本發(fā)明是關(guān)于一種從小鼠體內(nèi)獲取II型固有淋巴細(xì)胞的方法及所用載體，具體而言，本發(fā)明是關(guān)于一種能在肝臟中誘導(dǎo)并擴(kuò)增大量II型固有淋巴細(xì)胞的重組表達(dá)載體、以及利用該載體從小鼠體內(nèi)大量獲取II型固有淋巴細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)：

近年來(lái)，隨著人們對(duì)固有免疫細(xì)胞的深入研究，發(fā)現(xiàn)了一群新的細(xì)胞亞群。這類亞群不表達(dá)抗原特異性識(shí)別受體(TCR或BCR)，在發(fā)育和形態(tài)上屬于淋巴細(xì)胞譜系，與過(guò)去人們發(fā)現(xiàn)的自然殺傷(NK)細(xì)胞和淋巴組織誘導(dǎo)(LTi)細(xì)胞一起被稱為固有淋巴細(xì)胞(ILC)。按照輔助性T(Th)細(xì)胞的分類方法，根據(jù)細(xì)胞因子分泌和轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的不同，ILC家族又可被分成三大類：ILC1、ILC2和ILC3。

Ⅱ型固有淋巴細(xì)胞(Type II innate lymphoid cells,ILC2)是上述的其中一種新近發(fā)現(xiàn)的固有淋巴細(xì)胞群體，主要分布于肺臟、腸道、皮膚等黏膜組織，在IL-25和IL-33的刺激下能夠產(chǎn)生IL-5和IL-13等Th2型細(xì)胞因子。ILC2在呼吸道抗感染免疫以及過(guò)敏性疾病中發(fā)揮重要作用，因而備受關(guān)注。已有研究表明，在呼吸道過(guò)敏性疾病發(fā)病早期，ILC2是Th2型細(xì)胞因子的重要來(lái)源，可以調(diào)控適應(yīng)性免疫應(yīng)答；同時(shí)在抗寄生蟲、病毒感染以及組織修復(fù)過(guò)程中，ILC2也發(fā)揮重要功能。因此，ILC2的生物學(xué)研究具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。盡管目前在ILC2相關(guān)領(lǐng)域的研究取得了重大的突破，但是由于ILC2在正常小鼠體內(nèi)數(shù)量極少，而常規(guī)免疫或生化研究手段需要大量的細(xì)胞來(lái)進(jìn)行，因而對(duì)ILC2的研究目前仍然面臨重大的技術(shù)挑戰(zhàn)。因此，如何在短時(shí)間內(nèi)大量獲取高純度的ILC2是其進(jìn)一步研究面臨的主要技術(shù)問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種從小鼠體內(nèi)獲取大量II型固有淋巴細(xì)胞的方法。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種能在肝臟中誘導(dǎo)并擴(kuò)增大量II型固有淋巴細(xì)胞的重組表達(dá)載體，可用于從小鼠體內(nèi)大量獲取II型固有淋巴細(xì)胞。

一方面，本發(fā)明提供了一種重組表達(dá)載體，其是將小鼠IgG的κ鏈信號(hào)肽的編碼序列與鼠源IL-33活性區(qū)編碼序列連接到真核表達(dá)載體上而得到的。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，小鼠IgG的κ鏈信號(hào)肽的編碼序列具有如SEQ ID No.：1所示序列(其對(duì)應(yīng)的氨基酸序列如SEQ ID No.：2所示)。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，鼠源IL-33活性區(qū)編碼序列具有如SEQ ID No.：3所示序列(其對(duì)應(yīng)的氨基酸序列如SEQ ID No.：4所示)。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明提供的重組表達(dá)載體，其包含如SEQ ID No.：5所示序列。即，其是包含如SEQ ID No.：5所示開放閱讀框的真核表達(dá)載體。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的重組表達(dá)載體中，真核表達(dá)載體為任何使用CMV啟動(dòng)子或衍生啟動(dòng)子以在真核細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì)的真核表達(dá)載體，比如pcDNA3.1真核表達(dá)載體、pCMV真核表達(dá)載體等等。

在本發(fā)明的一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組表達(dá)載體具有CMV啟動(dòng)子或衍生啟動(dòng)子，并在其開放閱讀框內(nèi)具有小鼠IgG的κ鏈信號(hào)肽的編碼序列與鼠源IL-33活性區(qū)編碼序列，即，其是通過(guò)將小鼠IgG的κ鏈信號(hào)肽的編碼序列與鼠源IL-33活性區(qū)編碼序列連接到任何具有CMV啟動(dòng)子或衍生啟動(dòng)子的真核表達(dá)載體的開放閱讀框中而得到的，比如將小鼠IgG的κ鏈信號(hào)肽的編碼序列與鼠源IL-33活性區(qū)編碼序列連接到pcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體的HindIII和BamHI之間。本發(fā)明中，將這樣的重組表達(dá)載體(將小鼠IgG的κ鏈信號(hào)肽的編碼序列與鼠源IL-33活性區(qū)編碼序列連接到pcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體的HindIII和BamHI之間而得到的重組表達(dá)載體)命名為pcDNA3.1-mIgκ-mIL33。

本發(fā)明提供的重組表達(dá)載體，能在肝臟中誘導(dǎo)并擴(kuò)增大量II型固有淋巴細(xì)胞，從而，本發(fā)明還提供了所述重組表達(dá)載體在制備用于在肝臟中誘導(dǎo)并擴(kuò)增II型固有淋巴細(xì)胞的制劑中的應(yīng)用。

另一方面，本發(fā)明還提供了一種從動(dòng)物體內(nèi)獲取II型固有淋巴細(xì)胞的方法，該方法包括：

將本發(fā)明所述的重組表達(dá)載體導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)，使動(dòng)物體內(nèi)過(guò)表達(dá)鼠源IL-33，從而在肝臟中誘導(dǎo)擴(kuò)增出II型固有淋巴細(xì)胞；

分離得到肝臟組織淋巴細(xì)胞，并用Ⅱ型固有淋巴細(xì)胞特異性抗體標(biāo)記所得到的肝臟組織淋巴細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞流式技術(shù)分選得到Ⅱ型固有淋巴細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的從動(dòng)物體內(nèi)獲取II型固有淋巴細(xì)胞的方法中，所述動(dòng)物為小鼠。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的從動(dòng)物體內(nèi)獲取II型固有淋巴細(xì)胞的方法中，是采用尾靜脈高壓注射的方法將所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入動(dòng)物肝臟。

尾靜脈高壓注射，就是將大體積的裸質(zhì)粒DNA溶液經(jīng)小鼠尾靜脈快速注入，大量的質(zhì)粒溶液導(dǎo)致循環(huán)血量的急劇增加，超過(guò)心臟負(fù)荷，血液積聚在肝血竇中不能回流，延長(zhǎng)了質(zhì)粒DNA在肝竇中的停留時(shí)間，從而被肝組織細(xì)胞攝取。攝取重組載體的肝細(xì)胞就可以對(duì)目的蛋白進(jìn)行原位表達(dá)。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的從動(dòng)物體內(nèi)獲取II型固有淋巴細(xì)胞的方法中，是在靜脈高壓注射至少3天后(本發(fā)明中通常是在第3天后到第7天)，從動(dòng)物體內(nèi)分離得到肝臟組織淋巴細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的從動(dòng)物體內(nèi)獲取II型固有淋巴細(xì)胞的方法中，可通過(guò)密度梯度離心(例如Percoll法)分離得到肝臟組織淋巴細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的從動(dòng)物體內(nèi)獲取II型固有淋巴細(xì)胞的方法中，通過(guò)四種抗體從肝臟單個(gè)核細(xì)胞中進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分選純化Ⅱ型固有淋巴細(xì)胞。優(yōu)選地，所述抗體為FITC-anti mouse KLRG1、PE-anti mouse Lineage Cocktail、PerCP.Cy5.5-anti mouse CD90.2、APC-anti mouse IL33R。所述抗體可商購(gòu)獲得，例如可購(gòu)自Biolegend公司。

本發(fā)明的具體實(shí)驗(yàn)表明，正常小鼠或?qū)φ蛰d體高壓注射的小鼠肝臟中幾乎沒(méi)有ILC2細(xì)胞，而經(jīng)本發(fā)明的重組表達(dá)載體pcDNA3.1-mIgκ-mIL33注射的小鼠，肝臟中清晰出現(xiàn)ILC2細(xì)胞群體，經(jīng)歷流式細(xì)胞術(shù)分選，即可大量獲得該細(xì)胞。另，由于分選策略是完全基于II型固有淋巴細(xì)胞的定義，所以只要流式細(xì)胞儀足夠精確，分選出的細(xì)胞純度就足夠高。

本發(fā)明經(jīng)過(guò)大量重復(fù)實(shí)驗(yàn)證明，能從C57BL/6小鼠中誘導(dǎo)并大量擴(kuò)增、分離并純化出高純度、高活性的II型固有淋巴細(xì)胞。

附圖說(shuō)明

圖1顯示mIgκ的核酸及氨基酸序列。

圖2顯示mIL-33的核酸及氨基酸序列。

圖3顯示II型固有淋巴細(xì)胞的流式檢測(cè)及分選策略。

圖4顯示pcDNA3.1和pcDNA3.1-mIgκ-mIL-33分別尾靜脈注射3天后肝臟中II型固有淋巴細(xì)胞的水平。

圖5顯示pcDNA3.1-mIgκ-mIL-33注射1-3天后肝臟中II型固有淋巴細(xì)胞的數(shù)量。

圖6顯示經(jīng)本方法分選所得的II型固有淋巴細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)，經(jīng)過(guò)mIL-33刺激能產(chǎn)生大量的Th2型細(xì)胞因子，但不產(chǎn)生Th1型細(xì)胞因子。

圖7顯示經(jīng)本方法，選用不同量的pcDNA3.1-mIgκ-mIL-33注射3天后在肝臟中所能獲取的II型固有淋巴細(xì)胞數(shù)量。

具體實(shí)施方式

為了更清楚地理解本發(fā)明，現(xiàn)參照下列實(shí)施例及附圖進(jìn)一步描述本發(fā)明。實(shí)施例僅用于解釋而不以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法為所屬領(lǐng)域熟知的常規(guī)方法和常規(guī)條件，或按照制造商所建議的條件。

實(shí)施例1、pcDNA3.1-mIgκ-mIL33重組載體的構(gòu)建

通過(guò)基因重組技術(shù)，將帶有小鼠IgG的κ鏈信號(hào)肽的編碼序列(mIgK信號(hào)肽核苷酸序列和氨基酸序列分別參見SEQ ID No.：1與SEQ ID No.：2，圖1)與鼠源IL-33活性區(qū)編碼序列(IL-33活性區(qū)的核苷酸序列和氨基酸序列分別參見SEQ ID No.：3與SEQ ID No.：4，圖2)連接到pcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體(Invitrogen)的HindIII和BamHI之間，構(gòu)建得到pcDNA3.1-mIgκ-mIL33重組質(zhì)粒。

實(shí)施例2、肝臟Ⅱ型固有淋巴細(xì)胞的分離與純化

1、pcDNA3.1-mIgκ-mIL33重組質(zhì)粒的尾靜脈高壓注射

本實(shí)施例中，在6到8秒的時(shí)間內(nèi)將體積對(duì)應(yīng)于10％左右小鼠體重(v/w)的含有20微克pcDNA3.1-mIgκ-mIL33重組質(zhì)粒的生理鹽水或PBS溶液，通過(guò)小鼠尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)。

2、小鼠肝臟Ⅱ型固有淋巴細(xì)胞的分離與純化

(1)在前述步驟的尾靜脈高壓注射至少3天后，肝臟中聚集的II型固有淋巴細(xì)胞已較可觀(見圖5，圖中數(shù)據(jù)為多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的代表性結(jié)果)，殺鼠：摘眼放血，盡量放干凈。(以下實(shí)驗(yàn)均需無(wú)菌操作。)

(2)無(wú)菌技術(shù)摘取肝臟組織，放入無(wú)菌PBS中置于冰上。

(3)將肝臟組織輕輕研磨后用200目篩網(wǎng)過(guò)濾。

(4)4℃1060g離心10分鐘，棄上清。(以下離心除了密度梯度離心的步驟是常溫外均是4℃。)

(5)密度梯度離心：用42％Percoll 3ml重懸細(xì)胞沉淀，緩慢加到3ml70％Percoll(GE Healthcare)表面，離心1260g 30分鐘。

20ml 70％Percoll配方：12.6ml Percoll原液(GE Healthcare)+

1.4ml 10×PBS+6ml 1×PBS

20ml 42％Percoll配方：7.56ml Percoll原液(GE Healthcare)+

840ul 10×PBS+11.6ml 1×PBS

(6)取中間層細(xì)胞到新的15毫升離心管，PBS加滿，1060g離心10分鐘后棄去上清液。

(7)取出少量細(xì)胞用臺(tái)盼藍(lán)染色后進(jìn)行計(jì)數(shù)。

(8)細(xì)胞懸液加入大鼠血清封閉Fc受體并標(biāo)記熒光抗體：FITC-anti mouse KLRG1、PE-anti mouse Lineage Cocktail、PerCP.Cy5.5-anti mouse CD90.2、APC-anti mouse IL33R(抗體均來(lái)自Biolegend)，4℃避光孵育15min。

(9)加滿PBS，4℃1060g×10min，洗兩遍。

(10)用流式細(xì)胞儀分選Lineage-IL33R+CD90.2+KLRG1+細(xì)胞，即為ILC2細(xì)胞。

ILC2細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分選請(qǐng)參見圖3與圖4。圖3中，左圖從肝臟單個(gè)核細(xì)胞懸液中使用FSC-A和FSC-H圈出其中的單個(gè)細(xì)胞，中圖從上述單個(gè)細(xì)胞中按照Lineage陰性ST2陽(yáng)性的條件圈出Lineage-ST2+細(xì)胞，右圖從上述Lineage-ST2+細(xì)胞中圈出CD90.2陽(yáng)性KLRG1陽(yáng)性的細(xì)胞，該細(xì)胞即為ILC2細(xì)胞。

從圖4實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，正常小鼠或?qū)φ蛰d體高壓注射的小鼠肝臟中幾乎沒(méi)有ILC2細(xì)胞，經(jīng)pcDNA3.1-mIgκ-mIL33重組載體注射的小鼠，肝臟中清晰出現(xiàn)ILC2細(xì)胞群體，經(jīng)歷流式細(xì)胞術(shù)分選，即可大量獲得該細(xì)胞(圖5)。分選出的該細(xì)胞在體外以50000/mL密度培養(yǎng)時(shí)，以mIL-33(比如50ng/mL mIL-33)刺激2天后能產(chǎn)生大量的Th2型細(xì)胞因子如IL-5和IL-13，但不能產(chǎn)生Th1型細(xì)胞因子如IFN-γ(圖6)，表示該細(xì)胞具有較好的活性。

實(shí)施例3

經(jīng)不同量的pcDNA3.1-mIgκ-mIL-33注射正常成年小鼠3天后，從肝臟組織獲取II型固有淋巴細(xì)胞，其余具體操作同實(shí)施例2。本實(shí)施例在肝臟中所能獲取的II型固有淋巴細(xì)胞數(shù)量見圖7。表明采用本發(fā)明的方法能從小鼠中誘導(dǎo)并大量擴(kuò)增、分離并純化出高純度、高活性的II型固有淋巴細(xì)胞。

序列表

<110> 深圳先進(jìn)技術(shù)研究院

<120> 從小鼠體內(nèi)獲取II型固有淋巴細(xì)胞的方法及所用載體

<130> GAI16CN1304

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 60

<212> DNA

<213> 小鼠

<220>

<223> 小鼠IgG的?鏈信號(hào)肽的編碼序列

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(60)

<400> 1

atg gag aca gac aca ctc ctg cta tgg gta ctg ctg ctc tgg gtt cca 48

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

ggt tcc act ggt 60

Gly Ser Thr Gly

20

<210> 2

<211> 20

<212> PRT

<213> 小鼠

<220>

<223> 小鼠IgG的?鏈信號(hào)肽

<400> 2

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly

20

<210> 3

<211> 477

<212> DNA

<213> 小鼠

<220>

<223> 小鼠IL-33活性區(qū)編碼序列

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(477)

<400> 3

agc atc caa gga act tca ctt tta aca cag tct cct gcc tcc ctg agt 48

Ser Ile Gln Gly Thr Ser Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser

1 5 10 15

aca tac aat gac caa tct gtt agt ttt gtt ttg gag aat gga tgt tat 96

Thr Tyr Asn Asp Gln Ser Val Ser Phe Val Leu Glu Asn Gly Cys Tyr

20 25 30

gtg atc aat gtt gac gac tct gga aaa gac caa gag caa gac cag gtg 144

Val Ile Asn Val Asp Asp Ser Gly Lys Asp Gln Glu Gln Asp Gln Val

35 40 45

cta cta cgc tac tat gag tct ccc tgt cct gca agt caa tca ggc gac 192

Leu Leu Arg Tyr Tyr Glu Ser Pro Cys Pro Ala Ser Gln Ser Gly Asp

50 55 60

ggt gtg gat ggg aag aag ctg atg gtg aac atg agt ccc atc aaa gac 240

Gly Val Asp Gly Lys Lys Leu Met Val Asn Met Ser Pro Ile Lys Asp

65 70 75 80

aca gac atc tgg ctg cat gcc aac gac aag gac tac tcc gtg gag ctt 288

Thr Asp Ile Trp Leu His Ala Asn Asp Lys Asp Tyr Ser Val Glu Leu

85 90 95

caa agg ggt gac gtc tcg cct ccg gaa cag gcc ttc ttc gtc ctt cac 336

Gln Arg Gly Asp Val Ser Pro Pro Glu Gln Ala Phe Phe Val Leu His

100 105 110

aaa aag tcc tcg gac ttt gtt tca ttt gaa tgc aag aat ctt cct ggc 384

Lys Lys Ser Ser Asp Phe Val Ser Phe Glu Cys Lys Asn Leu Pro Gly

115 120 125

act tac ata gga gta aaa gat aac cag ctg gct cta gtg gag gag aaa 432

Thr Tyr Ile Gly Val Lys Asp Asn Gln Leu Ala Leu Val Glu Glu Lys

130 135 140

gat gag agc tgc aac aat att atg ttt aag ctc tcg aaa atc taa 477

Asp Glu Ser Cys Asn Asn Ile Met Phe Lys Leu Ser Lys Ile

145 150 155

<210> 4

<211> 158

<212> PRT

<213> 小鼠

<220>

<223> 小鼠IL-33活性區(qū)

<400> 4

Ser Ile Gln Gly Thr Ser Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser

1 5 10 15

Thr Tyr Asn Asp Gln Ser Val Ser Phe Val Leu Glu Asn Gly Cys Tyr

20 25 30

Val Ile Asn Val Asp Asp Ser Gly Lys Asp Gln Glu Gln Asp Gln Val

35 40 45

Leu Leu Arg Tyr Tyr Glu Ser Pro Cys Pro Ala Ser Gln Ser Gly Asp

50 55 60

Gly Val Asp Gly Lys Lys Leu Met Val Asn Met Ser Pro Ile Lys Asp

65 70 75 80

Thr Asp Ile Trp Leu His Ala Asn Asp Lys Asp Tyr Ser Val Glu Leu

85 90 95

Gln Arg Gly Asp Val Ser Pro Pro Glu Gln Ala Phe Phe Val Leu His

100 105 110

Lys Lys Ser Ser Asp Phe Val Ser Phe Glu Cys Lys Asn Leu Pro Gly

115 120 125

Thr Tyr Ile Gly Val Lys Asp Asn Gln Leu Ala Leu Val Glu Glu Lys

130 135 140

Asp Glu Ser Cys Asn Asn Ile Met Phe Lys Leu Ser Lys Ile

145 150 155

<210> 5

<211> 537

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 開放閱讀框

<400> 5

atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60

agcatccaag gaacttcact tttaacacag tctcctgcct ccctgagtac atacaatgac 120

caatctgtta gttttgtttt ggagaatgga tgttatgtga tcaatgttga cgactctgga 180

aaagaccaag agcaagacca ggtgctacta cgctactatg agtctccctg tcctgcaagt 240

caatcaggcg acggtgtgga tgggaagaag ctgatggtga acatgagtcc catcaaagac 300

acagacatct ggctgcatgc caacgacaag gactactccg tggagcttca aaggggtgac 360

gtctcgcctc cggaacaggc cttcttcgtc cttcacaaaa agtcctcgga ctttgtttca 420

tttgaatgca agaatcttcc tggcacttac ataggagtaa aagataacca gctggctcta 480

gtggaggaga aagatgagag ctgcaacaat attatgttta agctctcgaa aatctaa 537