一種桃膠多糖降解產(chǎn)物pgp-2及其制備方法和應(yīng)用
【專利說明】-種桃膠多糖降解產(chǎn)物PGP-2及其制備方法和應(yīng)用
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明屬于桃膠多糖制備技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，設(shè)及一種桃膠多糖降解產(chǎn)物PGP-2 及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0003] 桃膠為菩薇科植物桃或山桃樹皮中分泌出來的樹脂。關(guān)于桃膠的藥用價值，中醫(yī) 古籍廣有記載。桃膠性平，味甘苦，擅長活血消腫、通淋止痛，止渴、消渴。臨床運用對血淋、 石淋、糖尿病等癥均有良效。
[0004] 我國桃膠資源豐富，是一種優(yōu)質(zhì)的中藥資源。國內(nèi)外均有關(guān)于桃膠多糖組成的報 道，但是天然多糖的酶水解一直W來都是世界性難題，高效多糖水解酶菌株的篩選及相關(guān) 研究一直備受人們的關(guān)注。由于多糖空間構(gòu)象的位阻作用，單一酶很難將多糖完全解聚。由 于桃膠本身短螺旋結(jié)構(gòu)的保護及側(cè)鏈所產(chǎn)生的位阻，使得一般的阿拉伯半乳聚糖水解酶如 半乳糖巧酶、阿拉伯糖巧酶和半乳糖醒酸酶等都很難將其降解。本課題組采用前期研究的 成果，采用具有分解桃膠能力的微桿菌A5在桃膠培養(yǎng)基中誘導(dǎo)產(chǎn)酶的方法來水解桃膠多 糖，并進行分離純化，期望得到一種經(jīng)過酶解后的產(chǎn)物，能夠展現(xiàn)更高的生物學(xué)活性，從而 為桃膠多糖的進一步提取和應(yīng)用提供技術(shù)支持。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明根據(jù)目前桃膠多糖提取技術(shù)中的不足，提供了一種桃膠多糖降解產(chǎn)物PGP- 2及其制備方法和應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)目的通過W下技術(shù)方案實現(xiàn)： 本發(fā)明提供了一種桃膠多糖降解產(chǎn)物PGP-2，所述PGP-2由微桿菌A5接種至桃膠培養(yǎng)基 上獲得發(fā)酵液，分離純化獲得； 所述微桿菌A5于2009年8月7日保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、，其保藏編號為CCTCC NO :1209174； 所述分離純化采用陰離子交換進行，洗脫為采用NaCl溶液進行梯度洗脫。
[0007] 優(yōu)選地，所述化C1溶液的梯度洗脫濃度分別為0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、 0.4mol/L、0.5mol/L、0.6mol/L、0.7mol/L、0.8mol/L、0.9mol/L、l.Omol/X; 所述PGP-2為0.2mol/LNaCl溶液洗脫后的產(chǎn)物。
[000引優(yōu)選地，所述PGP-2的制備具體包括如下步驟： 51. 將菌種活化，得到種子液； 52. 將S1中所得種子液接種至桃膠培養(yǎng)基，進行發(fā)酵培養(yǎng)，S2中發(fā)酵溫度為20~40°C， 初始桃膠濃度4~8%，培養(yǎng)基抑為4~6，搖床轉(zhuǎn)速為160~20化pm，得到發(fā)酵液； 53. 將S2中所得發(fā)酵液進行分離純化，得到所述PGP-2; 所述S3中包括如下步驟： 531. 將S2中所得發(fā)酵液離屯、，得到桃膠多糖液，然后過濾，依次將過濾產(chǎn)物經(jīng)過脫蛋 白、醇沉、干燥后，得到干燥產(chǎn)物； 532. 將S31中所得干燥產(chǎn)物經(jīng)過陰離子交換、濃縮、透析、除雜、干燥后即得所述PGP-2。
[0009] 本申請人采用前期研究的成果，在特定酶解條件下，采用具有分解桃膠能力的微 桿菌A5在桃膠培養(yǎng)基中誘導(dǎo)產(chǎn)酶的方法來水解桃膠多糖，并結(jié)合分離純化工藝，提取得到 了桃膠多糖PGP-2。
[0010] 經(jīng)菌體降解后獲得的多糖產(chǎn)物中會有培養(yǎng)基來源的無機鹽及醇不溶的小分子等 雜質(zhì)，W及菌體及菌體分泌的蛋白及其它代謝產(chǎn)物。可按分子大小和形狀分級（如分級沉 淀、超濾、分子篩、層析等），也可按分子所帶基團的性質(zhì)分級(如按電荷性質(zhì)分級的電泳、離 子交換層析等)進而對多糖降解產(chǎn)物進行分離提取。
[0011] 同時，本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)，PGP-2經(jīng)過DEAE-Cellulose 52陰離子交換柱的方式可W獲 得，但是經(jīng)過Se地adex G200柱層析和有機溶劑洗脫的分離方式不能將經(jīng)過發(fā)酵后的桃膠 粗多糖產(chǎn)品分離開來。
[0012] 優(yōu)選地，所述S2中發(fā)酵溫度為30°C，初始桃膠濃度8%，培養(yǎng)基pH為4,搖床轉(zhuǎn)速為 160巧m，接種量為3%。
[0013] 優(yōu)選地，所述S1中菌種活化為將所述菌種在4Γ保存斜面菌種，營養(yǎng)瓊脂平板劃 線，37 Γ倒置培養(yǎng)24h，從平板挑單克隆轉(zhuǎn)接到LB試管培養(yǎng)基，于20化pm轉(zhuǎn)速，37 Γ下震蕩培 養(yǎng)1化。
[0014] 優(yōu)選地，所述S31中脫蛋白采用Sevage法脫蛋白，所述S31中醇沉為采用75%的乙 醇； 所述S32中濃縮為采用聚乙二醇8000進行濃縮處理，所述透析為采用截留分子量200的 透析袋。
[0015] 本發(fā)明中發(fā)酵液的分離純化步驟如下所示：
[0016] 本發(fā)明通過對PGP-2進行相關(guān)生物活性研究，發(fā)現(xiàn)其對能抑制化la細胞生長及增 殖，且抑制作用隨濃度增加而增加，并且能對半乳凝集素 -3所誘導(dǎo)的雞血紅細胞、Hela細 胞、乳腺癌MCF-7細胞的凝集產(chǎn)生抑制作用。還能促進雙歧桿菌和枯草芽抱桿菌的增長，抑 審IJ尿腸球菌的增長。此外，PGP-2對徑基自由基和DPPH都有較強的清除能力，為天然多糖產(chǎn) 物的實際應(yīng)用提供了技術(shù)支持，具備廣泛的應(yīng)用前景。
[0017] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有W下有益效果： 本發(fā)明的提供的PGP-2制備簡單，并能夠顯著促進雙歧桿菌的增長，抑制尿腸球菌的增 長，且具備較強的對徑基自由基和DPPH'自由基的清除能力，對Galectin-3介導(dǎo)的細胞聚集 抑制實驗表明，其能夠顯著抑制Galectin-3介導(dǎo)的雞血紅細胞、Hela細胞W及MCF-7細胞的 凝集。
[001引【附圖說明】： 圖1為實施例2中桃膠粗多糖經(jīng)過DEAE-52陰離子交換柱NaCl梯度洗脫曲線。
[0019] 圖2為PGP-2的紅外光譜圖。
[0020] 圖 3 為PGP-2 的 MALDI-T0F-MS 圖。
[0021] 圖4為PGP-2和PGP-2對幾種腸道菌生長的影響。
[0022] 圖5為PGP-2的抗氧化活性影響。
[0023] 圖6為PGP-2對化la細胞毒性和細胞生長抑制作用。
[0024] 圖7為PGP-2對化la細胞增殖的影響。
【具體實施方式】
[0025] 下面通過實施例對本發(fā)明進行具體描述，有必要在此指出的是本實施例只用于對 本發(fā)明進行進一步說明，但不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員 可W根據(jù)上述本發(fā)明的內(nèi)容作出一些非本質(zhì)的改進和調(diào)整。
[0026] 除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè) 備。
[0027] 實施例1:微桿菌降解桃膠制備發(fā)酵液： 1、 菌種活化 4 Γ保存斜面菌種，營養(yǎng)瓊脂平板劃線，37 Γ倒置培養(yǎng)24h，從平板挑單克隆轉(zhuǎn)接到LB試 管培養(yǎng)基，6ml/支，200巧m，37 °C，震蕩培養(yǎng)12h。
[002引 1.8%的LB液體培養(yǎng)基：3.6g復(fù)合LB，去離子水定容至200ml，PH=4，12rC，20分鐘 滅菌備用。
[0029] 菌種為微桿菌A5,于2009年8月7日保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、，其保藏編號 為CCTCC N0:M209174; 2、 搖瓶培養(yǎng) 將活化后的種子液接種至桃膠搖瓶培養(yǎng)基中，500mlS角瓶，裝液量為200ml，初始桃膠 濃度為8%、初始pH=4，接種量為3%，培養(yǎng)溫度為30°C、160rpm震蕩培養(yǎng)2地。培養(yǎng)后的發(fā)酵液 用于后續(xù)桃膠多糖降解產(chǎn)物的分離。
[0030] 桃膠多糖培養(yǎng)基的制備:準確稱取桃膠多糖，去離子水定容到200ml，PH=4。121°C， 15分鐘滅菌備用。
[0031] 實施例2:將實施例1所得發(fā)酵液進行分離純化： 先將實施例1制備得到的發(fā)酵液與Sevage試劑(氯仿:戊醇或正下醇（W4:l或5:1比例 混合)按一定比例混合，然后離屯、除去介于提取液與Sevage試劑交界處的變性蛋白質(zhì)，然后 采用75%的乙醇來沉淀上述物質(zhì)，得到桃膠粗多糖。
[0032] 選用DEAE-Cellulose 52陰離子交換來進一步純化桃膠粗多糖，具體如下： 取lOg肥AE-5巧日入500ml水，浸泡2地，使纖維素顆粒充分膨脹，去除懸浮的細顆粒。其 后轉(zhuǎn)移到布氏漏斗（內(nèi)墊200目的尼龍網(wǎng)）中抽濾，用200ml 0.5mol/L化0H-化C1溶液浸泡 地，轉(zhuǎn)移到布氏漏斗（內(nèi)墊200目的尼龍網(wǎng)）中抽濾，用蒸饋水洗至中性，抽干后轉(zhuǎn)移到燒杯 中，用200ml 0.5mol/L HC1浸泡4h。再轉(zhuǎn)移到布氏漏斗內(nèi)抽濾，用蒸饋水洗至中性，抽干后 轉(zhuǎn)移至燒杯中，如此酸堿反復(fù)輪洗，直至洗出液無色澄清為止。最后用150ml 0.02mol/L，PH =6.5的憐酸緩沖液浸泡20min，脫氣后裝柱，備用。
[0033] DEAE-Cellulose 52陰離子交換樹脂柱的制備:先將1.8X40cm的層析柱垂直架 好，用適量的水溶液先潤洗檢漏，保持底部有少許水溶液，然后把預(yù)先處理好的DEAE-52 攬勻，隨即將此懸濁液連續(xù)傾入柱中，待其自然沉降至柱高的1/4-1/3時打開柱下端出 口，讓溶劑慢慢流出，使柱上端懸浮液徐徐下降至需要的高度。吸附劑表面要平整，應(yīng)使其 一直浸沒在溶劑，嚴防氣泡產(chǎn)生?？刂破淞魉?，讓200ml