本發(fā)明涉及一種具有抗腫瘤活性的新化合物及其制備方法和應(yīng)用，具體涉及一種從守宮木葉分離的具有抗腫瘤活性的新化合物。

背景技術(shù)：

惡性腫瘤是嚴(yán)重危害人類健康和生命的多發(fā)病和常見病，早在2000～3000年前已有關(guān)于腫瘤的記載。在惡性腫瘤的治療中，藥物治療占有重要的地位。在合成化學(xué)類抗腫瘤藥物中絕大多數(shù)都以天然抗腫瘤活性成分為先導(dǎo)化合物，以天然產(chǎn)物為來源的抗腫瘤藥物具有活性顯著、結(jié)構(gòu)獨(dú)特、作用機(jī)制不同于一般的小分子化學(xué)治療藥物的優(yōu)勢。據(jù)報(bào)道，臨床使用的抗癌藥物中超過60％來源于天然產(chǎn)物。因此，通過研究天然產(chǎn)物中的化學(xué)抗癌物質(zhì)預(yù)防癌癥的發(fā)生和發(fā)展，已成為癌癥化學(xué)預(yù)防研究的一個重要領(lǐng)域，并受到世界各國科學(xué)界的普遍關(guān)注及研究。

守宮木(Sauropus androgynus(L.)Merr)是大戟科、守宮木屬植物。又稱五指山野菜、樹仔菜、越南菜、天綠香等。守宮木在我國四川、海南、廣東、廣西等省，以及越南、印度、印度尼西亞、菲律賓、泰國等國均有分布。植株直立生長，株高1～3m，葉和幼梢為綠色，羽狀復(fù)葉。葉披針形或卵狀披針形、葉互生，全緣。守宮木多作為蔬菜栽培，以其嫩莖葉為食，可植于庭院，也適合花盆種植。性涼、味苷、用水磨液內(nèi)服，外用涂擦疥瘡，具有消炎，清熱解毒的功效。也可用于治療痢疾便血，腹痛經(jīng)久不愈，淋巴結(jié)炎，扁桃體炎，咽喉炎，上呼吸道感染等。

已有研究報(bào)道，大戟科植物具有強(qiáng)抗腫瘤活性。但對守宮木葉中的化學(xué)成分及其生物活性研究報(bào)道甚少，本發(fā)明對守宮木葉化學(xué)成分深入研究，分離得到具有抗腫瘤活性的新化合物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種從守宮木葉中分離得到的具有抗腫瘤活性的新化合物。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

結(jié)構(gòu)如式(I)所示的化合物，

化合物名稱為：(3β，20β，24Z)-豆甾-5，24(28)-二烯-3，20-二醇，英文名(3β，20β，24Z)-stigmast-5，24(28)-dien-3，20-diol。

本發(fā)明所述的化合物的制備方法，步驟如下：

(1)、制備守宮木葉浸膏：守宮木葉用甲醇浸泡過夜后，再加熱回流提取4～6次，每次1～3小時，合并提取液，減壓回收溶劑，得守宮木葉浸膏；其中，守宮木葉與甲醇重量體積比1∶8～12(g/mL)，優(yōu)選為1∶10(g/mL)；

(2)、初步提?。航嗉铀鞈?，再用與混懸液等體積的乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯萃取液減壓濃縮，得到乙酸乙酯部位；乙酸乙酯部位加水混懸，再用與混懸液等體積的正己烷萃取3次，得水部位萃取液，水部位萃取液減壓回收溶劑，得到水部位粉末；

(3)、分離純化：將水部位粉末上硅膠柱色譜，以正己烷-乙酸乙酯90∶10、80∶20、70∶30、60∶40、50∶50、40∶60、30∶70、20∶80、10∶90、0∶100(V/V)梯度洗脫，收集每個梯度洗脫液；正己烷-乙酸乙酯70∶30(V/V)洗脫液組分濃縮，再上大孔吸附樹脂柱，用100％甲醇洗脫，收集甲醇洗脫液，減壓回收溶劑，得濃縮液；濃縮液采用硅膠柱色譜，用氯仿-丙酮20∶80、95∶5、0∶100(V/V)梯度洗脫，氯仿-丙酮95∶5(V/V)洗脫液組分濃縮得到濃縮液；濃縮液用C₁₈(100-200目)反相柱色譜進(jìn)行分離，用甲醇-水50∶50、60∶40、70∶30、80∶20、90∶10、100∶0(V/V)洗脫，100％甲醇洗脫液濃縮得到濃縮液；濃縮液以高效制備液相純化，采用十八烷基鍵合硅膠色譜柱，色譜柱規(guī)格為PEGASIL ODS SP100(250×10mm)，以甲醇-水90∶10(V/V)為流動相，檢測波長220nm，流速2.0mL/min，柱溫30℃，最終得到目標(biāo)化合物。

大孔吸附樹脂采用DIAION HP-20大孔吸附樹脂。

本發(fā)明式(I)所示的化合物對多種腫瘤細(xì)胞，包括人胃癌細(xì)胞AZ521、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549、人乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3等均具有一定的抗腫瘤活性。因此，本發(fā)明的另一個目的是提供式(I)所示的化合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。所述的腫瘤為胃癌、肺癌、乳腺癌。

一種組合物，以式(I)所示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽為活性成分或主要活性成分，輔以輔料制成。所述的組合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

同現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明以守宮木葉為原料，依次采用甲醇提取、乙酸乙酯萃取、正己烷萃取、硅膠柱色譜、大孔吸附柱色譜、硅膠柱色譜、反相柱色譜及高效液相色譜，簡便、快速的提取分離出新化合物。該新化合物具有抗腫瘤活性，可用于指導(dǎo)守宮木葉的應(yīng)用，也為研究與開發(fā)新的抗腫瘤藥物提供了候選化合物。

具體實(shí)施方式

下面所列實(shí)施例有助于本領(lǐng)域技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。

實(shí)施例1

化合物的分離純化

將守宮木葉用甲醇(守宮木葉與甲醇重量體積比1∶10g/mL)浸泡過夜，每次提取用甲醇1700mL，加熱回流提取4次，每次2小時，合并提取液，減壓回收溶劑，得守宮木葉浸膏90g。守宮木葉浸膏用水混懸，再用與混懸液等體積的乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯萃取液減壓濃縮，得到乙酸乙酯部位。乙酸乙酯部位用水混懸，再用與混懸液等體積的正己烷萃取3次，得水部位萃取液，水部位萃取液減壓回收溶劑，得到水部位粉末14.6g。水部位粉末采用硅膠柱色譜，先用正己烷-乙酸乙酯90∶10、80∶20、70∶30、60∶40、50∶50、40∶60、30∶70、20∶80、10∶90、0∶100(V/V)梯度洗脫，再用乙酸乙酯-甲醇50∶50(V/V)洗脫，最后用100％甲醇洗脫，收集每個梯度洗脫液。正己烷-乙酸乙酯70∶30(V/V)洗脫液組分濃縮，濃縮液上DIAION HP-20大孔吸附樹脂柱，用100％甲醇洗脫，大孔吸附樹脂吸附以除去色素，收集甲醇洗脫液，減壓回收溶劑，得濃縮液。100％甲醇洗脫濃縮液采用硅膠柱色譜，先用氯仿-丙酮20∶80、95∶5、0∶100(V/V)梯度洗脫，最后用100％甲醇洗脫。氯仿-丙酮95∶5(V/V)洗脫液組分濃縮得到濃縮液，濃縮液用C₁₈(100-200目)反相柱色譜進(jìn)行分離，用甲醇-水50∶50、60∶40、70∶30、80∶20、90∶10、100∶0(V/V)洗脫，100％甲醇洗脫液濃縮得到濃縮液。濃縮液以高效制備液相純化，采用十八烷基鍵合硅膠色譜柱，色譜柱規(guī)格為PEGASIL ODS SP100(250×10mm)，以甲醇-水90∶10(V/V)為流動相，檢測波長220nm，流速2.0mL/min，柱溫30℃，最終得到化合物8.7mg。

新化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物為白色無定形粉末，易溶于二氯甲烷，紫外254nm照射下無暗斑，365nm照射下無熒光，Molish反應(yīng)陰性，Libermann-Burchard反應(yīng)陽性，1％香草醛-濃硫酸加熱后顯紫紅色，提示該化合物為甾體類或三萜類化合物。

高分辨質(zhì)譜：HR-APCI-MS m/z：411.3533[(M-H₂O)+H]⁺。結(jié)合¹H-NMR，¹³C-NMR以及DEPT數(shù)據(jù)，推測該化合物可能的分子式：C₂₉H₄₈O₂，分子量為428，不飽和度為6。

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)譜中有6個甲基信號δ0.86(3H，s，H-18)，1.00(3H，s，H-19)，1.28(3H，s，H-21)，0.97(3H，d，J＝7.2Hz，H-26)，0.97(3H，d，J＝7.2Hz，H-27)，1.56(3H，d，J＝6.8Hz，H-29)。一個連氧次甲基信號δ3.51(1H，m，H-3)。兩個稀氫信號δ5.35(1H，d，J＝5.2Hz，H-6)，5.11(1H，q，J＝6.8Hz，H-28)。¹³C-NMR(100MHz，CDCl₃)中顯示個29碳信號，結(jié)合DEPT數(shù)據(jù)與HMQC信號，化合物有6個甲基碳信號(δ26.3，21.2，21.1，19.5，13.7，12.9)，10個亞甲基碳信號(δ43.7，42.4，40.2，37.3，31.9，31.7，25.8，23.9，22.6，21.0)，8個次甲基碳信號(δ121.7，117.1，71.9，57.9，57.0，50.1，31.4，28.8)，5個季碳信號(δ145.3，140.9，75.5，42.8，36.4)。由于兩個烯烴基團(tuán)占據(jù)了2個不飽和度，以及上述特征信號推斷化合物為豆甾醇類化合物。

經(jīng)與文獻(xiàn)中結(jié)構(gòu)類似化合物的(3β，24Z)-stigmast-5，24(28)-dien-3-ol ¹H-NMR數(shù)據(jù)對比發(fā)現(xiàn)(參考文獻(xiàn)：李兆春，陳重，李笑然，許瓊明，楊世林.錦燈籠根和莖化學(xué)成分研究[J].中草藥.2012(10))，δ0.95(3H，d，J＝6.5Hz，H-21)向低場偏移至δ1.28(3H，s，H-21)，質(zhì)子信號變?yōu)閱畏?。推測20位質(zhì)子被羥基取代。經(jīng)與文獻(xiàn)中結(jié)構(gòu)類似化合物的(3β，24Z)-stigmast-5，24(28)-dien-3-ol¹³C-NMR數(shù)據(jù)對比發(fā)現(xiàn)，δ36.2(C-20)向低場偏移至δ75.5(C-20)，δ56.0(C-17)向低場偏移至δ57.9(C-17)，δ18.8(C-21)向低場偏移至δ26.3(C-21)，δ36.0(C-22)向低場偏移至δ43.7(C-22)，δ28.2(C-16)向高場偏移至δ22.6(C-16)，δ28.0(C-23)向高場偏移至δ25.9(C-23)。根據(jù)羥基取代位移規(guī)律，化合物20位質(zhì)子被羥基取代。

HMBC數(shù)據(jù)顯示，δ1.28(3H，s，H-21)與δ75.5(C-20)，57.9(C-17)，43.7(C-22)相關(guān)，δ1.70-1.76(2H，m，H-16)與δ75.5(C-20)相關(guān)，確定化合物的20位質(zhì)子被羥基取代。δ5.11(1H，q，J＝6.8Hz，H-28)與δ12.9(C-29)，145.3(C-24)，28.8(C-25)相關(guān)，δ2.83(1H，sep，H-25)與δ21.1(C-26)，21.2(C-27)，117.1(C-28)，145.3(C-24)，25.8(C-23)相關(guān)，確定雙鍵位于24到28位。

¹H-¹H COSY譜中δ1.53(m，2H，H-22)與δ1.89(m，2H，H-23)相關(guān)以及HMBC譜中δ1.28(s，3H，H-21)與δ75.5(C-20)，43.7(C-22)相關(guān)，相關(guān)可以確定化合物為豆甾-5，24(28)-二烯-3，20-二醇。NOESY譜顯示相關(guān)信號Me-21/H-12α，表明Me-21、H-12在環(huán)的同一側(cè)為α構(gòu)型，則確定20位羥基為β構(gòu)型。24位，28位兩個碳原子上的較優(yōu)取代基在雙鍵同一邊為Z構(gòu)型，對比最終確定化合物為(3β，20β，24Z)-豆甾-5，24(28)-二烯-3，20-二醇。

經(jīng)SCIFinder檢索，確定該化合物為新化合物并命名為(3β，20β，24Z)-豆甾-5，24(28)-二烯-3，20-二醇，英文名(3β，20β，24Z)-stigmast-5，24(28)-dien-3，20-diol。其結(jié)構(gòu)式如下：

表1化合物的¹HNMR、¹³CNMR和HMBC數(shù)據(jù)歸屬

實(shí)施例2

化合物的抗腫瘤活性測定

腫瘤細(xì)胞為人胃癌細(xì)胞AZ521，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549，人乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3由中國科學(xué)院細(xì)胞庫提供。

順鉑溶液的配制：先稱取1.5mg順鉑溶于50μLDMSO，得到濃度為100.0mM的順鉑溶液。再取10.0μL濃度為100.0mM的順鉑溶液，加入990.0μL DMEM培養(yǎng)基得到濃度為1000.0μM的順鉑溶液；再取100.0μL濃度為1000.0μM的順鉑溶液，加入900.0μL DMEM培養(yǎng)基得到濃度為100.0μM的順鉑溶液；取300.0μL濃度為100.0μM的順鉑溶液，加入700.0μL DMEM培養(yǎng)基得到濃度為30.0μM的順鉑溶液；取100.0μL濃度為100.0μM的順鉑溶液，加入900.0μL DMEM培養(yǎng)基得到濃度為10μM的順鉑溶液；取100.0μL濃度為30.0μM的順鉑溶液，加入900.0μL DMEM培養(yǎng)基得到濃度為3μM的順鉑溶液；取100.0μL濃度為10.0μM的順鉑溶液，加入900.0μL DMEM培養(yǎng)基得到濃度為1μM的順鉑溶液。

受試化合物樣液的配制：先稱取2.14mg本發(fā)明化合物溶于50μL DMSO，得到濃度為100.0mM的化合物溶液。再取10.0μL濃度為100.0mM的化合物溶液，加入990.0μL DMEM培養(yǎng)基得到濃度為1000.0μM的化合物溶液；再取100.0μL濃度為1000.0μM化合物溶液，加入900.0μL DMEM培養(yǎng)基得到濃度為100.0μM的化合物溶液；取300.0μL濃度為100.0μM的化合物溶液，加入700.0μL DMEM培養(yǎng)基得到濃度為30.0μM的化合物溶液；取100.0μL濃度為100.0μM的化合物溶液，加入900.0μL DMEM培養(yǎng)基得到濃度為10μM的化合物溶液；取100.0μL濃度為30.0μM的化合物溶液，加入900.0μL DMEM培養(yǎng)基得到濃度為3μM的化合物溶液；取100.0μL濃度為10.0μM的化合物溶液，加入900.0μL DMEM培養(yǎng)基得到濃度為1μM的化合物溶液。

取對數(shù)生長期的人胃癌細(xì)胞AZ521或非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549或人乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3細(xì)胞，胰酶消化收集細(xì)胞后，以5×10³個/孔的密度接種到96孔板中，每孔加入100μl含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，孵育24h待細(xì)胞貼壁80％后，用移液槍吸棄上清液。將受試化合物溶液以濃度梯度(1μM、3μM、10μM、30μM、100μM)加入到各孔中，每孔加入100μL受試化合物溶液，每組設(shè)置三個平行孔。順鉑溶液以濃度梯度(1μM、3μM、10μM、30μM、100μM)加入到各孔中，每孔加入100μL順鉑溶液，每組設(shè)置三個平行孔。另設(shè)3孔加入100μL DMEM培養(yǎng)基作為對照組。繼續(xù)孵育48h，取出96孔板，避光條件下加入10μl 5mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)避光孵育3h，使用酶標(biāo)儀在570nm波長下測定各孔的吸光度值，記錄結(jié)果，按照下述公式計(jì)算細(xì)胞的存活率：

細(xì)胞存活率(％)＝(試驗(yàn)組吸光值/對照組吸光度值)×100％

其中化合物對細(xì)胞半抑制濃度IC₅₀由劑量效應(yīng)曲線得到。

表2化合物對AZ521、A549與SK-BR-3細(xì)胞的抑制作用

結(jié)果顯示，新化合物對胃癌細(xì)胞、肺腺癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長，有可能發(fā)展成為具有抗腫瘤作用的藥物，豐富了守宮木葉的研究。