本發(fā)明涉及脂溶性葡萄籽原花青素，特別涉及一種天然抗氧化劑的制備方法，具體涉及一種酶法制備脂溶性葡萄籽原花青素的方法。

背景技術(shù)：

葡萄籽原花青素，簡稱OPC，是一種有著特殊分子結(jié)構(gòu)的生物類黃酮，是目前國際上公認(rèn)的清除人體內(nèi)自由基最有效的天然抗氧化劑。葡萄籽原花青素具有非常強(qiáng)的體內(nèi)活性，具有極強(qiáng)的抗氧化、消除自由基的作用，可有效消除超氧陰離子自由基和羥基自由基，還具有眼睛保健、心率保健、降低癌癥發(fā)病危險(xiǎn)、增強(qiáng)血管強(qiáng)度、消炎、祛腫等多種功效。

葡萄籽原花青素易溶于水，也能溶于甲醇、乙醇、丙酮等極性有機(jī)溶劑中。但其多羥基結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其親水性好而親油性弱，難溶于油中，限制了其在脂酯類食品以及其它含油食品中的應(yīng)用。因此，開發(fā)研制脂溶性葡萄籽原花青素產(chǎn)品具有廣闊的市場前景。

傳統(tǒng)方法制備脂溶性葡萄籽原花青素的方法雖相對容易，但溶劑殘留量大，為了使產(chǎn)品不含有毒成分，導(dǎo)致后續(xù)處理工藝復(fù)雜，而且還帶來排放污染問題。中國發(fā)明專利CN101066075公布了添加葡萄籽原花青素微乳液的食用油生產(chǎn)方法，將油酸聚甘油單酯與乙醇以4：1的比例在20‐40℃范圍內(nèi)攪拌混合均勻，按體積比為1‐5％的量逐滴加入葡萄籽原花青素水溶液，邊攪拌邊加入，直到形成均勻穩(wěn)定的溶液，用Ultra‐TurraxT25高速分散機(jī)將葡萄籽原花青素乳化液在20,000rpm條件下分散3‐5分鐘，靜止1小時(shí)，待用；調(diào)節(jié)食用油溫度在20‐40℃范圍內(nèi)，用攪拌機(jī)在1,000rpm條件下攪拌30分鐘，將制備好的葡萄籽原花青素乳化液按照體積比5‐10％的比例緩慢加入食用油中，邊加邊攪拌，直到油脂澄清無渾濁為止，即為添加葡萄籽原花青素微乳液的食用油。

中國發(fā)明專利申請CN101703636A公布了一種油溶性葡萄籽提取物及其制備方法，含有6～28個(gè)碳原子的有機(jī)脂肪酸和氫氧化鈉混合，加熱回流反應(yīng)，得到高級脂肪酸鈉，將高級脂肪酸鈉加鹽酸酸化，取其上層油脂，在25～130℃時(shí)，向油脂中滴入?；瘎?；以葡萄籽提取物為溶質(zhì)，有機(jī)溶劑為溶劑，其溶液在30～90℃時(shí)，滴入上述?；磻?yīng)的合成物，反應(yīng)后減壓蒸去其濾液成粘稠油狀物。

上述兩種制備方法雖能制備天然產(chǎn)物，但工藝較為復(fù)雜，且需添加大量溶劑。另外，中國發(fā)明專利CN101066075的乳化法制成的產(chǎn)品穩(wěn)定差，易分層；中國發(fā)明專利CN101703636A的化學(xué)法需采用長時(shí)間高溫處理，制備時(shí)間長，不僅耗能，而且副產(chǎn)物多，產(chǎn)品的抗氧化性減弱。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種不污染環(huán)境，又易于分離，制得的產(chǎn)品食用安全，性能穩(wěn)定，抗氧化效果明顯的酶法制備脂溶性葡萄籽原花青素的方法。

酶法分子修飾因具有反應(yīng)條件溫和，區(qū)域選擇性強(qiáng)，副產(chǎn)物少、流程簡單可控等優(yōu)點(diǎn)逐漸成為取代化學(xué)合成的一種新方法。脂肪酶是工業(yè)生產(chǎn)中最重要的生物催化劑之一，固定化脂肪酶因其良好的穩(wěn)定性和催化活性在食品工業(yè)中得到廣泛應(yīng)用。在酶法酸化過程中，選擇合適的酶至關(guān)重要。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)9種適用于黃酮類化合物?；闹久福謩e為脂肪酶CALB、脂肪酶435、脂肪酶RMIM、脂肪酶TLIM、脂肪酶IM、脂肪酶TL100L、脂肪酶CRL、洋蔥假單胞菌脂肪酶和皺褶假絲酵母脂肪酶。本發(fā)明采用酶法制備脂溶性葡萄籽原花青素，通過改變反應(yīng)條件，制備脂溶性葡萄籽原花青素。本發(fā)明可提高產(chǎn)品穩(wěn)定性、縮短制備時(shí)間，增強(qiáng)食用安全性、避免環(huán)境污染。本發(fā)明方法以脂肪酶為催化劑，既不污染環(huán)境，又易于分離；制得的產(chǎn)品食用安全，可以任意比例添加到食用油中，性能穩(wěn)定，抗氧化效果明顯，且制備工藝簡單可控。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種酶法制備脂溶性葡萄籽原花青素的方法，包括如下步驟：

(1)將葡萄籽原花青素與含有2～30個(gè)碳原子的有機(jī)脂肪酸混合，加入溶劑，20～90℃下攪拌0.1～10h；

(2)加入固定化脂肪酶作為催化劑，在20～90℃下加熱攪拌反應(yīng)1～48h；所述固定化脂肪酶為脂肪酶CALB、脂肪酶435、脂肪酶RMIM、脂肪酶TLIM、脂肪酶IM、脂肪酶TL100L、脂肪酶CRL、洋蔥假單胞菌脂肪酶和皺褶假絲酵母脂肪酶中的任一種；

(3)將脂肪酶分離，終止反應(yīng)，反應(yīng)后減壓蒸去其濾液，得紫紅色的粘稠油狀物，為合成的脂溶性葡萄籽原花青素。

為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，優(yōu)選地，所述含2～30個(gè)碳原子的有機(jī)脂肪酸為月桂酸、棕?cái)R酸、硬脂酸、油酸和亞油酸中的一種或多種。

進(jìn)一步優(yōu)選，所述有機(jī)脂肪酸為含8～22個(gè)碳原子的不飽和脂肪酸。

優(yōu)選地，所述葡萄籽原花青素與有機(jī)脂肪酸的質(zhì)量比為10:1～1:50。

優(yōu)選地，所述溶劑為水、乙醇、丙酮、乙酸乙酯和石油醚中的一種或多種。

優(yōu)選地，加入溶劑與葡萄籽原花青素的質(zhì)量比為20:1～1:40。

優(yōu)選地，加入固定化脂肪酶與葡萄籽原花青素的質(zhì)量比為1:100～1:1。

優(yōu)選地，減壓蒸去其濾液的裝置為旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，溫度為30～90℃。

本發(fā)明制得的產(chǎn)品可以任意比例添加到食用油中，抗氧化效果明顯，性能穩(wěn)定，并保持原有油脂的品質(zhì)，制得的產(chǎn)品食用安全，制備工藝簡單可控。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

(1)酶法制備脂溶性葡萄籽原花青素，比現(xiàn)有技術(shù)CN101066075的乳化法等傳統(tǒng)方法性能穩(wěn)定、食用安全?？梢匀我獗壤砑拥绞秤糜椭校?/p>

(2)酶法制備脂溶性葡萄籽原花青素，其脂肪酶具有高度的選擇性和專一性，相比現(xiàn)有技術(shù)CN101703636A化學(xué)法，目標(biāo)產(chǎn)物易分離；

(3)酶法制備脂溶性葡萄籽原花青素，比現(xiàn)有技術(shù)CN101703636A化學(xué)法的反應(yīng)步驟少、簡單可控；

(4)酶法制備脂溶性葡萄籽原花青素，其采用固定化脂肪酶為催化劑，相比現(xiàn)有技術(shù)CN101703636A化學(xué)法的堿性催化劑，副產(chǎn)物少，不產(chǎn)生含堿廢液污染環(huán)境，且易于分離。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1原料葡萄籽原花青素的紅外光譜圖。

圖2為實(shí)施例1所得產(chǎn)物脂溶性葡萄籽原花青素的紅外光譜圖。

圖3為實(shí)施例1原料葡萄籽原花青素的HPLC譜圖。

圖4為所得產(chǎn)物脂溶性葡萄籽原花青素的HPLC譜圖。

具體實(shí)施方式

為更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步描述，需要說明的是，實(shí)施例并不構(gòu)成對本發(fā)明要求保護(hù)范圍的限制。

實(shí)施例1：

將5g葡萄籽原花青素與20g月桂酸混合，加入1L丙酮，40℃下攪拌2h。加入固定化脂肪酶435(杭州創(chuàng)科生物科技有限公司)作為催化劑，在45℃下加熱攪拌反應(yīng)8h。自加入固定化脂肪酶起開始計(jì)時(shí)，將脂肪酶分離，終止反應(yīng)，反應(yīng)后減壓蒸去其濾液，剩下的紫紅色的粘稠油狀物，即為合成的脂溶性葡萄籽原花青素產(chǎn)品。經(jīng)檢測，所得脂溶性葡萄籽原花青素乙酸乙酯溶解度為1.6g/100g，其轉(zhuǎn)化率為77％。

實(shí)施例2：

將5g葡萄籽原花青素與50g棕櫚酸混合，加入5L乙醇，50℃下攪拌4h。加入固定化脂肪酶RMIM(杭州創(chuàng)科生物科技有限公司)作為催化劑，在60℃下加熱攪拌反應(yīng)12h。自加入固定化脂肪酶起開始計(jì)時(shí)，將脂肪酶分離，終止反應(yīng)，反應(yīng)后減壓蒸去其濾液，剩下的紫紅色的粘稠油狀物，即為合成的脂溶性葡萄籽原花青素產(chǎn)品。經(jīng)檢測，所得脂溶性葡萄籽原花青素乙酸乙酯溶解度為2.4g/100g，其轉(zhuǎn)化率為73％。

實(shí)施例3：

將5g葡萄籽原花青素與1g亞油酸混合，加入2L石油醚，50℃下攪拌1h。加入固定化脂肪酶TLIM(杭州創(chuàng)科生物科技有限公司)作為催化劑，在50℃下加熱攪拌反應(yīng)5h。自加入固定化脂肪酶起開始計(jì)時(shí)，將脂肪酶分離，終止反應(yīng)，反應(yīng)后減壓蒸去其濾液，剩下的紫紅色的粘稠油狀物，即為合成的脂溶性葡萄籽原花青素產(chǎn)品。經(jīng)檢測，所得脂溶性葡萄籽原花青素乙酸乙酯溶解度為1.3g/100g，其轉(zhuǎn)化率為61％。

實(shí)施例4：

將5g葡萄籽原花青素與5g豆油脂肪酸混合，加入100ml蒸餾水，30℃下攪拌0.5h。加入固定化脂肪酶CALB(杭州創(chuàng)科生物科技有限公司)作為催化劑，在40℃下加熱攪拌反應(yīng)18h。自加入固定化脂肪酶起開始計(jì)時(shí)，將脂肪酶分離，終止反應(yīng)，反應(yīng)后減壓蒸去其濾液，剩下的紫紅色的粘稠油狀物，即為合成的脂溶性葡萄籽原花青素產(chǎn)品。經(jīng)檢測，所得脂溶性葡萄籽原花青素乙酸乙酯溶解度為3.1g/100g，其轉(zhuǎn)化率為82％。

利用FT‐RI和HPLC‐MS對實(shí)施例1所得樣品進(jìn)行檢測分析，其他實(shí)施例情況如實(shí)施例相似，不一一提供；實(shí)施例1測試所得結(jié)果如下：

FT‐RI(VERTEX33，Bruker)采用溴化鉀壓片法，按照GB/T6040的規(guī)定進(jìn)行試驗(yàn)。如圖1和圖2所示；經(jīng)檢測，脂溶性葡萄籽原花青素的紅外光譜與葡萄籽原花青素相比，3400cm^‐1左右的酚羥基吸收峰大大減弱，表明原物質(zhì)的水溶性降低，1700cm^‐1附近出現(xiàn)強(qiáng)的酯羰基吸收峰，表明新物質(zhì)的脂溶性增強(qiáng)，反應(yīng)后葡萄籽原花青素被?；?。其原理主要是葡萄籽原花青素的酚羥基生成了酯羰基，由水溶性基團(tuán)轉(zhuǎn)變成脂溶性基團(tuán)。

Waters2998高效液相色譜(HPLC)分離條件為：分析柱Waters C18(4.6mm×250mm ID，5.0μm)；檢測波長280nm；柱溫28℃；進(jìn)樣量20μL；流速1mL/min；流動(dòng)相：甲醇和水。

線性梯度洗脫程序：0‐5min，5‐25％甲醇；5‐20min，25％甲醇；20‐25min，25‐30％甲醇；25‐40min，30％甲醇；40‐45min，30‐100％甲醇；45‐60min，100％甲醇。

MS檢測通過Thermo Scientific LCQ Ion‐Trap Mass Spectrometer進(jìn)行，質(zhì)譜條件如下：ESI⁺，毛細(xì)管電壓3.5kV，m/z 50‐2000。

采用HPLC‐MS/MS對GSP‐o進(jìn)行了分析，結(jié)果見圖3、4，可見葡萄籽原花青素在保留時(shí)間40min后，幾乎沒有其它物質(zhì)出現(xiàn)，而改性后的葡萄籽原花青素在保留時(shí)間40min后有10種以上物質(zhì)存在，利用質(zhì)譜進(jìn)一步確定了7種主要物質(zhì)，分別為表沒食子兒茶素二棕櫚酸酯、兒茶素三棕櫚酸酯、原花青素B1二棕櫚酸酯、表兒茶素四棕櫚酸酯、表兒茶素沒食子酸酯二棕櫚酸酯、原花青素C1三棕櫚酸酯、原花青素A2二棕櫚酸酯。由表1(實(shí)施例1葡萄籽原花青素改性前后的成分分析情況表)可知，這些物質(zhì)主要是葡萄籽原花青素通過二、三和四取代酰化反應(yīng)得到，說明葡萄籽原花青素的酯化完成。

與現(xiàn)有技術(shù)CN101066075的乳化法等傳統(tǒng)方法相比，本發(fā)明實(shí)施例制得的產(chǎn)品為酶法制備脂溶性葡萄籽原花青，屬于的酯化反應(yīng)，產(chǎn)物性能穩(wěn)定，脂溶性好，可以任意比例添加到食用油中，抗氧化效果明顯，并保持原有油脂的品質(zhì)。

本發(fā)明酶法制備脂溶性葡萄籽原花青素，其采用固定化脂肪酶為催化劑，相比現(xiàn)有技術(shù)CN101703636A化學(xué)法的堿性催化劑，副產(chǎn)物少，不產(chǎn)生含堿廢液污染環(huán)境，且易于分離。因脂肪酶具有高度的選擇性和專一性，相比現(xiàn)有技術(shù)CN101703636A化學(xué)法，本發(fā)明無需調(diào)節(jié)pH，只需將脂肪酶分離，減壓蒸去其濾液，即可將目標(biāo)產(chǎn)物易分離。

本發(fā)明實(shí)施例原料皆為食品級原料，且為酶法反應(yīng)，無副反應(yīng)，反應(yīng)溫和，所以制得的產(chǎn)品食用安全，制備工藝簡單可控。

表1實(shí)施例1葡萄籽原花青素改性前后的成分分析情況表