本發(fā)明涉及一種用于提高微生物次級代謝產(chǎn)物中大環(huán)內(nèi)酯類化合物產(chǎn)量的發(fā)酵方法，具體涉及一種用于提高粘細(xì)菌中大環(huán)內(nèi)脂類次級代謝產(chǎn)物(具有臨床藥用價值的埃博霉素和粘球菌素)產(chǎn)量的發(fā)酵方法，屬于抗生素藥物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

粘細(xì)菌(Myxobacteria)是原核生物中一類具有復(fù)雜多細(xì)胞行為特征的革蘭氏陰性細(xì)菌類群，能夠代謝產(chǎn)生種類豐富、結(jié)構(gòu)新穎、作用機制獨特的次級代謝產(chǎn)物，包括聚酮類、大環(huán)類、芳香類、多烯類、肽類化合物等等。是繼放線菌之后又一個重要的、有巨大應(yīng)用潛力的藥源微生物新類群，在新藥研發(fā)中具有獨特的優(yōu)勢(Gerth,et al.,2003；Weissman and Müller,2010)。其中，16元環(huán)的埃博霉素(Epothilone)(式1)和28元環(huán)的粘球菌素(Myxovirescin)(式2)是粘細(xì)菌來源的2例具有臨床應(yīng)用價值的大環(huán)內(nèi)酯類化合物。

埃博霉素是由粘細(xì)菌中的纖維堆囊菌(Sorangium cellulosum)代謝產(chǎn)生的具有和紫杉醇相似的促微管聚合活性的16元大環(huán)內(nèi)脂類化合物。與紫杉醇相比，埃博霉素具有分子結(jié)構(gòu)簡單，水溶性好；其噻唑環(huán)結(jié)構(gòu)與微管作用更加緊密；抗腫瘤譜廣泛；對多重耐藥和耐紫杉醇的腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出更高的抗腫瘤活性(Kowalski et al.,1997；Goodin et al.,2004；Nettles et al.,2004)。不僅如此，由于埃博霉素可以由微生物代謝產(chǎn)生，通過發(fā)酵即可大規(guī)模制備，無須像紫杉醇那樣通過砍伐杉樹或者復(fù)雜的化學(xué)合成途徑來獲取，因此埃博霉素被公認(rèn)為是紫杉醇的更新替代品。粘球菌素是黃色粘球菌(Myxococcus xanthus)中報道的一類28元大環(huán)內(nèi)酯內(nèi)酰胺類化合物。已有文獻表明，粘球菌素對多數(shù)革蘭氏陰性菌和少數(shù)革蘭氏陽性菌均具有很好的殺菌活性，是一類抗菌譜較為寬廣的快速殺菌劑(Gerth et al.,1982；Onishi et al.,1984；Content et al.,2003)。其在大腸桿菌中的作用靶點是lspA基因編碼的二型信號肽酶，屬于二型信號肽酶抑制劑，可以抑制細(xì)胞內(nèi)含有LspA剪切位點的脂蛋白前體的加工(Xiao et al.,2012)。作為一類結(jié)構(gòu)較為獨特、作用靶點較為新穎的廣譜抗生素，粘球菌素具有潛在的廣闊應(yīng)用前景。

然而，目前埃博霉素和粘球菌素在其各自本源菌株中的發(fā)酵產(chǎn)量較低。而且，埃博霉素的本源菌株——纖維堆囊菌的代時較長、遺傳操作體系難以構(gòu)建，不利于工業(yè)生產(chǎn)。科研工作者們嘗試將埃博霉素在異源菌中(例如Streptomyces coelicolor、Escherichia coli、Myxococcus xanthus等)進行發(fā)酵，但每升發(fā)酵液中埃博霉素的產(chǎn)量僅為1～170μg(Tang et al.,2000；Julien and Shah,2002；Mutka et al.,2006)。這在一定程度上限制了其后續(xù)的研究與應(yīng)用。隨著全球市場對抗腫瘤和抗生素類藥物需求的不但增長，迫切需要對埃博霉素和粘球菌素的發(fā)酵技術(shù)進行改進，以促進其產(chǎn)量的提高。

參考文獻：

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Gerth,K.,Pradella,S.,Perlova,O.,Beyer,S.,&Müller,R.(2003).Myxobacteria:proficient producers of novel natural products with various biological activities—past and future biotechnological aspects with the focus on the genus Sorangium.Journal of biotechnology,106(2),233-253.

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Kowalski,R.J.,Giannakakou,P.,&Hamel,E.(1997).Activities of the microtubule-stabilizing agents epothilones A and B with purified tubulin and in cells resistant to paclitaxelJournal of Biological Chemistry,272(4),2534-2541.

Mutka,S.C.,Carney,J.R.,Liu,Y.,&Kennedy,J.(2006).Heterologous production of epothilone C and D in Escherichia coli.Biochemistry,45(4),1321-1330.

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Tang,L.,Shah,S.,Chung,L.,Carney,J.,Katz,L.,Khosla,C.,&Julien,B.(2000).Cloning and heterologous expression of the epothilone gene cluster.Science,287(5453),640-642.

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Weissman,K.J.,&Müller,R.(2010).Myxobacterial secondary metabolites:bioactivities and modes-of-action.Natural product reports,27(9),1276-1295.

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有發(fā)酵水平的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一種用于提高粘細(xì)菌中大環(huán)內(nèi)脂類次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的發(fā)酵方法，實現(xiàn)快速提高埃博霉素和粘球菌素的發(fā)酵水平、降低生產(chǎn)成本的目的。

本發(fā)明所述用于提高粘細(xì)菌中大環(huán)內(nèi)脂類次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的發(fā)酵方法，其中所述大環(huán)內(nèi)脂類次級代謝產(chǎn)物是指埃博霉素和粘球菌素，該方法是通過在粘細(xì)菌發(fā)酵中向液體發(fā)酵培養(yǎng)基中適時加入添加劑的方式來改善發(fā)酵培養(yǎng)基的組分，以實現(xiàn)埃博霉素和粘球菌素發(fā)酵水平的快速提高；

其特征在于：

所述粘細(xì)菌選能同時代謝產(chǎn)生埃博霉素和粘球菌素的黃色粘球菌(Myxococcus xanthus)ZE9菌株；

上述菌株是通過轉(zhuǎn)座隨機插入的方法將纖維堆囊菌中埃博霉素的合成基因簇整合到黃色粘球菌模式菌株的基因組上獲得。

所述添加劑為菜籽油、橄欖油、花生油、玉米油、芥末油、亞麻油、豆油、葵花籽油、葡萄籽油、調(diào)和油、油酸甲酯、亞油酸甲酯中的任意一種或其任意重量比例的混合物；

所述向液體發(fā)酵培養(yǎng)基中加入添加劑的時間是發(fā)酵后36±4小時；

所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基簡稱為CYE液體培養(yǎng)基，其組成及含量為酪蛋白胨10g，酵母浸提物5g，MgSO₄·7H₂O 1g，100mM MOPS溶液100ml，蒸餾水1000ml，pH值為7.5；菌株培養(yǎng)涉及的固體培養(yǎng)基簡稱為CYE固體培養(yǎng)基，其組成及含量為：酪蛋白胨10g，酵母浸提物5g，MgSO₄·7H₂O 1g，100mM MOPS溶液100ml，瓊脂粉15g，蒸餾水1000ml，pH值為7.5。

所述粘細(xì)菌發(fā)酵中，發(fā)酵培養(yǎng)基中加入用于吸附發(fā)酵液中的大環(huán)內(nèi)脂類次級代謝產(chǎn)物的滅菌吸附樹脂。

上述用于提高粘細(xì)菌中大環(huán)內(nèi)脂類次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的發(fā)酵方法中：所述添加劑優(yōu)選為菜籽油、花生油、油酸甲酯、亞油酸甲酯中的任意一種；所述向液體發(fā)酵培養(yǎng)基中加入添加劑的時間優(yōu)選是發(fā)酵后36小時；所述粘細(xì)菌發(fā)酵中，用于吸附發(fā)酵液中的大環(huán)內(nèi)脂類次級代謝產(chǎn)物的滅菌吸附樹脂優(yōu)選為大孔吸附型樹脂XAD-16。

上述用于提高粘細(xì)菌中大環(huán)內(nèi)脂類次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的發(fā)酵方法中：能明顯提升埃博霉素和粘球菌素發(fā)酵水平的添加劑用量優(yōu)選是終濃度為5μl/ml的花生油或/和終濃度為10μl/ml的油酸甲酯。

上述用于提高粘細(xì)菌中大環(huán)內(nèi)脂類次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的發(fā)酵方法中：能明顯提升埃博霉素發(fā)酵水平的添加劑用量優(yōu)選是終濃度為5μl/ml的菜籽油或/和終濃度為10μl/ml的亞油酸甲酯。

上述用于提高粘細(xì)菌中大環(huán)內(nèi)脂類次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的發(fā)酵方法中：能明顯提升埃埃博霉素A發(fā)酵水平的添加劑用量是終濃度為5μl/ml的的亞油酸甲酯；能明顯提升埃埃博霉素B發(fā)酵水平的添加劑用量是終濃度為20μl/ml的的亞油酸甲酯。

上述用于提高粘細(xì)菌中大環(huán)內(nèi)脂類次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的發(fā)酵方法中：能明顯提升粘球菌素發(fā)酵水平的添加劑用量優(yōu)選是終濃度為15μl/ml的油酸甲酯。

具體的，本發(fā)明所述用于提高粘細(xì)菌中大環(huán)內(nèi)脂類次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的發(fā)酵方法實施步驟及檢測方法如下：

(1)CYE培養(yǎng)基的配制方法為：酪蛋白胨10g，酵母浸提物5g，MgSO₄·7H₂O 1g，100mM MOPS溶液100ml，蒸餾水1000ml，使用KOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值至7.5。如需配制CYE固體培養(yǎng)基，需向其中加入瓊脂粉15g。121℃滅菌30min后冷卻至室溫。

(2)取-80℃條件下保存的黃色粘球菌ZE9菌株菌液20μl，滴加到CYE固體培養(yǎng)基上進行劃線操作，將劃線后的固體平板倒置，在30℃條件下培養(yǎng)至有明顯的黃色菌落出現(xiàn)。

(3)將接種鏟在酒精燈的火焰上反復(fù)灼燒并冷卻至室溫，刮取黃色粘球菌ZE9菌株，接種到裝有50ml CYE液體培養(yǎng)基的300ml錐形瓶中。

(4)在30℃，200rpm的條件下振蕩培養(yǎng)24h，至對數(shù)中前期。

(5)用CYE液體培養(yǎng)基調(diào)整菌體濃度至1×10⁸cfu/ml，按2％接種量將上述黃色粘球菌ZE9菌液轉(zhuǎn)接到100ml CYE液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，同時按照發(fā)酵體積2％的比例在每瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中加入事先已經(jīng)高溫滅菌的大孔吸附樹脂。在30℃，200rpm的條件下振蕩培養(yǎng)進行發(fā)酵。

(6)培養(yǎng)36小時后，添加不同的脂肪酸類化合物作為添加劑。在30℃，200rpm的條件下振蕩培養(yǎng)，繼續(xù)發(fā)酵7天。以不添加油酸甲酯的CYE培養(yǎng)基作為對照組。每組實驗設(shè)置4個平行。所述的添加劑為菜籽油、橄欖油、花生油、玉米油、芥末油、亞麻油、豆油、葵花籽油、葡萄籽油、調(diào)和油、油酸甲酯、亞油酸甲酯。

(7)用80目的篩網(wǎng)過濾發(fā)酵液，回收后的樹脂用無菌去離子水沖洗，自然晾干后轉(zhuǎn)入10ml離心管中并向其中加入3ml甲醇過夜浸提。

(8)將上述(7)中的浸提液用有機濾膜(直徑13mm，孔徑0.22μm)進行過濾，轉(zhuǎn)移至HPLC樣品瓶中進行檢測。

(9)發(fā)酵液中埃博霉素和粘球菌素的含量采用HPLC進行檢測，方法如下：

檢測埃博霉素的色譜柱為Hypersil GOLD SAX C18column(5μm，4.6×250mm，Thermo Scientific)，檢測條件如下：進樣量20μl；流動相流速:1.0mL/min；流動相A為水，流動相B為甲醇，采用60％B相等濃度梯度檢測25min，檢測波長為249nm。(圖1)

檢測粘球菌素的色譜柱為XTerra MS C18column(5μm，2.1×100mm，Waters，US)，檢測條件如下：進樣量20μl；流動相流速:0.3mL/min；流動相A為含0.1％甲酸的水溶液，流動相B為含0.1％甲酸的乙腈溶液，采用多階梯度洗脫的方法，即0-2min流動相B濃度為5％；2-10min流動相B濃度由5％上升到50％；10-27min流動相B濃度由50％上升到95％；27-40min流動相B的濃度維持在95％，檢測波長為239nm。(圖2)

(10)根據(jù)檢測到信號峰的峰面積與埃博霉素和粘球菌素含量的關(guān)系曲線計算其各自的發(fā)酵產(chǎn)量，實驗結(jié)果取平均值并計算誤差。

結(jié)果如下表所示。

表1不同添加劑對埃博霉素發(fā)酵的影響

表2不同添加劑對粘球菌素發(fā)酵的影響

從上述結(jié)果可以看出，不同種類的添加劑均不同程度的提高了埃博霉素和粘球菌素的發(fā)酵水平。其中，終濃度為5μl/ml的花生油和終濃度為10μl/ml的油酸甲酯均能提升埃博霉素和粘球菌素的發(fā)酵水平；終濃度為5μl/ml的菜籽油和終濃度為10μl/ml的亞油酸甲酯對埃博霉素的發(fā)酵產(chǎn)量提升最為明顯。該結(jié)果表明通過向液體發(fā)酵培養(yǎng)基中添加本發(fā)明所述的油脂類化合物，能夠有效提高埃博霉素和粘球菌素的發(fā)酵產(chǎn)量。

本發(fā)明提供的一種用于提高粘細(xì)菌中大環(huán)內(nèi)脂類次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的發(fā)酵方法，實現(xiàn)了快速提高埃博霉素和粘球菌素的發(fā)酵水平、降低生產(chǎn)成本的目的。該方法簡單、高效，無需增加額外的設(shè)備與人力，能夠大幅度提高埃博霉素和粘球菌素的產(chǎn)量，極為適合工業(yè)化生產(chǎn)。

附圖說明

圖1.使用HPLC檢測黃色粘球菌發(fā)酵液中的埃博霉素。

圖2.使用HPLC檢測黃色粘球菌發(fā)酵液中的粘球菌素。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實例對本發(fā)明提供的發(fā)酵添加劑進行詳細(xì)描述和說明。所描述的實例僅僅是本發(fā)明內(nèi)容的一部分實例，不是全部實例。其內(nèi)容是對本發(fā)明的解釋而非用于限定本發(fā)明的保護范圍。

實施例1：黃色粘球菌(Myxococcus xanthus)ZE9菌株的構(gòu)建

(1)選用的黃色粘球菌和纖維堆囊菌均購買自德國菌種保藏中心(DSMZ，https://www.dsmz.de/home.html)。

(2)提取纖維堆囊菌的基因組，向10μg的基因組中加入0.5U的Sau3A I進行酶切，利用瓊脂糖凝膠電泳進行分析確定30～50kb目的片段，將待回收片段放入V型槽電洗脫裝置中，100V電洗脫1.5h，利用苯酚/氯仿/異戊醇抽提，乙醇沉淀洗脫除鹽，回收純化目的DNA樣品備用。

(3)利用Xba l和BamH 1對粘粒DNA進行酶切處理，利用DNA連接酶將酶切處理后的粘粒DNA與(2)中的DNA片段進行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)染大腸桿菌構(gòu)建粘粒文庫，利用含有氨芐青霉素的篩選平板從中篩選陽性克隆。

(4)根據(jù)文獻中已經(jīng)報道的埃博霉素合成基因簇信息，選取其中3段不同區(qū)段設(shè)計巢式PCR引物對進行PCR測序驗證。

(5)將測序驗證正確的粘粒用DraI酶切，連同構(gòu)建的含有埃博霉素基因簇上下游同源臂的質(zhì)粒一起以電轉(zhuǎn)化的方式轉(zhuǎn)入大腸桿菌GB2005red(購買自Gene Bridges)中，同時進行兩輪Red-ET重組，在添加10％蔗糖(或2-DOG)+Apra(或Tet)+LB固體平板上篩選雙交換陽性克隆，提取質(zhì)粒進行酶切分析和測序驗證。

(6)刮取黃色粘球菌菌體轉(zhuǎn)接于50ml CYE液體培養(yǎng)基中，30℃，200rpm培養(yǎng)18～24h；離心回收菌體，用6ml無菌水洗滌2次。

(7)加入2ml無菌水懸浮菌體細(xì)胞，向其中加入50～100ng測序驗證正確的重組質(zhì)粒，混勻，用Electroporator電轉(zhuǎn)化儀以1250V電擊；轉(zhuǎn)至裝有2ml CYE培養(yǎng)基的10ml離心管中，200rpm，30℃修復(fù)培養(yǎng)4～6h；取修復(fù)培養(yǎng)后的菌液平鋪于含有篩選抗生素的CYE固體平板上培養(yǎng)6～7天。

(8)利用菌落PCR擴增特定的基因片段并測序分析，從中篩選陽性克隆，將篩選到的陽性克隆菌株命名為黃色粘球菌ZE9菌株。

實施例2：添加不同濃度的油酸甲酯對埃博霉素和粘球菌素發(fā)酵產(chǎn)量的影響

(1)取黃色粘球菌ZE9菌株在CYE固體平板上進行活化培養(yǎng)，在30℃條件下倒置培養(yǎng)至有明顯的黃色菌落出現(xiàn)。

(2)用無菌的接種鏟刮取活化后的ZE9菌株到50ml CYE液體培養(yǎng)基中，在30℃、200rpm的條件下振蕩培養(yǎng)24h，至對數(shù)中前期。

(3)檢測黃色粘球菌ZE9菌液在600nm條件下的吸光度值，調(diào)整菌體濃度至1×10⁸cfu/ml，按2％接種量將上述黃色粘球菌ZE9菌液轉(zhuǎn)接到100ml CYE液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30℃，200rpm的條件下振蕩培養(yǎng)進行發(fā)酵。

(4)培養(yǎng)36小時后，分別向液體發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同濃度的油酸甲酯(終濃度分別為0、5、10、15μl/ml)，按照2％的比例在每瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中加入事先已經(jīng)高溫滅菌的樹脂。在30℃，200rpm的條件下振蕩培養(yǎng)，繼續(xù)發(fā)酵7天。每組實驗設(shè)置4個平行。

(5)回收樹脂并用無菌去離子水沖洗，洗去表面殘留的菌體。樹脂自然晾干后轉(zhuǎn)入10ml離心管中，加入3ml甲醇過夜浸提。

(6)回收的浸提液用有機濾膜(直徑13mm，孔徑0.22μm)進行過濾，然后轉(zhuǎn)移至HPLC樣品瓶中進行檢測。

實驗結(jié)果如表3所示。

表3添加不同濃度的油酸甲酯對埃博霉素和粘球菌素發(fā)酵產(chǎn)量的影響。

從表3中的數(shù)據(jù)可以看出：在不添加油酸甲酯的情況下，發(fā)酵液中埃博霉素A、B和粘球菌素的產(chǎn)量分別是0.149±0.01mg/L、1.34±0.22mg/L和1.13±0.19mg/L。當(dāng)向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加了油酸甲酯后，埃博霉素和粘球菌素的發(fā)酵產(chǎn)量得到了不同程度的提高。當(dāng)油酸甲酯的終濃度達到10μl/ml時，發(fā)酵液中的埃博霉素的發(fā)酵產(chǎn)量達到最高，埃博霉素A和B分別提高了67.72倍和4.37倍。但是，當(dāng)油酸甲酯的終濃度進一步提高到15μl/ml時，埃博霉素的發(fā)酵產(chǎn)量有所下降，相比于終濃度為10μl/ml時下降了22.75％。相反，當(dāng)油酸甲酯的終濃度達到15μl/ml時，發(fā)酵液中的粘球菌素的發(fā)酵產(chǎn)量可高達7.78±2.77mg/L，提高了5.88倍。

實施例3：油酸甲酯不同添加時間對埃博霉素發(fā)酵產(chǎn)量的影響

根據(jù)實施例2中的結(jié)果，選取向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加油酸甲酯的終濃度為10μl/ml，按照實施例2中的方法，考察在發(fā)酵的不同階段添加油酸甲酯對埃博霉素發(fā)酵產(chǎn)量的影響。

實驗結(jié)果如表4所示。

表4油酸甲酯同一濃度不同添加時間對埃博霉素發(fā)酵產(chǎn)量的影響

從表4可以看出，在不同發(fā)酵時間里添加終濃度為10μl/ml油酸甲酯可以不同程度的提高埃博霉素的發(fā)酵產(chǎn)量。當(dāng)發(fā)酵36小時的時候添加終濃度為10μl/ml的油酸甲酯，發(fā)酵液中埃博霉素的產(chǎn)量最高，過早或過晚添加都會降低埃博霉素的發(fā)酵產(chǎn)量。

實施例4：添加不同濃度的亞油酸甲酯對埃博霉素發(fā)酵產(chǎn)量的影響

按照實施例2中的方法，考察添加不同濃度的亞油酸甲酯對埃博霉素發(fā)酵產(chǎn)量的影響。

實驗結(jié)果如表5所示。

表5添加不同濃度的亞油酸甲酯對埃博霉素發(fā)酵產(chǎn)量的影響。

從表5我們可以看出，亞油酸甲酯的添加能提高埃博霉素產(chǎn)量的提高，但是不同濃度的添加量對埃博霉素A和B的影響不同。當(dāng)添加終濃度為5μl/ml的亞油酸甲酯時埃博霉素A的產(chǎn)量達到最高18.29±5.56mg/L。當(dāng)添加終濃度為20μl/ml的亞油酸甲酯時埃博霉素B的產(chǎn)量達到最高18.35±7.61mg/L。