本發(fā)明屬于生物
技術領域：
，具體涉及一種用于生產(chǎn)具有耐溫性脂肪酶的基因。
背景技術：
：脂肪酶(Lipase，甘油酯水解酶)隸屬于羧基酯水解酶類，能夠逐步的將甘油三酯水解成甘油和脂肪酸。脂肪酶存在于含有脂肪的動、植物和微生物(如霉菌、細菌等)組織中。包括磷酸酯酶、固醇酶和羧酸酯酶。脂肪酸廣泛的應用于食品、藥品、皮革、日用化工等方面。然而，在脂肪酶的應用中，其活性受溫度影響較大，溫度較高時，脂肪酶的酶活急劇下降，影響其商業(yè)化推廣或應用。技術實現(xiàn)要素：為了解決上述問題，本發(fā)明的目的之一在于提供了一種用于生產(chǎn)具有耐溫性脂肪酶的基因；本發(fā)明的目的之二在于提供一種由所述基因所表達的耐溫性脂肪酶。本發(fā)明是通過以下技術方案來實現(xiàn)的：一種用于生產(chǎn)具有耐溫性脂肪酶的基因，所述基因的序列如下：一種由上述基因所表達的耐溫性脂肪酶。較佳地，所述耐溫性脂肪酶于50～60℃下處理50～90分鐘后的酶活為87.5％～90.6％。應用上，所述耐溫性脂肪酶可用于增白面制品，如面條，或增白烘焙制品，如饅頭等。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果：本發(fā)明的基因所表達的脂肪酶耐溫性良好、具有開發(fā)潛力，具有廣泛和實際的應用價值，如可用于面制品與烘焙制品的增白。附圖說明圖1是本發(fā)明線性化質(zhì)粒APYLL-pPICZαA的瓊脂糖電泳檢測，其中，線M，DL15000bpmarker；線2，線性化APYLL-pPICZαA。圖2是BMMY-羅丹明B平板法篩選重組子的示意圖。具體的實施方式下面結合具體實施方式對本發(fā)明作進一步的詳細說明，以助于本領域技術人員理解本發(fā)明。本發(fā)明用于生產(chǎn)具有耐溫性脂肪酶的基因(用APYLL-pPICZαA表示)的序列如下：一、基因的表達寄主：畢赤酵母菌株X-33和GS115。當然，可表達脂肪酶基因的其他寄主都可應用至本發(fā)明?；蚝铣桑罕景l(fā)明用于生產(chǎn)具有耐溫性脂肪酶的基因由上海捷瑞公司合成。1.1表達菌株構建1.1.1質(zhì)粒提取參照廣州東盛質(zhì)粒小提試劑盒使用說明書。1.1.2重組質(zhì)粒APYLL-pPICZαA的線性化和回收將所得的重組質(zhì)粒APYLL-pPICZαA用SacI進行線性化處理，37℃下酶切反應1h，反應體系如下：將酶切反應溶液混勻后放置于37℃水浴，1h后取出，用凝膠純化回收試劑盒進行回收(參見天根膠回收試劑盒使用說明書)。1.1.3畢赤酵母菌株感受態(tài)的制備及電轉(zhuǎn)化參見Invitrogen的pPICZαA,B,andC用戶操作手冊。1.1.4結果將經(jīng)酶切驗證和測序驗證后正確的重組質(zhì)粒APYLL-pPICZαA用SacI進行線性化處理，酶切產(chǎn)物回收后用1％瓊脂糖凝聚電泳進行鑒定，結果如圖1所示。1.2具脂肪酶活性的轉(zhuǎn)化子的篩選1.2.1初篩挑取YPDS平板上生長最快的單克隆子分別點接于YPD(用于保種)和BMMY-羅丹明B平板(用于誘導)平板上，30℃倒置恒溫培養(yǎng)3～5d；每隔24h在BMMY-羅丹明B平板的蓋子上添加100μL甲醇對重組子進行誘導表達，在培養(yǎng)過程中，根據(jù)水解圈的相對大小選出脂肪酶酶活性最強的10個轉(zhuǎn)化子，依次編號為1#，2#，3#～10#，平板篩選結果如圖2所示。1.2.2復篩將選定的10個轉(zhuǎn)化子分別接種含10mLBMGY液體培養(yǎng)基中(100mL規(guī)格搖瓶)，30℃250rpm培養(yǎng)至OD600＝6.0；3,000g離心5min收集菌體，用2mLBMMY液體培養(yǎng)基重懸細胞后轉(zhuǎn)移至50mLBMMY液體培養(yǎng)基中，使其OD600＝1.0；30℃250rpm繼續(xù)誘導培養(yǎng)，每隔24h添加一次甲醇使其終濃度為0.5％，48h后開始取樣測酶活性，取樣時間點為48h、72h、96h、120h，所取樣品在3,000g離心3min后收集上清，采用滴定法測脂肪酶酶活性，確定活性最高的轉(zhuǎn)化子及其誘導條件。1.2.3結果選取初篩獲得的脂肪酶活性較高的10個轉(zhuǎn)化子進一步進行篩選，觀察其三角瓶水平的表達情況，采用堿性滴定法測定發(fā)酵液上清中的脂肪酶活性，APYLL-pPICZαA的酶活測定結果見表1。表1搖床水平三角瓶中各轉(zhuǎn)化子的脂肪酶酶活性誘導時間(h)APYLL-pPICZαA酶活性(U/mL)484272559657120551.3脂肪酶活力測定本實驗采用堿式滴定法測定脂肪酶活力。1.3.1原理脂肪酶在一定條件下，能使甘油三脂水解成脂肪酸、甘油二酯、甘油單脂和甘油，所釋放的脂肪酸可用標準堿溶液進行中和滴定，用PH計或酚肽指示液指示反應終點，根據(jù)消耗的堿量，計算其酶活力。反應式為：RCOOH+NaOH→RCOONa+H2O1.3.2操作步驟1)取兩個50ml三角瓶，分別于空白管(A)和樣品管(B)中各加入底物溶液4.00ml橄欖油乳化液(橄欖油：PVA＝1:3，v/v)和5.00ml磷酸緩沖液(100mM,pH7.0),再于A管中加入95％乙醇15.00ml，于40℃水浴中預熱5min，然后于A、B管中各加待測酶液1.00ml，立即混勻計時，于40℃水浴中準確反應10min，于B管中立即補加95％乙醇15.0ml終止反應，取出；2)于空白和樣品溶液中各加酚肽指示液2滴，用50mMNaOH標準溶液滴定，直至微紅色并保持30s不褪色為滴定終點，記錄消耗50mMNaOH標準溶液的體積。1.3.3酶活計算酶活定義:1g固體酶粉(或1mL液體酶)，在40℃溫度和pH7.0條件下，1min水解橄欖油(oliveoil)產(chǎn)生1μmol的可滴定的脂肪酸，即為1個酶活力單位，以U/g(U/ml)表示。計算方法：脂肪酶制劑的酶活力按下式計算X1＝(V1-V2)*c*50*n1/0.05*1/10式中：X1-----樣品的酶活力，U/g(U/ml)V1----滴定樣品時消耗氫氧化鈉標準溶液的體積,單位為毫升(ml)；V2----滴定空白時消耗氫氧化鈉標準溶液的體積,單位為毫升(ml)c----氫氧化鈉標準溶液濃度，單位為摩爾每升(mol/L)；50---0.05mol/L氫氧化鈉溶液1.00ml相當于脂肪酸50μmol；n1----樣品的稀釋倍數(shù)；0.05----氫氧化鈉標準溶液濃度換算系數(shù)；1/10----反應時間10min,以1min計。所得結果表示至整數(shù)。1.3.4耐溫性測試以上述脂肪酶活力測定方法測試結果。對比例：LBK-B4000(饅頭專用脂肪酶，綠微康)：46.5mg蛋白/g粉末(蛋白含量4.65％)；LipozymeTL100L(用于油脂加工，Novozymes)：24.2mg蛋白/mL原酶液(蛋白含量2.42％)；CaL-B(用于有機合成，Novozymes)：9.24mg蛋白/mL原酶液(蛋白含量0.924％)。將APYLL-pPICZαA發(fā)酵上清液、LBK-B4000的稀釋液(稀釋100倍)、LipozymeTL100L的稀釋液(稀釋100倍)和CaL-B的原酶液置于50℃～60℃下溫浴(本實施例中取60℃)，分別于10、20、30、40、50、60、90和135min去樣測殘余酶活，以初始發(fā)酵上清液的酶活為100％。測試結果如下表2所示：表2：各脂肪酶酶在:60℃下的穩(wěn)定性由表2可知：APYLL-pPICZαA的耐溫性得到很大的提高，60℃下的穩(wěn)定性超過135分鐘，LBK-B4000于60℃下的穩(wěn)定性為90分鐘，LipozymeTL100L于60℃下的穩(wěn)定性為60分鐘，CaL-B于60℃下的穩(wěn)定性為60分鐘。在耐溫性方面，我們在研究的脂肪酶APYLL-pPICZαA具有開發(fā)潛力。二、應用通過將本發(fā)明的基因APYLL-pPICZαA在酵母上高效表達后獲得耐溫性的脂肪酶，再通過現(xiàn)有的配方優(yōu)化獲得了兩個樣品FNL-25000與FSL-20000，能分別被應用于面制品與烘焙制品的增白。其中，將脂肪酶優(yōu)化以適用于面制品或烘焙制品中屬于現(xiàn)有技術，在此不再贅述。2.1脂肪酶FNL-25000面條增白效果實驗2.1.1、實驗目的測試脂肪酶FNL-25000在白鹽面條中的增白效果2.1.2實驗主要原料面粉：山東中筋基礎粉脂肪酶：FNL-250002.1.3實驗配方及工藝表3、面條配方原料用量/g面粉100食鹽1水33面條工藝：加水和面；松弛；壓面機壓面；整型，制成面條和面片。2.1.4實驗結果表4、FNL-25000測試結果從上表可知，隨著FNL-25000濃度的增加，面條和面片白度依次遞增。2.1.5實驗結論以山東中筋基礎粉為面粉原料，添加脂肪酶FNL-25000，面條白度明顯增加，添加量越大，面條白度越大。2.2脂肪酶FSL-20000饅頭增白效果實驗2.2.1、實驗目的測試脂肪酶FSL-20000在北方饅頭中增白效果2.2.2實驗主要原料面粉：山東中筋基礎粉；河北中筋基礎粉脂肪酶：FSL-200002.2.3實驗配方及工藝表5、饅頭配方原料用量/g面粉100酵母0.8水462.2.4饅頭工藝加水和面→壓面機壓面→手工搓圓→醒發(fā)→蒸煮2.2.5實驗結果表6、FSL-20000測試結果山東中筋基礎粉及河北中筋基礎粉隨著FSL-20000添加濃度的增加，饅頭表皮白度依次增加。2.2.6結論以山東中筋基礎粉和河北中筋基礎粉為面粉原料，添加了脂肪酶FSL-20000，饅頭表皮白度明顯增加，隨著添加量的增加，饅頭表皮白度呈上升趨勢。申請人：東莞泛亞太生物科技有限公司發(fā)明名稱：用于生產(chǎn)具有耐溫性脂肪酶的基因序列特征：用于生產(chǎn)具有耐溫性脂肪酶的基因的基因全序列序列描述：GAATTCGTCTACACCTCTACCGAGACCTCTCACATCGACCAGGAGTCTTACAACTTCTTCGAGAAGTACGCCAGATTGGCCAATATCGGTTACTGCGTCGGACCTGGAACCAAGATTTTCAAGCCATTCAACTGCGGTTTGCAATGCGCACACTTCCCAAACGTCGAGTTGATCGAGGAGTTCCATGACCCTAGATTGATCTTTGACGTCTCTGGTTACTTGGCCGTCGACCACGCATCTAAGCAAATCTACTTGGTCATCAGAGGAACACACTCTTTGGAGGATGTCATCACCGACATTAGAATCATGCAGGCACCATTGACCAACTTCGACTTGGCAGCCAACATCTCTTCTACAGCAACCTGCGACGACTGTTTGGTCCACAACGGTTTCATCCAGTCTTACAACAACACCTACAATCAAATCGGTCCAAAGTTGGACTCTGTCATCGAGCAGTACCCTGATTACCAAATCGCTGTTACTGGTCACTCTTTGGGTGGTGCTGCCGCCTTGTTGTTCGGTATCAACTTGAAGGTCAACGGTCACGACCCTTTGGTCGTTACCTTGGGACAACCAATTGTCGGAAACGCTGGTTTCGCCAACTGGGTCGACAAGTTGTTCTTCGGTCAAGAAAACCCTGACGTTTCTAAGGTCTCTAAGGACAGAAAGTTGTACAGAATCACCCACAGAGGAGATATCGTCCCACAGGTCCCTTTTTGGGACGGATACCAGCATTGCTCTGGTGAGGTTTTCATCGACTGGCCTTTGATTCACCCTCCTTTGTCTAACGTCGTCATGTGCCAGGGTCAGTCTAACAAGCAATGTTCTGCCGGTAACACATTGTTGCAGCAGGTTAATGTCATCGGTAACCACTTGCAATACTTCGTCACTGAGGGTGTCTGCGGAATTTAAGCGGCCGC。當前第1頁1 2 3