本發(fā)明涉及一種用于動物源成分鑒別的方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：肉類食品是人們獲取高質(zhì)量蛋白的主要渠道，肉類食品的質(zhì)量與人類健康密切相關(guān)。據(jù)報(bào)道，2012年全世界人類每年消耗的肉類產(chǎn)品約2.84億噸，我國肉類年消耗量約占全世界消耗量的四分之一，其中加工和半加工肉類食品占4％，且這些數(shù)字呈逐年大幅升高的趨勢，人們對肉制品的需求日益提高。而近年來，在國內(nèi)及國際貿(mào)易中牛、羊肉中攙雜價(jià)格便宜的豬肉，以次充好的欺騙行為屢見不鮮，在清真肉品種摻豬肉以代替牛羊肉更是嚴(yán)重冒犯了廣大具有伊斯蘭教信仰的消費(fèi)者，影響民族團(tuán)結(jié)，這些摻假行為極大損害了消費(fèi)者的利益。DNA是一切物種的遺傳信息，隨著分子生物學(xué)和生物信息學(xué)手段的發(fā)展，以DNA為基礎(chǔ)的物種鑒別發(fā)展迅速。動物物種進(jìn)化的分子生物學(xué)研究對象涉及從門到種的各類生物，為深加工肉制品鑒別，特別是的非常規(guī)肉源的鑒別，提供借鑒。通過現(xiàn)有的分子生物學(xué)分類和進(jìn)化研究提供了大量與生物分類進(jìn)化相關(guān)的目的序列。目前常用于動物物種進(jìn)化研究的序列有以下幾種：線粒體DNA(mtDNA)、細(xì)胞核內(nèi)的小衛(wèi)星DNA、微衛(wèi)星DNA、單拷貝DNA及核糖體DNA(rDNA)。其中線粒體DNA(mtDNA)是共價(jià)閉合的環(huán)狀雙鏈DNA，分子量小，拷貝數(shù)高，基因組結(jié)構(gòu)簡單，較易于純化，并具有保守區(qū)和變異區(qū)，既可以有效地用于種內(nèi)不同種群及近緣種的研究，又可用于較高分類階元分析。mtDNA用于目水平上的親緣關(guān)系分析，與染色體核酸分析基本吻合。而且現(xiàn)有的線粒體數(shù)據(jù)庫為開放性數(shù)據(jù)庫，目前具有約幾千個物種的線粒體序列，隨著測序技術(shù)的提高該數(shù)據(jù)庫將不斷擴(kuò)充。20世紀(jì)80年代，國外開始了基于DNA的肉的種屬鑒定研究，采用的方法主要有DNA雜交、免疫擴(kuò)散和等電點(diǎn)聚焦等。這些方法大都存在著成本高，工作量大，檢測對象要求高等缺點(diǎn)。目前，針對摻假行為的檢測研究主要基于核酸擴(kuò)增的聚合酶鏈反應(yīng)(PolymeraseChainReaction，PCR)方法，檢測速度快，靈敏和特異性強(qiáng)。但目前以DNA為基礎(chǔ)的物種鑒別研究主要關(guān)注尋找不同物種的特異基因進(jìn)行種及以上水平物種鑒別。當(dāng)前的研究已能夠高效鑒別差異很小的物種。而且該方法對同時(shí)鑒別多種肉類較為局限。1999年Meat Science期刊53卷題為《一種快速簡單的PCR檢測方法用于肉品種及肉產(chǎn)品的鑒別》(AquickandsimplemethodfortheidentificationofmeatspeciesandmeatproductsbyPCRassay)中，Matsunaga等建立了多重PCR技術(shù),通過7種按適當(dāng)比例混合的引物,用多重PCR，也僅能同時(shí)對食品中的6種肉——牛肉、豬肉、雞肉、山羊、綿羊和馬肉中限制性DNA片段進(jìn)行檢測。中國肉類食品綜合研究中心周彤等于2015年6月發(fā)表了一種基于多重實(shí)時(shí)熒光PCR溶解曲線的鑒別肉或肉制品中動物源成分的方法(中國專利申請?zhí)?01510061793.2)。該方法設(shè)計(jì)5對特異性引物用于多重實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，以鑒別肉及肉制品中的豬、牛、綿羊、山羊、雞、鴨、狗、狐或貉共9種動物源成分?，F(xiàn)有PCR檢測方法都只針對某種動物源成份進(jìn)行分析。在檢測復(fù)雜動物源成份的樣品時(shí)，需要對可能的成分逐一分析。而且受引物種類的局限，所得到的物種結(jié)果也非常有限。而且研究發(fā)現(xiàn)，隨著多重PCR引物的增多，容易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，引物間相互作用易造成假陰性，檢出率大大降低。隨即擴(kuò)增多態(tài)性(RandomAmplificationPolymorphicDNA，RAPD)-PCR技術(shù)可以通過未知成分模版隨機(jī)擴(kuò)增的產(chǎn)物條帶圖譜，反映樣本成份組成。在文獻(xiàn)《基于PCR的指紋圖譜技術(shù)用于肉制品中動物種類的快速鑒別》(PCR-basedfingerprintingtechniquesforrapiddetectionofanimalspeciesinmeatproducts)(MeatScience,2004，66:659-665)中，Saez等就利用RAPD-PCR為基礎(chǔ)的PCR指紋圖譜技術(shù),對5種不同的肉類進(jìn)行了鑒定。但該方法由于需要預(yù)先建立指紋圖庫，對于不常見的肉源成份無法及時(shí)給出確切結(jié)果。所以目前傳統(tǒng)PCR擴(kuò)增的方法不能對混合動物源成分和未知動物源成分進(jìn)行有效鑒別。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種基于高通量測序的動物源成分鑒別方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，滿足相關(guān)領(lǐng)域應(yīng)用的需要。本發(fā)明的方法，包括如下步驟：以高通量測序得到的DNA序列為分析對象，以公開DNA序列數(shù)據(jù)庫為參照，考察分析對象與參照序列數(shù)據(jù)匹配數(shù)量，用于反映某特定類別的有無或多少，匹配次數(shù)有無或多少代表樣品中某動物成分的有無或多少；所述的DNA序列為樣本中總DNA；所述的公開DNA序列數(shù)據(jù)庫，為動物線粒體數(shù)據(jù)庫，具體的為對已公開動物線粒體數(shù)據(jù)庫，其中：所述的已公開動物線粒體數(shù)據(jù)庫為，針對不同用途(如：食用畜肉)進(jìn)行分類的，公共開放的動物線粒體數(shù)據(jù)庫中的動物線粒體全基因組序列及相應(yīng)物種信息；優(yōu)選的，本發(fā)明的方法，包括如下步驟：(1)首先對樣本總DNA進(jìn)行直接提取，不經(jīng)過核酸擴(kuò)增的步驟；(2)對提取的總DNA進(jìn)行高通量測序，不需要拼接，測序結(jié)果包含了樣品中動物源成分原始DNA短序列信息；(3)最后把測序得到的短序列信息與分析用動物分類數(shù)據(jù)庫中的線粒體序列進(jìn)行序列匹配分析，得到提取DNA的特異性序列的分類信息，從而對樣本中成分進(jìn)行鑒別和定量。所述的分析用動物分類數(shù)據(jù)庫為開放性數(shù)據(jù)庫，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可通過網(wǎng)絡(luò)公開數(shù)據(jù)庫，如：ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/release/mitochondrion等，獲得該數(shù)據(jù)庫中的線粒體序列；所述的總DNA是指：將樣本進(jìn)行常規(guī)或改良基因組提取方法后獲得的DNA，包括染色體DNA和線粒體DNA，所得的總DNA濃度≥100ng；所述的高通量測序是指：把提取總DNA隨機(jī)片段化后建庫，使用比傳統(tǒng)測序費(fèi)用更低、通量更高、速度更快的邊合成邊測序的高通量測序技術(shù)，比如Illumina的Solexa平臺、Roche的454平臺和ABI的SOLID平臺；所述的序列匹配分析是指：對開放數(shù)據(jù)庫的線粒體基因組信息進(jìn)行分類，建立動物種類鑒別參照用特定類別數(shù)據(jù)庫。把測序得到的序列信息，與數(shù)據(jù)庫中的序列信息進(jìn)行比較，與庫中相似度達(dá)到80％-100％的序列記為命中序列，在庫中的分類單元下統(tǒng)計(jì)樣品中每個物種分類被命中個數(shù)，以庫中各分類單元的命中次數(shù)有無及多少，表征某類動物成分的有無及含量；所述的總DNA片段化建庫指：通過超聲波或酶處理，將提取得到的DNA片段隨機(jī)破碎，使用瓊脂糖凝膠電泳或磁珠篩選或?qū)Ｓ迷噭┖羞x擇100-400bp的片段，采用高通量測序系統(tǒng)配套的常規(guī)建庫試劑盒，如Illumina公司的TruSeqDNASamplePreparation試劑盒，或其他可用于高通量測序的其他品牌常規(guī)建庫試劑盒，建立高通量測序用DNA文庫。本發(fā)明使用的高通量測序的分析動物成分的方法，對樣本中總DNA片段化后，直接進(jìn)行高通量測序分析，不受PCR多增偏好的影響，測序結(jié)果無需拼接，在保證足夠數(shù)據(jù)量的同時(shí)，提高信息獲取速度。后續(xù)分析方法采用測序結(jié)果逐一比對，命中記錄的分析方法，算法簡單高效。比對用分類數(shù)據(jù)庫信息來自于開放式線粒體數(shù)據(jù)庫，可根據(jù)需求進(jìn)行合理的數(shù)據(jù)分類，使得分類數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)信息全面、數(shù)據(jù)實(shí)時(shí)更新、分類方式靈活多變。該方法操作步驟簡單，準(zhǔn)確度高。特定種類動物成分檢出限可達(dá)1％，物種鑒別種類理論上可涵蓋所有物種。因此，利用本發(fā)明方法進(jìn)行樣本中動物成分鑒定，能分析未知成分樣本中的動物成分，簡化操作流程，在動物成分鑒定方面具有廣闊的應(yīng)用前景。附圖說明圖1為高通量測序數(shù)據(jù)分析方法和流程示意圖。具體實(shí)施方式下面對本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程。本發(fā)明的保護(hù)范圍涉及發(fā)明方法、步驟或條件的修改或替換，包括但不限于下述的實(shí)施例。若未特別指明，實(shí)施例中所用的化學(xué)試劑均為常規(guī)市售試劑，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。主要儀器設(shè)備：第高通量測序分析系統(tǒng)(AppliedBiosystemsSOLIDsystem，美國)(IlluminaGenomeAnalyzersystem，美國)、高速臺式離心機(jī)(Eppendorf5417R，德國)、微量移液器(10μl，100μl，1000μl)、微量分光光度計(jì)(Nanodrop，美國)；主要試劑：CTAB裂解液、SDS裂解液、飽和醋酸鈉、氯仿：異戊醇(24:1)、Tris飽和酚高通量測序數(shù)據(jù)分析方法和流程見圖1：首先訪問公共數(shù)據(jù)庫，下載動物線粒體DNA序列信息；然后按照物種不同分類整理為不同大類；然后使用軟件Bowtie把高通量測序的短序列與不同物種線粒體DNA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配，輸出SMA格式文件；再對SMA格式文件進(jìn)行檢索，統(tǒng)計(jì)每個物種的線粒體所能夠匹配的段序列數(shù)目，扣除共有匹配；最后計(jì)算不同動物源成分在樣品中的比例。具體的，本發(fā)明所述的所述方法，包括如下步驟：(1)總DNA提取：對樣品進(jìn)行斬切、攪拌后，采用物理或化學(xué)的裂解方法裂解細(xì)胞，使用總DNA提取常規(guī)方法或總DNA提取試劑盒進(jìn)行提取。(2)高通量測序：總DNA片段化建庫，使用高通量測序分析系統(tǒng)，測序讀長100-400bp，讀長個數(shù)50萬-500萬，測序深度達(dá)到(5-15)×。(3)物種分類數(shù)據(jù)庫建立：分析公開的開放數(shù)據(jù)庫里已提交線粒體序列及物種信息，以樣品分析所需分類方式對開放數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分類。(4)測序結(jié)果與分類數(shù)據(jù)庫比對：測序結(jié)果依次與已建好分類數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比較，當(dāng)相似度達(dá)到80-100％時(shí)記為命中，在命中序列所在類別中記命中數(shù)1。未命中的類別表明測序結(jié)果中沒有相似序列，即樣品中不含該種類DNA，樣品不含該種類動物成分； 命中率越高的類別表明測序結(jié)果中相似序列越多，即樣品中含該種類DNA較多，樣品中含該類動物成分較多；反之較少。實(shí)施例1稱取新鮮羊肉2g，均質(zhì)，加入CTAB裂解液及蛋白酶50℃條件下，孵育2h，取裂解液1ml，12000g離心10min，取上清，加入等體積(氯仿：異戊醇：飽和酚)(24：1：25)，顛倒混勻，12000g離心10min，取上清，加入(氯仿：異戊醇)(24：1)，顛倒混勻，12000g離心10min，取上清，加入2倍冰無水乙醇，或0.6倍異丙醇，放置30min，12000g離心10min，使用70％乙醇清洗兩遍，室溫自然風(fēng)干，加入ddH2O100uL。使用Nanodrop分析提取DNA濃度和質(zhì)量為DNA(ng/μL)：356.05，OD(260/280)：1.88，OD(260/230)：2.17。取樣本用純水稀釋，使用CovarisS220超聲破碎DNA，電泳回收200bp片段，TruSeqDNASamplePreparation試劑盒建庫，IlluminaGenomeAnalyzersystem高通量測序分析系統(tǒng)對該樣本進(jìn)行測序分析，400reads，45萬reads數(shù)。結(jié)合食用禽畜肉的分類和NCBI線粒體數(shù)據(jù)庫中的分類屬名，建立食用禽畜肉分類數(shù)據(jù)庫，用于二代測序結(jié)果的比對分析(表1)。使用軟件Bowtie，把測序結(jié)果與建好的線粒體數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配，分析中使用相似度參數(shù)為80％。得到分析結(jié)果與制備的混合樣品1比較(表2)，可見成分有無與實(shí)際樣本基本一致。表1食用禽畜肉分類數(shù)據(jù)庫建庫類別表2混合樣本各成分DNA濃度、百分含量和測序命中數(shù)、預(yù)測含量對照表實(shí)施例2分別稱取豬(市售)、牛(市售)、羊(市售)、雞(市售)、兔(市售)、鼠(實(shí)驗(yàn)室來源)均質(zhì)好的肉樣品2g，加入SDS裂解液及蛋白酶55℃條件下，孵育2h，取裂解液1ml，12000g離心10min，取上清，加入等體積(氯仿：異戊醇：飽和酚)(24：1：25)，顛倒混勻，12000g離心10min，取上清，加入(氯仿：異戊醇)(24：1)，顛倒混勻，12000g離心10min，取上清，加入2倍冰無水乙醇，或0.6倍異丙醇，放置30min，12000g離心10min，使用70％乙醇清洗兩遍，室溫自然風(fēng)干，加入ddH2O100uL。使用Nanodrop分析提取DNA濃度和質(zhì)量(表3)。表3提取肉樣本DNA濃度和質(zhì)量DNA(ng/μL)OD(260/280)OD(260/230)豬(A)328.691.842.30牛(B)386.041.852.05羊(C)498.051.892.07雞(D)544.621.912.05兔(E)120.351.852.01鼠(F)136.781.822.10混合A、B、C、D、E、F為混合樣本I，使用CovarisS220超聲破碎DNA，電泳回收150bp片段，TruSeqDNASamplePreparation試劑盒建庫，使用AppliedBiosystemsSOLIDsystem高通量測序分析系統(tǒng)對該樣本進(jìn)行測序分析，150reads，45萬reads數(shù)。結(jié)合食用禽畜肉的分類和NCBI線粒體數(shù)據(jù)庫中的分類屬名，建立食用禽畜肉分類數(shù)據(jù)庫，用于二代測序結(jié)果的比對分析(表4)。使用軟件Bowtie，把測序結(jié)果與建好的線粒體數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配，分析中使用相似度參數(shù)為90％。得到分析結(jié)果與制備的混合樣品1比較(表5)，可見成分含量與實(shí)際混合樣本I各成分含量基本一致。表4食用禽畜肉分類數(shù)據(jù)庫建庫類別表5混合樣本各成分DNA濃度、百分含量和測序命中數(shù)、預(yù)測含量對照表實(shí)施例3分別稱取豬(市售)1.05g、牛(市售)10.12g、羊(市售)20.36g、雞(市售)5.29g，均質(zhì)混勻后，稱取該混合樣品5g，加入SDS裂解液及蛋白酶55℃條件下，孵育過夜，取裂解液1ml，12000g離心10min，取上清，加入等體積(氯仿：異戊醇：飽和酚)(24：1：25)，顛倒混勻，12000g離心10min，取上清，加入(氯仿：異戊醇)(24：1)，顛倒混勻，12000g離心10min，取上清，加入2倍冰無水乙醇，或0.6倍異丙醇，放置30min，12000g離心10min，使用70％乙醇清洗兩遍，室溫自然風(fēng)干，加入ddH2O100uL。使用Nanodrop分析提取DNA濃度和質(zhì)量DNA(ng/μL)：541.78；OD(260/280)：1.78；OD(260/230)：2.02。該樣本稱為混合樣本II。使用CovarisS220超聲破碎DNA，電泳回收200bp-300bp片段，TruSeqDNASamplePreparation試劑盒建庫，使用AppliedBiosystemsSOLIDsystem高通量測序分析系統(tǒng)對該樣本進(jìn)行測序分析，200reads，50萬reads數(shù)。結(jié)合食用禽畜肉的分類和NCBI線粒體數(shù)據(jù)庫中的分類屬名，建立食用禽畜肉分類數(shù)據(jù)庫，用于二代測序結(jié)果的比對分析(表1)。使用軟件Bowtie，把測序結(jié)果與建好的線粒體數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配，分析中使用相似度參數(shù)為85％。得到分析結(jié)果與制備的混合樣品II比較(表6)，可見成分含量與實(shí)際混合樣本II各成分含量基本一致。表6混合樣本II各成分百分含量和測序命中數(shù)、預(yù)測含量對照表實(shí)施例4稱取未知動物成分的調(diào)制加工肉餡樣本5g，均質(zhì)，使用組織提取試劑盒提取總DNA。使用Nanodrop分析提取DNA濃度和質(zhì)量DNA(ng/μL)：354.87；OD(260/280)：1.90； OD(260/230)：2.15。使用CovarisS220超聲破碎DNA，電泳回收150bp-200bp片段，TruSeqDNASamplePreparation試劑盒建庫，使用AppliedBiosystemsSOLIDsystem高通量測序分析系統(tǒng)對該樣本進(jìn)行測序分析，150reads，50萬reads數(shù)。結(jié)合食用禽畜肉的分類和NCBI線粒體數(shù)據(jù)庫中的分類屬名，建立食用禽畜肉分類數(shù)據(jù)庫，用于二代測序結(jié)果的比對分析(表1)。使用軟件Bowtie，把測序結(jié)果與建好的線粒體數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配，分析中使用相似度參數(shù)為90％。得到未知樣本成分與現(xiàn)有實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法比較(表7)，可見未知成分樣本各成分含量與實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢出結(jié)果基本一致。表7未知成分樣本測序命中數(shù)、預(yù)測含量與實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果比較實(shí)施例5稱取未知動物成分的狗糧樣本5g，均質(zhì)，使用組織提取試劑盒提取總DNA。使用Nanodrop分析提取DNA濃度和質(zhì)量DNA(ng/μL)：169.45；OD(260/280)：2.03；OD(260/230)：1.90。使用CovarisS220超聲破碎DNA，電泳回收300bp-400bp片段，TruSeqDNASamplePreparation試劑盒建庫，使用AppliedBiosystemsSOLIDsystem高通量測序分析系統(tǒng)對該樣本進(jìn)行測序分析，150reads，50萬reads數(shù)。結(jié)合食用禽畜肉的分類和NCBI線粒體數(shù)據(jù)庫中的分類屬名，建立食用禽畜肉分類數(shù)據(jù)庫，用于二代測序結(jié)果的比對分析(表1)。使用軟件Bowtie，把測序結(jié)果與建好的線粒體數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配，分析中使用相似度參數(shù)為90％。得到未知樣本成分與現(xiàn)有實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法比較(表7)，可見未知成分樣本各成分含量與實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢出結(jié)果基本一致。表9未知成分狗糧樣本測序命中數(shù)、預(yù)測含量與實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果比較當(dāng)前第1頁1 2 3