二羥基戊二酸或其檢測試劑的用途
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種二羥基戊二酸(2-HG)或其檢測試劑的用途。具體地，本發(fā)明通過篩選大量血液系統(tǒng)腫瘤和健康體檢者的AML相關(guān)突變基因以及癌癥小分子代謝物，確定了2-HG可作為有效的判斷血液系統(tǒng)惡性腫瘤尤其是AML、ALL、NHL患者預(yù)后的標(biāo)志物。此外，通過對2-HG的異常升高的界定與劃分，能夠相對精確地判斷這一類患者的預(yù)后情況，能夠?yàn)榕R床診療進(jìn)行有利的指導(dǎo)。
【專利說明】二羥基戊二酸或其檢測試劑的用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。具體地，涉及二羥基戊二酸（2-HG)在判斷血液系統(tǒng)惡性腫 瘤尤其是急性髓細(xì)胞白血?。ˋML)、急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL)、非霍奇金淋巴瘤（NHL)等 患者預(yù)后中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 血液系統(tǒng)惡性腫瘤是一種異質(zhì)性疾病，具有特異的臨床表現(xiàn)、不同的治療反應(yīng)和 預(yù)后。由于分子生物學(xué)、遺傳學(xué)和測序等技術(shù)的發(fā)展，對化療方案改進(jìn)、各種新藥和造血干 細(xì)胞移植技術(shù)的廣泛應(yīng)用，其中，AML的療效和預(yù)后有了明顯提高。但是，只有大約40%的 年輕患者（〈60歲）和10%的老年患者（彡60歲）能夠長期存活。到目前為止，臨床指標(biāo) 如WBC和年齡，已經(jīng)被廣泛接受。
[0003] 對于某些血液系統(tǒng)惡性腫瘤而言，細(xì)胞遺傳學(xué)是預(yù)后的重要指標(biāo)，根據(jù)患者的染 色體核型，可分為預(yù)后好、預(yù)后差和預(yù)后中等三種類型。但是，以AML為例，近50%的患者為 染色體核型正常的AML(CN-AML)。這些患者，采用染色體核型檢查無法繼續(xù)進(jìn)行預(yù)后分層。 此外，由于體內(nèi)不同基因的相互作用對預(yù)后有著不同影響，導(dǎo)致無法有效地根據(jù)基因來作 出該類患者預(yù)后的判斷。
[0004] 因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)一種能夠?qū)ρ合到y(tǒng)惡性腫瘤患者尤其是常見的血液 系統(tǒng)惡性腫瘤患者進(jìn)行準(zhǔn)確、方便的預(yù)后。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了對血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者預(yù)后的方法及試劑盒。
[0006] 本發(fā)明第一方面，提供了一種二羥基戊二酸（2-HG)或其檢測試劑的用途，用于制 備判斷血液系統(tǒng)惡性腫瘤預(yù)后的試劑盒。
[0007]在另一優(yōu)選例中,所述血液系統(tǒng)惡性腫瘤包括急性髓細(xì)胞白血病（AML)、急性淋巴 細(xì)胞白血?。ˋLL)、原發(fā)性骨髓纖維化（PMF)、多發(fā)性骨髓瘤（MM)、淋巴瘤（HNL)、骨髓增生 異常綜合癥（MDS)、或慢性粒細(xì)胞性白血?。–ML)。
[0008] 在另一優(yōu)選例中，所述的AML包括核型正常的AML和核型異常的AML，較佳地為核 型正常的AML。
[0009] 在另一優(yōu)選例中，所述預(yù)后是指對測試對象進(jìn)行總生存時(shí)間（OS)或無事件生存 時(shí)間（EFS)的預(yù)估。
[0010] 在另一優(yōu)選例中，所述判斷血液系統(tǒng)惡性腫瘤預(yù)后是指判斷AML預(yù)后；更佳地，所 述判斷AML預(yù)后包括對AML患者進(jìn)行分層預(yù)后。
[0011] 在另一優(yōu)選例中，所述的預(yù)后是將來自測試對象的樣品2-HG含量Al與正常人群 的2-HG含量AO相比較，若Al顯著高于A0,則說明測試組預(yù)后差；
[0012] 較佳地，所述"顯著高于，，指Al多又A()+5SD,又Al)為正常人群血清2-HG的平均 值，SD為正常人群血清2-HG的平均值的標(biāo)準(zhǔn)差。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，所述的正常人群的數(shù)量為至少100人；較佳地至少300人；更佳 地至少500人，最佳地至少1000人。正常人群取自200-2000人的人群。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述"顯著高于"指該升高的差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著性。
[0015] 在另一優(yōu)選例中，所述的"顯著高于"指測試對象（如人）血清中2-HG濃度 > 4ug/ml〇
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述的預(yù)后是分層預(yù)后，包括通過將測試對象的樣品2-HG含量 Al與正常人群樣品的2-HG含量AO相比較，并如下進(jìn)行分層預(yù)后為：
[0017] 當(dāng)所述41彡22 69 1^/!111，則表明預(yù)后非常差（0級）；
[0018] 當(dāng)所述Al為f 則表明預(yù)后差（C級）；
[0019] 當(dāng)所述Al為2 1 85-22_>g/ml，則表明預(yù)后優(yōu)于C級（B級）；
[0020] 當(dāng)所述Al彡2185g/ml，則表明預(yù)后優(yōu)于B級（A級）。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，所述的檢測試劑包括2-HG特異性抗體、a-酮戊二酸依賴酶、 2腳H酶。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還包括二羥基戊二酸（2-HG)的標(biāo)準(zhǔn)品。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述的標(biāo)準(zhǔn)品是濃度分別為22 69、22 (11、和/或218~g/ml的二羥 基戊二酸（2-HG)的標(biāo)準(zhǔn)品。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，所述的檢測包括氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜法（GC-TOFMS)檢測、 酶聯(lián)免疫反應(yīng)法（ELISA法）檢測、核磁共振法（MRI)、或時(shí)間分辨免疫熒光法（TRFDWi) 檢測。
[0025] 在另一優(yōu)選例中，所述的2-HG特異性抗體偶聯(lián)有或帶有可檢測標(biāo)記。
[0026] 在另一優(yōu)選例中，所述可檢測標(biāo)記選自下組：生色團(tuán)、化學(xué)發(fā)光基團(tuán)、熒光團(tuán)、同位 素或酶。
[0027] 在另一優(yōu)選例中，所述2-HG特異性抗體是單克隆抗體或多克隆抗體。
[0028] 在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還包括點(diǎn)樣于測試板上的所述檢測試劑以及使用 說明書。
[0029] 在另一優(yōu)選例中，所述的說明書記載了檢測方法以及根據(jù)A1值進(jìn)行預(yù)后的方法。
[0030] 在另一優(yōu)選例中，所述的a-酮戊二酸依賴酶包括JumonjiC區(qū)結(jié)構(gòu)域去甲基化 酶、TET2-5甲基胞苷脫氫酶等。
[0031] 在另一優(yōu)選例中，所述的檢測試劑包括通過測定2-HG對a-酮戊二酸依賴酶的抑 制率而進(jìn)行檢測2-HG含量的檢測試劑。
[0032] 在另一優(yōu)選例中，所述的檢測的樣品包括血液樣品、血清樣品。
[0033] 本發(fā)明的第二方面，提供了一種判斷急性髓性細(xì)胞白血?。ˋML)預(yù)后的方法，包 括步驟：
[0034] (a)提供受試者的測試樣品；
[0035] (b)測定所述樣品中的2-HG含量為Al;
[0036] (c)將步驟（b)與正常人群樣品的2-HG含量AO相比較，若Al顯著高于A0,則說 明測試組預(yù)后差；
[0037] 較佳地，所述"顯著高于"指Al多又A()+5SD,又Aa為正常人群血清2-HG的平均 值，SD為正常人群血清2-HG的平均值的標(biāo)準(zhǔn)差。
[0038] 在另一優(yōu)選例中，所述的分層預(yù)后還進(jìn)一步分層為：
[0039] 當(dāng)所述八1彡22 69 1^/!111，則表明預(yù)后非常差（0級）；
[0040] 當(dāng)所述Al為22 °1-^69!^/!!^則表明預(yù)后差（C級）；
[0041] 當(dāng)所述Al為2 1 85-22_>g/ml，則表明預(yù)后優(yōu)于C級（B級）；
[0042] 當(dāng)所述Al彡2185 iig/ml，則表明預(yù)后優(yōu)于B級（A級）。
[0043] 在另一優(yōu)選例中，所述的方法可通過氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜法（GC-TOFMS)檢 測、酶聯(lián)免疫反應(yīng)法（ELISA法）檢測或時(shí)間分辨免疫熒光法（TRFIA法）檢測。
[0044] 在另一優(yōu)選例中，所述的檢測的樣品包括血液樣品、血清樣品。
[0045] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實(shí)施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0046] 圖1顯示了在健康對照比和其他血液系統(tǒng)腫瘤中，部分AML患者血清中的2-HG水 平顯著升高。與405健康對照（HC)比較，急性髓細(xì)胞白血?。ˋML)和其他的血液腫瘤患者 (包括淋巴瘤（NHL)、急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL)、多發(fā)性骨髓瘤（MM)、慢性粒細(xì)胞白血病 (CML)、骨髓增生異常綜合癥（MDS)、原發(fā)性骨髓纖維化（PMF) )，2-HG水平均有所上升，但以 AML和ALL患者的2-HG水平升高最為顯著。
[0047] 圖2顯示了Circos圖分析提示在AML患者中，2-HG升高與核型正常組密切相關(guān) (圖1A)，而在核型正常的AML患者中，2-HG升高與IDH1/2突變關(guān)系最為密切，其次是NPMl 和DNMT3A突變密切相關(guān)（圖1B)。
[0048] 圖3顯示了在CN-AML患者中，不同2-HG水平AML患者的Kaplan-Meier曲線的生 存分析比較。以健康體檢者的血清2-HG水平的平均值加5倍的標(biāo)準(zhǔn)差為界定值，把CN-AML 患者劃分為升高組52例，正常水平組182例。高2-HG患者的總生存期和無事件生存期， 均低于正常2-HG水平組，兩者之間的差異顯著，P〈0. 001 (圖3A，3B)。分別以高水平組和 正常水平組的2-HG的中位數(shù)，把兩組進(jìn)一步劃分為四組：〈1.85(iig/ml，Log2)水平組； I. 85-2. 01(iig/ml，Log2)水平組；2. 01-2. 69(iig/ml，Log2)水平組；>2. 69(iig/ml，Log2) 水平組。Kaplan-Meier(KM)曲線的生存分析的提示，2-HG水平越高，患者的預(yù)后越差，呈現(xiàn) 出劑量效應(yīng)（圖3C和3D)。
[0049] 圖4顯示了標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。其中，標(biāo)準(zhǔn)曲線的公式y(tǒng)=11.80x+1.66,R2=0. 997,y是 2-HG的溶度，X是2-HG的相對數(shù)值，2-HG的相對數(shù)值指2-HG的峰面積除以內(nèi)標(biāo)氯苯丙氨 酸的峰面積。

【具體實(shí)施方式】
[0050] 本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次意外地發(fā)現(xiàn)，普遍存在于各種惡性腫瘤中 的代謝物二羥基戊二酸（2-HG)在血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者尤其是AMUALL等患者中，具有 鮮明的、獨(dú)立于基因突變的預(yù)后指導(dǎo)意義。本發(fā)明篩選了大量癌癥代謝產(chǎn)物，最終通過采 用GC-TOFMS檢測234例染色體核型分析正常的AML患者血清中的2-HG濃度，發(fā)現(xiàn)高血清 2-HG水平AML患者預(yù)后差，且本發(fā)明的預(yù)后方法中，2-HG是目前唯一用于對血液系統(tǒng)惡性 腫瘤進(jìn)行預(yù)后的小分子化合物，根據(jù)不同濃度的2-HG含量對血液系統(tǒng)惡性腫瘤進(jìn)行更細(xì) 的分層預(yù)后，對于指導(dǎo)臨床治療、調(diào)整臨床用藥有重要意義。在此基礎(chǔ)上，完成了本發(fā)明。
[0051] 二羥基戊二酸（2-HG)
[0052] 2-HG在正常細(xì)胞和組織中含量很少。異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH)是三羧酸循環(huán)的限速酶，其家族包括IDH1、IDH2和IDH3三個(gè)成員，均 可使異檸檬酸發(fā)生氧化脫羧反應(yīng)，生成a-酮戊二酸（a-KG)，而當(dāng)IDH突變后，則在失去了 正常的酶活性的同時(shí)獲得新的酶活性，可將a-KG轉(zhuǎn)化為二羥基戊二酸（2-HG)。
[0053] a-KG在HOT酶或MDH酶的催化下生成2-HG。D/L2HGDH酶可催化D/L-2-HG為 a-KG。在D2HGDH基因突變的遺傳性代謝疾病中，血清、尿液、腦脊液的D-2-HG水平升高。 而L2HGDH基因突變的患者，L-2-HG水平升高。
[0054] 2-HG與三羧酸循環(huán)的中間代謝物a-KG的結(jié)構(gòu)極為相似，通過競爭性抑制a-KG 依賴的酶，如具有JumonjiC區(qū)結(jié)構(gòu)域的去甲基化酶和TET2-5甲基胞苷脫氫酶，導(dǎo)致DNA 和組蛋白的高甲基化，進(jìn)而抑制細(xì)胞分化、促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展。2-HG還可通過干擾機(jī)體的 抗氧化還原系統(tǒng)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。此外，2-HG還可穩(wěn)定HIF-Ia蛋白，使得VEGF 等生長因子高表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。
[0055] 急性髓性細(xì)胞白血病及其核型分析
[0056] 急性髓性細(xì)胞白血?。╝cutemyelocyticleukemia，AML)是多能干細(xì)胞或已輕度 分化的前體細(xì)胞核型發(fā)生突變所形成的一類疾病，是造血系統(tǒng)的克隆性惡性疾病。AML是一 個(gè)具有高度異質(zhì)性的疾病群，它可以由正常髓系細(xì)胞分化發(fā)育過程中不同階段的造血祖細(xì) 胞惡性變轉(zhuǎn)化而來，起源于不同階段祖細(xì)胞的AML具有不同的生物學(xué)特征。
[0057] 目前，AML的預(yù)后分類主要根據(jù)染色體核型分為三大類，染色體核型預(yù)后好組，預(yù) 后中等組和預(yù)后差組。預(yù)后好的核型有七（15 ;17)/^1^-狀狀3(8;21)/^1^141'0和11^16/ 〇8卩3-1^1111，預(yù)后差的核型有以9 ;22)，1鮮(3)八(3;3)，-5，-7，（161(59)，（161(7?)，11923 和復(fù)雜核型。
[0058] 遺傳、接觸化學(xué)物質(zhì)、電離輻射已被證明可能是白血病發(fā)病的重要危險(xiǎn)因素之一。 在AML患者中，近一半患者可被檢測出染色體異常，且可根據(jù)染色體核型判斷AML患者的預(yù) 后。而在另一半染色體核型正常的AML患者中，無法檢測到染色體的異常，也無法提供對這 一人群的預(yù)后指標(biāo)。
[0059] 總生存時(shí)間（OS)及無事件生存時(shí)間（EFS)
[0060] 本發(fā)明采用統(tǒng)計(jì)學(xué)中常用的腫瘤治療終點(diǎn)指標(biāo)，通常包括生存時(shí)間（OS)及無事 件生存時(shí)間（EFS)，完全緩解率。
[0061] 一種優(yōu)選的用于客觀體現(xiàn)腫瘤治療終點(diǎn)的指標(biāo)包括總生存時(shí)間（OS)及無事件生 存時(shí)間（EFS)。本發(fā)明中，所述的EFS-般指的是從患者開始治療到病人出現(xiàn)AML復(fù)發(fā)進(jìn)展 或死亡或兩個(gè)誘導(dǎo)療程后沒有完全緩解的時(shí)間；而OS-般指的是從患者開始治療到任何 原因死亡的時(shí)間。
[0062] 臨界值的判斷方法
[0063] 血清2-HG因非正態(tài)分布，首先進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)化，使數(shù)據(jù)更加接近正態(tài)性分布，然后 采用年齡、性別沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的405例健康對照的血清2-HG的平均值加5倍的標(biāo)準(zhǔn)差， 做為患者異常升高的界定值。根據(jù)該界定值，把367例患者劃分為升高組62例，正常組305 例。
[0064] 檢測試劑及檢測方法
[0065] 本發(fā)明涉及定量和定性檢測人體內(nèi)2-HG水平。這些試驗(yàn)是本領(lǐng)域所熟知的。試 驗(yàn)中所檢測的人體內(nèi)2-HG水平，可以用于判斷核型正常的AML的分層預(yù)后。
[0066] 在本發(fā)明中，所述2-HG的檢測劑包括2-HG特異性抗體、a-酮戊二酸依賴酶。
[0067] 其中，2-HG特異性抗體通常偶聯(lián)有或帶有可檢測標(biāo)記，如生色團(tuán)、化學(xué)發(fā)光基團(tuán)、 熒光團(tuán)、同位素或酶。此外，2-HG可作為半抗原與蛋白質(zhì)載體偶聯(lián)形成完全抗原，從而制備 2-HG的單克隆抗體或多克隆抗體，從而獲得2-HG的檢測試劑。
[0068] 在本發(fā)明中，術(shù)語"a_酮戊二酸依賴酶"指的是各種依賴于a_酮戊二酸結(jié)合才 能產(chǎn)生活性的酶，且該酶一般可通過2-HG競爭性抑制能夠失活。一種優(yōu)選的a-酮戊二酸 依賴酶包括JumonjiC區(qū)結(jié)構(gòu)域去甲基化酶、TET2-5甲基胞苷脫氫酶。
[0069] 通常，可通過測定樣品對這類a-酮戊二酸依賴酶的抑制程度從而判斷樣品中 2-HG的含量。因此，a-酮戊二酸依賴酶可作為本發(fā)明檢測試劑用于判斷AML的預(yù)后。其 中a-酮戊二酸依賴酶的抑制程度可采用本領(lǐng)域常規(guī)方法獲得。
[0070] 另一種檢測2-HG的方法在間接檢測?，F(xiàn)有研究已經(jīng)表明，D/L2HGDH酶可催化D/ L-2-HG形成a-KG，而a-KG是易于測定的（可采用常規(guī)技術(shù)進(jìn)行測定），因此將D/L2HGDH 酶與經(jīng)處理待測樣品（如血清）或未處理的待測樣品進(jìn)行混合，然后通過測定D/L2HGDH酶 轉(zhuǎn)化所生成的a-KG數(shù)量，可以間接換算成2-HG的含量。在該間接檢測法中，D/L2HGDH酶 就是一種2_HG檢測試劑。
[0071] 在本發(fā)明中，可采用多種方法對檢測試劑-樣品之間的反應(yīng)進(jìn)行定性或定量檢 測，優(yōu)選的方法如氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜法（GC-TOFMS)檢測、液相質(zhì)譜（LC-MS)、酶聯(lián)免 疫反應(yīng)法（ELISA法）檢測、核磁共振法（MRI)或時(shí)間分辨免疫熒光法（TRFIA法）檢測。
[0072] -種檢測樣品中是否存在2-HG的方法是利用CSF2RB蛋白的特異性抗體進(jìn)行檢 測，它包括：將樣品與2-HG特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物 就表示樣品中存在2-HG，當(dāng)然，還可以采用上述提到的質(zhì)譜分析等方法進(jìn)行2-HG的定量分 析。
[0073] 試劑盒
[0074] 本發(fā)明還提供了一種判斷核型正常AML患者預(yù)后的試劑盒。可用于本發(fā)明的試劑 盒通常包括點(diǎn)樣于測試板上的檢測試劑、各種濃度的2-HG標(biāo)準(zhǔn)品和/或預(yù)后判斷說明書。
[0075] 其中，所述的說明書中記載了檢測方法以及根據(jù)不同樣品測定值A(chǔ)1判斷AML患者 預(yù)后的方法。
[0076] -種優(yōu)選說明書中記載的判斷預(yù)后方法如下：
[0077] (a)提供受試者的測試樣品；
[0078] (b)測定所述樣品中的2-HG含量為Al;
[0079] (c)將步驟（b)與正常人群樣品的2-HG含量AO相比較，若Al顯著高于A0,則說 明測試組預(yù)后差；
[0080] 其中，所述"顯著高于"指Al彡又A()+5SD, X\。為正常人群血清2-HG的平均值， SD為正常人群血清2-HG的平均值的標(biāo)準(zhǔn)差。
[0081]通常，所述的正常人群的數(shù)量為至少100人；較佳地至少300人；更佳地至少500 人，最佳地至少1000人。正常人群取自200-2000人的人群。
[0082] 一般所述"顯著高于"指該升高的差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著性，典型的"顯著高于" 的數(shù)值是指測試對象（如人）血清中2-HG濃度彡4iig/ml。
[0083] 此外，本發(fā)明所述的預(yù)后還可以指進(jìn)一步的分層預(yù)后，包括通過將測試對象的樣 品2-HG含量Al與正常人群樣品的2-HG含量AO相比較，并如下進(jìn)行分層預(yù)后為：
[0084] 當(dāng)所述Al彡22 6\ g/ml，則表明預(yù)后非常差（D級）；
[0085] 當(dāng)所述Al為f 則表明預(yù)后差（C級）；
[0086] 當(dāng)所述Al為2 1 85-22_>g/ml，則表明預(yù)后優(yōu)于C級（B級）；
[0087] 當(dāng)所述Al彡2185 g/ml，則表明預(yù)后優(yōu)于B級（A級）。
[0088] 一種典型的本發(fā)明的試劑盒可用于檢測人血液樣品、血清樣品。其中，所述的血液 或血清樣品可來自于外周血或骨髓。
[0089] 本發(fā)明有益效果
[0090] 本發(fā)明通過篩選大量AML相關(guān)基因以及癌癥代謝物，確定了 2-HG可作為有效的判 斷AML尤其是核型正常型AML預(yù)后的標(biāo)志物，此外，通過對2-HG的不同含量的界定與劃分， 還能夠相對精確地判斷這一類人群的預(yù)后情況，能夠?yàn)榕R床診療進(jìn)行有利的指導(dǎo)。
[0091] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照 常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否 則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量份數(shù)。
[0092] 通用方法
[0093] 血清樣品的前處理
[0094] 內(nèi)標(biāo)溶液和甲氧胺吡啶溶液的制備
[0095] 1.稱取足量的內(nèi)標(biāo)2-氯苯丙氨酸粉末，加入準(zhǔn)確體積的超純水，振蕩使其充分溶 解，然后制成〇. 3mg/mL的水溶液，放至玻璃管中，避光，4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> [0096] 2.稱取足量的內(nèi)標(biāo)十七烷酸粉末，加入準(zhǔn)確體積的甲醇溶液（色譜純級），振蕩使 其充分溶解，制成lmg/mL的醇溶液，放至玻璃管中，避光，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0097] 3.稱取適量的甲氧胺粉末，加入準(zhǔn)確體積的吡啶，振蕩使其充分溶解，制成15mg/ mL的溶液，室溫下避光暫時(shí)存放備用。
[0098] 血清衍生化處理
[0099] 從_80°C冰箱中取出凍存的血清，室溫下解凍。對每份標(biāo)本，取出血清IOOyL，加 入300yL的甲醇：氯仿混合溶液（體積比甲醇：氯仿=3:1)，振蕩1分鐘，充分混勻。-20°C 靜置10分鐘，沉淀蛋白。室溫下，10,OOOrpm離心10分鐘。取上清300iiL放入GC高回收 進(jìn)樣瓶中，加入IOuL內(nèi)標(biāo)2-氯苯丙氨酸（0. 3mg/mL)和IOiiL內(nèi)標(biāo)十七燒酸（lmg/mL)，真 空濃縮干燥。干燥完畢后，接通氮?dú)獬ミM(jìn)樣瓶中的殘留水汽，迅速加入80yL甲氧胺吡啶 溶液（15mg/mL)并加蓋密封，振蕩混勻后，置于搖床（30°C，200rpm)上反應(yīng)90分鐘。反應(yīng) 完畢后，開啟密封蓋，迅速加入80iiL硅烷化試劑BSTFA(含1%TMCS)，立即加蓋密封，振蕩 混勻后，置于70°C烘箱中1小時(shí)，進(jìn)行衍生化反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，振蕩1分鐘，室溫下靜置1 小時(shí)，等待上樣檢測。
[0100] 檢測的程序設(shè)置
[0101] 進(jìn)樣針以splitless的模式吸取Ii!L衍生化標(biāo)本入偶聯(lián)了PegasusHT飛行時(shí)間 質(zhì)譜儀的Agilent6890N色譜儀中（(LecoCorporation,StJoseph,USA)。使用的色譜柱為 DB-5MS毛細(xì)管柱（30mX250iimI.D.，0.25_iimfilmthickness; (5%-phenyl)_methylpo lysiloxanebondedandcrosslinked;AgilentJ&ffScientific,Folsom,CA,USA) 〇 載氣 為氮?dú)?，載氣流速為ImL/分鐘。進(jìn)樣口溫度設(shè)為270°C，離子源溫度設(shè)為220°C，接口溫度 設(shè)為270°C。程序升溫起始溫度為80°C，保持2分鐘；以KTC/分鐘的速度升至180°C，再 以6°C/分鐘的速度升至230°C，最后以40°C/分鐘的速度升至295°C，保持8分鐘。質(zhì)譜 儀的電離方式設(shè)為EI，電子能量設(shè)為70eV，以全掃描方式掃描，掃描范圍設(shè)為m/z30-600。
[0102] 主要儀器設(shè)備
[0103] 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國PerkinElmer公司）
[0104]DB-5MS氣相毛細(xì)管色譜柱（安捷倫科技有限公司）
[0105] 低溫冷凍冰箱（BC/BD-190S型青島海爾）
[0106] 離心機(jī)（LD5-2A型北京醫(yī)用離心機(jī)廠）
[0107] 離心機(jī)（TGL-16B上海安亭科學(xué)儀器制造廠）
[0108] 微型漩渦混合器（QL-901型江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）
[0109] 電子分析天平（BS124S德國Startorius公司）
[0110] 數(shù)控超聲儀（KQ-250DB型昆山市超聲儀器有限公司）
[0111] 超純水器（Mill-QII型Milipore,Bedford,MA,USA)
[0112] 實(shí)施例1樣本收集
[0113] 1 ?研究對象
[0114]I. 1.實(shí)驗(yàn)例：本研究納入從2007年?2012年間，在全國7個(gè)主要的血液病診療 中心，包括上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院、浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院、蘇州大學(xué) 附屬第一醫(yī)院、中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院、大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院、南京醫(yī)科大學(xué)附 屬第一醫(yī)院、北京大學(xué)人民醫(yī)院，經(jīng)形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)（MIC)檢查確診的急性髓細(xì)胞 白血病患者，共367例，具體如下：
[0115] 男性210例，女性157例，AML患者的中位年齡46歲，年齡分布15-82歲。
[0116] 另外收集其他常見的血液系統(tǒng)腫瘤患者：急性淋巴細(xì)胞白血病150例，男性92例， 女性58例，患者的中位年齡36歲，年齡分布13-73歲；原發(fā)性骨髓纖維化7例，男性3例， 女性4例，患者的中位年齡54歲，年齡分布46-61歲；多發(fā)性骨髓瘤24例，男性15例，女性 9例，患者的中位年齡56歲，年齡分布42-79歲；淋巴瘤64例，男性40例，女性24例，患者 的中位年齡54歲，年齡分布14-79歲；骨髓增生異常綜合癥31例，男16例，女15例，患者 的中位年齡60歲，年齡分布43-86歲；慢性粒細(xì)胞白血病18例，男10例，女8例，患者的中 位年齡41歲，年齡分布23-84歲。
[0117] 入選標(biāo)準(zhǔn)：所有患者無嚴(yán)重的心肝腦肺等其他系統(tǒng)的嚴(yán)重合并癥。排除復(fù)治AML， 排除患有其它臟器惡性腫瘤，排除懷孕或哺乳期婦女，排除糖尿病、甲狀腺功能亢進(jìn)等常見 內(nèi)分泌代謝性疾病患者，排除偏食、煙酒嗜好患者，排除嚴(yán)重胃腸炎患者。
[0118] 1. 3.對照例：瑞金醫(yī)院體檢中心的健康體檢者405例，男233例，女性172例，中 位年齡46歲，年齡分布16-82歲。體檢者無皮膚粘膜出血，無全身淺表淋巴結(jié)腫大。血常 規(guī)、肝腎功能正常。健康對照排除糖尿病、甲狀腺疾病等常見內(nèi)分泌性疾病，排除急性和慢 性胃腸炎患者，排除心肝肺腎結(jié)構(gòu)及功能嚴(yán)重受損，排除腫瘤患者。
[0119] 2.血液樣本采集
[0120] 病人初發(fā)狀態(tài)與健康體檢者均在清晨空腹留取5ml靜脈血，使用BD公司的真空 采血管（BDVacutainerSSTIIAdvanceREF367955,黃蓋普管）采血。血液標(biāo)本2000轉(zhuǎn) IOmin離心后獲得的血清用AxygenO. 5mL離心管分裝上清、編號、負(fù)80度凍存。此項(xiàng)研究經(jīng) 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院臨床研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。充分告知患者和正常對照研 究內(nèi)容和意義，經(jīng)簽署知情同意書后，在無菌條件下采集患者血液標(biāo)本。
[0121] 3?材料與試劑
[0122] BSTFA購自于美國SIGMA公司。氯仿，無水乙醇，吡啶，氫氧化鈉，無水硫酸鈉，以上 皆為分析純，購自上海潤潔化學(xué)試劑有限公司。內(nèi)標(biāo)：L-2_氯苯丙氨酸，十七酸，購自美國 SIGMA公司。2-HG,購自TorontoResearchChemicalsInc。
[0123] 實(shí)施例2標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配置和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
[0124] 配置2-HG標(biāo)準(zhǔn)品的母液，然后分別取適量的母液一一稀釋成為14個(gè)濃度不同 溶度，并且各取IOOyL稀釋液入GC高回收進(jìn)樣瓶中，加入內(nèi)標(biāo)氯苯丙氨酸和十七烷酸各 10yL，按照血清衍生化方法進(jìn)行衍生化，最后上樣檢測。
[0125] 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的溶度梯度和相應(yīng)的峰面積，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)品不同溶度對應(yīng)的峰面積的 回歸線，由回歸線確定每個(gè)樣本的2-HG的溶度。為了使2-HG的溶度趨向正態(tài)分布，所有樣 本的2-HG溶度經(jīng)過log2轉(zhuǎn)換。轉(zhuǎn)換的數(shù)值再進(jìn)行最后的分析比較。
[0126] 圖4顯示了標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。標(biāo)準(zhǔn)曲線的公式y(tǒng)=ll. 80x+l. 66，R2=0. 997，y是2-HG的 溶度，X是2-HG的相對數(shù)值，2-HG的相對數(shù)值指2-HG的峰面積除以內(nèi)標(biāo)氯苯丙氨酸的峰面 積。
[0127] 實(shí)施例3數(shù)據(jù)的提取及定量檢測方法
[0128] 原始GC-T0FMS數(shù)據(jù)文件，通過Turbomass軟件的DataBridge(Perkin-Elmer Inc，USA)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換功能轉(zhuǎn)換Net⑶F的格式，然后直接導(dǎo)入MTLABCThe MathWorks,Inc.，USA)腳本進(jìn)行處理。
[0129] 處理過程大致可以分為基線矯正、峰判別和匹配、內(nèi)標(biāo)和一些系統(tǒng)雜峰的排除以 及用峰面積總和的方法進(jìn)行峰的歸一化。最終得到三維矩陣圖，這三維的坐標(biāo)分別為：化合 物的特性指標(biāo)（這里用質(zhì)荷比來表示），樣本名以及歸一化后的峰面積。把峰的保留時(shí)間和 質(zhì)荷比信息跟標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行匹配，鑒定出代謝物2-HG。
[0130] 結(jié)果：通過檢測分析405例健康對照和661例血液系統(tǒng)腫瘤包括367例AML患者 的血清中小分子代謝物2-羥基戊二酸水平。由于血液系統(tǒng)惡性腫瘤在整體人群中屬于發(fā) 病率較低的疾病，因此為了避免假陽性率過高，選用健康對照的血清2-羥基戊二酸的平均 值加5倍的標(biāo)準(zhǔn)差為界定值(又A()+5SD)，把血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者劃分為高2-羥基戊二 酸水平組和正常組。
[0131] 跟健康對照比較，發(fā)現(xiàn)部分常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤血清2-羥基戊二酸水平升 高，其中，以AML和ALL最為顯著（見表1和圖1)。
[0132] 表 1
[0133]

【權(quán)利要求】
1. 一種二羥基戊二酸（2-HG)或其檢測試劑的用途，其特征在于，用于制備判斷血液系 統(tǒng)惡性腫瘤預(yù)后的試劑盒。
2. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述血液系統(tǒng)惡性腫瘤包括急性髓細(xì)胞白 血?。ˋML)、急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL)、原發(fā)性骨髓纖維化（PMF)、多發(fā)性骨髓瘤（MM)、淋 巴瘤（HNL)、骨髓增生異常綜合癥（MDS)、或慢性粒細(xì)胞性白血?。–ML)。
3. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述預(yù)后是指對測試對象進(jìn)行總生存時(shí)間 (OS)或無事件生存時(shí)間（EFS)的預(yù)估。
4. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述判斷血液系統(tǒng)惡性腫瘤預(yù)后是指判斷 AML預(yù)后；更佳地，所述判斷AML預(yù)后包括對AML患者進(jìn)行分層預(yù)后。
5. 如權(quán)利要求1-4中任一所述的用途，其特征在于，所述的預(yù)后是將來自測試對象的 樣品2-HG含量Al與正常人群的2-HG含量AO相比較，若Al顯著高于A0,則說明測試組預(yù) 后差； 較佳地，所述"顯著高于"指A1S?又A()+5SD,又AQ為正常人群血清2-HG的平均值，SD 為正常人群血清2_HG的平均值的標(biāo)準(zhǔn)差。
6. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的檢測試劑包括2-HG特異性抗體、 α -酮戊二酸依賴酶、2HGDH酶。
7. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的試劑盒還包括二羥基戊二酸（2-HG) 的標(biāo)準(zhǔn)品。
8. 如權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于，所述的標(biāo)準(zhǔn)品是濃度分別為22 69、22 (11、和/ 或2185yg/ml的二羥基戊二酸（2-HG)的標(biāo)準(zhǔn)品。
9. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的檢測的樣品包括血液樣品、血清樣 品。
10. -種判斷急性髓性細(xì)胞白血?。ˋML)預(yù)后的方法，其特征在于，包括步驟： (a) 提供受試者的測試樣品； (b) 測定所述樣品中的2-HG含量為Al ; (c) 將步驟（b)與正常人群樣品的2-HG含量AO相比較，若Al顯著高于A0,則說明測 試組預(yù)后差； 較佳地，所述"顯著高于"指Al >^a()+5SD,又\()為正常人群血清2-HG的平均值，SD 為正常人群血清2_HG的平均值的標(biāo)準(zhǔn)差。
【文檔編號】C12Q1/26GK104515852SQ201310455927
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2013年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月29日
【發(fā)明者】陳賽娟, 陳竺, 王敬瀚, 陳文連, 賈偉 申請人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院