本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)黃酮類物質(zhì)的方法，屬于生物醫(yī)藥
技術(shù)領域：
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背景技術(shù)：
：黃酮類化合物(Flavonoids)是自然界種類最多的多酚類植物次級代謝產(chǎn)物，廣泛存在于植物界中，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的種類已超過8000多種。黃酮類化合物具有廣泛的藥學價值，具有較強的抑菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、清除自由基、免疫調(diào)節(jié)、抗癌、抗病毒、降血糖、抗輻射和降血脂等多種生物學作用。隨著對黃酮類化合物生物活性研究的逐步深入，對其的開發(fā)利用也越來越多，對其的需求量也越來越大，近年來，黃酮類化合物的市場每年增長30％以上，在藥品和營養(yǎng)化學品領域上具有廣闊的應用前景。但天然黃酮類物質(zhì)的獲得受到時間和區(qū)域的限制，而且在植物中含量低，不利于迅速研究和臨床檢驗，并且化學結(jié)構(gòu)很復雜，用化學合成法很復雜，不利于大規(guī)模的生產(chǎn)。因此用微生物生產(chǎn)黃酮類化合物越來越受到人們的重視隨著黃酮類化合物的應用范圍越來越廣，其需求量也在不斷的增大，從植物中提取有各種各樣的問題，因此，通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)黃酮類化合物具有很大的應用前景。目前，黃酮類化合物生物合成的代謝途徑已經(jīng)非常清楚，黃酮類化合物的基本骨架是由3個丙二酰輔酶A(malonylCoA)和1個香豆酰輔酶A(coumaroylCoA)在查爾酮合成酶(CHS)的催化下合成的，然后其他種類的黃酮是在母核的基礎上通過羥基、甲氧基取代或烷基化等化學反應生成的。大腸桿菌遺傳背景清晰，分子操作技術(shù)完善，是生物技術(shù)生產(chǎn)平臺的首選，因此很早就有人通過改造E.coli相關代謝途徑生產(chǎn)黃酮類化合物。目前很多研究成功通過基因工程等技術(shù)手段實現(xiàn)了多種黃酮類化合物在E.coli中的合成，如柚皮素、槲皮素、白藜蘆醇等。但是黃酮類化合物本身對E.coli生長具有一定的抑制作用，主要是通過以下幾種機制：①破壞細胞壁及細胞膜的完整性，改變細胞膜滲透性，進而破壞細胞膜的功能，影響細菌的生長；②抑制核酸的合成，槲皮素，芹黃素，五羥基黃酮等能夠抑制E.coli的DNA旋轉(zhuǎn)酶的活性進而抑制DNA的合成。蘆丁能夠促進E.coli的DNA裂解，導致SOS反應發(fā)生，從而抑制菌體的生長；③抑制能量代謝，通過抑制ATP合酶的活力進而抑制胞內(nèi)ATP的含量，影響菌體的生長。因此利用E.coli生產(chǎn)黃酮類化合物必須要考慮黃酮類化合物對E.coli的毒性作用。目前已有報道通過過表達ompA蛋白、過表達FadL蛋白或者沉默lamB基因的方法，提高了E.coli對黃酮類化合物耐受性。但是這種方法需要構(gòu)建重組菌，步驟繁瑣。技術(shù)實現(xiàn)要素：為了克服上述問題，本發(fā)明提供了一種簡便地提高微生物發(fā)酵產(chǎn)黃酮類化合物產(chǎn)量的方法，通過在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加大豆卵磷脂和維生素B6，有效提高了大腸桿菌對黃酮類化合物的耐受性，提高了黃酮類物質(zhì)的產(chǎn)量。本發(fā)明的第一個目的是提供一種提高大腸桿菌對黃酮類化合物的耐受性的方法，所述方法是在大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)黃酮類化合物的培養(yǎng)基中添加大豆卵磷脂和/或維生素B6。在一種實施方式中，所述大豆卵磷脂添加量為1～5g/L。在一種實施方式中，所述維生素B6的添加量為12～16mg/L。在一種實施方式中，所述培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基，含有蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl10g/L。在一種實施方式中，所述大腸桿菌為任一能夠用于黃酮生產(chǎn)的大腸桿菌。在一種實施方式中，所述黃酮類化合物，包括蘆丁、柚皮素或白藜蘆醇。本發(fā)明的第二個目的是提供一種提高微生物發(fā)酵產(chǎn)黃酮類化合物產(chǎn)量的方法，所述方法是在大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)黃酮類化合物的培養(yǎng)基中添加大豆卵磷脂和/或維生素B6。在一種實施方式中，所述黃酮類化合物，包括蘆丁、柚皮素或白藜蘆醇。在一種實施方式中，所述大豆卵磷脂添加量為1～5g/L。在一種實施方式中，所述維生素B6的添加量為12～16mg/L。在一種實施方式中，所述發(fā)酵生產(chǎn)是在35～40℃下進行。發(fā)明還要求保護按照上述方法在生物、醫(yī)藥、食品方面的應用。本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明發(fā)現(xiàn)通過控制培養(yǎng)基中大豆卵磷脂和/或維生素B6含量，能夠有效地提高黃酮類化合物的產(chǎn)量。本發(fā)明方法簡便、易控，適合工業(yè)化應用。本發(fā)明方法適合所有能夠用于黃酮生產(chǎn)的大腸桿菌。具體實施方式實施例1柚皮素脅迫耐受性能比較對照組：將能夠用于黃酮生產(chǎn)的大腸桿菌，活化后接種到額外添加有1g/L柚皮素化合物的LB培養(yǎng)基中，于37℃發(fā)酵培養(yǎng)。每隔1h測一次OD600直至菌株生長到穩(wěn)定期。根據(jù)公式μ＝dx/x*dt算出菌株的比生長速率圖，然后得出最大比生長速率μmax。結(jié)果顯示，對照組的μmax為0.27。實驗組，與對照組相比，培養(yǎng)基中再額外添加有以下物質(zhì)：A組：3g/L大豆卵磷脂；B組：14mg/L維生素B6；C組：3g/L大豆卵磷脂+14mg/L維生素B6；D組：3g/L大豆卵磷脂+6mg/L維生素B2；E組：1g/L大豆卵磷脂+12mg/L維生素B6；F組：3g/L大豆卵磷脂+16mg/L維生素B6。表1不同添加物對菌株柚皮素耐受性的影響μmax相對于對照組的比值A組252％B組111％C組353％D組231％E組280％F組345％注：A組～F組數(shù)據(jù)，為不同添加物下的μmax與對照組的μmax的比值。由表1結(jié)果可知，大豆卵磷脂和維生素B6對比生長速率都有提高效果，說明大豆卵磷脂和維生素B6都能在一定程度上提高菌株對黃酮類物質(zhì)的耐受能力。此外，結(jié)果顯示，大豆卵磷脂提高效果非常顯著，尤其是大豆卵磷脂與維生素B6的復配。雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應該以權(quán)利要求書所界定的為準。當前第1頁1 2 3