本發(fā)明屬生物制藥領域，涉及血液制品的制備工藝，具體地說，是一種速溶無析出的凍干人纖維蛋白原制備工藝。
背景技術：
人纖維蛋白原(human fibrinogen，簡稱纖原或Fg)是含2964個氨基酸的大分子糖蛋白，是一種由肝臟合成的具有凝血功能的蛋白質，它是人體十三種凝血因子中含量最大的一種凝血因子，又稱凝血因子I。人纖維蛋白原是一種在臨床上使用非常頻繁的血液制品，也是戰(zhàn)場上止血不可或缺的急救藥品，然而纖維蛋白原在臨床上一直處于供不應求狀態(tài)。特別是近年來，一種具有高效止血功能的外科用血液制品——人纖維蛋白粘合劑越來越受到醫(yī)生與患者的青睞，作為該藥品配伍之一的高濃度人纖維蛋白原的需求量大增，從而使該產品面臨更加短缺的局面。人纖維蛋白粘合劑所用的人纖維蛋白原與常規(guī)靜脈輸注的人纖維蛋白原有很大的不同，主要體現在前者具有很高的蛋白濃度，至少是后者(一般為2.5％)的二倍或者更高即5-7％。人纖維蛋白原制品最大的問題在于凍干粉復溶時間長且溶解時需在30-37℃的水浴中進行，另一個問題是容易析出變性蛋白且有蛋白顆粒懸浮，這給臨床使用帶來了不便，譬如必須提前從冰箱里取出置于水浴中，靜脈輸注時需配備過濾裝置。低濃度人纖維蛋白原尚且如此，高濃度人纖維蛋白原的復溶就更困難了。因此用常規(guī)的人纖維蛋白原生產工藝很難制備出合格的高濃度纖維蛋白原產品，為此，必須從工藝的源頭開始在各個環(huán)節(jié)包括原液的配方乃至最后的凍干工序均需采取針對性的措施。
目前，制備人纖維蛋白原的原料主要有三種，一是冷沉淀(又稱冷膠)，其主要用途是制備人凝血因子FVIII的，因從血漿分離冷膠時，由于蛋白的共沉淀現象，血漿中的部分人纖維蛋白原及其它蛋白質一齊隨冷膠沉淀出來(其中的纖維蛋白原含量有限，僅占整個血漿Fg的很小比例)；二是組分I沉淀，該沉淀是在去冷膠血漿中加入一定濃度的乙醇并降溫后分離收集的沉淀，含有血漿中最大比例的Fg；三是冷膠與組分I共沉淀，即在融化血漿中加入一定濃度的乙醇并降溫后使冷膠與組分I一起沉淀。
以冷膠為原料的纖原制備工藝，因原料里面所含Fg甚少，經過一系列操作步驟，層層損失，最后的得率非常有限，缺乏商業(yè)生產的價值；而以冷膠與組分I共沉淀為原料的纖原生產工藝，也存在如下的問題，首先，沉淀中含有8％的乙醇，對沉淀中的人凝血因子VIII的穩(wěn)定性而言，是個很不利的因素，沉淀的儲存必須十分謹慎，保存時間不可過長，投料時必須特別當心乙醇對人凝血因子VIII的變性損傷作用，所以原料中乙醇的存在無疑對人凝血因子VIII的生產工藝提出了苛刻的要求；其次，由于沉淀中人凝血因子VIII的大量存在，對纖原的生產也帶來了隱患，因為纖原容易被激活而導致生產失敗，纖原激活的原因比較復雜，但凝血酶是其中最直接的原因，凝血酶是凝血酶原在Ca2+離子及其它凝血因子包括凝血因子VIII參與下經過一系列復雜的鏈式反應被激活的，所以在纖原的制備過程中，人凝血因子VIII的存在也是一個不利的因素，應盡可能在工藝的最初工序中就徹底地除去；另外，從纖原的制備工藝看，有的工藝工序繁多，尤其是溶解與沉淀反復進行，由此導致頻繁的升溫、降溫、添加乙醇、酸堿等操作，這些操作對蛋白而言都不同程度地對蛋白產生損傷，一旦操作中出現劇烈變化的情形，很可能就會導致最終產品產生乳光乃至析出及復溶時間過長等的原因。還有，過高追求纖原的純度，也是導致有些工藝程序繁多，生產周期過長的原因，不少實踐證明，過高的產品純度對穩(wěn)定性反而不利，容易導致纖原析出。有些蛋白譬如白蛋白是著名的蛋白保護劑，也是一些生物制品如疫苗不可或缺的保護劑。所以，對于纖原制品而言，更應追求產品的穩(wěn)定性、速溶性目標。
技術實現要素：
本發(fā)明的目的在于克服目前傳統(tǒng)纖原制備工藝存在的一些不足和缺陷，提供一種新型的速溶、高濃度、無析出的凍干人纖維蛋白原生產工藝，由該工藝不僅可制備傳統(tǒng)靜脈注射用人纖維蛋白原，也可制備人纖維蛋白粘合劑中配伍的高濃度人纖維蛋白原。
本發(fā)明提供一種速溶無析出的凍干人纖維蛋白原制備工藝，包括以下步驟：
A)將組分I沉淀切碎，按1：10-20的稀釋比，投入緩沖液1中溶解，均勻攪拌1-2小時；
B)用30SP深層濾芯(CUNO公司濾芯)串聯(lián)一只1.0μm的濾芯過濾懸浮液； 用上述緩沖液1后洗濾芯，收集濾液；
C)在濾液中加入S/D母液；
D)將S/D溶液降溫至-1℃左右，用噴霧方式緩慢加入低溫乙醇(不高于-20℃)至乙醇濃度為8-10％(V/V)；攪拌1-2小時，低溫(-2-0℃)離心，流速1-2kg/min/臺，收集沉淀，棄上清液；
E)按1：15-25左右的稀釋比，用緩沖液2溶解收集的沉淀，攪拌1-2小時；
F)用一只30SP深層濾芯串聯(lián)一只0.45μm的濾芯過濾懸浮液，用上述緩沖液2后洗濾芯，收集濾液；
G)濾液降溫至-1℃，然后加入低溫乙醇(不高于-20℃)至乙醇濃度為8-10％(V/V)，低溫(-2-0℃)離心，流速1-2kg/min/臺，收集沉淀，棄上清液；
H)按1：2-6的稀釋比，用緩沖液3溶解收集的沉淀，在20-30℃下攪拌0.5-2小時，用一只0.45μm的濾芯過濾懸浮液并用緩沖液3后洗濾芯，收集濾液；
I)調節(jié)pH值至6.50-7.50，根據所需規(guī)格用上述緩沖液3將蛋白濃度稀釋至2.50-3.0％或5.5-6.0％；無菌分裝；
J)凍干，采用預冷、速凍及多次“退火”操作，最后得到人纖維蛋白原凍干粉；
K)沸水浴中干熱進行病毒滅活(100℃，30分鐘)。
所述的組分I沉淀即經典的Cohn血漿組分I沉淀，其制備方法為：
在去冷膠血漿中加入冷的50％乙醇溶液(溫度不高于-20℃)至乙醇濃度為8-10％(V/V)，調解血漿pH值至6.85-7.15，保持血漿溫度-2-2℃，均勻攪拌1-3小時后離心得到組分I沉淀。
所述的步驟A中的緩沖液1的組成為：檸檬酸鈉·2H2O 30-60mmol/L，TRIS10-30mmol/L，賴氨酸鹽酸10-30mmol/L，蔗糖1-3％(w/w)，甘氨酸0.5-5％(w/w)，氯化鈉0.1-0.15mol/L，pH值為6.50-7.50，溫度20-30℃。
所述的步驟E中的緩沖液2的組成為：檸檬酸鈉·2H2O 30-60mmol/L，TRIS 10-30mmol/L，，精氨酸鹽酸鹽1-3％(w/w)，蔗糖1-3％(w/w)，甘氨酸0.5-5％(w/w)，氯化鈉0.1-0.15mol/L，pH值為6.50-7.50，溫度20-30℃。
所述的步驟E的緩沖液2中還加入0.015-0.025％(w/w)的吐溫-80，促進了蛋白的快速分散與溶解。
所述的步驟H中的緩沖液3的組成為：檸檬酸鈉·2H2O 30-60mmol/L，精氨酸鹽酸鹽1-5％(w/w)，甘氨酸1-5％(w/w)，氯化鈉30-150mmol/L，pH值為6.50-7.50。
所述的步驟C中在濾液中加入預先配好的S/D母液，使溶液中吐溫-80的濃度至1％(w/v)，TNBP的濃度至0.3％(w/v)，24-26℃下緩慢攪拌，保溫6小時。
所述的步驟J中凍干的操作步驟為：采用預冷、速凍及多次“退火”操作，將預冷到3-5℃的制品迅速深冷至-50℃左右，保持1-2小時，然后迅速升溫至-30℃左右，保持0.5-1小時(該升溫操作稱為“退火”)，再降溫至-50℃，保持1-2小時，重復1-2次退火操作，最后在制品溫度-45℃左右時開始抽真空，升華，主干燥溫度即擱板溫度(或導熱油溫度)至少比共晶點溫度低5℃左右，確保制品溫度在整個升華干燥階段不超過共晶點溫度，同時采取措施縮短制品溫度在低溫下持續(xù)的時間，最后的解析干燥時間不宜過長，制品的最高溫度控制在26℃左右，最后得到Fg凍干粉。速凍會使制品的晶型細密，而退火則會使整個制品的晶型均勻，這都會顯著改善凍干粉復溶性質，縮短制品在低溫下持續(xù)的時間則會有助于防止復溶時蛋白顆粒的形成。
本發(fā)明優(yōu)點在于：
(1)生產流程簡潔，生產周期短，凍干前的生產時間不足32小時，凍干時間70-80小時左右，總生產周期100小時左右；
(2)在各步溶解緩沖液中均加入了甘氨酸作為保護劑，在溶解、過濾及后洗、離心等操作中，Fg自始至終均得到甘氨酸的保護，避免了操作中引起的蛋白損傷；
(3)在加乙醇環(huán)節(jié)，采用低溫乙醇，溫度低于-20℃，同時用噴霧方式，減少了乙醇對蛋白的損傷；
(4)優(yōu)化了凍干工藝條件，采取了速凍及“退火”措施，同時縮短了凍干總時間，由傳統(tǒng)的100多小時縮短到70-80小時，制得的凍干粉呈均勻海綿狀，速溶且無蛋白析出，無蛋白顆粒。
附圖說明
圖1是從組分I沉淀制備凍干人纖維蛋白原流程框圖。
具體實施方式
下面結合附圖及實施例對本發(fā)明提供的具體實施方式作詳細說明。
實施例1
第一步，按稀釋比1：20，取新鮮組分I沉淀2kg，立即攤薄切碎，然后投入40kg緩沖液1中溶解，均勻攪拌3小時；緩沖液1的配方：檸檬酸鈉·2H2O640g，TRIS 108g，賴氨酸鹽酸160g，蔗糖600g，甘氨酸600g，氯化鈉400g，緩沖液1的pH值為6.95，溫度20℃；
第二步，用一只30SP深層濾芯串聯(lián)一只1.0μm的濾芯過濾第一步懸浮液；過濾壓力控制在0.5bar左右，用第一步所述配方的緩沖液1后洗濾芯，收集濾液50.1kg。
第三步，在濾液中加入預先配好的S/D母液2.5kg，使溶液中吐溫-80的濃度至1％，TNBP的濃度至0.3％，24-26℃下緩慢攪拌，保溫6小時；
第四步，將S/D后的溶液降溫至-1℃左右，用噴霧方式緩慢加入低溫(-22℃)50％乙醇溶液8.2kg，攪拌1.5小時，低溫(-2-0℃)離心，流速1.5-1.8kg/min/臺，收集沉淀1.62kg，棄上清液；
第五步，將以上沉淀攤薄切碎，按稀釋比1：25，投入到40.5kg緩沖液2中溶解，均勻攪拌2小時；緩沖液2配方：檸檬酸鈉·2H2O 640g，TRIS 108g，精氨酸鹽酸鹽600g，蔗糖600g，甘氨酸607g，氯化鈉400g，吐溫-80，8g，緩沖液2的pH值為7.05，溫度20℃；
第六步，常溫下，用30SP深層濾芯串聯(lián)一只0.45μm的濾芯過濾以上懸浮液，用第五步所述配方的緩沖液2后洗濾芯，收集濾液55.2kg；
第七步，將上述濾液降溫至-1℃，用噴霧方式緩慢加入低溫(-21℃)50％乙醇溶液9.4kg，攪拌1.5小時，低溫(-2～-0℃)離心，流速1.5-1.8kg/min/臺，收集沉淀1.32kg，棄上清液；
第八步，將以上沉淀攤薄切碎，按稀釋比1：4，然后投入5.28kg緩沖液3中溶解，均勻攪拌1.5小時，然后用一只0.45μm的濾芯過濾以上懸浮液并用緩沖液3后洗濾芯；緩沖液3配方：檸檬酸鈉·2H2O 80g，精氨酸鹽酸鹽186g，甘氨酸158g，氯化鈉32g，緩沖液3的pH值為7.13，溫度20℃；
第九步，用第八步所述配方的緩沖液3將蛋白濃度稀釋至2.8％；復測pH7.08，送去無菌分裝；
第十步，將分裝好的制品半壓塞，放入凍干機，首先將制品預冷至3℃， 然后將擱板溫度設定為-55℃，速凍至制品溫度-45℃，后保持2小時，然后迅速升高擱板溫度使制品溫度升至-25℃，保持1小時，然后將擱板溫度重新設定為-55℃，速凍至制品溫度-45℃，保持2小時；后設定擱板溫度-30℃后，開始抽真空，升華。約40小時，主干燥結束；設定解析干燥段最終擱板溫度28℃，開始升溫，約16小時后，解析干燥結束，壓塞、停機、出箱。完成整個凍干工序。
第十一步，將制品在沸水浴中干熱(100℃，30分鐘)，進行病毒滅活，后置于2-8℃冷庫存放。
實施例2
第一步，取新鮮組分I沉淀10kg立即攤薄切碎，按稀釋比1：20，投入200kg緩沖液1中溶解，均勻攪拌1.5小時；緩沖液1配方：檸檬酸鈉·2H2O 3.2kg，TRIS 540g，賴氨酸鹽酸鹽800g，蔗糖3kg，甘氨酸2.0kg，氯化鈉2.0kg，緩沖液1的pH值為6.95，溫度25℃；
第二步，用30SP深層濾芯串聯(lián)一只1.0μm(10英寸)的濾芯過濾以上懸浮液；過濾壓力控制在0.5bar左右，用上述配方的緩沖液1約50kg后洗濾芯，收集濾液251kg。
第三步，在濾液中加入預先配好的S/D母液12.5kg，使溶液中吐溫-80的濃度至1％，TNBP的濃度至0.3％，24-26℃下緩慢攪拌，保溫6小時；；
第四步，將S/D后溶液降溫至-1℃左右，用噴霧方式緩慢加入低溫(不高于-20℃)50％乙醇溶液42kg，攪拌1.5小時，低溫(-2-0℃)離心，流速1.5-1.8kg/min/臺，收集沉淀8.9kg，棄上清液；
第五步，將以上沉淀攤薄切碎，按稀釋比1：20，投入到178kg緩沖液2中溶解，均勻攪拌1.5小時；緩沖液2配方：檸檬酸鈉·2H2O 2.85kg，TRIS 480g，精氨酸鹽酸鹽2.67kg，蔗糖2.67kg，甘氨酸1.78kg，氯化鈉1.78kg，吐溫-80，35.6g，緩沖液2的pH值為7.05，溫度25℃；
第六步，常溫下，用30SP深層濾芯串聯(lián)一只0.45μm的濾芯過濾以上懸浮液，用上述配方的緩沖液2后洗濾芯，收集濾液249kg；
第七步，將上述濾液降溫至-1℃，用噴霧方式緩慢加入低溫(-22℃)50％乙醇溶液42.8kg，攪拌1.5小時，低溫(-2-0℃)離心，流速1.5-1.8kg/min/臺，收集沉淀7.1kg，棄上清液；
第八步，將以上沉淀攤薄切碎，按稀釋比1：4，投入28.4kg緩沖液3中 溶解，均勻攪拌1.0小時，然后用一只0.45μm的濾芯過濾以上懸浮液并后洗濾芯；緩沖液3配方：檸檬酸鈉·2H2O 430g，精氨酸鹽酸鹽1.00kg，甘氨酸568g，氯化鈉170g，緩沖液3的pH值為7.20，溫度25℃；
第九步，同實施例1；
第十步，將分裝好的制品半壓塞，放入凍干機，首先將制品預冷至5℃，然后將隔板溫度設定為-55℃，速凍，至制品溫度-45℃，后保持2小時，然后迅速升溫至-30℃，保持1小時，再降溫至-55℃，保持1小時；重復一次“退火”操作，后在制品溫度-45℃下保持2小時，設定隔板溫度-28℃后，開始抽真空，升華。約48小時后，結束主干燥；設定最終隔板溫度28℃，開始升溫，進入解析干燥階段，約18小時后，解析干燥結束，壓塞、停機、出箱，完成整個凍干工序。
第十一步，同實施例1。
實施例3
第一步，取新鮮組分I沉淀10kg，立即攤薄切碎，按稀釋比1：10，然后投入100kg緩沖液1中溶解，均勻攪拌3小時；緩沖液1配方：檸檬酸鈉·2H2O1.6kg，TRIS 270g，賴氨酸鹽酸鹽400g，蔗糖1.5kg，甘氨酸3.0kg，氯化鈉1.0kg，緩沖液1的pH值為6.80，溫度30℃；
第二步，用一只30SP深層濾芯串聯(lián)一只1.0μm的濾芯過濾以上懸浮液；過濾壓力控制在0.5bar左右，用第一步所述配方的緩沖液1約50kg后洗濾芯，收集濾液152kg。
第三步，在濾液中加入預先配好的S/D母液7.5kg，使溶液中吐溫-80的濃度至1％，TNBP的濃度至0.3％，24-26℃下緩慢攪拌，保溫6小時；；
第四步，將S/D后溶液降溫至-1℃左右，用噴霧方式緩慢加入低溫(不高于-20℃)50％乙醇溶液25.0kg，攪拌1.5小時，低溫(-2-0℃)離心，流速1.5-1.8kg/min/臺，收集沉淀9.1kg，棄上清液；
第五步，將以上沉淀攤薄切碎，按稀釋比1：15投入到137kg緩沖液2中溶解，均勻攪拌1小時；緩沖液2配方：檸檬酸鈉·2H2O 2.2kg，TRIS 366g，精氨酸鹽酸鹽2.1kg，蔗糖2.1kg，甘氨酸4.2kg，氯化鈉1.37kg，吐溫-80，28g，緩沖液2的pH值為7.35，溫度30℃；
第六步，同實施例2，得到濾液152kg；
第七步，將上述濾液降溫至-1℃，用噴霧方式緩慢加入低溫(-22℃)50％ 乙醇溶液26.1kg，攪拌1.5小時，低溫(-2-0℃)離心，流速1.5-1.8kg/min/臺，收集沉淀7.5kg，棄上清液；
第八步，將以上沉淀攤薄切碎，按稀釋比1：2，然后投入15.0kg緩沖液3中溶解，均勻攪拌2小時，然后用一只0.45μm的濾芯過濾以上懸浮液并后洗濾芯；緩沖液3配方：檸檬酸鈉·2H2O 272g，精氨酸鹽酸鹽645g，甘氨酸600g，氯化鈉132g，緩沖液3的pH值為6.85，溫度30℃；
第九步，用第八步所述配方的緩沖液3將蛋白濃度稀釋至5.8％；復測pH6.88，送去無菌分裝；
第十、十一步，同實施例2。
以上是對本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實施例進行的具體描述，但本發(fā)明的實施方法并不限于所述實施例，熟悉本領域的技術人員在不違背本發(fā)明創(chuàng)造精神的前提下還可作出種種的等同的變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請權利要求所限定的范圍內。
本發(fā)明工藝的產品與國內某公司上市產品的對照，見下表1。
表1 本發(fā)明工藝的產品與國內某公司上市產品對比