本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，更具體的，本發(fā)明涉及適于抗EGFR抗體生產(chǎn)的培養(yǎng)基及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著環(huán)境的不斷惡化，全球癌癥發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)逐年遞增的趨勢，世界衛(wèi)生組織和各國政府衛(wèi)生部門紛紛把攻克惡性腫瘤列為一項(xiàng)重要任務(wù)。有研究表明表皮生長因子受體(EGFR)的過表達(dá)與多種癌癥發(fā)生相關(guān)。表皮生長因子受體是一種上皮生長因子細(xì)胞增殖和信號傳導(dǎo)的重要受體，EGFR通過與其配體相結(jié)合來產(chǎn)生效應(yīng)。EGFR的特異性配體為EGF和EGF相關(guān)多肽，包括轉(zhuǎn)化生長因子α(TGF-α)、雙調(diào)蛋白和肝素結(jié)合EGF樣生長因子。為了激活EGFR，配體EGF(單體)同時結(jié)合并連接兩個相鄰的受體鏈，使受體的胞內(nèi)激酶局域在多個酪氨酸上相互磷酸化，酪氨酸激酶活性提高從而可以激活數(shù)個信號通路如ras-MAPK通路，PI3激酶通路以及JAK/STAT通路等。EGFR受體過表達(dá)或突變后結(jié)構(gòu)激活(不需要配體)以及自分泌刺激導(dǎo)致的過度EGFR功能與多種癌癥發(fā)生相關(guān)。EGFR的致瘤效應(yīng)包括DNA合成啟動、促進(jìn)細(xì)胞生長、侵襲以及轉(zhuǎn)移，特異性敲除EGFR可導(dǎo)致細(xì)胞周期俘獲、細(xì)胞凋亡以及癌細(xì)胞的分化。研究發(fā)現(xiàn)，EGFR在多種人上皮組織來源的癌癥(如膀胱、乳腺、宮頸、結(jié)腸、頭頸、腎、肺、胰腺、以及前列腺等)中有不同水平的表達(dá)，EGFR在結(jié)腸直腸癌表達(dá)率高達(dá)25－77％，且與腫瘤的惡化以及不良預(yù)后相關(guān)。正因?yàn)镋GFR具有上述特點(diǎn)，以EGFR為靶點(diǎn)的抗體藥物不斷被開發(fā)，有的產(chǎn)品已被用于腫瘤治療的臨床實(shí)踐：
(愛必妥、cetuximab、西妥昔單抗)是Imclone公司開發(fā)的一種鼠/人嵌合的單克隆抗EGFR抗體。Cetuximab可以與EGFR受體以高出內(nèi)源配體約5到10倍的親和力與EGFR特異結(jié)合，從而競爭性拮抗配體與EGFR的結(jié)合，封鎖受體與配體的結(jié)合繼而抑制配體介導(dǎo)的EGFR酪氨酸激酶的激活，從而使腫瘤細(xì)胞或腫瘤微環(huán)境中的基質(zhì)細(xì)胞中多種由EGFR信號通路調(diào)節(jié)的細(xì)胞過程被阻斷，包括EGFR下調(diào)，細(xì)胞內(nèi)信號的抑制，細(xì)胞周期的抑制，凋亡的誘導(dǎo)，DNA修復(fù)的抑制，血管生成的抑制，腫瘤細(xì)胞運(yùn)動性、侵襲性以及轉(zhuǎn)移性的抑制等等。美國FDA于2004年2月批準(zhǔn)用于結(jié)直腸癌的治療，2006年FDA還批準(zhǔn)其用于治療頭頸部腫瘤。
(帕尼單抗、panitumumab)是由Amgen公司開發(fā)的一種用于治療化療失敗后轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的抗EGFR全人源單克隆抗體，2006年被美國FDA批準(zhǔn)用于治療轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌。
但是，抗EGFR抗體藥物價格非常高，例如需要137953美元/人/年，這對于普通老百姓來說，根本無力承擔(dān)。抗體藥物之所以如此昂貴，生產(chǎn)成本居高不下是其中重要原因，例如用于細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的商用培養(yǎng)基價格非常昂貴，動則幾百萬元，而且用常規(guī)的培養(yǎng)基如DMEM/F12、RPMI1640等進(jìn)行抗EGFR單克隆抗體制備，其細(xì)胞表達(dá)效果不是非常理想，因此，有必要開發(fā)一種特別適合于抗EGFR單克隆抗體的細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，以便最大限度地提高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種新型培養(yǎng)基。具體地，本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過大量的實(shí)驗(yàn)研究，在DMEM/F12培養(yǎng)基(Sigma公司購買)的基礎(chǔ)上成功開發(fā)了一種新型培養(yǎng)基，其特別適于抗EGFR單克隆抗體規(guī)?；a(chǎn)的培養(yǎng)基，與現(xiàn)有商業(yè)化DMEM/F12培養(yǎng)基相比，本發(fā)明的培養(yǎng)基可大大提高生產(chǎn)效率。具體地，
本發(fā)明公開了一種新型培養(yǎng)基，其包括：氨基酸、微量元素及無機(jī)鹽、維生素、碳水化合物和其他有機(jī)分子。
優(yōu)選地，所述的培養(yǎng)基的氨基酸的組分和用量如下：
更優(yōu)選地，上述培養(yǎng)基的氨基酸的組分和用量如下：
更優(yōu)選地，上述任一所述的培養(yǎng)基的微量元素及無機(jī)鹽的組分和用量如下，
更優(yōu)選地，上述任一所述的培養(yǎng)基的微量元素及無機(jī)鹽的組分和用量如下，
更優(yōu)選地，上述任一所述的培養(yǎng)基的維生素的組分和用量如下，
更優(yōu)選地，上述任一所述的培養(yǎng)基的的維生素的組分和用量如下，
更優(yōu)選地，上述任一所述的培養(yǎng)基的碳水化合物和其他有機(jī)分子的組分和用量如下，
更優(yōu)選地，上述任一所述的培養(yǎng)基的碳水化合物和其他有機(jī)分子的組分和用量如下，
最優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基中各組分和用量如下，
另外，發(fā)明還公開上述任一所述培養(yǎng)基在抗體生產(chǎn)中的應(yīng)用，尤其是在抗EGFR單克隆抗體生產(chǎn)中的應(yīng)用。非常適合于抗EGFR單克隆抗體的生產(chǎn)過程中的細(xì)胞培養(yǎng)，可大大提高生產(chǎn)效率。
現(xiàn)有培養(yǎng)基的組分一般包括葡萄糖、氨基酸、無機(jī)鹽、維生素、微量元素、類固醇激素和相關(guān)蛋白替代物，其中，氨基酸：是中主要營養(yǎng)物質(zhì)之一，用于蛋白、核酸以及脂類等物質(zhì)的合成，還可以通過幾個主要的中間代謝節(jié)點(diǎn)進(jìn)入TCA循環(huán)，用于能量的生成，并同其他營養(yǎng)物質(zhì)的代謝相關(guān)聯(lián)；無機(jī)鹽：NaCl維持滲透壓平衡，協(xié)調(diào)共同轉(zhuǎn)運(yùn)有機(jī)大分子進(jìn)入細(xì)胞，K+，Ca2+，Mg2+，Zn2+等離子則參予代謝與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及促進(jìn)貼壁和細(xì)胞增殖，各種陰離子(SO42-，NO3-等)，則主要用于調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)細(xì)胞膜勢能或作為含硫或氮元素有機(jī)分子的前體；維生素：培養(yǎng)基中主要營養(yǎng)物質(zhì)之一，維生素在培養(yǎng)基中存在的量很微量，但在細(xì)胞代謝中作為細(xì)胞功能有機(jī)催化劑，起重要的調(diào)控作用；碳水化合物：葡萄糖是主要的碳水化合物，作為主要的碳源和能源物質(zhì)；微量元素：主要起調(diào)節(jié)、傳遞和控制的作用，在無血清培養(yǎng)基中的作用尤為重要，如：Fe：酶和血紅素的輔基，是線粒體中呼吸鏈的組成部分；Cu：超氧化物歧化酶的輔基，是線粒體中呼吸鏈的組成部分；Mg：對ATP酶、激酶等起活化作用；Zn：酶的輔基；此外，培養(yǎng)基中還加入酚紅用作培養(yǎng)基pH的指示劑，為適合細(xì)胞發(fā)酵罐中的大規(guī)模培養(yǎng)而添加有0.1％的Pluronic F68以消除剪切力的影響。但是如何對這些成分進(jìn)行合理設(shè)計，是開發(fā)培養(yǎng)基的關(guān)鍵。
本發(fā)明人通過對DMEM/F12培養(yǎng)基的組分和含量進(jìn)行適當(dāng)?shù)母淖?，?jīng)過大量的實(shí)驗(yàn)最終確定培養(yǎng)基的各個組分及最佳劑量，從而完成了本發(fā)明。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的培養(yǎng)基與DMEM/F12培養(yǎng)基相比，本發(fā)明的培養(yǎng)基特別適合于抗EGFR單克隆抗體的生產(chǎn)，細(xì)胞培養(yǎng)效率得到了大大提高。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例僅對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說明，不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。本發(fā)明的基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM/F12購自Sigma公司，并按相關(guān)要求儲存。
實(shí)施例1：培養(yǎng)基配制
通過常規(guī)方法配制培養(yǎng)基，本發(fā)明的培養(yǎng)包括：氨基酸、微量元素及無機(jī)鹽、維生素、碳水化合物和其他有機(jī)分子，優(yōu)選的3種培養(yǎng)基各組分和用量如下：
培養(yǎng)基1：
培養(yǎng)基2：
培養(yǎng)基3：
培養(yǎng)基干粉配置方法：
將1L用量的干粉加入900ml超純水中，溫度35℃左右，攪拌半小時后，加入一定量的氫氧化鈉助溶，然后加入濃鹽酸和碳酸氫鈉，調(diào)節(jié)PH到6.5～7.5。用0.2um負(fù)壓過濾，分裝于500毫升的玻璃瓶中無菌避光保存。
本發(fā)明獲得的培養(yǎng)基的理化性質(zhì)參數(shù)、檢測方法和檢測結(jié)果如表1所示。
表1：培養(yǎng)基檢測結(jié)果表
從檢測結(jié)果看，配置的液體培養(yǎng)基結(jié)果合格，能夠用于CHO細(xì)胞培養(yǎng)。
實(shí)施例2：不同培養(yǎng)基在相同培養(yǎng)條件下的細(xì)胞培養(yǎng)效果對比
培養(yǎng)條件如下表2所示：
表2：細(xì)胞培養(yǎng)條件列表
如上述培養(yǎng)方法，本發(fā)明人分別將上述配制好的4種培養(yǎng)基300ml裝入1000ml的搖瓶中，再加入CHO細(xì)胞，接種密度為6.5×105細(xì)胞/ml，放置CO2培養(yǎng)箱中(CO2為5％)中培養(yǎng)，溫度為37℃，每隔24小時取樣20μl，通過細(xì)胞計數(shù)儀(購自invitrogen)進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，通過MTT法檢測細(xì)胞存活率，并通過光鏡觀察細(xì)胞成團(tuán)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示：
表3：不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞密度、細(xì)胞存活率和細(xì)胞成團(tuán)情況檢測結(jié)果表
以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的培養(yǎng)基1、培養(yǎng)基2和培養(yǎng)基3相比市售的DMEM/F12培養(yǎng)基具有更好的細(xì)胞培養(yǎng)效果，在第5-7天活細(xì)胞密度均大于80×105(市售DMEM/F12培養(yǎng)基僅40×105)，8天細(xì)胞存活率均大于80％(市售DMEM/F12培養(yǎng)基第八天存活率僅51.0％)；且本發(fā)明的培養(yǎng)基在細(xì)胞培養(yǎng)過程中未見細(xì)胞成團(tuán)現(xiàn)象，而商業(yè)培養(yǎng)基DMEM/F12在第五天則見有 細(xì)胞成團(tuán)現(xiàn)象產(chǎn)生。
另外，本發(fā)明人還對cetuximab及panitumumab等抗EGFR單克隆抗體的CHO細(xì)胞重復(fù)上述實(shí)施例2的試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述實(shí)施例2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似，結(jié)果均顯示本發(fā)明的培養(yǎng)基相比市售的DMEM/F12培養(yǎng)基具有更好的細(xì)胞培養(yǎng)效果，本發(fā)明培養(yǎng)基1、培養(yǎng)基2和培養(yǎng)基3在對上述抗EGFR抗體的細(xì)胞培養(yǎng)中，在第5-7天活細(xì)胞密度均大于80×105(市售DMEM/F12培養(yǎng)基僅40×105)，8天細(xì)胞存活率均大于80％，且未見細(xì)胞成團(tuán)現(xiàn)象產(chǎn)生(市售DMEM/F12培養(yǎng)基第5天已現(xiàn)成團(tuán))。