本發(fā)明屬于分子生物和遺傳學(xué)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一種利用線粒體上的單核苷酸多態(tài)性位點作為分子標(biāo)記鑒定日本血吸蟲地域株的方法以及線粒體DNA在日本血吸蟲群體的遺傳變異和進化方面中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：日本血吸蟲是一種人獸共患寄生蟲，主要流行于東亞及東南亞地區(qū)。目前，我國尚有12個血吸蟲病流行省(直轄市、自治區(qū))，約2億人受此病威脅，18萬人受到感染。流行地區(qū)主要分為西南山區(qū)和長江中下游湖沼區(qū)2種生態(tài)類型，不同的生態(tài)環(huán)境內(nèi)可能存在不同的蟲株，而不同的蟲株對宿主的感染力和致病性可能存在差異。近年來，眾多的分子標(biāo)記被應(yīng)用于日本血吸蟲的群體地域遺傳研究中，如等位酶、限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、隨機擴增多態(tài)性(RAPD)、微衛(wèi)星(STR)等。然而，日本血吸蟲的線粒體基因組序列全長為14085nt，包括12個蛋白編碼基因、22個tRNA基因和2個rDNA基因(參考序列GenBankID:10445372)。因此，從這些基因中找到地域高相關(guān)性基因，從而鑒別日本血吸蟲的不同地域株、鑒定血吸蟲病患者的初始感染地，對于我國血吸蟲病的預(yù)防和控制有重要意義。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的就是提供一種鑒別日本血吸蟲地域特異性的方法及檢測試劑盒。本發(fā)明第一方面，提供了一種鑒別日本血吸蟲地域特異性的方法，包括步驟：i)日本血吸蟲ND2基因特異性引物擴增樣品的日本血吸蟲ND2基因，得到擴增產(chǎn)物；和2)檢測擴增產(chǎn)物是否存在以下單核苷酸多態(tài)性SNP位點：第30位T→A；和/或第881位G→A；其中，核苷酸位置編號基于SEQIDNO:1。在另一優(yōu)選例中，當(dāng)?shù)?0位為T和/或第811位為G時，所述的日本血吸蟲為湖區(qū)日本血吸蟲；或當(dāng)?shù)?0位為A和/或第811位為A時，所述的日本血吸蟲為山區(qū)日本血吸蟲。在另一優(yōu)選例中，所述的日本血吸蟲樣本包括蟲卵、毛蚴、尾蚴、和/或成蟲樣本。在另一優(yōu)選例中，所述的湖區(qū)日本血吸蟲包括中國長江中下游湖區(qū)日本血吸蟲。在另一優(yōu)選例中，所述的山區(qū)日本血吸蟲包括中國西南山區(qū)日本血吸蟲。本發(fā)明第二方面，提供了一種日本血吸蟲ND2基因或其單核苷酸多態(tài)性位點在制備鑒別日本血吸蟲地域特異性和/或判斷血吸蟲病初始感染地的試劑或試劑盒中的用途，其中所述的單核苷酸多肽性(SNP)位點是：第30位T→A；第881位G→A；其中，核苷酸位置編號基于SEQIDNO:1。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑包括引物、探針、芯片、或抗體。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒含有一種或多種選自下組的試劑：(a)日本血吸蟲ND2基因或一種或多種所述SNP位點的特異性引物；(b)用于檢測一種或多種所述SNP位點的特異性探針；(c)用于檢測一種或多種所述SNP位點的芯片；(d)用于檢測一種或多種所述SNP位點所對應(yīng)的氨基酸突變的特異性抗體。在另一優(yōu)選例中，所述的特異性引物具有SEQIDNO:2-3所示的序列。本發(fā)明第三方面，提供了一種檢測日本血吸蟲地域特異性和/或判斷血吸蟲病初始感染地的試劑盒，它包括：(a)日本血吸蟲ND2基因或一種或多種SNP位點的特異性引物；(b)用于檢測一種或多種SNP位點的特異性探針；(c)用于檢測一種或多種SNP位點的芯片；(d)用于檢測一種或多種SNP位點所對應(yīng)的氨基酸突變的特異性抗體；其中所述的單核苷酸多肽性(SNP)位點是：第30位T→A；第881位G→A；其中，核苷酸位置編號基于SEQIDNO:1。在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒含有特異性擴增日本血吸蟲ND2基因單核苷酸多態(tài)性的特異性引物，并且所述的引物擴增出的擴增產(chǎn)物的長度為100-2000bp。在另一優(yōu)選例中，所述的特異性引物具有SEQIDNO:2-3所示的序列。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還任選地含有選自下組的試劑：(a)與所述SNP位點的結(jié)合的探針；(b)識別所述SNP位點的限制性內(nèi)切酶。本發(fā)明第四方面，提供了一種試劑在制備檢測檢測日本血吸蟲地域特異性和/或判斷血吸蟲病初始感染地的試劑盒的用途，其中所述試劑選自下組：(a)日本血吸蟲ND2基因的特異性引物；(b)用于檢測一種或多種所述SNP位點的特異性探針；(c)用于檢測一種或多種所述SNP位點的芯片；或(d)用于檢測一種或多種所述SNP位點所對應(yīng)的氨基酸突變的特異性抗體。本發(fā)明第五方面，提供了一種多核苷酸，所述的多核苷酸如SEQIDNO.:4-48所示。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附圖說明圖1為中國大陸9個流行區(qū)(安徽貴池、安徽銅陵、湖南岳陽、湖南常德、湖北武漢、江西南昌、江西都昌、四川西昌和云南洱源)的日本血吸蟲樣本線粒體序列在本發(fā)明提供的第一個單核苷酸多態(tài)性位(ND2基因第30個堿基)的序列比對結(jié)果。其中：GC代表安徽貴池，TL代表安徽銅陵，LG代表湖南岳陽，WY代表湖南常德，WH代表湖北武漢，NC代表江西南昌，DC代表江西都昌，SC代表四川西昌，YN代表云南洱源。圖2為中國大陸9個流行區(qū)(安徽貴池、安徽銅陵、湖南岳陽、湖南常德、湖北武漢、江西南昌、江西都昌、四川西昌和云南洱源)的日本血吸蟲樣本線粒體序列在本發(fā)明提供的第二個單核苷酸多態(tài)性位點(ND2基因第811個堿基)的序列比對結(jié)果。各縮寫代表地域同圖1.具體實施方式本發(fā)明人經(jīng)過深入而廣泛的研究，對大量候選基因的SNP進行了測定和分析。首次發(fā)現(xiàn)和證明了日本血吸蟲ND2基因組序列與日本血吸蟲地域特異性密切相關(guān)，因此可作為輔助性檢測日本血吸蟲地域特異性(或其易感性)的特異性SNP。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。具體地，本發(fā)明人通過對119個來自不同流行區(qū)的日本血吸蟲成蟲線粒體基因組全序列進行二代測序和序列比對篩選所獲得了2個來源于ND2基因的單核苷酸多態(tài)性位點，這2個單核苷酸多態(tài)性位點可作為鑒別日本血吸蟲在中國區(qū)域山區(qū)和湖區(qū)株的有效遺傳標(biāo)記。基于本發(fā)明成果，通過簡單的PCR擴增和測序，就能分辨來自中國西南山區(qū)和長江中下游湖沼區(qū)的日本血吸蟲，有助于準(zhǔn)確、快速地鑒定血吸蟲病患者的初始感染地，判斷是否異地感染的輸入性病例，并為研究日本血吸蟲的遺傳和進化提供了依據(jù)。日本血吸蟲線粒體基因ND2自上世紀(jì)80年代以來，線粒體DNA(mtDNA)分析方法在遺傳學(xué)、系統(tǒng)分類學(xué)、分子生態(tài)學(xué)、群體遺傳及人類學(xué)等方面得到了廣泛的應(yīng)用。線粒體DNA具有分子結(jié)構(gòu)簡單、無內(nèi)含子，突變率高、進化速度快，穩(wěn)定母系遺傳、無重組等特點，非常有利于進行遺傳進化及親緣學(xué)分析，已經(jīng)成為相關(guān)領(lǐng)域中應(yīng)用最廣泛的分子標(biāo)記。近年來，眾多的分子標(biāo)記被應(yīng)用于日本血吸蟲的群體遺傳研究中，如等位酶、限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、隨機擴增多態(tài)性(RAPD)、微衛(wèi)星(STR)等。然而線粒體基因作為一種中性的分子標(biāo)記，因其突變率高、進化速度快(是核基因的四倍)、遺傳穩(wěn)定的特點，在日本血吸蟲遺傳分類鑒定方面，具有更大的優(yōu)勢。日本血吸蟲的線粒體基因組序列全長為14085nt，包括12個蛋白編碼基因、22個tRNA基因和2個rDNA基因(參考序列GenBankID:10445372)。其中NADH脫氫酶第二亞基(NADHdehydrogenasesubunit2，ND2)基因全長855nt，編碼284個氨基酸，是遺傳分析中常用的線粒體基因之一。日本血吸蟲ND2基因的應(yīng)用基于本發(fā)明的新發(fā)現(xiàn)，日本血吸蟲ND2基因、蛋白或多肽有多方面的新用途。這些用途包括(但不限于)：用于輔助性診斷日本血吸蟲地域特異性，或用于篩選用于檢測日本血吸蟲地域特性的物質(zhì)，如抗體、多肽或其它配體。另一方面，本發(fā)明還包括對ND2DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于日本血吸蟲ND2基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與日本血吸蟲ND2基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體。本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進行制備。例如，純化的日本血吸蟲ND2基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備。本發(fā)明的各類抗體可以利用日本血吸蟲ND2基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與日本血吸蟲ND2基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)抗人ND2蛋白的抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中，檢測樣本ND2蛋白的多少和/或突變與否。一種優(yōu)選的抗ND2抗體是不識別正常ND2但識別突變ND2的抗體，或者識別正常ND2但不識別突變ND2的抗體。利用這些抗體，可以方便地進行蛋白質(zhì)水平的日本血吸蟲地域特異性檢測。本發(fā)明還涉及定量和定位檢測人ND2蛋白水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領(lǐng)域所熟知的，且包括ELISA等。一種檢測檢測樣品中是否存在ND2蛋白的方法是利用ND2蛋白的特異性抗體進行檢測，它包括：將樣品與ND2蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在ND2蛋白。最方便的檢測本發(fā)明SNP的方法，是通過用日本血吸蟲ND2基因特異性引物擴增樣品的日本血吸蟲ND2基因，得到擴增產(chǎn)物；然后檢測擴增產(chǎn)物中是否存在本發(fā)明單核苷酸多肽性。例如，可通過測序或特異性探針進行檢測。應(yīng)理解，在本發(fā)明首次揭示了日本血吸蟲ND2基因的SNP與日本血吸蟲地域特異性的相關(guān)性之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以方便地設(shè)計出可特異性擴增出含該SNP位置的擴增產(chǎn)物，然后通過測序等方法確定是否存在本發(fā)明所揭示的SNP或突變。通常，引物的長度為15-50bp，較佳地為20-30bp。雖然引物與模板序列完全互補是優(yōu)選的，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，在引物與模板存在一定的不互補(尤其是引物的5’端)的情況下，也能夠特異性地擴增(即僅擴增出所需的片段)。含有這些引物的試劑盒和使用這些引物的方法都在本發(fā)明范圍之內(nèi)，只要該引物擴增出的擴增產(chǎn)物含有本發(fā)明SNP的對應(yīng)位置。雖然擴增產(chǎn)物的長度沒有特別限制，但是通常擴增產(chǎn)物的長度為100-2000bp，較佳地為150-1500bp，更佳地為200-1000bp。一種優(yōu)選擴增產(chǎn)物可分別含有SEQIDNO:1中第30位和第811位，更優(yōu)選地，所述擴增產(chǎn)物同時含有SEQIDNO:1中第30位和第811位。在本發(fā)明中，提供了一種可同時擴增這兩個位點的引物，其優(yōu)選序列如SEQIDNO.:2-3所示。(TTTGCCATAGTTCGTTTTCC，SEQIDNO.:2；AACCTTATTCGGACCCTTAC，SEQIDNO.:3)一種優(yōu)選的檢測方法包括步驟：(1)采集血吸蟲成蟲，提取單個蟲體的基因組DNA；(2)以線粒體基因組全序列(GenBankID:10445372)為模板，設(shè)計并合成擴增2個單核苷酸多態(tài)性位點所在線粒體片段的特異性引物對；(3)在適當(dāng)條件(已優(yōu)化)下用(1)中所提取的單條血吸蟲成蟲DNA為模板，用(2)中所設(shè)計的引物進行PCR擴增(4)對PCR產(chǎn)物進行純化并測序；(5)閱讀測序結(jié)果，定位所選的SNP位置，通過2個位點上的堿基類型快速判斷日本血吸蟲個體的來源地，即，來源于湖區(qū)或者是山區(qū)。較佳地，步驟(3)所述已優(yōu)化的PCR反應(yīng)體系為：每個PCR反應(yīng)(總體積20μl)包含DNA聚合酶(TaKaRa)1.25U，10XPCRBuffer2μl(Mg2+終濃度1.5mM)，dNTPMixture2μl(dATP,dGTP,dCTP,dTTP,終濃度各0.25mM)，特異性上下游引物各0.5μmol，日本血吸蟲基因組DNA20～30ng。步驟(3)所述優(yōu)化的PCR擴增程序為：①94℃預(yù)變性10min；②94℃變性30s；③49℃退火30s；④72℃延伸90s；⑤步驟②—④重復(fù)35個循環(huán)后，72℃延伸5min。試劑盒本發(fā)明還提供了一種檢測日本血吸蟲地域特異性的試劑盒，它包括：(a)日本血吸蟲ND2基因或一種或多種SNP位點的特異性引物；(b)用于檢測一種或多種SNP位點的特異性探針；(c)用于檢測一種或多種SNP位點的芯片；(d)用于檢測一種或多種SNP位點所對應(yīng)的氨基酸突變的特異性抗體；其中所述的單核苷酸多肽性(SNP)位點是：第30位T→A；第881位G→A；其中，核苷酸位置編號基于SEQIDNO:1。優(yōu)選地，所述試劑盒含有特異性擴增日本血吸蟲ND2基因單核苷酸多態(tài)性的特異性引物，并且所述的引物擴增出的擴增產(chǎn)物的長度為100-2000bp。更佳地，所述的特異性引物具有SEQIDNO:2-3所示的序列。更佳地，所述的試劑盒還任選地含有選自下組的試劑：(a)與所述SNP位點的結(jié)合的探針；(b)識別所述SNP位點的限制性內(nèi)切酶。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于：本發(fā)明提供的2個單核苷酸多態(tài)性位點可作為鑒別日本血吸蟲在中國區(qū)域山區(qū)和湖區(qū)株的有效遺傳標(biāo)記?；诒景l(fā)明成果，通過簡單的PCR擴增和測序，就能分辨來自中國西南山區(qū)和長江中下游湖沼區(qū)的日本血吸蟲，有助于準(zhǔn)確、快速地鑒定血吸蟲病患者的初始感染地，判斷是否異地感染的輸入性病例，并為研究日本血吸蟲的遺傳和進化提供了依據(jù)。下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨?NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量份數(shù)。實施例1中國大陸不同流行區(qū)的日本血吸蟲所屬群體區(qū)分方法：(1)收集來自安徽貴池(GC)、安徽銅陵、湖南岳陽、湖南常德、湖北武漢、江西南昌、江西都昌、四川西昌和云南洱源這9個流行區(qū)的日本血吸蟲樣本，提取單個個體的基因組DNA。用于提取高質(zhì)量基因組DNA的試劑為QIAGEN公司(德)生產(chǎn)的DNeasyBlood&TissueKit試劑盒。具體方法如下：將單條日本血吸蟲成蟲放入1.5mlEP管中，加入1.0mMEDTA和10mMTris緩沖液500μl。振蕩后吸盡液體，重復(fù)三次。加入試劑盒中提供的ATL緩沖液180μl；加入20μl蛋白酶K，振蕩混勻。在56℃水浴中孵育4h，中間振蕩數(shù)次。從水浴中取出后振蕩15s，加入200μl緩沖液AL，振蕩混勻。再加入200μl95％以上的乙醇，混勻。將所有液體移入DNeasy抽提柱里，8000g離心1min，棄濾液。向抽提柱中加入500μl緩沖液AW1，8000g離心1min，棄濾液。再向抽提柱中加入500μl緩沖液AW2，12000g離心3min，棄濾液。保留的抽提柱移入新的EP管中，加入150μl緩沖液AE(或ddH2O)。室溫下靜置1min，12000g離心1min。濾液中即含有基因組DNA，-20℃保存。獲得的基因組DNA如下表所示：樣本號SEQIDNO.:樣本縮寫14dc25dc136dc247dc358dc469gc710gc1811gc2912gc31013gc41114lg1215LG11316LG21417LG31518LG41619NC11720NC21821NC31922NC42023NC52124SC2225SC12326SC22427SC32528SC42629TL2730TL12831TL22932TL33033TL43134WH3235WH13336WH23437WH33538WH43639WY3740WY13841WY23942WY34043WY44144YN4245YN14346YN24447YN34548YN4(2)合成特異性擴增引物的方法為固相亞磷酰胺三酯法，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，用PAGE法純化。(3)所用PCR反應(yīng)體系為20μl：包括2μl10×Buffer，四種dNTP各0.25mM，TaqDNA聚合酶1.25U，上、下游引物各0.5μmol，模板DNA20—30ng。擴增反應(yīng)在LifeProPCR儀上進行，反應(yīng)條件為：①94℃預(yù)變性10min；②94℃變性30s；③49℃退火30s；④72℃延伸90s；⑤步驟②—④重復(fù)35個循環(huán)后，72℃延伸5min。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至華大基因上海分公司進行測序。采用ABI3730進行雙向測序，測序引物即擴增所用引物。測序結(jié)果經(jīng)拼接和人工校對后，用MEGA5.1軟件進行多序列聯(lián)配，以展示多態(tài)性位點。結(jié)果如圖1和圖2所示，在本發(fā)明所提供的、可用于鑒定日本血吸蟲地域株的2個單核苷酸多態(tài)性位點處，來自長江中下游湖區(qū)7個地點(安徽貴池、安徽銅陵、湖南岳陽、湖南常德、湖北武漢、江西南昌及江西都昌)的樣本均與來自西南山區(qū)2個地點(四川西昌和云南洱源)的樣本有明顯的堿基差異。圖1所示為ND2基因第30個堿基處的T/A突變，圖2所示為ND2基因第811個堿基處的G/A突變。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3