料添加到本發(fā)明的組合物中，這類(lèi)輔料包括但不限于山梨醇、山梨酸鉀、苯甲酸甲酯、苯甲酸乙酯、蔗糖、甘露糖、海藻糖、淀粉、氯化鈉、氯化鈣等穩(wěn)定劑或其他物質(zhì)中的一種或多種。

本發(fā)明方法中使用的本發(fā)明多肽的量可根據(jù)實(shí)際情況加以確定。

酶法脫膠

本發(fā)明還提供一種酶法脫膠方法，所述方法包括在55～75℃的溫度下孵育磷脂酶C，然后將該磷脂酶C加到毛油中，進(jìn)行脫膠。

如前所述，本發(fā)明的多肽可用于油脂制備中的酶法脫膠。因此，本發(fā)明提供一種脫膠方法，所述方法包括在脫膠過(guò)程中將本發(fā)明的多肽加入到毛油中，進(jìn)行脫膠。

可直接將本發(fā)明的多肽加到待脫膠的毛油中，然后按常規(guī)的脫膠條件進(jìn)行脫膠?；蛘?，優(yōu)選的是，先在55～75℃、優(yōu)選60～70℃的溫度下孵育本發(fā)明的多肽，然后再將其加到毛油中，進(jìn)行脫膠。孵育時(shí)間通常為15～45分鐘，優(yōu)選為20～40分鐘。

通常，先將毛油加熱至50～70℃，優(yōu)選50～60℃，然后再加入孵育或未孵育的酶。

酶通常以水溶液的形式加入。以毛油重量計(jì)，酶的添加量為50～1000ppm，優(yōu)選為100～500ppm，更優(yōu)選為100～300ppm。

脫膠條件一般包括：在50～60℃下攪拌1～3小時(shí)，然后升溫至80～90℃保持1～10分鐘。

本發(fā)明另一方面還提供一種提高磷脂酶C脫膠性能的方法，所述方法包括，先在55～75℃、優(yōu)選60～70℃的溫度下孵育磷脂酶C，然后再將其加到毛油中，進(jìn)行脫膠。如前文所述，所述磷脂酶C可以是本發(fā)明的多肽。孵育時(shí)間通常為15～45分鐘，優(yōu)選為20～40分鐘。通常，先將毛油加熱至50～70℃，優(yōu)選50～60℃，然后再加入孵育或未孵育的酶。酶通常以水溶液的形式加入。以毛油重量計(jì)，酶的添加量為50～1000ppm，優(yōu)選為100～500ppm，更優(yōu)選為100～300ppm。脫膠條件一般包括：在50～60℃下攪拌1～3小時(shí)，然后升溫至80～90℃保持1～10分鐘。

適用于本發(fā)明方法脫膠的毛油包括但不限于大豆油、葵花籽油、花生油、菜籽油、米糠油、玉米油、橄欖油、棕櫚油、棕櫚仁油、棕櫚軟脂、卡諾拉油、蓖麻油、椰子油、芫荽油、棉籽油、榛子油、大麻籽油、亞麻籽油、芒果仁油、白芒花油、牛蹄油、紅花油、山茶花油、妥爾油、椿油和其他植物油。

下文將以具體實(shí)施例的方式闡述本發(fā)明。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等，《分子克隆：實(shí)驗(yàn)室指南》(美國(guó)紐約州：冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，1989)所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件進(jìn)行。對(duì)于試劑的用法和用量，除非另有說(shuō)明，否則按照常規(guī)的用法和用量使用。

實(shí)驗(yàn)材料

1、實(shí)驗(yàn)菌株和質(zhì)粒

菌株：畢赤酵母SMD1168(Invitrogen,貨號(hào)C175-00)，大腸桿菌DH5α(TAKARA:Catalog#.D9057A)。

質(zhì)粒：pAO815質(zhì)粒(Invitrogen，貨號(hào)V180-20)，pAO-PLC質(zhì)粒(本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建)，pmAO-PLC質(zhì)粒(本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建)。

2、培養(yǎng)基和溶液

LB液體培養(yǎng)基：0.5％酵母提取物，1％胰化蛋白胨，1％NaCl，pH7.0。

LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基中加入瓊脂濃度1.5％。

YPD液體培養(yǎng)基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖。

YPD固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基中加入瓊脂濃度2％。

MGYS固體培養(yǎng)基：1.34％酵母氮源堿(YNB)含硫酸銨不含氨基酸，1％甘油，1M山梨醇，4×10^-5％D-生物素，2％瓊脂。

BMM-大豆磷脂篩選培養(yǎng)基：1.34％酵母氮源堿(YNB)含硫酸銨不含氨基酸，4×10^-5％D-生物素，0.5％甲醇(滅菌后加入)，2％大豆磷脂乳化液，0.1M檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液pH6.6，2％瓊脂，添加10uM的ZnSO₄·7H₂O。

2％大豆磷脂乳化液：2g大豆磷脂，100ml H₂O，用高速勻漿機(jī)8000rpm勻漿1min。

BMGY液體培養(yǎng)基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％酵母氮源堿(YNB)含硫酸銨不含氨基酸，1％甘油，4×10^-5％D-生物素，0.1M磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀緩沖液pH6.0。

BMMY液體培養(yǎng)基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％酵母氮源堿(YNB)含硫酸銨不含氨基酸，0.3％ZnSO₄·7H₂O，0.5％甲醇(滅菌后加入)，4×10^-5％D-生物素(滅菌后加入)，0.1M檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液pH6.6。

大豆磷脂來(lái)源：購(gòu)自北京美亞斯磷脂技術(shù)有限公司，F(xiàn)PLA級(jí)

酵母提取物和胰化蛋白胨購(gòu)自O(shè)XOID，蛋白胨和酵母氮源堿購(gòu)自BD，生物素購(gòu)自上海生工，硫酸銨、檸檬酸、檸檬酸鈉購(gòu)自國(guó)藥，為分析級(jí)。

本發(fā)明中未特別說(shuō)明的化學(xué)品均購(gòu)自國(guó)藥，為分析級(jí)。

3、鉬藍(lán)法檢測(cè)PLC活力所用試劑：

PLC反應(yīng)液：0.5％大豆磷脂，25mM檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液pH 6.6，10uM ZnSO₄；

CIAP反應(yīng)液：50mM Tris-HCl pH 9.0，10mM MgCl₂，1U CIAP(購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司)；

鉬藍(lán)顯色反應(yīng)液：100ul CIAP反應(yīng)物，0.2％抗壞血酸，0.1％鉬酸銨(用30％H₂SO₄配制)；

改良型Bradford法蛋白濃度測(cè)定試劑盒(購(gòu)自上海生工生物工程有限公司)；

限制性?xún)?nèi)切酶HindIII，EcoRI(購(gòu)自紐英倫生物技術(shù)(北京)有限公司)；

PCR酶：TaKaRa Taq，DNA Polymerase(購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司)；

T4 DNA連接酶(購(gòu)自富酶泰斯有限公司)。

4、所用到的引物如下表所示：

實(shí)施例1：PLC-N63DN131SN134D突變體文庫(kù)構(gòu)建及篩選

根據(jù)蠟樣芽孢桿菌的磷脂酰膽堿特異性磷脂酶C的成熟肽序列(PDB ID:1AH7)以及畢赤酵母密碼子偏好性，設(shè)計(jì)得到BC-PC-PLC的DNA序列(SEQ ID NO：8，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示)，并在其前端融合α因子信號(hào)肽序列以及畢赤酵母的Kozak序列，最終得到α-BC-PC-PLC DNA序列(SEQ ID NO：10)。

將α-BC-PC-PLC DNA序列提供給上海生工生物有限公司進(jìn)行全基因合成，得到含α-BC-PC-PLC DNA序列的克隆載體pGEM-T-PLC。以此載體為模板，使用DNA聚合酶和引物對(duì)AmPLC-3/AmPLC-4，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到PLC片段。

以pPIC-9k表達(dá)載體為模板，使用DNA聚合酶和引物對(duì)AmPLC-1/AmPLC-2，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到AOX1啟動(dòng)子片段(PAOX1)。

通過(guò)重疊PCR，利用引物對(duì)AmPLC-1/AmPLC-4和DNA聚合酶，得到PAOX1+PLC融合片段。利用AatII和EcoRI酶切位點(diǎn)將PAOX1+PLC融合片段克隆至pAO815載體中，得到表達(dá)載體pAO-PLC。

將pAO-PLC用SalI線性化，膠回收8.5kb片段，利用LiAC法制備畢赤酵母GS115菌株的感受態(tài)細(xì)胞，再通過(guò)電轉(zhuǎn)化將線性化的pAO-PLC片段轉(zhuǎn)化GS115感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化物涂布于MGYS平板上，30℃培養(yǎng)3天，將平板上的單克隆挑于5μL無(wú)菌水中，取0.5μL點(diǎn)于BMM-大豆磷脂篩選平板上。30℃培養(yǎng)3天后，陽(yáng)性克隆可在菌體周?chē)吹桨咨恋砣ΓY選得到陽(yáng)性菌株，命名為PLC-WT。

以pAO-PLC載體為模板，使用DNA聚合酶和引物對(duì)AmPLC-1/AOXH-2，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到約900 bp片段。以pAO-PLC載體為模板，使用DNA聚合酶和引物對(duì)AOXH-3/AmPLC-4，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到約1.1kb片段，以前兩步PCR得到的約900bp片段和約1.1kb片段混合作為第三步PCR的模板，使用引物對(duì)AmPLC-1/AmPLC-4和DNA聚合酶，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到約1.9kb片段。

將該約1.9kb片段通過(guò)AatII和EcoRI酶切位點(diǎn)克隆至pAO-PLC中，得到pmAO-PLC。在pmAO-PLC中，pAO-PLC中的一個(gè)HindIII酶切位點(diǎn)被進(jìn)行了突變，從而只保留位于BC-PC-PLC序列5’端的一個(gè)HindIII酶切位點(diǎn)，從而能使用HindIII和EcoRI將BC-PC-PLC的突變片段克隆至pmAO-PLC。

以pAO-PLC載體為模板，使用DNA聚合酶和引物對(duì)EPPLC-1/63D-2，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到約207bp片段。以pAO-PLC載體為模板，使用DNA聚合酶和引物對(duì)63D-3/EPPLC-2，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到約576bp片段。再以前兩步PCR得到的207bp片段和576bp片段混合作為第三步PCR的模板，使用引物對(duì)EPPLC-1/EPPLC-2和DNA聚合酶，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到約755bp片段。將該755bp片段通過(guò)HindIII和EcoRI酶切位點(diǎn)克隆至pmAO-PLC中，得到pmAO-PLC-N63D載體。

以pmAO-PLC-N63D載體為模板，使用DNA聚合酶和引 物對(duì)EPPLC-1/DSD-2序列見(jiàn)引物表，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到約414bp片段。以pAO-PLC載體為模板，使用DNA聚合酶和引物對(duì)DSD-3/EPPLC-2序列見(jiàn)引物表，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到約361bp片段。再以前兩步PCR得到的414bp片段和361bp片段混合作為第三步PCR的模板，使用引物對(duì)EPPLC-1/EPPLC-2和DNA聚合酶，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到755bp片段。將該755bp片段通過(guò)HindIII和EcoRI酶切位點(diǎn)克隆至pmAO-PLC中，得到pmAO-PLC-N63DN131SN134D載體。

以pmAO-PLC-N63DN131SN134D載體為模板，使用TaKaRa Taq酶和引物對(duì)EPPLC-1/EPPLC-2進(jìn)行易錯(cuò)PCR(在PCR時(shí)額外添加0.3mM的MnCl₂)，得到大小為約755bp的突變擴(kuò)增子片段集合。通過(guò)HindIII和EcoRI酶切位點(diǎn)將得到的片段克隆至pmAO-PLC，并將得到的載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α菌株，一共得到1×10⁴個(gè)BC-PC-PLC突變體。

將每1×10³個(gè)PLC-N63DN131SN134D突變體用2ml的無(wú)菌水洗至8ml的LB液體培養(yǎng)基中(含100μg/ml氨芐青霉素)，37℃培養(yǎng)4h。抽提質(zhì)粒，用SalI進(jìn)行線性化，回收約8.5kb的片段。取500ng載體(使用盡量少的DNA，保證大多數(shù)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子含單拷貝PLC基因)，用電轉(zhuǎn)化法將載體轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115菌株的感受態(tài)細(xì)胞中。將轉(zhuǎn)化物接種于MGYS平板上，30℃培養(yǎng)3天，得到PLC-N63DN131SN134D的畢赤酵母突變體文庫(kù)。挑取平板上的單克隆，至BMM-大豆磷脂篩選平板上。選取白色沉淀圈大的克隆。該克隆編號(hào)31#。

實(shí)施例2：PLC-N63DN131SN134D突變體序列分析

將31#菌株接種于3ml YPD液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)過(guò)夜，抽提基因組DNA。以31#菌株的基因組DNA為模板，使用DNA聚合酶和引物對(duì)AOX1-5/AOX1-3進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到31#菌株中PLC的DNA序列。將得到的序列送往上海生工生物工程公司，用引物對(duì)AOX1-5/AOX1-3進(jìn)行測(cè)序。31#的PLC的DNA測(cè)序結(jié)果有2個(gè)堿基發(fā)生了突變，第56位酪氨酸突變?yōu)榻M氨酸(TAT→CAT)；第106位蛋氨酸突變?yōu)槔i氨酸(ATG→GTG)。序列如SEQ ID NO：3所示。

實(shí)施例3：PLC-N63DN131SN134D突變體單點(diǎn)突變體畢赤酵母表達(dá)菌株構(gòu)建及篩選

1.PLC-N63DN131SN134D-Y56H的構(gòu)建及篩選

以pmAO-PLC-N63DN131SN134D載體為模板，使用DNA聚合酶和引物對(duì)EPPLC-1/56H-2，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到約180bp片段。以pmAO-PLC-N63DN131SN134D載體為模板，使用DNA聚合酶和引物對(duì)56H-3/EPPLC-2，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到約570bp片段。再以前兩步PCR得到的約180bp片段和約570bp片段混合作為第三步PCR的模板，使用引物對(duì)EPPLC-1/EPPLC-2和DNA聚合酶，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到約755bp片段。

將該約755bp片段通過(guò)HindIII和EcoRI酶切位點(diǎn)克隆至pmAO-PLC中，得到pmAO-PLC-N63DN131SN134D-Y56H載體。將pmAO-PLC-N63DN131SN134D-Y56H用SalI線性化，凝膠回收8.5kb片段。利用LiAC法制備畢赤酵母SMD1168菌株的感受態(tài)細(xì)胞，再通過(guò)電轉(zhuǎn)化將500ng線性化的pmAO-PLC-N63DN131SN134D-Y56H轉(zhuǎn)化至SMD1168感受態(tài)細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化物接種于MGYS平板上，30℃培養(yǎng)3天。挑取平板上的單克隆，至BMM-大豆磷脂篩選平板上。選取白色沉淀圈大的克隆。

2.PLC-N63DN131SN134D-M106V的構(gòu)建及篩選

以pmAO-PLC-N63DN131SN134D載體為模板，使用DNA聚合酶和引物對(duì)EPPLC-1/106V-2，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到約320bp片段。以pmAO-PLC-N63DN131SN134D載體為模板，使用DNA聚合酶和引物對(duì)106V-3/EPPLC-2，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到約440bp片段。再以前兩步PCR得到的約320bp片段和約440bp片段混合作為第三步PCR的模板，使用引物對(duì)EPPLC-1/EPPLC-2和DNA聚合酶，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到約755bp片段。

將該約755bp片段通過(guò)HindIII和EcoRI酶切位點(diǎn)克隆至pmAO-PLC中，得到pmAO-PLC-N63DN131SN134D-M106V載體。將pmAO-PLC-N63DN131SN134D-M106V用SalI線性化，凝膠回收8.5kb片段。 利用LiAC法制備畢赤酵母SMD1168菌株的感受態(tài)細(xì)胞，再通過(guò)電轉(zhuǎn)化將500ng線性化的pmAO-PLC-N63DN131SN134D-M106V轉(zhuǎn)化至SMD1168感受態(tài)細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化物接種于MGYS平板上，30℃培養(yǎng)3天。挑取平板上的單克隆，至BMM-大豆磷脂篩選平板上。選取白色沉淀圈大的克隆。

3.PLC-N63DN131SN134D-Y56HM106V的構(gòu)建及篩選

以31#菌株基因組DNA為模板，使用DNA聚合酶和引物對(duì)EPPLC-1/EPPLC-2，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到約755bp片段。將該約755bp片段通過(guò)HindIII和EcoRI酶切位點(diǎn)克隆至pmAO-PLC中，得到pmAO-N63DN131SN134D-Y56HM106V載體。將pmAO-7-7PLC-106M用SalI線性化，凝膠回收8.5kb片段。利用LiAC法制備畢赤酵母SMD1168菌株的感受態(tài)細(xì)胞，再通過(guò)電轉(zhuǎn)化將500ng線性化的pmAO-N63DN131SN134D-Y56HM106V轉(zhuǎn)化至SMD1168感受態(tài)細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化物接種于MGYS平板上，30℃培養(yǎng)3天。挑取平板上的單克隆，至BMM-大豆磷脂篩選平板上。選取白色沉淀圈大的克隆。

如圖1所示，比較PLC-N63DN131SN134D-Y56H，PLC-N63DN131SN134D-M106V和PLC-N63DN131SN134D-Y56HM106V三種突變體在BMM-大豆磷脂篩選平板上白色沉淀圈的大小可以發(fā)現(xiàn)，PLC-N63DN131SN134D-Y56H和PLC-N63DN131SN134D-Y56HM106V的白色沉淀圈大小相當(dāng)，而PLC-N63DN131SN134D-M106V的白色沉淀圈大小明顯較PLC-N63DN131SN134D-Y56H和PLC-N63DN131SN134D-Y56HM106V小，說(shuō)明Y56H突變使得突變體的酶活進(jìn)一步提高，Y56H為關(guān)鍵的突變位點(diǎn)。

實(shí)施例4：PLC-N63DN131SN134D第56位氨基酸飽和突變

將PLC-N63DN131SN134D第56位酪氨酸分別突變?yōu)楸彼?A)，半胱氨酸(C)，天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)，苯丙氨酸(F)，甘氨酸(G)，組氨酸(H)，異亮氨酸(I)，賴(lài)氨酸(K)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，天冬酰胺(N)，脯氨酸(P)，谷氨酰胺(Q)，精氨酸(R)，蘇氨酸(T)，結(jié)氨酸(V)和色氨酸(W)。

簡(jiǎn)單而言，以pmAO-PLC-N63DN131SN134D載體為模板，使用DNA聚合酶和引物對(duì)EPPLC-1/56X-2(X代表上述18種氨基酸的單字母簡(jiǎn)寫(xiě))，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到約180bp片段。以pmAO-PLC-N63DN131SN134D載體為模板，使用DNA聚合酶和引物對(duì)56X-3/EPPLC-2，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到約570bp片段。再以前兩步PCR得到的約180bp片段和約570bp片段混合作為第三步PCR的模板，使用引物對(duì)EPPLC-1/EPPLC-2和DNA聚合酶，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到約755bp片段。

將得到的18個(gè)約755bp片段分別通過(guò)HindIII和EcoRI酶切位點(diǎn)克隆至pmAO-PLC中，得到18種pmAO-7-7PLC-Y56X載體，將18種pmAO-PLC-N63DN131SN134D-Y56X載體用SalI線性化，凝膠回收8.5kb片段。利用LiAC法制備畢赤酵母SMD1168菌株的感受態(tài)細(xì)胞，再通過(guò)電轉(zhuǎn)化將500ng線性化的18種pmAO-PLC-N63DN131SN134D-Y56X分別轉(zhuǎn)化SMD1168感受態(tài)細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化物接種于MGYS平板上，30℃培養(yǎng)3天。挑取平板上的單克隆，挑取平板上的單克隆，至BMM-大豆磷脂篩選平板上。從每種突變體的篩選平板上選取白色沉淀圈大的克隆。

取PLC-WT，PLC-N63DN131SN134D及PLC-N63DN131SN134D的56位飽和突變菌株，先在液體YPD中活化，然后接種于BMGY培養(yǎng)基中，在30℃下，220rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)至BMMY培養(yǎng)基中，初始OD600為6。

首先，用2％甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)，在24h和32h后各補(bǔ)加1％甲醇，48h和56h后各補(bǔ)加1％甲醇，72h取樣。將獲得的樣品用截留分子量為10kDa的超濾管進(jìn)行超濾脫鹽濃縮20倍。將處理后的樣品加入緩沖液中(20mM檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH6.6)，10uM ZnSO₄)。

取1μl發(fā)酵液至190μl PLC反應(yīng)液(含0.5％大豆磷脂，25mM檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液pH 6.6，10uM ZnSO₄)中，45℃振蕩孵育30min。孵育后，加入100μl氯仿振蕩混勻，12000rpm離心2min。取80μl上清，加入20μl CIAP反應(yīng)液(含50mM Tris-HCl pH 9.0，10mM MgCl₂，1U CIAP)，37℃振蕩孵育1h。

孵育后，取100μl反應(yīng)物，加入900μl鉬藍(lán)顯色液(含0.2％抗壞血酸，0.1％ 鉬酸銨)，37℃振蕩孵育10min。在700nm波長(zhǎng)下測(cè)定樣品的吸光度，計(jì)算得到各個(gè)發(fā)酵液樣品的PLC活力。用Bradford試劑測(cè)定PLC-N63DN131SN134D及PLC-N63DN131SN134D的56位飽和突變菌株的搖瓶發(fā)酵液的蛋白濃度，從而得出比酶活。如圖2所示，PLC-N63DN131SN134D-Y56H和PLC-N63DN131SN134D-Y56W較PLC-N63DN131SN134D的比酶活有7倍和5倍的提高。

實(shí)施例5：PLC-N63DN131SN134D-Y56H脫膠小試

取大豆毛油100g，加熱至55℃，分別加入200ppm的PLC-WT，PLC-N63DN131SN134D樣品和PLC-N63DN131SN134D-Y56H，使得體系中的水相為3％，用高速剪切機(jī)高速剪切(10000r/min)1min，在55℃下攪拌(750r/min)反應(yīng)2h，升溫至85℃，維持5min，樣品12000rpm離心10min，取約10g上層油樣，用HPLC檢測(cè)其DAG含量(按AOCS Cd 11d-96(09)的方法測(cè)定)。PLC-N63DN131SN134D樣品和PLC-N63DN131SN134D-Y56H相對(duì)于毛油的DAG增量如圖3所示，PLC-N63DN131SN134D-Y56H的DAG增量為PLC-N63DN131SN134D的1.5倍。

實(shí)施例6：突變序列及其活性

以pmAO-PLC-N63DN131SN134D載體為模板，使用DNA聚合酶和引物對(duì)EPPLC-1/20H-2，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到約78bp片段。以pmAO-PLC-N63DN131SN134D載體為模板，使用DNA聚合酶和引物對(duì)20H-3/EPPLC-2，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到約707bp片段。再以前兩步PCR得到的約78bp片段和約707bp片段混合作為第三步PCR的模板，使用引物對(duì)EPPLC-1/EPPLC-2和DNA聚合酶，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到約755bp片段。

將該約755bp片段通過(guò)HindIII和EcoRI酶切位點(diǎn)克隆至pmAO-PLC中，得到pmAO-PLC-N63DN131SN134D-R20H載體。將pmAO-PLC-N63DN131SN134D-R20H用SalI線性化，凝膠回收8.5kb片段。利用LiAC法制備畢赤酵母SMD1168菌株的感受態(tài)細(xì)胞，再通過(guò)電轉(zhuǎn)化將500ng 線性化的pmAO-PLC-N63DN131SN134D-R20H轉(zhuǎn)化至SMD1168感受態(tài)細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化物接種于MGYS平板上，30℃培養(yǎng)3天。挑取平板上的單克隆，至BMM-大豆磷脂篩選平板上。選取白色沉淀圈大的克隆,為PLC-N63DN131SN134D-R20H

以pmAO-PLC-N63DN131SN134D載體為模板，使用DNA聚合酶和引物對(duì)EPPLC-1/83D-2，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到約266bp片段。以pmAO-PLC-N63DN131SN134D載體為模板，使用DNA聚合酶和引物對(duì)83D-3/EPPLC-2，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到約520bp片段。再以前兩步PCR得到的約266bp片段和約520bp片段混合作為第三步PCR的模板，使用引物對(duì)EPPLC-1/EPPLC-2和DNA聚合酶，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到約755bp片段。

將該約755bp片段通過(guò)HindIII和EcoRI酶切位點(diǎn)克隆至pmAO-PLC中，得到pmAO-PLC-N63DN131SN134D-A83D載體。將pmAO-PLC-N63DN131SN134D-A83D用SalI線性化，凝膠回收8.5kb片段。利用LiAC法制備畢赤酵母SMD1168菌株的感受態(tài)細(xì)胞，再通過(guò)電轉(zhuǎn)化將500ng線性化的pmAO-PLC-N63DN131SN134D-A83D轉(zhuǎn)化至SMD1168感受態(tài)細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化物接種于MGYS平板上，30℃培養(yǎng)3天。挑取平板上的單克隆，至BMM-大豆磷脂篩選平板上。選取白色沉淀圈大的克隆，為PLC-N63DN131SN134D-A83D。

取PLC-N63DN131SN134D、PLC-N63DN131SN134D-R20H和PLC-N63DN131SN134D-A83D菌株，先在液體YPD中活化，然后接種于BMGY培養(yǎng)基中，在30℃下，220rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)至BMMY培養(yǎng)基中，初始OD600為6。

首先，用2％甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)，在24h和32h后各補(bǔ)加1％甲醇，48h和56h后各補(bǔ)加1％甲醇，72h取樣。將獲得的樣品用截留分子量為10kDa的超濾管進(jìn)行超濾脫鹽濃縮20倍。將處理后的樣品加入緩沖液中(20mM檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH6.6)，10uM ZnSO₄)。

取1μl發(fā)酵液至190μl PLC反應(yīng)液(含0.5％大豆磷脂，25mM檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液pH 6.6，10uM ZnSO₄)中，45℃振蕩孵育30min。孵育后， 加入100μl氯仿振蕩混勻，12000rpm離心2min。取80μl上清，加入20μl CIAP反應(yīng)液(含50mM Tris-HCl pH 9.0，10mM MgCl₂，1U CIAP)，37℃振蕩孵育1h。

孵育后，取100μl反應(yīng)物，加入900μl鉬藍(lán)顯色液(含0.2％抗壞血酸，0.1％鉬酸銨)，37℃振蕩孵育10min。在700nm波長(zhǎng)下測(cè)定樣品的吸光度，計(jì)算得到各個(gè)發(fā)酵液樣品的PLC活力。用Bradford試劑測(cè)定PLC-N63DN131SN134D、PLC-N63DN131SN134D-R20H和PLC-N63DN131SN134D-A83D菌株的搖瓶發(fā)酵液的蛋白濃度，從而得出比酶活，發(fā)現(xiàn)三者的比酶活沒(méi)有明顯差別。

實(shí)施例7

取大豆毛油100g，加熱至55℃；將磷脂酶C(序列編號(hào)SEQ ID NO:7中Xaa為His的磷脂酶C)樣品100倍稀釋?zhuān)环謩e加入1ml純水和2ml稀釋后的磷脂酶C樣品(加水量3％、酶添加量200ppm)；高速剪切(10000r/min)1分鐘；在55℃條件下攪拌(750r/min)反應(yīng)2小時(shí)；升溫至85℃保持5分鐘；12000rpm離心10分鐘，取約10g上層油樣，檢測(cè)其DAG含量(檢測(cè)方法：AOCS Official Method Cd 11d-96)。經(jīng)過(guò)計(jì)算，脫膠后大豆油中甘油二酯的增加量ΔDAG為1.02％。

實(shí)施例8

將磷脂酶C(序列編號(hào)SEQ ID NO:7中Xaa為His的磷脂酶C)樣品10倍稀釋?zhuān)糜?0℃水浴孵育0.5小時(shí)。

取大豆毛油100g，加熱至55℃；將孵育后的磷脂酶C樣品10倍稀釋?zhuān)环謩e加入1ml純水和2ml稀釋后的磷脂酶C樣品(加水量3％、酶添加量200ppm)；高速剪切(10000r/min)1分鐘；在55℃條件下攪拌(750r/min)反應(yīng)2小時(shí)；升溫至85℃保持5分鐘；12000rpm離心10分鐘，取約10g上層油樣，檢測(cè)其DAG含量(檢測(cè)方法：AOCS Official Method Cd 11d-96)。經(jīng)過(guò)計(jì)算，脫膠后大豆油中甘油二酯的增加量ΔDAG為1.02％。

實(shí)施例9

將磷脂酶C(序列編號(hào)SEQ ID NO:7中Xaa為His的磷脂酶C)樣品10 倍稀釋?zhuān)糜?0℃水浴孵育0.5小時(shí)。

取大豆毛油100g，加熱至55℃；將孵育后的磷脂酶C樣品10倍稀釋?zhuān)环謩e加入1ml純水和2ml稀釋后的磷脂酶C樣品(加水量3％、酶添加量200ppm)；高速剪切(10000r/min)1分鐘；在55℃條件下攪拌(750r/min)反應(yīng)2小時(shí)；升溫至85℃保持5分鐘；12000rpm離心10分鐘，取約10g上層油樣，檢測(cè)其DAG含量(檢測(cè)方法：AOCS Official Method Cd 11d-96)。經(jīng)過(guò)計(jì)算，脫膠后大豆油中甘油二酯的增加量ΔDAG為1.06％。

實(shí)施例10

將磷脂酶C(序列編號(hào)SEQ ID NO:7中Xaa為His的磷脂酶C)樣品10倍稀釋?zhuān)糜?0℃水浴孵育0.5小時(shí)。

取大豆毛油100g，加熱至55℃；將孵育后的磷脂酶C樣品10倍稀釋?zhuān)环謩e加入1ml純水和2ml稀釋后的磷脂酶C樣品(加水量3％、酶添加量200ppm)；高速剪切(10000r/min)1分鐘；在55℃條件下攪拌(750r/min)反應(yīng)2小時(shí)；升溫至85℃保持5分鐘；12000rpm離心10分鐘，取約10g上層油樣，檢測(cè)其DAG含量(檢測(cè)方法：AOCS Official Method Cd 11d-96)。經(jīng)過(guò)計(jì)算，脫膠后大豆油中甘油二酯的增加量ΔDAG為1.11％。

實(shí)施例11

將磷脂酶C(序列編號(hào)SEQ ID NO:7中Xaa為His的磷脂酶C)樣品10倍稀釋?zhuān)糜?0℃水浴孵育0.5小時(shí)。

取大豆毛油100g，加熱至55℃；將孵育后的磷脂酶C樣品10倍稀釋?zhuān)环謩e加入1ml純水和2ml稀釋后的磷脂酶C樣品(加水量3％、酶添加量200ppm)；高速剪切(10000r/min)1分鐘；在55℃條件下攪拌(750r/min)反應(yīng)2小時(shí)；升溫至85℃保持5分鐘；12000rpm離心10分鐘，取約10g上層油樣，檢測(cè)其DAG含量(檢測(cè)方法：AOCS Official Method Cd 11d-96)。經(jīng)過(guò)計(jì)算，脫膠后大豆油中甘油二酯的增加量ΔDAG為0.73％。