一種α?酮戊二酸和丙酮酸聯(lián)產(chǎn)的發(fā)酵方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種α?酮戊二酸和丙酮酸聯(lián)產(chǎn)的發(fā)酵方法，屬于發(fā)酵工程技術領域。本發(fā)明考慮到α?酮戊二酸和丙酮酸的商業(yè)價值差異不大，因此將兩種羧酸進行聯(lián)產(chǎn)。在羧酸聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵過程中，控制合適的甘油初始濃度以及流加速度促進菌體生長和羧酸的積累。本發(fā)明能夠大大提高底物轉(zhuǎn)化率、總酸產(chǎn)量、生產(chǎn)強度，縮短發(fā)酵周期，達到節(jié)能減耗、提高經(jīng)濟效益的目的。
【專利說明】
一種α-酮戊二酸和丙酮酸聯(lián)產(chǎn)的發(fā)酵方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及一種α-酮戊二酸和丙酮酸聯(lián)產(chǎn)的發(fā)酵方法，屬于發(fā)酵工程技術領域。
【背景技術】
[0002] α-酮戊二酸(α-ketoglutaric acid，簡稱α-KG)和丙酮酸(Pyruvic acid)是細胞 代謝過程中重要的兩種短鏈羧酸分子，都可以廣泛應用于食品、醫(yī)藥、化工等領域。目前，這 兩種有機酸在工業(yè)生產(chǎn)中主要是通過化工合成的方法，但是化工合成中存在有毒物質(zhì)的使 用、收率低等缺點，這些弊端限制了產(chǎn)品在醫(yī)藥、食品等領域的使用。微生物發(fā)酵法可以利 用多種可再生碳源生產(chǎn)多種產(chǎn)品，不僅可以提高產(chǎn)品安全性，而且可以降低生產(chǎn)過程中的 污染。
[0003] 解脂亞洛酵母(Y.lip〇lytica)WSH-Z06是一株能夠以甘油為唯一碳源積累α-酮戊 二酸的硫胺素營養(yǎng)缺陷型高產(chǎn)菌株。但是在其積累α-酮戊二酸過程中會伴隨著一定量的丙 酮酸的積累，這使得在以積累α-酮戊二酸為目的的發(fā)酵中，在發(fā)酵后期需要通過補加硫酸 控制PH的方法使前期積累的丙酮酸轉(zhuǎn)化為α-酮戊二酸。但這樣做有以下缺點：發(fā)酵周期延 長、硫酸的添加會增加新的雜質(zhì)、底物轉(zhuǎn)化率較低;在工業(yè)生產(chǎn)中，這些弊端都會放大，給生 產(chǎn)帶來不便。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的在于克服上述發(fā)酵過程的不足，提供一種提高底物轉(zhuǎn)化率和縮短生產(chǎn) 周期的α-酮戊二酸和丙酮酸聯(lián)產(chǎn)的發(fā)酵方法。
[0005] 本發(fā)明實現(xiàn)上述目的所采用的技術方案包括如下步驟：
[0006] (1)菌種活化:制備解脂亞洛酵母WSH-Z06的二級種子液；
[0007] 流加發(fā)酵:將種子液按10 %接種量接到發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，在發(fā)酵前期， 利用發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳酸鈣作為pH緩沖劑，當pH自然下降至3.0時，用20%Ca(0H) 2控制pH 維持在3.0;在發(fā)酵過程中，當甘油濃度降到20~30g/L時，按43.75g/h的流速恒速流加純甘 油至總甘油濃度為150g/L，144h結(jié)束發(fā)酵。
[0008] 在本發(fā)明的一種能夠?qū)嵤┓绞街校襟E（1)將菌種從甘油管接種到茄型瓶斜面種 子培養(yǎng)基中活化，28 °C培養(yǎng)24h后，將活化的種子接到種子培養(yǎng)基，28 °C培養(yǎng)18h后，將一級 種子液按〇. 5%接種量接到種子培養(yǎng)基中，28 °C培養(yǎng)18h后。
[0009] 在本發(fā)明的一種能夠?qū)嵤┓绞街校襟E(2)中當甘油濃度降到26g/L，開始流加甘 油。
[0010] 所述的種子培養(yǎng)基的組成為（g/L):葡萄糖20,大豆蛋白10,磷酸二氫鉀1.0,七水 硫酸鎂0.5。固體培養(yǎng)基中加入20g/L瓊脂。
[0011] 所述的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為(g/L):甘油50，硫酸銨3，磷酸二氫鉀3，七水硫酸鎂1.2， 氯化鈉0.5，磷酸氫二鉀0.1，鹽酸硫胺6 X HT7，乙酸鈉6，碳酸鈣10。
[0012] 本發(fā)明考慮到α-酮戊二酸和丙酮酸的商業(yè)價值差異不大，因此將兩種羧酸進行聯(lián) 產(chǎn)，可以大大提高底物轉(zhuǎn)化率、總酸產(chǎn)量、生產(chǎn)強度，縮短發(fā)酵周期，達到節(jié)能減耗、提高經(jīng) 濟效益的目的。在羧酸聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵過程中，控制合適的甘油初始濃度以及流加速度促進菌體 生長和羧酸的積累。
【附圖說明】
[0013] 圖1實施例1發(fā)酵過程中各參數(shù)變化情況，菌體干重（·);α-酮戊二酸(·）；丙酮酸 (〇）；甘油（AhpH(A)13
[0014] 圖2實施例2發(fā)酵過程中各參數(shù)變化情況，菌體干重（·);α-酮戊二酸(·）；丙酮酸 (〇）；甘油（AhpH(A)13
[0015] 圖3實施例3發(fā)酵過程中各參數(shù)變化情況，菌體干重（·);α-酮戊二酸(·）；丙酮酸 (〇）；甘油（AhpH(A)13
【具體實施方式】
[0016] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的【具體實施方式】作詳細說明。
[0017] 種子培養(yǎng)液的組成為（g/L):葡萄糖20,大豆蛋白10,磷酸二氫鉀1.0,七水硫酸鎂 〇. 5;固體培養(yǎng)基中加入20g/L瓊脂。
[0018] 發(fā)酵培養(yǎng)基組成為(g/L):甘油50，硫酸銨3，磷酸二氫鉀3，七水硫酸鎂1.2，氯化鈉 0.5，磷酸氫二鉀0.1，鹽酸硫胺6 X HT7，乙酸鈉6，碳酸鈣10。
[0019] 細胞干重的測定:準確吸取ImL發(fā)酵液于50mL容量瓶，加入15mL 2mol/L鹽酸的與 發(fā)酵液中的CaCO3充分反應，用去離子水定容后混合均勻，在570nm處測定OD值。根據(jù)OD 570: 細胞干重(g/L) = 1: . 223，計算細胞干重。
[0020] α-酮戊二酸、丙酮酸和和甘油的測定：高效液相色譜(HPLC)。儀器:Agilent 1260 高效液相色譜儀(配紫外可見檢測器、示差折光檢測器），色譜條件:色譜柱:Aminex HPX-87H ion exchange column，流動相：5mM H2SO4,流速:0.6mL/min，柱溫:40°C，進樣量：10yL。 紫外檢測器波長：210nm(檢測α-酮戊二酸和丙酮酸），示差折光檢測器:檢測甘油。樣品制 備：ImL發(fā)酵液于12 ,OOOrpm下離心5min，上清經(jīng)過適當?shù)南♂屘幚砗徒?jīng)0.22yL濾膜過濾后， 進行高效液相色譜分析。
[0021] 底物轉(zhuǎn)化率（％) = (α-酮戊二酸產(chǎn)量+丙酮酸產(chǎn)量)*1〇〇/總甘油濃度，單獨生產(chǎn)α-酮戊二酸時，丙酮酸產(chǎn)量取〇。
[0022] 生產(chǎn)強度(g/(L*h)) = (a-酮戊二酸產(chǎn)量+丙酮酸產(chǎn)量)/發(fā)酵周期，單獨生產(chǎn)α-酮 戊二酸時，丙酮酸產(chǎn)量取〇。
[0023] 實施例1初始甘油濃度50g/L并且后期補加甘油條件下羧酸聯(lián)產(chǎn)
[0024]步驟一、將解脂亞洛酵母WSH-Z06從甘油管接種到茄型瓶斜面活化，28°C培養(yǎng)24h 后，用接種環(huán)將活化的種子接一環(huán)到一級種子培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)18h后，將一級種子液按 0.5%接種量接到二級種子培養(yǎng)基中，28 °C培養(yǎng)18h后，再將二級種子液按10 %接種量接到 發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28°C進行發(fā)酵培養(yǎng)。一級種子培養(yǎng)方法為:500mL三角瓶中裝液量50mL，培 養(yǎng)溫度28°C，轉(zhuǎn)速200r/min，培養(yǎng)17-18h。二級種子培養(yǎng)方法為：15L種子罐中裝液量10.5L， 接種量〇. 5 %，培養(yǎng)溫度28 °C，攪拌轉(zhuǎn)速300r/min，通氣量I vvm，培養(yǎng)17-18h。
[0025]步驟二、在發(fā)酵前期，依靠發(fā)酵培養(yǎng)基中的10g/L的碳酸鈣作為pH緩沖劑，當pH自 然下降至3.0時，用20 % Ca (OH) 2溶液控制pH維持在3.0。
[0026]發(fā)酵過程中，24h左右當發(fā)酵液中甘油濃度降到26g/L，按43.75g/h的流速恒速流 加純甘油使總甘油用量達到150g/L，期間甘油濃度維持在20-3(^/1。14411結(jié)束發(fā)酵。
[0027]發(fā)酵結(jié)束后，測得總酸產(chǎn)量為106.7g/L，a-酮戊二酸和丙酮酸產(chǎn)量分別為67.4g/L 和39.3g/L。
[0028]實施例2初始甘油濃度150g/L條件下羧酸聯(lián)產(chǎn)
[0029]步驟一、將解脂亞洛酵母WSH-Z06從甘油管接種到茄型瓶斜面活化，28°C培養(yǎng)24h 后，用接種環(huán)將活化的種子接一環(huán)到一級種子培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)18h后，將一級種子液按 0.5%接種量接到二級種子培養(yǎng)基中，28 °C培養(yǎng)18h后，再將二級種子液按10 %接種量接到 發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28 °C進行發(fā)酵培養(yǎng)。
[0030]步驟二、在發(fā)酵前期，依靠發(fā)酵培養(yǎng)基中的10g/L的碳酸鈣作為pH緩沖劑，當pH自 然下降至3.0時，用20 % Ca (OH) 2溶液控制pH維持在3.0。
[0031]發(fā)酵過程中，初始甘油濃度為150g/L，發(fā)酵期間不補加甘油，144h結(jié)束發(fā)酵。
[0032]發(fā)酵結(jié)束后，測得總酸產(chǎn)量為75.7g/L，a-酮戊二酸和丙酮酸產(chǎn)量分別為61 · 5g/L 和14.2g/L。
[0033]實施例3初始甘油濃度50g/L并且后期補加甘油條件下只生產(chǎn)a-酮戊二酸 [0034]步驟一、將菌種從甘油管接種到茄型瓶斜面活化，28°C培養(yǎng)24h后，用接種環(huán)將活 化的種子接一環(huán)到一級種子培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)18h后，將一級種子液按0.5 %接種量接到二 級種子培養(yǎng)基中，28 °C培養(yǎng)18h后，再將二級種子液按10 %接種量接到發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā) 酵培養(yǎng)，28 °C發(fā)酵144h后結(jié)束發(fā)酵。
[0035]步驟二、在發(fā)酵前期依靠發(fā)酵培養(yǎng)基中的10g/L碳酸鈣作為pH緩沖劑，當pH自然下 降至3.0時，用20%Ca(0H)2控制pH維持在3.0，待pH開始反彈升高時，用4mol/L硫酸控制pH 維持在3.0。
[0036] 發(fā)酵過程中，24h發(fā)酵液中甘油濃度降到26.2g/L，24-104h期間按43.75g/h的流速 恒速流加純甘油至總甘油用量為150g/L，期間甘油濃度維持在20-30g/L，192h結(jié)束發(fā)酵。 [0037]發(fā)酵結(jié)束后，測得總酸產(chǎn)量為79.3g/L，α-酮戊二酸和丙酮酸產(chǎn)量分別為79.3g/L 和〇g/L。
[0038]表1羧酸聯(lián)產(chǎn)的兩種發(fā)酵方式對比
[0042]雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范 圍應該以權利要求書所界定的為準。
【主權項】
1. 一種α-酮戊二酸和丙酮酸聯(lián)產(chǎn)的發(fā)酵方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 菌種活化:制備解脂亞洛酵母WSH-Z06的二級種子液； (2) 流加發(fā)酵:將種子液按10 %接種量接到發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，在發(fā)酵前期， 利用發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳酸鈣作為pH緩沖劑，當pH自然下降至3.0時，用20%Ca(0H) 2控制pH 維持在3.0;在發(fā)酵過程中，當甘油濃度降到20~30g/L時，按43.75g/h的流速恒速流加純甘 油至甘油總用量為150g/L，144h結(jié)束發(fā)酵。2. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基按g/L計組成為：甘油 50，硫酸銨3，磷酸二氫鉀3，七水硫酸鎂1.2，氯化鈉0.5，磷酸氫二鉀0.1，鹽酸硫胺6 X 10-7， 乙酸鈉6,碳酸鈣10。3. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（1)將菌種從甘油管接種到茄型瓶斜 面種子培養(yǎng)基中活化，28 °C培養(yǎng)24h后，將活化的種子接到種子培養(yǎng)基，28 °C培養(yǎng)18h后，將 一級種子液按〇. 5%接種量接到種子培養(yǎng)基中，28 °C培養(yǎng)18h后。4. 根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于，所述的種子培養(yǎng)基按g/L計組成為:葡萄糖 20，大豆蛋白10，磷酸二氫鉀1.0，七水硫酸鎂0.5。5. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中當甘油濃度降到26g/L，開始流 加甘油。
【文檔編號】C12P7/50GK106086092SQ201610726130
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年8月25日
【發(fā)明人】周景文, 陳堅, 張海林, 堵國成, 劉松, 方芳
【申請人】江南大學