本發(fā)明屬于植物活性成分提取分離技術(shù)及生物作用領(lǐng)域，涉及到內(nèi)折香茶菜苷A的提取分離技術(shù)及內(nèi)折香茶菜苷A在細(xì)胞毒檢測(cè)方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

原發(fā)性肝癌的臨床病象極不典型，其癥狀一般多不明顯，特別是在病程早期。通常5cm以下小肝癌約70％左右無癥狀，無癥狀的亞臨床肝癌亦70％左右為小肝癌。癥狀一旦出現(xiàn)，說明腫瘤已經(jīng)較大，其病勢(shì)的進(jìn)展則一般多很迅速，通常在數(shù)周內(nèi)即呈現(xiàn)惡病質(zhì)，往往在幾個(gè)月至1年內(nèi)即衰竭死亡。目前，國(guó)內(nèi)外研究癌癥科學(xué)工作者們一直在不懈努力以探求和尋找安全、可靠、有效的治療藥物。毫無疑問，一種新藥物的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，都將是對(duì)全人類的一種貢獻(xiàn)。天然藥物因其毒副作用小并且顯示出了顯著的治療作用而受到人們關(guān)注。

王棗子唇形科香茶菜屬多年生草本植物，是世界上稀有的名貴食用植物，集中生長(zhǎng)在安徽宿州的一種地方草藥。王棗子中含有多種有效藥用成分，具有抗腫瘤，抗菌消炎，抗氧化，抗血栓等功能，在民間被用于治療毒蛇咬傷，紅斑狼瘡等疾病。王棗子中單體成分的研究以及在藥物方面具有較好的應(yīng)用前景，目前已發(fā)現(xiàn)的王棗子活性成分不過10種，而天然產(chǎn)物成分結(jié)構(gòu)復(fù)雜，仍有大量有效成分亟待開發(fā)，因此王棗子中未知成分的提取分離及結(jié)構(gòu)鑒定成為一項(xiàng)技術(shù)難題。王棗子活性成分的傳統(tǒng)加熱回流提取技術(shù)采用有機(jī)溶劑對(duì)大量原材料加熱回流，使易揮發(fā)性有機(jī)溶劑大量消耗，普遍存在提取時(shí)間長(zhǎng)、提取效率低、嚴(yán)重污染環(huán)境的問題，它影響王棗子活性成分藥用的經(jīng)濟(jì)效益。采取大批量王棗子原材料采用加熱回流的方法提取王棗子活性成分，不僅使提取不夠充分而且使得部分不穩(wěn)定化合物在高溫下變性，不能滿足活性成分的有效提取進(jìn)而無法發(fā)揮其活性成分原有的藥效作用，使得提取效率降低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一在于提供一種從中藥王棗子中提取新化合物內(nèi)折香茶菜苷A的方法。

本發(fā)明的目的之二在于內(nèi)折香茶菜苷A在抗肝癌細(xì)胞活性及氧化損傷活性方面的應(yīng)用。

內(nèi)折香茶菜苷A化學(xué)名為(1S,5S,10S,11R,13R)-1,11,13-三羥-脫氧-8-烯-7-酮1-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，分子式C₂₆H₄₂O₉，相對(duì)分子質(zhì)量498.62，溶于乙醇、甲醇，不溶于氯仿。是一種二萜苷化合物。首次在王棗子植物中提取得到內(nèi)折香茶菜苷A。內(nèi)折香茶菜苷A具有抗腫瘤作用，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激作用，促進(jìn)氧自由基增加進(jìn)而加快癌細(xì)胞的凋亡，是一種潛在的純天然抗腫瘤藥物。

本發(fā)明的技術(shù)方案：

一種從王棗子中分離提取內(nèi)折香茶菜苷A的方法，步驟如下：將王棗子根粉碎，過40～60目篩，按料液比1:8加入質(zhì)量百分比為80％的乙醇，攪拌均勻；在40～55℃，功率150～300W條件下超聲提取20～60min后，將提取的混合物進(jìn)行抽濾，除去濾渣，上清液在溫度為40～48℃，壓力為0.08～-0.1MPa條件下進(jìn)行蒸餾，蒸出乙醇回收再利用，濃縮液依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯在室溫下萃取，乙酸乙酯萃取液在溫度為35～40℃，壓力為0.08～-0.1MPa條件下減壓蒸餾，蒸出乙酸乙酯回收再利用，濃縮干粉即乙酸乙酯提取物；粗提物采用硅膠柱層析，薄層層析及重結(jié)晶方法分離得到內(nèi)折香茶菜苷A。

化合物內(nèi)折香茶菜苷A用于檢測(cè)人肝癌細(xì)胞毒。

本發(fā)明的有益效果：

(1)利用超聲技術(shù)輔助提取，能夠有效提取王棗子活性成分，與傳統(tǒng)提取方法相比，由原來的浸泡24h縮短為30min，大大減少活性成分溶出時(shí)間，節(jié)省操作時(shí)間，使得活性成分的溶出度提高，大大提高了活性成分的提取效率。工藝作簡(jiǎn)單，節(jié)省成本，更有利于工業(yè)化。

(2)新化合物在細(xì)胞毒檢測(cè)方面的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)一種新的潛在抗癌藥物。

附圖說明

圖1A是MTT法檢測(cè)單體一次給藥對(duì)人肝癌細(xì)胞(HepG2)細(xì)胞活性的影響圖，隨著藥物濃度的增大，HepG2細(xì)胞存活率越低，呈現(xiàn)劑量依賴作用。

圖1B是用乳酸脫氫酶(LDH)細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)單體一次給藥后對(duì)細(xì)胞內(nèi)LDH泄露率的影響圖，給藥組HepG2細(xì)胞LDH泄漏率明顯增高，表明藥物對(duì)HepG2細(xì)胞膜具有破壞作用，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

圖1C是用活性氧檢測(cè)(ROS)試劑盒檢測(cè)單體一次給藥后對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響圖，給藥組HepG2細(xì)胞ROS水平明顯增高，表明氧自由基明顯增加，進(jìn)而對(duì)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷作用，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖和技術(shù)方案，進(jìn)一步說明本發(fā)明的具體實(shí)施方式。

實(shí)施例一：內(nèi)折香茶菜苷A的分離純化

王棗子根用普通粉碎機(jī)粉碎，過60目篩，用40℃干燥箱干燥王棗子根粉末，得到王棗子根干燥粉末。精確稱量2.0kg放于燒杯中，按料液比1:8加入體積分?jǐn)?shù)為80％的乙醇水溶液，攪拌均勻，在溫度為50℃，頻率43kHz，功率250W的超聲波條件下超聲提取30min，提取液真空抽濾，得濾液。重復(fù)提取三次，合并提取液。在45℃，60r/min的條件下減壓濃縮得濃縮液。濃縮液依次用石油醚，氯仿，乙酸乙酯按比例1:1萃取，分別萃取1次，2次，2次，得各相萃取液。減壓濃縮得乙酸乙酯相萃取物固體為15.0g。

將上述乙酸乙酯濃縮物進(jìn)行硅膠柱層析，石油醚-乙酸乙酯(3:1)，氯仿-甲醇(15:1,10:1,5:1,2:1)為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，500ml為一個(gè)餾分收集段，每個(gè)餾分收集六段，洗脫成分進(jìn)行薄層色譜檢測(cè)，氯仿-甲醇-乙酸展開，暗箱式紫外燈下觀察，收集合并含相同點(diǎn)的餾分段，減壓濃縮，收集合并氯仿-甲醇為15:1第9～11段餾分，減壓濃縮得到結(jié)晶物811.2mg。將上述結(jié)晶物30℃恒溫下慢慢滴加甲醇使結(jié)晶物完全溶解于甲醇，待全部溶解后置于4℃重結(jié)晶。結(jié)晶物用甲醇多次沖洗抽濾，35℃真空干燥，得到無色針晶28.5mg。

實(shí)施例二：無色針晶的結(jié)構(gòu)鑒定

無色針晶，溶于甲醇，乙醇，不溶于氯仿。高分辨質(zhì)譜(HR-ESI-MS)檢測(cè)得：m/z 521.2721[M+Na]⁺。核磁共振波譜數(shù)據(jù)如下：¹H NMR(500MHz DMSO-d₆)δ_H 5.06(1H,d,J＝8.8Hz,OH-13),4.94(1H,d,J＝5.5Hz,OH-11),4.90(1H,m,H-11),4.88(1H,d,J＝11.4,H-1′),4.85(1H,m,H-1),4.68(1H,m,H-6′),4.02(1H,m,H-3′),3.66(1H,m,H-4′),3.38(1H,m,H-2′),3.13(1H,m,H-5′),2.98(1H,dd,J＝11.4,5.3Hz,H-14),2.90(1H,m,H-6),2.43(1H,d,J＝2.1Hz,H-5),2.31(1H,m,H-2),2.15(1H,m,H-12),1.89(1H,m,H-3),1.55(1H,m,H-15),1.34(3H,s,H-20),0.92(3H,d,J＝6.8Hz,H-16),0.87(3H,d,J＝6.8Hz,H-17),0.85(3H,s,H-19),0.84(3H,s,H-18).

¹³C NMR(126MHz DMSO-d₆)δ_C 200.35(C-7),163.20(C-9),129.26(C-8),104.91(C-1′),81.51(C-1),77.74(C-3′),77.47(C-5′),74.03(C-2′),72.27(C-13),70.66(C-4′),65.41(C-11),61.77(C-6′),44.78(C-10),43.83(C-5),37.94(C-15),35.29(C-6),34.53(C-3),33.13(C-14),32.84(C-4),32.77(C-19),23.26(C-2),22.41(C-18),20.33(C-20),17.32(C-17),17.19(C-16)。

無色針晶化學(xué)結(jié)構(gòu)參見

¹H–¹H COSY光譜和HMBC光譜無色針晶結(jié)構(gòu)相分析參見

無色針晶，化學(xué)名(1S,5S,10S,11R,13R)-1,11,13-三羥-脫氧-8-烯-7-酮1-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，相對(duì)分子質(zhì)量498.62分子式為C₂₆H₄₂O₉。

實(shí)施例三：?jiǎn)误w一次給藥對(duì)人肝癌細(xì)胞(HepG2)細(xì)胞活性的影響

第七代HepG2細(xì)胞接種密度為每孔1×10⁵個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，給藥濃度分別為0,1,2,5,10,20μmol·L^-1，給藥后繼續(xù)培養(yǎng)24h，MTT法檢測(cè)不同濃度下的內(nèi)折香茶菜苷A對(duì)HepG2的影響效果明顯，具有較好的抗癌作用，結(jié)果參見圖1A，實(shí)驗(yàn)表明，在濃度為1μmol·L^-1細(xì)胞存活率為95.87±1.46％，20μmol·L^-1時(shí)，細(xì)胞存活率為7.52±2.48％，癌細(xì)胞基本全部死亡，IC₅₀值為4.66±0.11μmol·L^-1，該藥物具有較好的抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)作用。

在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，HepG2細(xì)胞接種密度為每孔1×10⁵個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，給藥濃度分別為0,2,5μmol·L^-1，給藥后繼續(xù)培養(yǎng)12h，用乳酸脫氫酶(LDH)細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)給藥濃度為0,2,5μmol·L^-1時(shí)，對(duì)肝癌細(xì)胞的影響。結(jié)果見圖1B，表明一定濃度的藥物能夠增加肝癌細(xì)胞膜的破壞，進(jìn)而使LDH泄露率增加，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。

實(shí)施例四：?jiǎn)误w一次給藥對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)活性氧的影響

HepG2細(xì)胞接種密度為每孔1×10⁵個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，根據(jù)活性氧檢測(cè)(ROS)試劑盒裝載探針，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入200μl DCFH-DA后于二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育20min，給藥濃度分別為0,2,5μmol·L^-1，給藥后孵育40min，除去上清，用無血清培養(yǎng)基洗滌1次，用胰酶消化后加入培養(yǎng)基反復(fù)吹打轉(zhuǎn)移至EP管中離心5min，吸去上清，加入200μl PBS轉(zhuǎn)移至96孔板中檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖1C)表明顯示給藥組使細(xì)胞內(nèi)活性氧水平顯著增加，對(duì)肝癌細(xì)胞具有氧化損傷作用，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。