本發(fā)明屬于植物蛋白和植物抗除草劑領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及粳稻的乙酰乳酸合成酶(ALS)突變蛋白，該突變蛋白能賦予植物尤其水稻抗乙酰乳酸合成酶抑制劑類除草劑的特性。本發(fā)明公開(kāi)了該突變蛋白的序列，以及它們?cè)谥参锟钩輨╊I(lǐng)域中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

乙酰乳酸合成酶(ALS)(也稱乙酰羥酸合成酶，AHAS；EC 4.1.3.18)，是植物和微生物3種氨基酸生物合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶。如果此酶的活力受到抑制或者喪失，會(huì)導(dǎo)致植物纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸合成受阻，影響蛋白的合成，最終導(dǎo)致植物生長(zhǎng)受阻，直至死亡。因此，以ALS為作用靶標(biāo)開(kāi)發(fā)了多種高效除草劑，主要包括磺酰脲類(Sulfonylureas,SU)、咪唑啉酮類(Imidazolinones,IMI)、三唑嘧啶類(Triazolopyrimidines,TP)、嘧啶氧(硫)苯甲酸類[Pyrimidinylthio(or oxy)–benzoates,PTB；pyrimidinyl-carboxyherbicides；PCs]和磺酰胺基羰基三唑啉酮類(Sulfonylamino-carbonyltriazolinones,SCT)等13類化合物。這些除草劑統(tǒng)稱為ALS抑制劑類除草劑或ALS類除草劑，這類除草劑具有選擇性強(qiáng)、殺草譜廣、低毒高效等特點(diǎn)，目前已大面積推廣使用。但這些除草劑屬于選擇性除草劑，在殺草的同時(shí)，也會(huì)對(duì)一般不具有抗(耐)除草劑特性的農(nóng)作物本身產(chǎn)生藥害，極大限制了其使用時(shí)間和使用空間，如需要在農(nóng)作物播種前一段時(shí)間使用除草劑才能避免農(nóng)作物遭受藥害。培育抗(耐)除草劑作物品種可減少作物藥害、拓寬除草劑的使用范圍。

ALS屬于依賴硫胺素焦磷酸酶的家族，在植物、真菌以及藻類等體內(nèi)均已被發(fā)現(xiàn)。該酶由催化亞基和調(diào)節(jié)亞基構(gòu)成，催化亞基分子量約為65kD，調(diào)節(jié)亞基在9-54kD之間。對(duì)于實(shí)現(xiàn)ALS的全酶活性，除了這2個(gè)亞基之外，還依賴于3個(gè)必不可少的輔助因子，ThDP、二價(jià)金屬離子和黃素嘌呤二核苷酸。成熟的ALS蛋白大約由670個(gè)氨基酸組成，其序列在不同物種間高度保守。ALS蛋白在Gly 95、Ala 96、Ala 122、Pro 171、Pro 196、Pro 197、Ala 205、Asp 376、Trp 537、Trp 548、Trp 552、Trp 557、Trp 563、Trp 574、Ser 621、Ser 627、Ser 638、Ser 653、Gly 654、Val 669等氨基酸位點(diǎn)(以模式植物擬南芥的ALS氨基酸位置計(jì)算)發(fā)生突變可以產(chǎn)生ALS抑制劑類除草劑抗性，這在多種農(nóng)作物(包括玉米、小麥、水稻、油菜、向日葵等)、模式植物擬南芥和上百種雜草中均有報(bào)道。而且，不同位點(diǎn)的氨基酸殘基變異產(chǎn)生不同類型的ALS抑制劑類除草劑抗性。

其中，水稻已知的抗ALS抑制劑突變位點(diǎn)包括Gly 95、Ala 96、Ala 122、Trp 548、Ser 627、Ser 653和Gly 654。ALS突變體抗除草劑水平與ALS氨基酸突變的位置有關(guān)，還與突變后的氨基酸種類及突變氨基酸的數(shù)目有關(guān)。有些研究還表明，氨基酸變異引起的ALS突變酶對(duì)抑制劑類除草劑產(chǎn)生抗性的同時(shí)，有些ALS突變酶的酶學(xué)特性也有所改變。

目前，ALS抑制劑類除草劑的作用機(jī)理尚未確定，很難提前預(yù)測(cè)ALS蛋白其它氨基酸位點(diǎn)的突變是否會(huì)產(chǎn)生除草劑抗性，只能依賴于科研人員長(zhǎng)期、艱苦的實(shí)踐探索，并憑借一些運(yùn)氣才可能發(fā)現(xiàn)ALS蛋白新的除草劑抗性位點(diǎn)。

而且目前國(guó)內(nèi)外均沒(méi)有人研究報(bào)道關(guān)于粳稻的乙酰乳酸合成酶的突變否會(huì)產(chǎn)生除草劑抗性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種粳稻的ALS突變型基因。

本發(fā)明還要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供上述粳稻的ALS突變型基因所編碼的ALS突變蛋白。

本發(fā)明還要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供了含有上述的粳稻的ALS突變型基因的表達(dá)盒、重組載體或細(xì)胞。

本發(fā)明還要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供了上述粳稻的ALS突變型基因、突變蛋白、表達(dá)盒、重組載體或細(xì)胞在制備綠色植物除草劑方面的應(yīng)用。

本發(fā)明還要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供了獲得具有除草劑抗性的綠色植物的方法。

本發(fā)明最后要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供了鑒定具有除草劑抗性的綠色植物的方法。

本發(fā)明人通過(guò)對(duì)粳稻品種鎮(zhèn)稻18號(hào)植株進(jìn)行長(zhǎng)期、不斷地EMS突變的篩選，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的ALS突變蛋白，其對(duì)ALS抑制劑類除草劑不敏感，從而使得植物具有ALS抑制劑類除草劑抗性。本發(fā)明在植物育種中的應(yīng)用，可用于培育具有除草劑抗性的植物，尤其是農(nóng)作物，本發(fā)明還開(kāi)發(fā)了這些蛋白及其編碼基因在轉(zhuǎn)基因水稻中的應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：一種粳稻的ALS突變型基因，其在粳稻的ALS基因序列的第406位核苷酸由G突變?yōu)門。

上述粳稻的ALS突變型基因其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。

上述的粳稻的ALS突變型基因所編碼的ALS突變型蛋白。該突變來(lái)源于粳稻品種鎮(zhèn)稻18，與對(duì)ALS抑制劑類除草劑敏感的野生型水稻粳稻ALS(如Genbank登錄號(hào)XM_015770973.1)相比，其在氨基酸在Gly136位點(diǎn)突變。目前還沒(méi)有報(bào)道表明，在來(lái)自水稻粳稻的ALS的Gly136位點(diǎn)突變，會(huì)使得粳稻具有ALS抑制劑類除草劑抗性。

上述的粳稻的ALS突變蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本發(fā)明內(nèi)容還包括表達(dá)盒、重組載體或細(xì)胞，其含有上述的粳稻的ALS突變型基因。

本發(fā)明內(nèi)容還包括上述的粳稻的ALS突變型基因、蛋白、表達(dá)盒、重組載體或細(xì)胞在綠色植物抗除草劑方面的應(yīng)用。

上述綠色植物為水稻等。

本發(fā)明內(nèi)容還包括獲得具有除草劑抗性的綠色植物的方法，包括如下步驟：

1)使綠色植物包含所述的粳稻的ALS突變型基因；或

2)使綠色植物表達(dá)所述的粳稻的ALS突變型蛋白。

上述的方法，包括轉(zhuǎn)基因、雜交、回交或無(wú)性繁殖步驟。

鑒定權(quán)利要求上述的方法獲得的綠色植物的方法，包括以下步驟：

1)測(cè)定所述綠色植物是否包含上述的粳稻的ALS突變型基因；或，

2)測(cè)定所述綠色植物是否表達(dá)上述的粳稻的ALS突變型蛋白。

有益效果：田間噴施ALS抑制劑類除草劑“百壟通”的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，含有本發(fā)明的粳稻的ALS突變蛋白的植物3-4葉幼苗在施用3mL百壟通/L水(9倍推薦使用濃度)后，植株仍然正常生長(zhǎng)發(fā)育和結(jié)實(shí)，而野生型粳稻3-4葉幼苗在施用1mL百壟通/3L水(1倍推薦使用濃度)30天后表現(xiàn)為整株死亡。

附圖說(shuō)明

圖1百壟通除草劑篩選獲得的抗性水稻粳稻突變體；

圖2 PCR擴(kuò)增粳稻鎮(zhèn)稻18突變體的ALS基因結(jié)果圖；第1泳道為Marker；Marker分子量從上到下依次為8kb、5kb、3kb、2kb、1kb、750bp、500bp、250bp，第2泳道為鎮(zhèn)稻18野生型水稻DNA，第3泳道為抗除草劑鎮(zhèn)稻18突變植株的DNA；目的片段長(zhǎng)度1935bp；

圖3為百壟通除草劑對(duì)野生型和抗除草劑突變植株的ALS酶活性抑制；

圖4百壟通除草劑對(duì)野生型和抗除草劑鎮(zhèn)稻18突變體植株的ALS酶活性抑制的吸光值測(cè)定；

圖5突變體植株的ALS基因的過(guò)量表達(dá)載體BamHI/SacI雙酶切驗(yàn)證圖；第1泳道為Marker；Marker分子量從上到下依次為8kb、5kb、3kb、2kb、1kb、750bp、500bp、250bp，第2泳道為重組載體經(jīng)BamHI/SacI雙酶切后產(chǎn)生的基因片段和質(zhì)粒片段DNA，基因片段大小符合預(yù)期，證明載體構(gòu)建成功；

圖6突變型ALS基因水稻PCR檢測(cè)圖；總共有9個(gè)泳道，第1泳道為Marker；Marker分子量從上到下依次為8kb、5kb、3kb、2kb、1kb、750bp、500bp、250bp，第2泳道為質(zhì)粒DNA，作為陽(yáng)性對(duì)照，第3～9泳道為突變植株的轉(zhuǎn)基因DNA。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例1：水稻粳稻鎮(zhèn)稻18突變體抗咪唑啉酮類除草劑突變體獲取過(guò)程(百壟通)

將粳稻常規(guī)水稻種子鎮(zhèn)稻18(購(gòu)自江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺(tái))(此為M0，用清水浸泡2小時(shí))150kg分6次用0.5-1.0％(w/w)甲磺酸乙酯(EMS)室溫下浸泡6-9小時(shí)，期間每1小時(shí)搖動(dòng)一次種子；棄去EMS溶液，自來(lái)水翻動(dòng)浸泡種子5次，每次5分鐘，然后用自來(lái)水沖洗種子過(guò)夜，次日進(jìn)行田間播種，并進(jìn)行常規(guī)肥水管理(此為M1)。植株成熟后，種子混收、晾干，過(guò)冬保存。次年播種田間。待水稻(此為M2)幼苗長(zhǎng)至3-4葉期時(shí)，噴施為3mL百壟通/L水(“百壟通”是德國(guó)巴斯夫公司生產(chǎn)一種水劑型咪唑啉酮類除草劑，推薦最低使用濃度為1mL百壟通/1.5～3L水)，30天后還呈正常綠色植株即為抗咪唑啉酮類除草劑的粳稻突變植株(圖1)。共計(jì)獲得抗除草劑的M2單株421株，這些抗性單株進(jìn)行常規(guī)肥水管理，有385個(gè)M2單株可正常結(jié)實(shí)，種子成熟后，單株收種、晾干，過(guò)冬保存。

實(shí)施例2：抗咪唑啉酮類除草劑粳稻突變體突變位點(diǎn)分析

取上述實(shí)施例1獲得的抗除草劑粳稻突變植株選取突變植株的葉片，分別提取基因組DNA，送上海翰宇生物科技有限公司進(jìn)行基因組測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與粳稻參考基因序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/XM_015770973.1)相比，發(fā)現(xiàn)上述抗除草劑粳稻突變體在ALS基因上發(fā)生了1個(gè)位點(diǎn)的突變，其中抗除草劑突變植株在ALS基因的第406位點(diǎn)堿基發(fā)生突變，由G變成T，導(dǎo)致其相應(yīng)編碼的氨基酸序列的第136位點(diǎn)由甘氨酸變?yōu)樘K氨酸，即抗除草劑突變植株的ALS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其編碼的ALS突變型蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明的突變植株水稻種子zhen9其分類命名為水稻種子zhen9(Oryza sativa Japonica Group zhen 9)，該植株已于2017年2月12號(hào)保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，湖北省武漢市武昌區(qū)武漢大學(xué)保藏中心(武漢大學(xué)第一附屬小學(xué)對(duì)面)，郵編：430072，保藏編號(hào)為CCTCC No：P201704。該保藏的水稻種子與普通水稻種子的培養(yǎng)條件一致，喜高溫、多濕、短日照，對(duì)土壤要求不嚴(yán)，在20-32℃、濕潤(rùn)的土壤(pH 5.5-7.5)、正常日照條件下都可較好地生長(zhǎng)。將水稻種子用清水浸泡后，置于恒溫培養(yǎng)箱25-30℃培養(yǎng)48小時(shí)，早晚各換一次水；接著將水稻種子放在墊有濕紗布的平皿中，蓋上蓋子，放在恒溫培養(yǎng)箱25-30℃培養(yǎng)，大約3-4天就可檢測(cè)發(fā)芽情況。

實(shí)施例3抗咪唑啉酮類除草劑粳稻突變體ALS基因克隆

取上述抗除草劑粳稻突變體zhen9的葉片，分別提取突變體zhen9基因組DNA。根據(jù)水稻野生型ALS基因(如Genbank登錄號(hào)XM_015770973.1)所在的染色體序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增ALS基因的特異引物為：正向引物F5’-ATCCGAGCCACACATCGCCTCAC-3’、反向引物R 5’-CTCTTTATGGGTCATTCAGGTCAA-3’。

采用OneTaq^TM Quick2×Master Mix(購(gòu)自NEB公司，貨號(hào)：M0483L)擴(kuò)增ALS基因5’端序列、3’端序列，其反應(yīng)體系如下：

PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序采用兩步法，退火和延伸合為一起，采用68度。

程序如下：預(yù)變性：98℃3min；35個(gè)循環(huán)：變性98℃10sec；延伸68℃1min；保溫：72℃10min。

取2μl PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有預(yù)期大小的片段后(圖2)，剩余的PCR產(chǎn)物經(jīng)PCR清潔試劑盒(購(gòu)自Axygen公司)清潔回收后，克隆至pMD19-T載體(購(gòu)自Takara公司)，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌。每個(gè)轉(zhuǎn)化隨機(jī)挑取12個(gè)大腸桿菌單克隆進(jìn)行PCR檢測(cè)，取PCR結(jié)果呈陽(yáng)性的6個(gè)單克隆，送金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序，獲得突變的ALS基因序列。

實(shí)施例4粳稻M3突變體抗咪唑啉酮類除草劑(百壟通)

將zhen9收獲的種子播種出苗(此為M3)，待M3粳稻幼苗長(zhǎng)至3-4葉期時(shí)，噴施4mL百壟通/L水(推薦最低使用濃度為1mL百壟通/3L水，相當(dāng)于12倍濃度)。噴施除草劑15天后，抗性苗M3呈正常綠色、能繼續(xù)長(zhǎng)高至20-30cm，而非抗性苗葉片失去綠色甚至部分枯黃，植株不長(zhǎng)高，只有5-9cm。30天后，M3抗性株呈正常綠色植株，而噴施同樣濃度除草劑的野生型粳稻都已全部枯死，表明突變粳稻至少抗12倍濃度的百壟通除草劑。

實(shí)施例5粳稻M3突變體的ALS酶活測(cè)定

為了驗(yàn)證粳稻突變體的除草劑抗性是否由ALS突變所致，本發(fā)明人進(jìn)行了ALS酶活性測(cè)定。測(cè)定方法參照Singh等的方法(Singh B.K.,Stidham M.A.,Shaner D.L.Assay of acetohydroxyacid synthase.Analytical Biochemistry,1988,171:173-179.)。具體的，分別取野生型粳稻和zhen9的M3植株葉片0.2g，在研缽中用液氮研磨粉碎，加入2mL提取液(100mM K2HPO4，pH 7.5、10mM丙酮酸鈉、5mM EDTA、1mM纈氨酸、1mM亮氨酸、10mM半胱氨酸、0.1mM黃素腺嘌呤二核苷酸、5mM氯化鎂、10％(V/V)甘油、1％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮)，待提取液解凍后繼續(xù)研磨1min左右。12000rpm、4℃離心30min，吸取上清液，加入硫酸銨使之達(dá)到50％飽和度，于冰上放置半小時(shí)，12000rpm、4℃離心30min，棄上清，將沉淀溶解于0.2mL反應(yīng)緩沖液(100mM K2HPO4，pH 7.0、1mM EDTA、10mM氯化鎂、100mM丙酮酸鈉、1mM焦磷酸硫胺素、0.1mM黃素腺嘌呤二核苷酸)，分別得各植株的ALS提取液。

在獲得的ALS提取液中分別加入10μL除草劑“百壟通”(水劑，有效成分240g/L)，混勻，37℃孵育1h，加0.1ml 3M硫酸終止反應(yīng)，反應(yīng)混合物在60℃反應(yīng)孵育30分鐘便于脫羧，然后加0.4mL顯色液(0.09g/L 1-萘酚和0.009g/L肌酸，用2.5M NaOH溶解)得到混合物液?；旌弦涸?7℃孵育30分鐘進(jìn)行顯色(ALS催化丙酮酸形成乙酰乳酸，乙酰乳酸脫羧形成3-羥基丁酮，再與肌酸和1-萘酚形成粉紅色復(fù)合物，該復(fù)合物在530nm處有最大吸收值)，隨后測(cè)定其530nm的吸光度，ALS活性用A530吸光值表示，A530吸光值的高低反映ALS活性的高低。實(shí)驗(yàn)以水為對(duì)照，野生型、zhen9株系都各測(cè)5個(gè)單株。

A530吸光值測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)野生型、zhen9的ALS提取液中沒(méi)有ALS抑制劑百壟通時(shí)，它們的A530吸光值均在1.2-1.4間，表明野生型和突變體的ALS酶活性無(wú)顯著性差異(圖3，4)；而加入ALS抑制劑百壟通后，野生型的A530吸光值僅為0.3，zhen9的A530吸光值為1.15，即野生型的ALS酶活性僅為對(duì)照的24％，而zhen9的ALS酶活性仍有85％(圖3，4)，突變體的ALS酶活性是野生型的3倍，表明zhen9的突變ALS對(duì)百壟通不敏感，從而賦予了抗性。

實(shí)施例6轉(zhuǎn)基因ALS水稻抗百壟通

設(shè)計(jì)特異引物5’-CGCGGATCCATCCGAGCCACACATCGCCTC-3’和5’-TCCCCGCGGCCTACGGAAAACAACACAC-3’，其5’分別加入BamHI和SacI酶切修飾位點(diǎn)。參考實(shí)施例3的方法，通過(guò)PCR從上述粳稻突變體zhen9的基因組DNA中擴(kuò)增出突變ALS基因，測(cè)序正確后，用BamHI和SacI分別雙酶切突變ALS基因片段和植物表達(dá)載體pCAMBIA1301質(zhì)粒(購(gòu)自pcambia公司)，酶切產(chǎn)物用T4-DNA酶(購(gòu)自TaKaRa公司)連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌。重組質(zhì)粒提取DNA，用BamHI和SacI雙酶切驗(yàn)證，可以產(chǎn)生大的質(zhì)粒片段和小的基因片段(圖5)，證明已將核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的ALS基因克隆至植物表達(dá)載體pCAMBIA1301質(zhì)粒(購(gòu)自pcambia公司)中。將構(gòu)建好的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，培養(yǎng)菌體。采用常規(guī)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化粳型水稻日本晴(購(gòu)自江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺(tái))，獲得轉(zhuǎn)基因植株收種后，后代植株長(zhǎng)至3-4葉期時(shí)，PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株(圖6)。PCR檢測(cè)引物為正向引物35SF 5’-ATGGTTAGAGAGGCTTACGC-3’，反向引物5R 5’-AGCAACAGGTCAGCCTTATCCAC-3’，擴(kuò)增片段涵括CaMV35S啟動(dòng)子和ALS基因的5’端序列，大小約2kb。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系參考實(shí)施例3，PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序采用兩步法，退火和延伸合為一起，采用68度。擴(kuò)增程序如下：預(yù)變性：98℃3min；30個(gè)循環(huán)：變性98℃10sec；延伸68℃2min；保溫：72℃10min。經(jīng)PCR鑒定呈陽(yáng)性后，噴施4mL百壟通/L水(12倍推薦使用濃度)，7天后，參照實(shí)施例5所述方法測(cè)定ALS酶活性，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻的ALS酶活性顯著高于野生型鎮(zhèn)稻18；30天后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻生長(zhǎng)狀態(tài)良好，而非轉(zhuǎn)基因水稻則全部枯死。

盡管本發(fā)明的具體實(shí)施方式已經(jīng)得到詳細(xì)描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解。根據(jù)已經(jīng)公開(kāi)的所有教導(dǎo)，可以對(duì)那些細(xì)節(jié)進(jìn)行各種修改和替換，這些均在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附專利要求極其任何等同物給出。

SEQUENCE LISTING

<110>江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院

<120>粳稻的ALS突變型基因及其蛋白和應(yīng)用

<130>SG20170215001

<160>6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1935

<212> DNA

<213>鎮(zhèn)稻18 ALS突變型基因

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1935)

<400> 1

atg gct acg acc gcc gcg gcc gcg gcc gcc gcc ctg tcc gcc gcc gcg 48

Met Ala Thr Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Ser Ala Ala Ala

1 5 10 15

acg gcc aag acc ggc cgt aag aac cac cag cga cac cac gtc ctt ccc 96

Thr Ala Lys Thr Gly Arg Lys Asn His Gln Arg His His Val Leu Pro

20 25 30

gct cga ggc cgg gtg ggg gcg gcg gcg gtc agg tgc tcg gcg gtg tcc 144

Ala Arg Gly Arg Val Gly Ala Ala Ala Val Arg Cys Ser Ala Val Ser

35 40 45

ccg gtc acc ccg ccg tcc ccg gcg ccg ccg gcc acg ccg ctc cgg ccg 192

Pro Val Thr Pro Pro Ser Pro Ala Pro Pro Ala Thr Pro Leu Arg Pro

50 55 60

tgg ggg ccg gcc gag ccc cgc aag ggc gcg gac atc ctc gtg gag gcg 240

Trp Gly Pro Ala Glu Pro Arg Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val Glu Ala

65 70 75 80

ctg gag cgg tgc ggc gtc agc gac gtg ttc gcc tac ccg ggc ggc gcg 288

Leu Glu Arg Cys Gly Val Ser Asp Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Ala

85 90 95

tcc atg gag atc cac cag gcg ctg acg cgc tcc ccg gtc atc acc aac 336

Ser Met Glu Ile His Gln Ala Leu Thr Arg Ser Pro Val Ile Thr Asn

100 105 110

cac ctc ttc cgc cac gag cag ggc gag gcg ttc gcg gcg tcc ggg tac 384

His Leu Phe Arg His Glu Gln Gly Glu Ala Phe Ala Ala Ser Gly Tyr

115 120 125

gcg cgc gcg tcc ggc cgc gtc tgg gtc tgc gtc gcc acc tcc ggc ccc 432

Ala Arg Ala Ser Gly Arg Val Trp Val Cys Val Ala Thr Ser Gly Pro

130 135 140

ggg gca acc aac ctc gtg tcc gcg ctc gcc gac gcg ctg ctc gac tcc 480

Gly Ala Thr Asn Leu Val Ser Ala Leu Ala Asp Ala Leu Leu Asp Ser

145 150 155 160

gtc ccg atg gtc gcc atc acg ggc cag gtc ccc cgc cgc atg atc ggc 528

Val Pro Met Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Pro Arg Arg Met Ile Gly

165 170 175

acc gac gcc ttc cag gag acg ccc ata gtc gag gtc acc cgc tcc atc 576

Thr Asp Ala Phe Gln Glu Thr Pro Ile Val Glu Val Thr Arg Ser Ile

180 185 190

acc aag cac aat tac ctt gtc ctt gat gtg gag gac atc ccc cgc gtc 624

Thr Lys His Asn Tyr Leu Val Leu Asp Val Glu Asp Ile Pro Arg Val

195 200 205

ata cag gaa gcc ttc ttc ctc gcg tcc tcg ggc cgt cct ggc ccg gtg 672

Ile Gln Glu Ala Phe Phe Leu Ala Ser Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val

210 215 220

ctg gtc gac atc ccc aag gac atc cag cag cag atg gcc gtg ccg gtc 720

Leu Val Asp Ile Pro Lys Asp Ile Gln Gln Gln Met Ala Val Pro Val

225 230 235 240

tgg gac acc tcg atg aat cta cca ggg tac atc gca cgc ctg ccc aag 768

Trp Asp Thr Ser Met Asn Leu Pro Gly Tyr Ile Ala Arg Leu Pro Lys

245 250 255

cca ccc gcg aca gaa ttg ctt gag cag gtc ttg cgt ctg gtt ggc gag 816

Pro Pro Ala Thr Glu Leu Leu Glu Gln Val Leu Arg Leu Val Gly Glu

260 265 270

tca cgg cgc ccg att ctc tat gtc ggt ggt ggc tgc tct gca tct ggt 864

Ser Arg Arg Pro Ile Leu Tyr Val Gly Gly Gly Cys Ser Ala Ser Gly

275 280 285

gac gaa ttg cgc tgg ttt gtt gag ctg act ggt atc cca gtt aca acc 912

Asp Glu Leu Arg Trp Phe Val Glu Leu Thr Gly Ile Pro Val Thr Thr

290 295 300

act ctg atg ggc ctc ggc aat ttc ccc agt gac gac ccg ttg tcc ctg 960

Thr Leu Met Gly Leu Gly Asn Phe Pro Ser Asp Asp Pro Leu Ser Leu

305 310 315 320

cgc atg ctt ggg atg cat ggc acg gtg tac gca aat tat gcc gtg gat 1008

Arg Met Leu Gly Met His Gly Thr Val Tyr Ala Asn Tyr Ala Val Asp

325 330 335

aag gct gac ctg ttg ctt gcg ttt ggt gtg cgg ttt gat gat cgt gtg 1056

Lys Ala Asp Leu Leu Leu Ala Phe Gly Val Arg Phe Asp Asp Arg Val

340 345 350

aca ggg aaa att gag gct ttt gca agc agg gcc aag att gtg cac att 1104

Thr Gly Lys Ile Glu Ala Phe Ala Ser Arg Ala Lys Ile Val His Ile

355 360 365

gac att gat cca gca gag att gga aag aac aag caa cca cat gtg tca 1152

Asp Ile Asp Pro Ala Glu Ile Gly Lys Asn Lys Gln Pro His Val Ser

370 375 380

att tgc gca gat gtt aag ctt gct tta cag ggc ttg aat gct ctg cta 1200

Ile Cys Ala Asp Val Lys Leu Ala Leu Gln Gly Leu Asn Ala Leu Leu

385 390 395 400

caa cag agc aca aca aag aca agt tct gat ttt agt gca tgg cac aat 1248

Gln Gln Ser Thr Thr Lys Thr Ser Ser Asp Phe Ser Ala Trp His Asn

405 410 415

gag ttg gac cag cag aag agg gag ttt cct ctg ggg tac aaa act ttt 1296

Glu Leu Asp Gln Gln Lys Arg Glu Phe Pro Leu Gly Tyr Lys Thr Phe

420 425 430

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Gly Glu Glu Ile Pro Pro Gln Tyr Ala Ile Gln Val Leu Asp Glu Leu

435 440 445

acg aaa ggt gag gca atc atc gct act ggt gtt ggg cag cac cag atg 1392

Thr Lys Gly Glu Ala Ile Ile Ala Thr Gly Val Gly Gln His Gln Met

450 455 460

tgg gcg gca caa tat tac acc tac aag cgg cca cgg cag tgg ctg tct 1440

Trp Ala Ala Gln Tyr Tyr Thr Tyr Lys Arg Pro Arg Gln Trp Leu Ser

465 470 475 480

tcg gct ggt ctg ggc gca atg gga ttt ggg ctg cct gct gca gct ggt 1488

Ser Ala Gly Leu Gly Ala Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala Ala Gly

485 490 495

gct tct gtg gct aac cca ggt gtc aca gtt gtt gat att gat ggg gat 1536

Ala Ser Val Ala Asn Pro Gly Val Thr Val Val Asp Ile Asp Gly Asp

500 505 510

ggt agc ttc ctc atg aac att cag gag ctg gca ttg atc cgc att gag 1584

Gly Ser Phe Leu Met Asn Ile Gln Glu Leu Ala Leu Ile Arg Ile Glu

515 520 525

aac ctc cct gtg aag gtg atg gtg ttg aac aac caa cat ttg ggt atg 1632

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530 535 540

gtg gtg caa tgg gag gat agg ttt tac aag gcg aat agg gcg cat aca 1680

Val Val Gln Trp Glu Asp Arg Phe Tyr Lys Ala Asn Arg Ala His Thr

545 550 555 560

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565 570 575

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Thr Ile Ala Lys Gly Phe Asn Ile Pro Ala Val Arg Val Thr Lys Lys

580 585 590

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Ser Glu Val Arg Ala Ala Ile Lys Lys Met Leu Glu Thr Pro Gly Pro

595 600 605

tac ttg ttg gat atc atc gtc ccg cac cag gag cat gtg ctg cct atg 1872

Tyr Leu Leu Asp Ile Ile Val Pro His Gln Glu His Val Leu Pro Met

610 615 620

atc cca agt ggg ggc gca ttc aag gac atg atc ctg gat ggt gat ggc 1920

Ile Pro Ser Gly Gly Ala Phe Lys Asp Met Ile Leu Asp Gly Asp Gly

625 630 635 640

agg act gtg tat taa 1935

Arg Thr Val Tyr

<210> 2

<211> 644

<212> PRT

<213>鎮(zhèn)稻18 ALS突變型蛋白

<400> 2

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1 5 10 15

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20 25 30

Ala Arg Gly Arg Val Gly Ala Ala Ala Val Arg Cys Ser Ala Val Ser

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

Leu Glu Arg Cys Gly Val Ser Asp Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Ala

85 90 95

Ser Met Glu Ile His Gln Ala Leu Thr Arg Ser Pro Val Ile Thr Asn

100 105 110

His Leu Phe Arg His Glu Gln Gly Glu Ala Phe Ala Ala Ser Gly Tyr

115 120 125

Ala Arg Ala Ser Gly Arg Val Trp Val Cys Val Ala Thr Ser Gly Pro

130 135 140

Gly Ala Thr Asn Leu Val Ser Ala Leu Ala Asp Ala Leu Leu Asp Ser

145 150 155 160

Val Pro Met Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Pro Arg Arg Met Ile Gly

165 170 175

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180 185 190

Thr Lys His Asn Tyr Leu Val Leu Asp Val Glu Asp Ile Pro Arg Val

195 200 205

Ile Gln Glu Ala Phe Phe Leu Ala Ser Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val

210 215 220

Leu Val Asp Ile Pro Lys Asp Ile Gln Gln Gln Met Ala Val Pro Val

225 230 235 240

Trp Asp Thr Ser Met Asn Leu Pro Gly Tyr Ile Ala Arg Leu Pro Lys

245 250 255

Pro Pro Ala Thr Glu Leu Leu Glu Gln Val Leu Arg Leu Val Gly Glu

260 265 270

Ser Arg Arg Pro Ile Leu Tyr Val Gly Gly Gly Cys Ser Ala Ser Gly

275 280 285

Asp Glu Leu Arg Trp Phe Val Glu Leu Thr Gly Ile Pro Val Thr Thr

290 295 300

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305 310 315 320

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325 330 335

Lys Ala Asp Leu Leu Leu Ala Phe Gly Val Arg Phe Asp Asp Arg Val

340 345 350

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355 360 365

Asp Ile Asp Pro Ala Glu Ile Gly Lys Asn Lys Gln Pro His Val Ser

370 375 380

Ile Cys Ala Asp Val Lys Leu Ala Leu Gln Gly Leu Asn Ala Leu Leu

385 390 395 400

Gln Gln Ser Thr Thr Lys Thr Ser Ser Asp Phe Ser Ala Trp His Asn

405 410 415

Glu Leu Asp Gln Gln Lys Arg Glu Phe Pro Leu Gly Tyr Lys Thr Phe

420 425 430

Gly Glu Glu Ile Pro Pro Gln Tyr Ala Ile Gln Val Leu Asp Glu Leu

435 440 445

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450 455 460

Trp Ala Ala Gln Tyr Tyr Thr Tyr Lys Arg Pro Arg Gln Trp Leu Ser

465 470 475 480

Ser Ala Gly Leu Gly Ala Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala Ala Gly

485 490 495

Ala Ser Val Ala Asn Pro Gly Val Thr Val Val Asp Ile Asp Gly Asp

500 505 510

Gly Ser Phe Leu Met Asn Ile Gln Glu Leu Ala Leu Ile Arg Ile Glu

515 520 525

Asn Leu Pro Val Lys Val Met Val Leu Asn Asn Gln His Leu Gly Met

530 535 540

Val Val Gln Trp Glu Asp Arg Phe Tyr Lys Ala Asn Arg Ala His Thr

545 550 555 560

Tyr Leu Gly Asn Pro Glu Cys Glu Ser Glu Ile Tyr Pro Asp Phe Val

565 570 575

Thr Ile Ala Lys Gly Phe Asn Ile Pro Ala Val Arg Val Thr Lys Lys

580 585 590

Ser Glu Val Arg Ala Ala Ile Lys Lys Met Leu Glu Thr Pro Gly Pro

595 600 605

Tyr Leu Leu Asp Ile Ile Val Pro His Gln Glu His Val Leu Pro Met

610 615 620

Ile Pro Ser Gly Gly Ala Phe Lys Asp Met Ile Leu Asp Gly Asp Gly

625 630 635 640

Arg Thr Val Tyr

<210>3

<211> 23

<212> DNA

<213>ALS基因的特異引物正向引物

<400>3

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<210>4

<211> 24

<212> DNA

<213>ALS基因的特異引物反向引物

<400>4

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<210>5

<211> 20

<212> DNA

<213> PCR檢測(cè)引物正向引物35SF

<400>5

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<210>6

<211> 23

<212> DNA

<213> PCR檢測(cè)引物反向引物5R

<400>6

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