本發(fā)明涉及生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種發(fā)酵生產(chǎn)他克莫司的方法。
背景技術(shù)：
他克莫司(Tacrolimus，F(xiàn)K506)是由筑波鏈霉菌(streptomyces tsukubaensis)發(fā)酵產(chǎn)生的一種23元大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，其分子式C44H69NO12，結(jié)構(gòu)式如下式(1)所示。
他克莫司能減少肝腎移植受體的急、慢性排斥反應(yīng)。用本品的患者，細菌和病毒感染率也較環(huán)孢素治療者低，尤其是該藥品有較強的親肝性，對肝移植的功效比環(huán)孢素高100倍，因而大大降低了臨床使用劑量，可降低原治療費用1/3～1/2。FK-506和環(huán)孢菌素合用具有明顯的協(xié)同作用，效果更好。他克莫司不僅可用于防止免疫反應(yīng)的發(fā)生，還可用于治療已發(fā)生的免疫反應(yīng)及自身免疫性疾病，對防止器官移植的免疫反應(yīng)和自身免疫性疾病的治療具有重要意義。
自他克莫司發(fā)現(xiàn)以來，國內(nèi)外對他克莫司進行了基礎(chǔ)和臨床研究，于1994被美國食品和藥物管理局(FDA)批準上市。目前臨床應(yīng)用于預(yù)防肝臟或腎臟移植手術(shù)后的移植物排斥反應(yīng)。他克莫司與其他免疫抑制劑如雷帕霉素和環(huán)孢霉素等對預(yù)防器官移植中所出現(xiàn)的排斥反應(yīng)具有很好的效果，并且在臨床效果免疫抑制劑作用比環(huán)孢霉素(CsA)強100倍，因而能夠大大降低臨床使用劑量，同時不良反應(yīng)液明顯降低，并且可以降低治療費用他克莫司廣泛應(yīng)用于特應(yīng)性皮炎(AD)、變應(yīng)性接觸式皮炎、銀屑病、紅斑狼瘡(SLE)、白癜風、扁平苔蘚和Nethenton等自身免疫疾病的治療。目前，傳統(tǒng)的發(fā)酵法制備他克莫司存在產(chǎn)量不高的缺陷，無法滿足對他克莫司的巨大需求，且存在制備他克莫司的生產(chǎn)成本較高的缺陷，這就患者帶來了較大負擔。
有鑒于此，有必要對現(xiàn)有技術(shù)中通過發(fā)酵法生產(chǎn)他克莫司的方法予以改進，以解決上述問題。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于公開一種發(fā)酵生產(chǎn)他克莫司的方法，用以降低采用發(fā)酵法制備他克莫司的生產(chǎn)成本，縮短發(fā)酵周期。
為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種發(fā)酵生產(chǎn)他克莫司的方法，包括以下步驟：
步驟(1)、將鏈霉菌接種于斜面培養(yǎng)基，26～30℃下培養(yǎng)9～15天；
步驟(2)、挑選成熟斜面接種于種子培養(yǎng)基上，在26～30℃，轉(zhuǎn)速200～300rmp下在搖床上培養(yǎng)40～50h，按2～15％的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基后置入發(fā)酵罐；
步驟(3)、將發(fā)酵罐置于26～30℃下進行發(fā)酵，待發(fā)酵進行至20～30h時補加有機溶劑及鹽溶液，待發(fā)酵進行至40～50h時再次補加有機溶劑及鹽溶液，待發(fā)酵進行至70～80h時進行補料培養(yǎng)基，并在整個發(fā)酵過程中，通過改變轉(zhuǎn)速的方式維持發(fā)酵罐內(nèi)的溶解氧濃度保持在設(shè)定值之上；
步驟(4)、對經(jīng)步驟(3)得到的發(fā)酵液進行分離提取，即得他克莫司。
作為本發(fā)明的進一步改進，所述步驟(1)中的斜面培養(yǎng)基組成為：麥芽汁粉10～20g/L，酵母膏粉3～8g/L，葡萄糖5～15g/L和瓊脂18～22g/L組成；所述斜面培養(yǎng)基的pH呈6.0～8.0。
作為本發(fā)明的進一步改進，所述步驟(2)中的種子培養(yǎng)基組成為：玉米淀粉5～15g/L，玉米漿5～15g/L，葡萄糖10～20g/L，酵母粉5～15g/L，碳酸鈣1～5g/L組成；所述斜面培養(yǎng)基的pH呈6.0～8.0。
作為本發(fā)明的進一步改進，所述步驟(2)中的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：玉米淀粉45～55g/L，酵母粉5～15g/L，玉米漿5～15g/L，玉米油5～15g/L，K2HPO41～5g/L，KH2PO4 1～5g/L和碳酸鈣1～5g/L組成；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH呈6.0～8.0。
作為本發(fā)明的進一步改進，所述步驟(3)中鹽溶液的添加量為發(fā)酵罐中的發(fā)酵液的體積的0.05％～0.5％；有機溶劑的添加量為發(fā)酵罐中的發(fā)酵液的體積的0.01～0.05％。
作為本發(fā)明的進一步改進，所述步驟(3)中的鹽溶液選自氯化鈉溶液或者氯化鉀溶液，所述有機溶劑選自甲醇、乙醇或者異丙醇；所述鹽溶液的濃度為1.0～5.0mol/L。
作為本發(fā)明的進一步改進，所述步驟(3)中的補料培養(yǎng)基組成為：玉米淀粉50～80g/L，酵母粉10～20g/L，碳酸鈣0.3～0.6g/L組成；所述補料培養(yǎng)基的pH呈6.0～7.0。
作為本發(fā)明的進一步改進，所述步驟(3)中發(fā)酵罐的罐壓為0.01～0.05MPa，通氣量為0.5～1.5VVM，初始發(fā)酵罐的溶解氧濃度為100％，發(fā)酵過程中發(fā)酵罐內(nèi)的溶解氧濃度的設(shè)定值為25％。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明中，在發(fā)酵罐發(fā)酵過程中采用分批發(fā)酵的方式進行發(fā)酵培養(yǎng)，并在發(fā)酵的不同階段向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加有機溶劑及鹽溶液，相對于傳統(tǒng)的發(fā)酵法制備他克莫司本發(fā)明能夠提高他克莫司的產(chǎn)量約20～40％，且發(fā)酵周期也較短，從而降低了他克莫司的生產(chǎn)成本。
具體實施方式
下面結(jié)合各實施方式對本發(fā)明進行詳細說明，但應(yīng)當說明的是，這些實施方式并非對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)這些實施方式所作的功能、方法、或者結(jié)構(gòu)上的等效變換或替代，均屬于本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
除非說明書中有特殊說明，本發(fā)明中的各個實施例中的組分、原料均采用分析純級別。另外，各實施例中的“g”為重量單位“克”；“h”為時間單位“小時”；“ml”為體積單位“毫升”；“室溫”為23℃?！癡VM”為通氣量單位(air volume/culture volume/min)，并具體為單位時間內(nèi)(通常為每分鐘)通入到發(fā)酵容器(例如“發(fā)酵罐”)的氣體體積。“g/L”為培養(yǎng)基中各組分的含量單位。
實施例一：
一種發(fā)酵生產(chǎn)他克莫司的方法，包括以下步驟。
步驟(1)、將鏈霉菌接種于斜面培養(yǎng)基，26℃下培養(yǎng)15天。
步驟(2)、挑選成熟斜面進行接種于種子培養(yǎng)基，在26℃，轉(zhuǎn)速300rpm下在搖床上進行培養(yǎng)50h。按2％的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基后置入發(fā)酵罐中進行發(fā)酵。
步驟(3)、將發(fā)酵罐置于26℃下進行發(fā)酵。待發(fā)酵進行至30h補加含甲醇的氯化鈉溶液，待發(fā)酵進行至50h時再次補加甲醇及氯化鈉溶液，甲醇的添加量為發(fā)酵罐中的發(fā)酵液的體積的0.01％，氯化鈉溶液的添加量為發(fā)酵罐中的發(fā)酵液的體積的0.05％。氯化鈉溶液的濃度為1.0mol/L。待發(fā)酵進行至80h時進行補料培養(yǎng)。在整個發(fā)酵過程中，發(fā)酵罐罐壓為0.01MPa，通氣量0.5VVM，初始發(fā)酵罐的溶解氧濃度為100％。同時，在發(fā)酵過程中通過改變轉(zhuǎn)速的方式維持發(fā)酵罐內(nèi)的溶解氧濃度保持在25％以上，發(fā)酵90h后放罐，制得發(fā)酵液。
步驟(4)、對經(jīng)步驟(3)得到的發(fā)酵液進行分離提取，即得他克莫司。在本實施例中，對發(fā)酵液中的他克莫司可通過重結(jié)晶進行分離提取。
斜面培養(yǎng)基中的各組分為(單位：g/L)：麥芽汁粉10，酵母膏粉3，葡萄糖5，瓊脂18，余量為水；斜面培養(yǎng)基的pH呈6.0。
種子培養(yǎng)基中的各組分為(單位：g/L)：玉米淀粉5，玉米漿5，葡萄糖10，酵母粉5，碳酸鈣1，余量為水；種子培養(yǎng)基的pH呈6.0。
發(fā)酵培養(yǎng)基中的各組分為(單位：g/L)：玉米淀粉45，酵母粉5，玉米漿5，玉米油5，K2HPO4 1，KH2PO4 1，碳酸鈣1，余量為水；發(fā)酵培養(yǎng)基的pH呈6.0。
補料培養(yǎng)基各組分為(單位：g/L)：玉米淀粉50，酵母粉10，碳酸鈣0.3，余量為水。補料培養(yǎng)基的pH呈6.0。
實施例二：
一種發(fā)酵生產(chǎn)他克莫司的方法，包括以下步驟。
步驟(1)、將鏈霉菌接種于斜面培養(yǎng)基，30℃下培養(yǎng)9天。
步驟(2)、挑選成熟斜面進行接種于種子液培養(yǎng)基，在30℃，200rmp下在搖床上培養(yǎng)40h，按15％的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基后置入發(fā)酵罐中進行發(fā)酵。
步驟(3)、將發(fā)酵罐置于30℃下進行發(fā)酵。發(fā)酵進行至20h補加乙醇及氯化鉀溶液，發(fā)酵進行至40h再次補加乙醇及氯化鉀溶液，乙醇添加量為發(fā)酵罐中的發(fā)酵液的體積的0.05％，氯化鉀溶液的添加量為發(fā)酵罐中的發(fā)酵液的體積的0.5％。氯化鉀溶液的濃度為2.0mol/L。發(fā)酵進行至70h進行補料培養(yǎng)。在整個發(fā)酵過程中，發(fā)酵罐罐壓為0.05MPa，通氣量1.5VVM，初始發(fā)酵罐的溶解氧濃度為100％。同時，在發(fā)酵過程中通過改變轉(zhuǎn)速的方式維持發(fā)酵罐內(nèi)的溶解氧濃度保持在25％以上，發(fā)酵100h后放罐，制得發(fā)酵液。
在本實施例中，發(fā)酵罐的底部設(shè)置有攪拌裝置，攪拌裝置被伺服電機驅(qū)動，以控制攪拌裝置的轉(zhuǎn)速。攪拌裝置的轉(zhuǎn)速設(shè)定轉(zhuǎn)速范圍為180～400rpm。提高轉(zhuǎn)速可提高發(fā)酵罐內(nèi)的溶解氧濃度，降低轉(zhuǎn)速可降低發(fā)酵罐內(nèi)的溶解氧濃度。伺服電機在控制器，例如單片機或者PLC的控制下，通過自發(fā)酵罐內(nèi)所設(shè)置的傳感器所測得的溶解氧濃度，以自動控制伺服電機的轉(zhuǎn)速，從而自動控制發(fā)酵罐底部所設(shè)置的攪拌裝置的轉(zhuǎn)速，從而通過改變轉(zhuǎn)速的方式維持發(fā)酵罐內(nèi)的溶解氧濃度保持在25％以上。
步驟(4)、對經(jīng)步驟(3)得到的發(fā)酵液進行分離提取，即得他克莫司。
斜面培養(yǎng)基中的各組分為(單位：g/L)：麥芽汁粉20，酵母膏粉8，葡萄糖15，瓊脂22，余量為水；斜面培養(yǎng)基的pH呈8.0。
種子培養(yǎng)基中的各組分為(單位：g/L)：玉米淀粉15，玉米漿15，葡萄糖20，酵母粉15，碳酸鈣5，余量為水；種子培養(yǎng)基的pH呈8.0。
發(fā)酵培養(yǎng)基中的各組分為(單位：g/L)：玉米淀粉55，酵母粉15，玉米漿15，玉米油15，K2HPO4 5，KH2PO4 5，碳酸鈣5，余量為水；發(fā)酵培養(yǎng)基的pH呈8.0。
補料培養(yǎng)基中的各組分為(單位：g/L)：玉米淀粉80，酵母粉20，碳酸鈣0.6，余量為水；補料培養(yǎng)基的pH呈6.4。
實施例三：
一種發(fā)酵生產(chǎn)他克莫司的方法，包括以下步驟。
步驟(1)、將鏈霉菌接種于斜面培養(yǎng)基，28℃下培養(yǎng)12天。
步驟(2)、挑選成熟斜面進行接種于種子液培養(yǎng)基，在28℃，250rmp下在搖床上培養(yǎng)45h，按8％的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基后置入發(fā)酵罐中進行發(fā)酵。
步驟(3)、將發(fā)酵罐置于28℃下進行培養(yǎng)。發(fā)酵進行至24h時補加異丙醇及氯化鈉溶液；發(fā)酵進行至48h時再次補加異丙醇及氯化鈉溶液，異丙醇添加量為發(fā)酵罐中的發(fā)酵液的體積的0.20％，氯化鈉溶液的添加量為發(fā)酵罐中的發(fā)酵液的體積的0.03％。氯化鈉溶液的濃度為5.0mol/L。
發(fā)酵進行至75h時進行補料培養(yǎng)。在整個發(fā)酵過程中，發(fā)酵罐罐壓為0.03MPa，通氣量1.0VVM，初始發(fā)酵罐的溶解氧濃度為100％。同時，在發(fā)酵過程中通過改變轉(zhuǎn)速的方式維持發(fā)酵罐內(nèi)的溶解氧濃度保持在25％以上，發(fā)酵96h后放罐，制得發(fā)酵液。
步驟(4)、對經(jīng)步驟(3)得到的發(fā)酵液進行分離提取，即得他克莫司。
斜面培養(yǎng)基中的各組分為(單位：g/L)：麥芽汁粉15，酵母膏粉5，葡萄糖10，瓊脂20，斜面培養(yǎng)基的pH呈6.5。
種子培養(yǎng)基中的各組分為(單位：g/L)：玉米淀粉10，玉米漿10，葡萄糖15，酵母粉10，碳酸鈣3，余量為水；種子培養(yǎng)基的pH呈6.5。
發(fā)酵培養(yǎng)基中的各組分為(單位：g/L)：玉米淀粉50，酵母粉10，玉米漿10，玉米油10，K2HPO4 3，KH2PO4 3，碳酸鈣3，余量為水；發(fā)酵培養(yǎng)基的pH呈6.5。
補料培養(yǎng)基中的各組分為(單位：g/L)：玉米淀粉60，酵母粉15，碳酸鈣0.4，余量為水；補料培養(yǎng)基的pH呈7.0。
上文所列出的一系列的詳細說明僅僅是針對本發(fā)明的可行性實施方式的具體說明，它們并非用以限制本發(fā)明的保護范圍，凡未脫離本發(fā)明技藝精神所作的等效實施方式或變更均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實施例的細節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點來看，均應(yīng)將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。
此外，應(yīng)當理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但并非每個實施方式僅包含一個獨立的技術(shù)方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當將說明書作為一個整體，各實施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其他實施方式。