本發(fā)明涉及一種新的深海適冷微生物胞外多糖的制備方法，屬于海洋生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

60％的海洋是深度超過2000米的深海，深海是一個特殊的生態(tài)環(huán)境，這里永久低溫(深海熱液口是高溫環(huán)境)、高壓、黑暗、高鹽、寡營養(yǎng)。深海中生活著多種極端微生物，比如嗜(耐)熱菌、嗜(適)冷菌、嗜(耐)壓菌、嗜(耐)鹽菌等。深海熱液口區(qū)域的微生物是目前研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。

過去十年，科學(xué)家對深海熱液口微生物分泌的胞外多糖(Exopolysaccharides EPSs)的結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行了大量的研究，主要是熱液口附近的中溫菌分泌的多糖：交替單胞菌屬、假交替單胞菌屬和弧菌屬。熱液口微生物分泌的胞外多糖與其他生態(tài)環(huán)境中微生物分泌的胞外多糖的結(jié)構(gòu)不同，表現(xiàn)在糖醛酸含量高(高達(dá)10～40％)和高度乙?；希沟眠@些多糖粘度較高，對金屬離子、微生物菌體自身以及蛋白顆粒具有較強(qiáng)的結(jié)合能力。深海熱液口的微生物資源被認(rèn)為是能夠分泌新型特殊功能多糖的重要資源。因?yàn)?，一方面，深海熱液口微生物分泌的胞外多糖的特殊結(jié)構(gòu)，預(yù)示其具有新的潛在的生物學(xué)功能，在生物技術(shù)領(lǐng)域中將有新的用途；另一方面，深海極端環(huán)境下胞外多糖可以作為研究極端環(huán)境下生物大分子穩(wěn)定性保護(hù)的模式材料。因此，深海微生物多糖的研究日益引起了各國科學(xué)家的重視，已經(jīng)成為微生物學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，同時，也成為各國競爭的焦點(diǎn)。我國應(yīng)該加強(qiáng)深海微生物多糖的研究，從而能在這一海洋生物高技術(shù)領(lǐng)域占有一席之地。

微生物多糖是重要地生物技術(shù)產(chǎn)品，在藥物、生物技術(shù)領(lǐng)域、食品、環(huán)保、化妝品等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。微生物多糖的種類很多，多糖的結(jié)構(gòu)決定其功能。深海區(qū)域由于其高壓、高鹽、低溫等獨(dú)特的極端生態(tài)特性，因此，深海微生物分泌的胞外多糖應(yīng)該具有新的結(jié)構(gòu)特性。過去關(guān)注更多的是深海熱液口微生物分泌的胞外多糖的結(jié)構(gòu)及其在微生物適應(yīng)熱液口極端環(huán)境中的作用。但是，深海熱液口在整個深海海底中所占的面積很少，而且，在該區(qū)域生長的微生物大多都是嗜(耐)熱菌或中溫菌。而深海海底絕大部分區(qū)域是一個高壓、低溫、弱光、寡營養(yǎng)的海水流動的環(huán)境，這些區(qū)域生長著大量的嗜(適)冷微生物。

2001年，陳秀蘭等人首次報(bào)道了深海適冷菌Pseudomonas sp.SM9913的菌株篩選及特征與鑒定，參見陳秀蘭等，“深海適冷菌SM9913產(chǎn)生的低溫蛋白酶”，《海洋科學(xué)》2001年，第5卷，第1期，第4-8頁。中國專利01127405.0公開了利用該菌株生產(chǎn)適冷風(fēng)味蛋白酶的方法。但到目前為止，對深海適冷微生物胞外多糖的結(jié)構(gòu)與功能的研究，尚未見報(bào)道，而對該問題的研究，對于深海微生物利用而言具有更普遍的意義，值得深入探討。

本發(fā)明提供一種深海適冷微生物胞外多糖的制備方法。

本發(fā)明首先提供以胞外多糖產(chǎn)率高的深海適冷菌Pseudomonas sp.SM9913為菌株，通過液體深層發(fā)酵制備胞外多糖的工藝，得到分離純化的胞外多糖，解析其結(jié)構(gòu)，為其在生物技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

一種深海適冷微生物胞外多糖的制備方法，包括如下步驟：

(1)種子制備

培養(yǎng)基：豆餅粉2～3份、玉米2～3份、麩皮1～1.5份、Na₂HPO₄ 0.4～0.5份、KH₂PO₄0.03～0.04份和水100份，均為重量份，培養(yǎng)基100-120℃滅菌30-50分鐘，冷卻后，以深海適冷菌Pseudomonas sp.SM9913為菌株(參見陳秀蘭等，“深海適冷菌SM9913產(chǎn)生的低溫蛋白酶”，《海洋科學(xué)》2001年1月19日，菌株持有人山東大學(xué))，接茄子瓶菌種的菌懸液，接種量5-7％質(zhì)量百分比。通風(fēng)，攪拌，培養(yǎng)。得種子液，待用。

優(yōu)選的，上述培養(yǎng)基中加豆油300～350毫升作消泡劑。

優(yōu)選的，上述種子制備是在150升發(fā)酵罐中裝樣量70升，于10～12℃下，通風(fēng)1∶0.5～0.6，攪拌320～330轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)36～48小時。胞外多糖產(chǎn)量約5克/升。

(2)液體深層發(fā)酵制備胞外多糖發(fā)酵液

培養(yǎng)基，：豆餅粉3～3.5份、玉米粉2.5～3份、山芋粉2.5～3份、麩皮2.0～2.5份、Na₂HPO₄0.4～0.5份、KH₂PO₄ 0.03～0.04份和水100份，均為重量份。1000升發(fā)酵罐，裝450升培養(yǎng)基，滅菌后pH6.2～6.3，接種步驟(1)制備的種子5～7％，攪拌200～220轉(zhuǎn)/分，控制通風(fēng)量0-12小時1∶0.5～0.6，12-20小時1∶0.6～0.7，20-28小時1∶0.8～0.9，控制培養(yǎng)溫度10～12℃，發(fā)酵48～72小時。每升產(chǎn)多糖量可達(dá)5克。

優(yōu)選的，上述培養(yǎng)基中加豆油1～1.2公斤作消泡劑。

(3)胞外多糖發(fā)酵液的后處理

上述胞外多糖發(fā)酵液經(jīng)10000rpm離心，然后離心上清液用無水乙醇沉淀，上清液體積與無水乙醇體積比例為1∶3，除蛋白、脫色后，離心干燥得到多糖粗制品。多糖粗品在60～70℃熱水中重溶，濃縮至原體積的20～30％，再經(jīng)過凝膠過濾層析和離子交換層析技術(shù)分離，真空冷凍干燥，得到多糖的純品。

最后，經(jīng)質(zhì)檢、分裝成胞外多糖產(chǎn)品。

上述步驟(1)中所述的茄子瓶斜面菌種的制作可按已有技術(shù)。本發(fā)明提供如下具體操作步驟：

以0.2～0.4份牛肉膏、0.8～1.2份蛋白胨、1.5～2份瓊脂、0.4～0.6份NaCl為培養(yǎng)基，水95～100份，pH為7.0～7.2，滅菌，在試管斜面上，劃線接深海適冷菌Pseudomonassp.SM9913菌種，12～15℃培養(yǎng)24～26小時，貯藏于4℃。

將上述菌種移入茄子瓶斜面(培養(yǎng)基與保藏斜面相同)，12～15℃培養(yǎng)24～26小時，作菌懸液用。

上述步驟(3)凝膠過濾層析和離子交換層析中優(yōu)選：

凝膠過濾層析柱：100cm×1.2cm，凝膠類型：Sephadex G-100。

離子交換層析柱：25cm×1.6cm，凝膠類型：DEAE-Sepharose Fast Flow。

下面結(jié)合胞外多糖的結(jié)構(gòu)解析，對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。

本發(fā)明方法所制備的多糖純品經(jīng)過1D、2D-NMR、MS、甲基化分析得到此多糖的主要結(jié)構(gòu)組成重復(fù)單元為：

{→6)-[3，6-O-acetyl]-α-D-Glcp-(1→6)-[3-O-acetyl]-α-D-Glcp-(1→6)-[3-O-acetyl]-α-D-Glcp-(1→6)-[3-O-acetyl]-α-D-Glcp-(1→}_n

其中糖單元∶乙酰基∶乙醇基＝4∶5∶1，高度乙?；摩?(1→6)構(gòu)成多糖主鏈的核心結(jié)構(gòu)(61.8％)，多糖鏈的末端還存在少量的Ara(11.0％)、Xyl(3.9％)、Gal(3.1％)、(1→4)Glc(5％)和(3→6)Glc(4％)。從此胞外多糖結(jié)構(gòu)中，可以看出高度乙?；軌蚋淖兌嗵欠肿拥亩ㄏ蛐院蜋M向次序，從而改變多糖的物理性質(zhì)，乙酰基的引入使分子的伸展變化，最終導(dǎo)致多糖羥基基團(tuán)的暴露，增加其在水中的溶解性，從而達(dá)到提高其生物活性的效果。

本發(fā)明的所制備的多糖純品為生物技術(shù)產(chǎn)品，在藥物、生物技術(shù)領(lǐng)域、食品、環(huán)保、化妝品等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)特點(diǎn)在于：

1、海洋作為一個特殊的極端環(huán)境，海洋微生物分泌的EPS應(yīng)該具有特殊的結(jié)構(gòu)與功能，已經(jīng)日益引起各國科學(xué)家的關(guān)注。近年來，已經(jīng)對深海熱液口的中溫及耐熱微生物和極地適冷微生物分泌的EPS的結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行了許多研究，發(fā)現(xiàn)了多種新的結(jié)構(gòu)和功能的EPS。但關(guān)于深海適冷微生物分泌的EPS的結(jié)構(gòu)與功能的研究，至今未見報(bào)道。因?yàn)?，世界?0％以上的環(huán)境都是深度超過2000米的深海，其中絕大部分都是低溫環(huán)境。

2、首次以深海適冷菌Pseudomonas sp.SM9913為菌株發(fā)酵生產(chǎn)胞外多糖，建立該菌株合成分泌的胞外多糖EPS的優(yōu)化發(fā)酵生產(chǎn)工藝。

3、首次提供高效分離純化深海適冷菌Pseudomonas sp.SM9913分泌的胞外多糖的技術(shù)方法，利用核磁共振、紅外光譜、質(zhì)譜等技術(shù)，分析其物理化學(xué)特性，解析其結(jié)構(gòu)，多糖的主要結(jié)構(gòu)組成如前所述，說明這是一種新的結(jié)構(gòu)的深海微生物胞外多糖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但不限于此。

實(shí)施例1：茄子瓶菌種的菌懸液的制備

以0.3份牛肉膏、1.0份蛋白胨、1.7份瓊脂、0.5份NaCl為培養(yǎng)基，水96份，pH為7.0～7.2，滅菌，在試管斜面上，劃線接深海適冷菌Pseudomonas sp.SM9913菌種(參見陳秀蘭等，“深海適冷菌SM9913產(chǎn)生的低溫蛋白酶”，《海洋科學(xué)》2001年1月19日，菌株持有人山東大學(xué))，12～15℃培養(yǎng)25小時，貯藏于4℃。將該菌種移入茄子瓶斜面(培養(yǎng)基與保藏斜面相同)，12～15℃培養(yǎng)25小時，作菌懸液用。

實(shí)施例2：深海適冷微生物胞外多糖的制備，步驟如下：

(1)種子制備

培養(yǎng)基：豆餅粉2份、玉米3份、麩皮1.5份、Na₂HPO₄0.5份、KH₂PO₄ 0.04份和水100份，均為重量份，培養(yǎng)基中加豆油300毫升作消泡劑。培養(yǎng)基120℃滅菌50分鐘，冷卻后，在150升發(fā)酵罐中裝樣量70升，接實(shí)施例1制備的茄子瓶菌種的菌懸液，接種量5％。于10～12℃下，通風(fēng)1∶0.5～0.6，攪拌320～330轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)40小時。

(2)液體深層發(fā)酵制備胞外多糖發(fā)酵液

培養(yǎng)基，：豆餅粉3.5份、玉米粉2.5份、山芋粉3份、麩皮2.5份、Na₂HPO₄ 0.4份、KH₂PO₄0.03份和水100份，均為重量份。培養(yǎng)基中加豆油1公斤作消泡劑。1000升發(fā)酵罐，裝450升培養(yǎng)基，滅菌后pH6.2～6.3，接種步驟(1)制備的種子，接種量5％，攪拌220轉(zhuǎn)/分，控制通風(fēng)量0-12小時1∶0.5～0.6，12-20小時1∶0.6～0.7，20-28小時1∶0.8～0.9，控制培養(yǎng)溫度10～12℃，發(fā)酵56小時。每升產(chǎn)多糖量可達(dá)5克。

(3)胞外多糖發(fā)酵液的后處理

上述胞外多糖發(fā)酵液經(jīng)10000rpm離心，然后用無水乙醇沉淀(離心上清液體積與無水乙醇體積比例為1∶3)，除蛋白、脫色后，離心干燥得到多糖的粗制品。多糖粗品在60～70℃熱水中重溶，濃縮至原體積的22％，再經(jīng)過凝膠過濾層析和離子交換層析技術(shù)分離，真空冷凍干燥，得到多糖的純品(固體)。凝膠過濾層析和離子交換層析中優(yōu)選：凝膠過濾層析柱：100cm×1.2cm，凝膠類型：Sephadex G-100；離子交換層析柱：25cm×1.6cm，凝膠類型：DEAE-Sepharose Fast Flow。

所制備的多糖純品經(jīng)過1D、2D-NMR、MS、甲基化分析得到此多糖的主要結(jié)構(gòu)組成重復(fù)單元為：

{→6)-[3,6-O-acetyl]-α-D-Glcp-(1→6)-[3-O-acetyl]-α-D-Glcp-(1→6)-[3-O-acetyl]-α-D-Glcp-(1→6)-[3-O-acetyl]-α-D-Glcp-(1→)_n

其中糖單元∶乙?；靡掖蓟?∶5∶1，高度乙?；摩?(1→6)構(gòu)成多糖主鏈的核心結(jié)構(gòu)(61.8％)，多糖鏈的末端還存在少量的Ara(11.0％)、Xyl(3.9％)、Gal(3.1％)、(1→4)Glc(5％)和(3→6)Glc(4％)。

實(shí)施例3：

深海適冷微生物胞外多糖的制備方法，包括如下步驟：

(1)種子制備

培養(yǎng)基：豆餅粉2份、玉米3份、麩皮1.5份、Na₂HPO₄ 0.5份、KH₂PO₄ 0.04份和水100份，均為重量份，培養(yǎng)基中加豆油300毫升作消泡劑。培養(yǎng)基120℃滅菌50分鐘，冷卻后，接種SM9913菌種茄子瓶菌種的菌懸液(可為實(shí)施例1的產(chǎn)物)，接種量5％質(zhì)量百分比。上述種子制備是在150升發(fā)酵罐中裝樣量70升，于10～12℃下，通風(fēng)1∶0.5～0.6，攪拌320～330轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)48小時。胞外多糖產(chǎn)量5克/升。

(2)液體深層發(fā)酵制備胞外多糖發(fā)酵液

培養(yǎng)基：豆餅粉3.5份、玉米粉2.5份、山芋粉3份、麩皮2.5份、Na₂HPO₄ 0.4份、KH₂PO₄ 0.03份和水100份，均為重量份，培養(yǎng)基中加豆油1.2公斤作消泡劑。1000升發(fā)酵罐，裝450升培養(yǎng)基，滅菌后pH6.2～6.3，接種步驟(1)制備的種子，接種量6％，攪拌200～220轉(zhuǎn)/分，控制通風(fēng)量0-12小時1∶0.5～0.6，12-20小時1∶0.6～0.7，20-28小時1∶0.8～0.9，控制培養(yǎng)溫度10～12℃，發(fā)酵72小時。每升產(chǎn)多糖量可達(dá)5克。

(3)胞外多糖發(fā)酵液的后處理

上述胞外多糖發(fā)酵液經(jīng)10000rpm離心，然后用無水乙醇沉淀(離心上清液體積與無水乙醇體積比例為1∶3)，除蛋白、脫色后，離心干燥得到多糖的粗制品。多糖粗品在65℃熱水中重溶，濃縮至原體積的30％，再經(jīng)過凝膠過濾層析和離子交換層析技術(shù)分離，真空冷凍干燥，得到多糖的純品。凝膠過濾層析和離子交換層析中優(yōu)選：凝膠過濾層析柱：100cm×1.2cm，凝膠類型：Sephadex G-100；離子交換層析柱：25cm×1.6cm，凝膠類型：DEAE-Sepharose Fast Flow。

多糖結(jié)構(gòu)組成同實(shí)施例2。