技術領域
本發(fā)明涉及一種他汀類藥物（如瑞舒伐他汀或者匹伐他?。╆P鍵手性中間體(S)-3-羥基戊二酸單酯的酶法制備方法，尤其是(S)-3-羥基戊二酸單酯的脂肪酶催化水解制備方法，屬于制藥和生物化工技術領域。
背景技術：
心腦血管疾病是危害人類（特別是中老年）健康最常見、最嚴重的疾病之一。他汀類藥物是目前治療高血壓、高血脂等心血管疾病最有效的藥物。瑞舒伐他汀由阿斯利康(Astrazeneca) 公司研究開發(fā)并于2002 年11 月首次在荷蘭獲批，2003 年8 月通過美國FDA 上市審批。瑞舒伐他汀的藥效和安全性方面均令人非常滿意，2009 年在全球銷售額高達44 億美元。
在他汀藥物如瑞舒伐他汀或者匹伐他汀的合成和制備工藝中，高光學純度( ≥ 99％ ) 的手性側鏈的合成是關鍵步驟，同時也是難點。利用傳統(tǒng)的化學合成的方法，由于(S)-3-羥基戊二酸單甲酯或單乙酯的碳鏈長度比較短，而且含有羥基、羧基和酯基等活潑基團，很容易破壞產物分子的結構，其制備成本相比其他他汀類藥物要高出許多，所以銷售價格一直居高不下，制約了其市場的開拓和發(fā)展，同時也妨礙了心血管疾病的有效控制和治療。
目前多篇文獻已經報道了脂肪酶法催化水解反應獲得瑞舒伐他汀手性中間體(S)-3-羥基戊二酸單甲酯或單乙酯。Elisabeth Egholm Jacobsen等[Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2003,21,55–58]早在2003年報道了一系列的脂肪酶催化3-羥基戊二酸二酯的反應，其中脂肪酶Novozym 435催化反應的底物濃度為0.735mol/L，獲得的產物3-羥基戊二酸單乙酯的ee值為91%，收率為80%，而催化獲得的3-羥基戊二酸單甲酯的ee值為90%，收率為70%。Hua-Ping Dong 等[Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic ,2010,66 ,90–94]在2010年報道了脂肪酶Novozym 435催化水解3-羥基戊二酸二乙酯合成(S)-3-羥基戊二酸單乙酯的反應，對其反應條件進行了一系列的優(yōu)化，3-羥基戊二酸二乙酯的底物濃度為0.15 mol/L，ee值為95%，收率為98.5%。
我們嘗試了現有的所有文獻報道的工藝制備手性中間體（S）-3-羥基戊二酸單酯，均存在著以下幾個問題：（1）脂肪酶存在產物和底物抑制，影響反應速率和底物濃度；（2）反應產物（S）-3-羥基戊二酸單酯的ee值較低，光學異構體雜質在后續(xù)反應過程中不易去除。
技術實現要素：
本發(fā)明的目的在于，提供一種手性中間體(S)-3-羥基戊二酸單酯的酶法制備方法。本發(fā)明有效地減少了底物和產物抑制、提高了反應速率、提高了光學純度，具有優(yōu)越的工業(yè)化應用價值。
為解決上述技術問題，本發(fā)明提供的技術方案如下：手性中間體(S)-3-羥基戊二酸單酯的酶法制備方法，在緩沖液相和有機相的兩相體系中，以3-羥基戊二酸二酯為底物，在脂肪酶的作用下，實時流加弱堿溶液調控pH至7.0-9.0，生成手性中間體(S)-3-羥基戊二酸單酯；其中所述(S)-3-羥基戊二酸單酯為甲酯或者乙酯。
上述的手性中間體(S)-3-羥基戊二酸單酯的酶法制備方法中，所述的緩沖液相為磷酸鉀緩沖液。
前述的手性中間體(S)-3-羥基戊二酸單酯的酶法制備方法中，所述的緩沖液相為10-50mmol/L的磷酸鉀緩沖液。
前述的手性中間體(S)-3-羥基戊二酸單酯的酶法制備方法中，所述的磷酸鉀緩沖液的pH為7.0-9.0。
前述的手性中間體(S)-3-羥基戊二酸單酯的酶法制備方法中，所述的有機相為正庚烷或乙酸乙酯。
前述的手性中間體(S)-3-羥基戊二酸單酯的酶法制備方法中，所述的有機相占兩相體系中體積比為5%-20%。
前述的手性中間體(S)-3-羥基戊二酸單酯的酶法制備方法中，所述的脂肪酶與底物的質量比為5%-40%。
前述的手性中間體(S)-3-羥基戊二酸單酯的酶法制備方法中，所述的脂肪酶為Novozym 435。
前述的手性中間體(S)-3-羥基戊二酸單酯的酶法制備方法中，所述的底物3-羥基戊二酸二酯投料量為40-400g/L。
前述的手性中間體(S)-3-羥基戊二酸單酯的酶法制備方法中，所述的弱堿為碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸鉀、醋酸鈉、磷酸氫二鉀、氨水中的一種或者幾種，弱堿溶液濃度為0.5-2mol/L。
前述的手性中間體(S)-3-羥基戊二酸單酯的酶法制備方法中，所述的調控pH為7.0-9.0，使反應物溶液與緩沖液相的pH值一致。
前述的手性中間體(S)-3-羥基戊二酸單酯的酶法制備方法中，所述的反應溫度為-5-40℃。
與現有技術相比，本發(fā)明一方面采用了兩相反應體系，降低了底物抑制，使得脂肪酶維持較高的催化反應速率。另一方面實時流加弱堿溶液可以及時的將反應產生的酸中和，避免產物對脂肪酶的抑制作用,減少光學異構體雜質的產生。采用本發(fā)明獲得的底物濃度較高并且產物ee值較好，大大提高了產品質量和時空收率。
具體實施方式
下面結合實施例對本發(fā)明作進一步的說明。
實施例1：（S）-3-羥基戊二酸單甲酯的制備（對照例）
將5g（28.4 mmol）3-羥基戊二酸二甲酯和0.5g 脂肪酶Novozym 435加入到25mL磷酸鉀緩沖溶液（20mM，pH7.0）中，反應溫度為40℃，實時流加NaOH溶液（1N）調節(jié)體系pH7.0， 24 h底物反應完全。反應液過濾除去脂肪酶，濾液用鹽酸溶液（1N）調節(jié)pH至3.0，用5 mL乙酸乙酯萃取3次，合并有機相，無水硫酸鈉干燥后，旋干得4g粗產品，收率為86.9%。
產物ee值檢測方法采用衍生化后高效液相色譜檢測。
產物衍生化檢測條件為：稱?。⊿）-3-羥基戊二酸單乙酯（0.4g），加入二氯甲烷（3mL）和咪唑（0. 4g），室溫震蕩，加入叔丁基二甲基氯硅烷（0. 9g），反應24h；反應液過一次性過濾器，濾液40℃旋干；隨后加入2mL碳酸鉀水溶液（2N），室溫震蕩2h；反應液正己烷（0.3mL）萃取3次，水相采用1N鹽酸調節(jié)pH值至3.0，正己烷（0.3mL）萃取3次，合并正己烷相，飽和氯化鈉洗，無水硫酸鈉干燥，過濾膜準備進樣。
高效液相色譜檢測條件為：Agilent 1100液相色譜，Chiralcel OD-H色譜柱，流動相為正己烷∶異丙醇（98∶2），流速1mL/min，柱溫20 ℃，紫外檢測波長210 nm，產品取5 μL溶于1 mL正己烷中，進樣量為2 μL。出峰時間：產物（6.9min，8.7min）。檢測結果顯示產品ee值為89.6%。
實施例2：（S）-3-羥基戊二酸單甲酯的制備
將5 g（28.4 mmol）3-羥基戊二酸二甲酯和0.25 g 脂肪酶Novozym 435加入到23.75mL磷酸鉀緩沖溶液（20mM，pH7.0）和1.25mL乙酸乙酯中，反應溫度為40℃，實時流加Na2CO3溶液（0.5N）調節(jié)體系pH7.0，24 h底物反應完全。反應液過濾除去脂肪酶，濾液用鹽酸溶液（1N）調節(jié)pH至3.0，用5 mL乙酸乙酯萃取3次，合并有機相，無水硫酸鈉干燥后，旋干得4.19 g粗產品，收率為91.2%，ee值為97.4%。
實施例3：（S）-3-羥基戊二酸單甲酯的制備
將10g（56.8mmol）3-羥基戊二酸二甲酯和2g 脂肪酶Novozym 435加入到22.5mL磷酸鉀緩沖溶液（50mM，pH9.0）和2.5mL乙酸乙酯中，反應溫度為30℃，實時流加氨水溶液（2N）調節(jié)體系pH9.0， 8h底物反應完全。反應液過濾除去脂肪酶，分層，水相用鹽酸溶液（1N）調節(jié)pH至3.0，用10mL乙酸乙酯萃取3次，合并有機相，無水硫酸鈉干燥后，旋干得8.53 g粗產品，收率為92.7%，ee值為98.6%。
實施例4：（S）-3-羥基戊二酸單甲酯的制備
將1g（5.68mmol）3-羥基戊二酸二甲酯和0.4g 脂肪酶Novozym 435加入到20mL磷酸鉀緩沖溶液（10mM，pH8.0）和5mL正庚烷中，反應溫度為20℃，實時流加K2CO3溶液（1N）調節(jié)體系pH8.0，24h底物反應完全。反應液過濾除去脂肪酶，分層，水相用鹽酸溶液（1N）調節(jié)pH至3.0，用10 mL乙酸乙酯萃取3次，合并有機相，無水硫酸鈉干燥后，旋干得0.89g粗產品，收率為96.7%，ee值為99.3%。
實施例5：（S）-3-羥基戊二酸單甲酯的制備
將2g（11.4mmol）3-羥基戊二酸二甲酯和0.8g 脂肪酶Novozym 435加入到20mL磷酸鉀緩沖溶液（10mM，pH8.0）和5mL正庚烷中，反應溫度為-5℃，實時流加NaHCO3溶液（1N）調節(jié)體系pH8.0，24h底物反應完全。反應液過濾除去脂肪酶，分層，水相用鹽酸溶液（1N）調節(jié)pH至3.0，用10 mL乙酸乙酯萃取3次，合并有機相，無水硫酸鈉干燥后，旋干得1.61g粗產品，收率為93%，ee值為99.6%。
實施例6：（S）-3-羥基戊二酸單乙酯的制備
將1g（4.9mmol）3-羥基戊二酸二乙酯和0.1g 脂肪酶Novozym 435加入到22.5mL磷酸鉀緩沖溶液（10mM，pH8.0）和2.5mL正庚烷中，反應溫度為0℃，實時流加K2CO3溶液（0.5N）調節(jié)體系pH8.0，24h底物反應完全。反應液過濾除去脂肪酶，分層，水相用鹽酸溶液（1N）調節(jié)pH至3.0，用10 mL乙酸乙酯萃取3次，合并有機相，無水硫酸鈉干燥后，旋干得0.78g粗產品，收率為90.2%，ee值為99.8%。
實施例7：（S）-3-羥基戊二酸單乙酯的制備
將5g（24.5mmol）3-羥基戊二酸二乙酯和2g 脂肪酶Novozym 435加入到22.5mL磷酸鉀緩沖溶液（10mM，pH8.5）和2.5mL乙酸乙酯中，反應溫度為10℃，實時流加氨水溶液（1N）調節(jié)體系pH8.5，24h底物反應完全。反應液過濾除去脂肪酶，分層，水相用鹽酸溶液（1N）調節(jié)pH至3.0，用10 mL乙酸乙酯萃取3次，合并有機相，無水硫酸鈉干燥后，旋干得4.1g粗產品，收率為95.2%，ee值為99.8%。
從上述實施例可以看出，與實施例1的對照組相比，采用本發(fā)明制備方法的實施例2-7得到的底物的收率從86.9%大幅提高到90.2%-96.7%，產物ee值更是從89.6%大幅提高到98.6%-99.8%，取得了顯著的、預料不到的有益效果。